Artykuł metodologiczny

Analiza hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61551

⸱

20 kwietnia 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biology, The City College of New York and The Graduate Center of The City University of New York, 2Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest test do ilościowego określenia hipermutacji somatycznej w locus genu ciężkiego łańcucha immunoglobuliny przy użyciu komórek B centrum zarodkowego z mysich plastrów Peyera.

Streszczenie

W centrach rozrodczych narządów limfoidalnych, dojrzałe limfocyty B zmieniają swoją ekspresję immunoglobuliny (Ig) poprzez wprowadzanie nieszablonowych mutacji do zmiennych eksonów kodujących loci genów ciężkiego i lekkiego łańcucha Ig. Ten proces hipermutacji somatycznej (SHM) wymaga indukowanej aktywacją enzymu deaminazy cytydyny (AID), która przekształca deoksycytydyny (C) w deoksyurydyny (U). Przetwarzanie niedopasowań U:G generowanych przez AID w mutacje za pomocą szlaków wycinania zasady i naprawy niedopasowania wprowadza nowe sekwencje kodujące Ig, które mogą wytwarzać wyższe powinowactwo Ig. Mutacje w genach AID lub genach naprawy DNA mogą blokować lub znacząco zmieniać typy mutacji obserwowanych w loci Ig. Opisujemy protokół ilościowego oznaczania mutacji intronów JH4, który wykorzystuje sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), PCR i sekwencjonowanie Sangera. Chociaż test ten nie mierzy bezpośrednio dojrzewania powinowactwa Ig, wskazuje na mutacje w sekwencjach kodujących zmienne Ig. Ponadto metody te wykorzystują popularne techniki biologii molekularnej, które analizują mutacje w sekwencjach Ig wielu klonów komórek B. Tym samym test ten jest nieocenionym narzędziem w badaniu dywersyfikacji SHM i Ig.

Wprowadzenie

B, członkowie adaptacyjnego układu odpornościowego, rozpoznają i eliminują antygeny poprzez wytwarzanie przeciwciał, znanych również jako immunoglobuliny (Ig). Każdy Ig składa się z dwóch ciężkich (IgH) i dwóch lekkich (IgL) polipeptydów łańcuchowych, które są utrzymywane razem przez wiązania dwusiarczkowe, tworząc charakterystyczną strukturę w kształcie litery "Y" klasy Ig1. N-końce IgH i IgL obejmują zmienny region (V) każdego polipeptydu i razem tworzą miejsce wiązania antygenu Ig, podczas gdy stały region IgH nadaje funkcję efektorową Ig. Rozwój limfocytów B w szpiku kostnym powoduje przegrupowanie eksonów kodujących V IgH i IgL w procesie znanym jako rekombinacja V(D)J2,3,4. Transkrypcja rekombinowanych eksonów V, w połączeniu z odpowiednimi eksonami o stałym regionie, tworzy mRNA, które ulega translacji do Ig.

Dojrzałe limfocyty B wyrażające Ig związane z błoną, znane również jako receptor komórek B (BCR), krążą do wtórnych narządów limfatycznych, takich jak śledziona, węzły chłonne lub plamy Peyera, gdzie badają środowisko w poszukiwaniu antygenów i wchodzą w interakcje z innymi komórkami układu odpornościowego1. W centrach rozrodczych (GC) wtórnych narządów limfatycznych aktywowane są limfocyty B, które rozpoznają antygen przez BCR. Wspomagane przez pęcherzykowe komórki dendrytyczne i pęcherzykowe limfocyty pomocnicze T, aktywowane limfocyty B mogą następnie namnażać się i różnicować w komórki plazmy i pamięci, które są ważnymi efektorami silnej odpowiedzi immunologicznej5,6,7,8,9. Dodatkowo te aktywowane limfocyty B mogą ulegać wtórnym procesom dywersyfikacji genu Ig - rekombinacji przełącznika klasy (CSR) i hipermutacji somatycznej (SHM). Podczas CSR limfocyty B wymieniają domyślny μ stały region polipeptydu IgH z innym stałym regionem (γ, α, ε) poprzez reakcję rekombinacji delecyjalno-rekombinacji DNA (Figura 1). Pozwala to na ekspresję innego stałego eksonu i translację nowego Ig. Limfocyt B przełączy się z ekspresji IgM na inny izotyp (IgG, IgA, IgE). CSR zmienia funkcję efektora Ig bez zmiany jego swoistości antygenowej10,11,12. Jednak podczas SHM komórki B mutują regiony kodujące V IgH i IgL, aby umożliwić produkcję i selekcję Igs o wyższym powinowactwie, co może skuteczniej wyeliminować antygen13,14,15 (Rysunek 1). Co ważne, zarówno CSR, jak i SHM zależą od funkcji jednego enzymu: indukowanej aktywacją deaminazy cytydynowej (AID)16,17,18. Ludzie i myszy z niedoborem AID nie mogą ukończyć CSR lub SHM i mają podwyższone miana IgM w surowicy lub Hyper-IgM17,19.

W CSR, AID deaminuje deoksycytydyny (C) w powtarzających się regionach przełączania, które poprzedzają każde stałe kodowanie eksonów, przekształcając je w deoksyurydyny (U)20,21, co tworzy niedopasowane parowanie zasad między deoksyurydynami i deoksyguanozynami (U:G). Te niedopasowania U:G są przekształcane w dwuniciowe pęknięcia DNA, które są wymagane do rekombinacji DNA, przez naprawę przez wycięcie zasady (BER) lub niedopasowanie ścieżka naprawy (MMR)22,23,24,25,26,27,28,29. W SHM AID deaminuje C w eksonach kodujących V. Replikacja w niedopasowaniu U:G generuje mutacje przejściowe C:G do T:A, podczas gdy usunięcie zasady uracylu przez białko BER, glikozylazę DNA uracylu (UNG), przed replikacją DNA powoduje zarówno mutacje przejściowe, jak i transwersyjne16. Mutacje zerowe w UNG znacząco zwiększają mutacje przejściowe C:G do T:A21,22. Podobnie jak w przypadku CSR, SHM wymaga komplementarnych ról MMR i BER. Podczas SHM MMR generuje mutacje w parach zasad A:T. Mutacje inaktywujące w homologii MutS 2 (MSH2) lub polimerazie DNA η (Polη) znacznie redukują mutacje na zasadach A:T, a mutacje złożone w MSH2 i Polη praktycznie znoszą mutacje w zasadach A:T21,30,31. Zgodnie z krytyczną rolą BER i MMR w przekształcaniu U generowanego przez AID w mutacje przejściowe lub transwersyjne, myszy z niedoborem zarówno MSH2, jak i UNG (MSH2-/-UNG-/-) wykazują tylko mutacje przejściowe C:G do T:A wynikające z replikacji w niedopasowaniu U:G21.

Analiza SHM w regionach kodujących V pozostaje skomplikowana, ponieważ rozwijające się komórki B mogą rekombinować dowolne egzony kodujące V(D)J w loci1,2,4. Dokładna analiza tych unikalnie rekombinowanych i somatycznie zmutowanych regionów V wymaga identyfikacji i izolacji klonów limfocytów B lub Ig mRNA11,13. Intron JH4, który jest 3' ostatniego eksonu kodującego J w locus IgH, jest siedliskiem mutacji somatycznych spowodowanych rozprzestrzenianiem się mutacji 3' promotora V32,33,34 i dlatego jest często używany jako marker zastępczy dla SHM w regionach V31,35 (Rysunek 1). Aby eksperymentalnie wyjaśnić, w jaki sposób określone geny lub mutacje genetyczne zmieniają wzorce lub tempo SHM, intron JH4 można zsekwencjonować z komórek B centrum rozrodczego (GCBC) z łatami Peyera (PP), które przechodzą wysokie wskaźniki SHM36,37,38. GCBC można łatwo zidentyfikować i wyizolować za pomocą fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym komórki (B220 + PNAHI) 17,39.

Przedstawiono szczegółowy protokół charakteryzujący mutacje intronów JH4 w PP GCBC od myszy przy użyciu kombinacji FACS (sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją), PCR i sekwencjonowania Sangera (Rysunek 2).

Protokół

Wszystkie zmutowane myszy były utrzymywane na tle C57BL/6. We wszystkich eksperymentach wykorzystano dopasowane wiekowo (2-5 miesięcy) samce i samice myszy. Hodowla i eksperymenty na myszach były prowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez The City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Sekcja plam Peyera

  1. Poddaj mysz eutanazji 100% CO2 w dawce 3 l/min przez 5 minut, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, aby potwierdzić śmierć. Sterylizuj narzędzia preparacyjne (nożyczki, kleszcze, kleszcze) i ręce w rękawiczkach 70% etanolem.
  2. Połóż mysz na podkładce sekcyjnej z odsłoniętym brzuchem. Obficie spryskaj ciało myszy 70% etanolem przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć w celu wysterylizowania obszaru sekcji.
  3. Wykonaj nacięcie w skórze w poprzek brzucha i usuń skórę z brzucha, ciągnąc jednocześnie po obu stronach nacięcia w kierunku głowy i ogona za pomocą kleszczy (lub wysterylizowanych rąk w rękawiczkach).
  4. Przypnij przednie i tylne kończyny myszy.
  5. Przetnij jamę otrzewnej nożyczkami, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
  6. Zlokalizuj jelito cienkie między żołądkiem a jelitem ślepym (struktura w kształcie litery "J" w pobliżu okrężnicy). Usuń jelito cienkie, przecinając poniżej żołądka i powyżej kątnicy.
  7. Usuń tkankę łączną i tłuszcz łączący ze sobą fałdy jelita cienkiego.
    UWAGA: Tłuszcz będzie miał charakterystyczny biały kolor, w przeciwieństwie do różowego koloru jelita cienkiego.
  8. Zbadaj zewnętrzną powierzchnię jelita cienkiego pod kątem plam Peyera (PP), które są małymi (~1 mm), owalnymi strukturami, które wydają się białe pod cienką warstwą półprzezroczystych komórek nabłonka.
  9. Ostrożnie wyciąć wszystkie widoczne PP nożyczkami.
    UWAGA: Jedna mysz C57BL/6 typu dzikiego (WT) może dać 4-8 PP, podczas gdy mysz AID-/- będzie miała 6-10 PP.
  10. Zebrać PP do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml buforu FACS na lodzie.
    UWAGA: PP powinien zatonąć, podczas gdy tłuszcz wypłynie na powierzchnię i będzie można go usunąć.

2. Izolacja komórek dla FACS

  1. Umieścić filtr 40 μm w 6-dołkowym naczyniu z 1 ml zimnego (4 °C) buforu FACS.
  2. Wlej PP z probówki 1,5 ml na filtr.
  3. Przemyj PP 1 ml zimnego buforu FACS, upewniając się, że zawsze są w płynie i na lodzie.
  4. Użyj płaskiego końca tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml jako tłuczka, aby zmiażdżyć PP na filtrze, aż na filtrze pozostanie tylko tkanka łączna.
  5. Umyj filtr i tłok 1 ml zimnego buforu FACS, aby uwolnić komórki do naczynia 6-dołkowego.
  6. Zbierz ~ 4 ml komórek w zimnym buforze FACS i przefiltruj je przez probówkę FACS z filtrem siatkowym o średnicy 40 μm.
  7. Umyj nasadkę sitka 1 ml zimnego buforu FACS.
  8. Granulować komórki w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w wirówce z odchylanym wiadrem.
  9. Zdekantować supernatant.
  10. Ponownie zawiesić komórki w 0,4 ml zimnego buforu FACS.
  11. Usuń 10 μL do liczenia komórek w celu sprawdzenia wydajności (spodziewaj się ~5 x 106 komórek/mysz, patrz Rysunek 3A)
  12. Przefiltruj pozostałe komórki przez nasadkę sitka 40 μm do probówki FACS i przystąp do barwienia pod kątem FACS.

3. Barwienie GCBC dla FACS

  1. Dodaj 1 μl bloku Fc (nieznakowany anty-mysz CD16/CD32) do 400 μl zawiesiny komórek i umieść komórki na lodzie na 15 minut.
  2. Dodaj 2 ml zimnego buforu FACS, aby umyć komórki.
    1. Osadzać komórki w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 80 μl zimnego buforu FACS.
  4. Usunąć 10 μl komórek z WT PP dla każdej kontroli barwienia (w sumie 4, w tym 3 kontrolne pojedyncze barwienie i 1 kontrola niebarwiona). Pozostaw 40 μl WT PP na następny krok. Alternatywnie użyj koralików kompensacyjnych do kontroli barwienia.
  5. Każdą z próbek doświadczalnych (np. WT i AID-/-) zabarwić w 500 μl zimnego buforu FACS z 2,5 μl aglutyniny (PNA)-biotyny z orzeszków ziemnych przez 15 minut na lodzie.
  6. Dodaj 2 ml zimnego buforu FACS, aby umyć komórki.
    1. Osadzać komórki w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  7. Każdą próbkę doświadczalną barwić 500 μl koktajlu w ciemności, na lodzie, przez 15 minut (tabela 1). Upewnij się, że komórki są całkowicie ponownie zawieszone w koktajlu barwiącym.
  8. Przygotuj kontrole pojedynczych plam dla matrycy kompensacji.
    1. Wybarwić komórki w 500 μl zimnego buforu FACS, stosując rozcieńczenia określone w tabeli 2.
    2. Inkubować kontrole barwienia w ciemności, na lodzie, przez 15 minut.
  9. Dodać 2 ml zimnego buforu FACS do wszystkich probówek w krokach 3.7 i 3.8, zagnieździć komórki i wyrzucić supernatant w celu zmycia niezwiązanych przeciwciał lub DAPI.
  10. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl zimnego buforu FACS i umieścić na lodzie.
  11. Za pomocą sortera komórek zbierz B220 + PNAHI z każdej barwionej próbki eksperymentalnej. Rysunek 3B pokazuje typowe procenty B220+ PNAHI uzyskane z WT i AID-/- PPs. Rysunek 3C przedstawia strategię bramkowania FACS.

4. Ekstrakcja DNA z GCBC

  1. Sortowane komórki osadzać w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego buforu FACS i przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    1. Osadzać komórki w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu do ekstrakcji DNA i 5 μl 20 mg/ml proteinazy K.
  4. Inkubować w temperaturze 56 °C przez noc.
  5. Wytrącić DNA za pomocą 500 μl izopropanolu i 1 μl 20 mg/ml glikogenu. Dokładnie wymieszaj probówkę, odwracając 5-6 razy.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  7. Wirować w mikrowirówce przez 15 minut w temperaturze 25 °C i przy 21 000 x g.
    1. Odrzucić supernatant i zachować osad, który zawiera wytrącone DNA i glikogen.
  8. Umyj osad DNA 1 ml 70% etanolu.
    1. Osadzać DNA w mikrowirówce przez 10 minut w temperaturze 25 °C przy 21 000 x g.
    2. Usuń 70% etanolu i wysusz na powietrzu osad DNA przez 5-10 min.
      UWAGA: Unikaj nadmiernego wysuszenia, ponieważ DNA może nie nawodnić się całkowicie.
  9. Zawiesić DNA w buforze TE o pojemności 30 μl i inkubować przez noc w temperaturze 56 °C.

5. Wzmocnienie i analiza sekwencji intronów JH4

  1. Określić ilościowo DNA, mierząc absorbancję przy długości fali 260 nm (A260).
    UWAGA: Typowe stężenie DNA odzyskanego z posortowanych B220+PNAHI GCBC myszy C57BL/6 wynosi 20-40 ng/μL.
  2. Wykonać zagnieżdżony PCR dla intronu JH4 (Tabela 3, Tabela 4). Znormalizować całkowitą ilość genomowego DNA użytego w pierwszej reakcji PCR do próbki o najmniejszym stężeniu. (np. jeśli próbka o najmniejszym stężeniu wynosi 5 ng/μl, użyj 58,75 ng DNA dla wszystkich próbek w maksymalnej objętości wody (11,75 μl) w PCR #1).
  3. Rozpuścić produkt PCR na 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 200 V przez 20 minut. Przewidywana wielkość amplikonu to 580 pz.
  4. Wyciąć amplikon z żelu i wyekstrahować DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz rysunek uzupełniający 1).
    1. Eluować DNA za pomocą 30 μl wody i określić ilościowo ilość DNA, mierząc A260.
      UWAGA: Typowe stężenie oczyszczonego produktu PCR wynosi 3-10 ng/μL.
  5. Podwiązać oczyszczony produkt PCR do plazmidu z końcami. Standaryzować całkowitą ilość produktu PCR użytego w każdej reakcji ligacji (Tabela 5).
    1. Reakcję ligacji inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut lub przez noc w temperaturze 16 °C.
  6. Przekształć elektrokompetentne komórki bakteryjne za pomocą 2 μl reakcji ligacji.
    1. Elektroporacja przy napięciu 1,65 kV.
    2. Ratunek w 600 μl pożywki SOC przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 225 obr./min.
    3. Umieścić 100 μl przekształconych bakterii na LB uzupełnionym ampicyliną (100 μg/ml) płytkach agarowych i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  7. Prześlij płytkę z koloniami bakteryjnymi do sekwencjonowania Sangera przy użyciu startera T7 do przodu. Alternatywnie, hoduj przez noc kultury każdej kolonii bakteryjnej i przeprowadź oczyszczanie plazmidu.
    1. W razie potrzeby powtórz PCR, ligację i/lub transformację, aby zoptymalizować wydajność kolonii bakteryjnych
      UWAGA: Z każdej płytki należy wybrać co najmniej 30 kolonii.
  8. Standaryzacja danych sekwencji w plikach .txt
    1. Usuń sekwencję plazmidu.
    2. Upewnij się, że każda sekwencja jest zorientowana od 5' do 3' zgodnie z sekwencją referencyjną intronu JH4 (NG_005838). W razie potrzeby wygeneruj odwrotne uzupełnienie dowolnej sekwencji.
  9. Dopasuj sekwencje uzyskane dla każdego PCR do sekwencji referencyjnej intronu JH4 (NG_005838) za pomocą oprogramowania Clustal Omega (Rysunek 4A).
    1. Zidentyfikuj różnice w stosunku do sekwencji referencyjnej jako mutacje
    2. Sprawdź, czy wszystkie mutacje są prawdziwymi mutacjami punktowymi, badając elektroferogram sekwencjonowania Sangera. W razie potrzeby powtórz sekwencjonowanie. (Rysunek 4B,C).
  10. Tabelaryzuj i określ ilościowo unikalne mutacje w intronie JH4 dla każdego genotypu (Rysunek 5).
    1. Policz sekwencje z identycznymi mutacjami tylko raz
      UWAGA: Nie jest możliwe określenie, czy identyczne sekwencje zostały wygenerowane podczas PCR, czy identyczne zdarzenia SHM w różnych komórkach B.
    2. Policz każde wystąpienie sekwencji intronowych JH4 linii zarodkowej WT (tj. tych bez mutacji) jako unikalną sekwencję.

Wyniki

Cytometria przepływowa
Dojrzałe limfocyty B krążą do centrów rozmnażania, gdzie przechodzą dojrzewanie powinowactwa, ekspansję klonalną oraz różnicowanie w komórki plazmatyczne lub komórki pamięci40,41,42,43,44. Komórki B centrów rozmnażania (GCBC) można zidentyfikować za pomocą licznych markerów powierzchniowych, w tym wysokiej ekspresji receptora CD45R/B220 oraz wiązania aglutyniny z orzeszków ziemnych (PNA)45,46. W celu izolacji aktywowanych GCBC, komórki Peyerów (PP) barwiono przeciwciałami anty-B220 sprzężonymi z fykoerytryną (PE) oraz biotynilowaną PNA, a następnie streptawidyną sprzężoną z APC-eFluor780. Martwe komórki eliminowano za pomocą fluorescencyjnego barwnika 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI), który barwi kwasy nukleinowe umierających lub martwych komórek47,48. Obarwione komórki poddano następnie analizie i sortowaniu za pomocą cytometrii przepływowej. Płatki Peyerów składały się w ~80% z komórek B220+49,50. PP typu WT zawierają średnio 4 x 106 komórek na mysz (Rycyna 3A). Około 8% komórek PP typu WT było B220+PNAHI, co stanowi połowę liczby zaobserwowanych u myszy AID-/ - (Rycyna 3B). Zatem po sortowaniu uzyskano 0,3-0,6 x 106 komórek B220+PNAHI GCBC, co było wystarczające do analizy mutacji w intronie JH4.

Analiza sekwencji JH4
Intron JH4 został amplifikowany za pomocą zagnieżdżonej reakcji PCR z użyciem wspólnych starterów rodziny VHJ558 (J558FR3Fw i VHJ558.2), a następnie starterów obejmujących intron JH4, VHJ558.3 i VHJ558.435,37. Spośród 105 unikalnych sekwencji uzyskanych z GCBC typu WT, zidentyfikowano łącznie 226 mutacji (Rycina 5A). Analiza spektrum mutacji GCBC u myszy WT wykazała szereg przejść i transwersji przy częstotliwości 4 x 10-3 mutacji/bp, obliczonej poprzez podzielenie całkowitej liczby zmutowanych zasad przez całkowitą liczbę zsekwencjonowanych zasad32,36,37,38. Dodatkowo, każdy produkt PCR JH4 z GCBC typu WT zawierał od 1 do 25 mutacji (Rycina 5B), przy czym w jednej sekwencji często stwierdzano wiele mutacji33,36. W 113 sekwencjach AID-/- zidentyfikowano tylko dwie mutacje (Rycina 5A). Limfocyty B AID-/- wykazywały częstotliwość 1,66 x 10-5 mutacji/bp, co było wartością znacznie niższą niż w przypadku limfocytów B typu WT (p <0,05)36 i było porównywalne z częstością błędów polimerazy o wysokiej wierności (5,3 x 10-7 sub/base/doubling)51,52. Zatem limfocyty B AID-/- stanowiły użyteczną kontrolę negatywną w tym badaniu.

figure-results-1
Rycina 1: Schemat locus genu IgH oraz regionów docelowych dla AID podczas CSR i SHM. Czerwony pasek oznacza intron JH4 o długości 580 bp, znajdujący się na 3’ końcu rearanżacji VDJH4, który jest analizowany w niniejszym protokole. W procesie CSR zależna od AID deaminacja intronowych regionów przełączeń (Sμ i Sε) sprzyja powstawaniu DSB, co umożliwia rekombinację delecyjną i ekspresję nowego izotypu przeciwciała (z IgM na IgE). Podczas SHM regiony V (szare pola) kumulują mutacje (niebieskie linie), co może prowadzić do powstania przeciwciał o wyższym powinowactwie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Schemat analizy SHM intronu JH4 w GCBC wyizolowanych z PPs. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Charakterystyka GCBC z PP. (A) Całkowita liczba komórek PP od myszy WT oraz AID-/- (n = 4 na genotyp). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe od średniej. (B) Procent GCBC B220+PNAHI uzyskanych z PP myszy WT oraz AID-/- (n = 4 na genotyp)36. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe od średniej, *p<0.05 przy użyciu testu t Studenta. (C) Reprezentatywne wykresy FACS służące do sortowania GCBC B220+PNAHI z PP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Analiza danych z sekwencjonowania metodą Sangera dla JH4. (A) Przykładowe dopasowania sekwencji z danych sekwencjonowania Sangera produktu PCR JH4 z GCBC typu WT (góra) i AID-/- (dół) do referencyjnej sekwencji genomowej (NG_005838), która znajduje się bezpośrednio pod ponumerowanymi znacznikami. Dopasowania zostały wygenerowane przy użyciu programu Clustal Omega. (B) Elektroferogram wysokiej jakości danych z sekwencjonowania Sangera, wykazujący wyraźne piki dla każdej zasady. (C) Elektroferogram niskiej jakości danych sekwencyjnych, wykazujący niejednoznaczne piki i nieokreślone zasady (N). Nukleotyd zaznaczony na czerwono musi zostać ręcznie adnotowany w pliku tekstowym sekwencji.  Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Analiza mutacji w intronie JH4 w GCBC typu WT i AID-/-. (A) W tabelach zestawiono całkowitą liczbę mutacji przejść (czerwone) i transwersji (niebieskie) w zasadach A, C, G i T dla każdego genotypu. Całkowita liczba analizowanych sekwencji jest wskazana poniżej tabeli. (B) Liczba mutacji na amplikon PCR dla każdego genotypu przedstawiona jest na wykresach kołowych. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Choi i wsp.36 Copyright 2020. The American Association of Immunologists, Inc. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Koktajl barwiący dla GCBCsObjętość: 500 μL
Przeciwciało lub barwnikFluoroforRozcieńczenieμL
B220PE10000.5
StreptavidinaAPC-eFluor7805001
DAPIN/D5001

Tabela 1: Koktajle barwiące dla GCBCs. Do barwienia komórek PP w 500 μL na potrzeby cytometrii przepłyewowej użyto koktajlu wskazanych przeciwciał lub barwnika (oznaczonego kursywą) w określonych rozcieńczeniach.

   

Barwienia pojedyncze do kompensacjiTom: 500 μL
Przeciwciało lub barwnikFluoroforRozcieńczanieμL
B220PE10000.5
B220APC-eFluor780 7500.67
DAPIProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.5001

Tabela 2: Kontrole pojedynczego barwienia do kompensacji. Przeciwciała B220 sprzężone z wskazanymi fluoroforami zostały użyte jako kontrole pojedynczego barwienia w celu kompensacji nakładania się widm.

   

PCR #1
OdczynnikObjętośćWarunki termocyklera
Bufor 5x4 μL195 °C3 min
10 mM dNTP2 μL294 °C30 sec
10 μM J558FR3Fw1 μL355 °C30 sec
10 μM VHJ558.21 μL472 °C1:30 min
Polimeraza DNA o wysokiej wierności (High Fidelity)0,25 μLCykle 2-4 9x
DNAx (standaryzować do próbki o najniższym stężeniu)
H2Odo 20 μL572 °C5 min
Przed przejściem do PCR #2 rozcieńczyć produkt PCR w H2O w stosunku 1:5

Tabela 3: Zagnieżdżona PCR intronu JH4. Składniki PCR i warunki termocyklera dla pierwszej reakcji amplifikacji. Produkt pierwszej PCR należy rozcieńczyć wodą w stosunku 1:5 i wykorzystać 1 μL tego roztworu do drugiej reakcji PCR.

   

PCR nr 2
OdczynnikObjętośćWarunki termocyklera nr 2
Bufor 5x4 μL194 °C3 min
10 mM dNTP2 μL294 °C30 s
10 μM VHJ558.31 μL355 °C30 s
10 μM VHJ558.41 μL472 °C30 s
Polimeraza DNA o wysokiej wierności0.25 μLCykl 2-4 21x
Rozcieńczony PCR#11 μL
H2OProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 20 μL572 °C5 min

Tabela 4: Składniki PCR i warunki termocyklera dla drugiej reakcji PCR.

   

OdczynnikObjętość
Bufor 2x10 μL
Oczyszczony produkt PCRx (standaryzować do próbki o najniższym stężeniu)
Plazmid z tępymi końcami1 μL
T4 DNA ligaza1 μL
H2Odo 20 μL
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min lub przez noc w temperaturze 16°CºC

Tabela 5: Reakcja ligacji. Składniki do ligacji oczyszczonego produktu PCR intronu JH4 do plazmidu.

   

Bufor do FACS
Inaktywuj termicznie FBS w temperaturze 56°C ˚C przez jedną godzinę przed użyciem. Do PBS o pH 7,4 (Gibco, #10010049) dodać 2,5% (v/v) inaktywowanego termicznie FBS. Przechowywać w temperaturze 4˚C.
Bufor do ekstrakcji DNA (100 mM Tris pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5% (w/v) SDS)
Dodać 50 ml 1 M Tris o pH 8,0, 100 ml 0,5 M EDTA oraz 12,5 ml 20% SDS. Dopełnić wodą destylowaną do objętości 500 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Bufor TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA)
Dodać 2,5 ml 1 M Tris pH 8,0 oraz 500 µl 0,5 M EDTA. Dopełnić wodą destylowaną do objętości 250 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

Tabela 6: Składy buforów.

   

Lista oligonukleotydów
J558FR3Fw5’-GCCTGACATCTGAGGACTCTGC-3’
VHJ558.25’-CTGGACTTTCGGTTTGGTG-3’
VHJ558.35’-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3’
VHJ558.45’-TCTCTAGACAGCAACTAC-3’

Tabela 7: Oligonukleotydy użyte w teście.

   

Rycina uzupełniająca 1: Reprezentatywne zdjęcie żelu agarozowego po zakończeniu kroku 5.4. Produkt zagnieżdżonej reakcji PCR intronu JH4 rozdzielono na żelu agarozowym 1,5% i wycięto amplikon o wielkości 580 bp. WT PP oznacza, że jako matryca dla pierwszej reakcji PCR wykorzystano genomiczne DNA WT PP GCBC, a AID PP oznacza, że jako matryca dla pierwszej reakcji PCR wykorzystano genomiczne DNA AID-/- PP GCBC. ɸ oznacza kontrolę PCR bez matrycy, a znak - oznacza, że do dołka żelu agarozowego nic nie nałożono. Ostatnia ścieżka przedstawia drabinkę DNA 100 bp. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Dyskusja

Scharakteryzowanie SHM w sekwencjach kodujących IgH i IgL V heterogenicznej populacji komórek B stanowi wyzwanie, biorąc pod uwagę, że każda komórka B w unikalny sposób reorganizuje segmenty kodujące V podczas rekombinacji V(D)J34. W artykule opisano metodę identyfikacji mutacji w intronie JH4 GCBC. Intron JH4, który znajduje się 3' ostatniego segmentu kodującego J w locus IgH, jest używany jako substytut SHM regionów V (Figura 1)31,33,34,35. Aby skatalogować te mutacje intronów JH4 i ocenić, jak określone geny wpływają na produkcję lub wzorzec mutacji, PP GCBC są specjalnie analizowane. Komórki te akumulują mutacje intronów JH4 w wyniku przewlekłej stymulacji przez mikrobiotę jelitową53. Co więcej, B220 + PNAHI GCBC z PP nieuodpornionych myszy mają widma mutacji, które porównuje się do GCBC śledziony od uodpornionych zwierząt54,55. Jednak mutacje w intronie JH4 nie mogą być skorelowane z dojrzewaniem powinowactwa do Ig, ponieważ mutacje te są niekodujące.

Aby ustalić, czy SHM zmienia powinowactwo do Ig, myszy powinny być immunizowane dootrzewnowo antygenem, takim jak NP (4-hydroksy-3-nitrofenyloacetyl) sprzężony z CGG (gamma globulina kurczaka) lub KLH (hemocyjanina przez dziurkę od klucza)56. Następnie mRNA można oczyścić ze śledziony B220 + PNA HI GCBC w celu zbadania SHM w VH 186.2, eksonie kodującym V, który najczęściej rozpoznaje NP i jest zmutowany po immunizacji NP-CGG lub NP-KLH 31,57,58,59,60. Mutacja tryptofanu-33 do leucyny w VH186.2 została scharakteryzowana w celu zwiększenia powinowactwa do Ig do 10-krotnego59,60 i dlatego jest jednym ze wskaźników, że SHM i selekcja klonalna wygenerowały wysokie powinowactwo Ig. Pomiar miana Ig swoistego dla NP7 i NP20 w surowicy za pomocą testu ELISA i obliczenie stosunku NP7/NP20 specyficznego dla Ig w trakcie immunizacji dokumentuje również dojrzewanie powinowactwa do Ig wynikające z SHM regionów V 17,21,36. Oba te testy można wykorzystać do skorelowania SHM w sekwencjach kodujących VH186.2 ze zmianami w dojrzewaniu powinowactwa Ig specyficznego dla NP.

Niezależnie od tego, czy do analizy SHM VH186.2 lub intronu JH4 wykorzystywane są zwierzęta uodpornione, czy nieuodpornione, GCBC muszą być dokładnie zidentyfikowane. Przedstawiamy podejście oparte na FACS do izolacji B220 + PNAHI GCBC. Alternatywnie, Fas i niesiarczanowy antygen α2-6-sialyl-LacNAc, który jest rozpoznawany przez przeciwciało GL7 61,62,63,64, mogą być również używane do izolacji GCBC, które są identyfikowane jako B220 + Fas + GL7 + 65 lub CD19 + Fas + GL7 + 37. Ekspresja GL7 ściśle odzwierciedla PNA w aktywowanych GCBC węzłów chłonnych 64,65,66. Oprócz stosowania markerów przeciwciał specyficznych dla GCBC, koktajle barwiące powinny maksymalizować wzbudzenie fluoroforu i wykrywanie biomarkera, jednocześnie minimalizując spektralne nakładanie się emisji fluorescencji. Antygeny ulegające ekspresji na niskich poziomach powinny być wykrywane za pomocą przeciwciała, które jest sprzężone z fluoroforem o silnej fluorescencji emisyjnej67. Zalecany protokół barwienia został zoptymalizowany pod kątem analizy na sortowniku komórek wyposażonym w cztery lasery (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) i 12 filtrów; Jednak konfiguracje filtrów i dostępność lasera różnią się w zależności od cytometru. W celu zmiany protokołu w zależności od dostępności odczynników i sprzętu, czytelnik jest odsyłany do dodatkowych zasobów, internetowych przeglądarek widma i opublikowanej literatury 67,68,69,70,71,72,73. Opisany w niniejszym dokumencie protokół barwienia wielobarwnego wymaga kompensacji nakładania się widma, aby zapewnić, że posortowane populacje komórek są GCBC, a nie niedokładnym wykrywaniem emisji fluorescencji. B220 służy jako użyteczna kontrola barwienia dla opisanego FACS (Tabela 1B), ponieważ PP będą miały charakterystyczne populacje ujemne i dodatnie B220 (Figura 3C), co pozwala na odpowiednią kompensację nakładania się widma. Strategię bramkowania przedstawioną na rysunku 3C należy stosować jako wskazówkę. Wykresy cytometrii przepływowej mogą się różnić w zależności od warunków barwienia i ustawień cytometru. Niemniej jednak 4-10% żywych komórek powinno być B220 + PNAHI 35, 52.

Wszystkie mutacje w obrębie intronu JH4 PP GCBC muszą zostać zwalidowane, aby upewnić się, że obserwowane mutacje naprawdę odzwierciedlają SHM, a nie artefakt PCR lub sekwencjonowania. Komórki AID -/- B mogą służyć jako użyteczna kontrola negatywna podczas badania fenotypu SHM w innych zmutowanych modelach myszy, ponieważ komórki te nie mogą ukończyć SHM17,19. Częstość mutacji intronów JH4 w AID-/- GCBC (mutacje 1,66x10-5/bp)20,21,36,37,38,50,74 jest porównywalna z częstością błędów polimerazy o wysokiej wierności (5,3x10-7 sub/zasada/podwojenie)51,52, która jest używana do amplifikacji DNA w zagnieżdżonym PCR. Jeśli myszy z AID-/- nie są dostępne, porównaj obserwowany wzorzec mutacji i częstość z opublikowaną literaturą. Regiony Ig V akumulują 10-3-10-4 mutacje na podział par zasad, co jest około 10 6-krotnie wyższe niż tempo mutacji innych loci genów 73,75. Wyniki mogą się różnić w zależności od wieku zwierzęcia76 lat. Alternatywnie, komórki B220 + PNALO, które oznaczają inne niż GCBC, mogą być używane jako kontrola negatywna pod nieobecność myszy AID / - 52. Jeśli częstość mutacji w WT GCBC jest niższa niż oczekiwano, sekwencja intronowa WT germinu JH4 może być nieproporcjonalnie reprezentowana. W takim przypadku należy upewnić się, że GCBC zostały odpowiednio wybarwione i posortowane, a PCR są wolne od zanieczyszczenia intronami linii zarodkowej WT JH4. Ponadto surowe dane sekwencjonowania w elektroferogramach powinny być dokładnie analizowane, aby upewnić się, że mutacje w danych tekstowych sekwencji nie są artefaktami błędów sekwencjonowania. Na przykład słabe wyniki sekwencjonowania Sangera mogą zmniejszyć wiarygodność danych sekwencji (rysunek 4). Ta kontrola jakości danych sekwencji Sangera zwiększy dokładność i odtwarzalność analizy mutacji intronów JH4.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Tasuku Honjo za myszy AID-/-. Prace te były wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia Mniejszości i Dysproporcji Zdrowotnych (5G12MD007603), Narodowy Instytut Raka (2U54CA132378) oraz Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych (1SC1GM132035-01).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 ml 8-tubowy pasek FLEX-FREE do PCR, dołączone przezroczyste płaskie nakrętki, mieszaneUSA Scientific1402-4708
Sól sodowa ampicylinyFisherBP1760-5
APC-eFluor780 anty-CD45R/B220eBioscience47-0452-80klon RA3-6B2
BD FACSAria IIBD643186cztery lasery (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) i 12 filtrów (PacBlue (450/50),
AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40),
PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60))Końcówka
BD strzykawka 1mLFisher14-823-434sterylna
biotynylowana aglutynina z orzeszków ziemnych (PNA)Myszy Vector LabsB-1075-5
C57BL/6JJackson Laboratories664
Corning Falcon probówka z zatrzaskiem sitka do komórekFisher08-771-23
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)FisherD13060,5 mg / ml
dNTPNEBN0447L10 mM
ElectroMAX DH10B kompetentne ogniwaFisher18-290-015
Sitko do komórek Falcon 40mmFisher08-771-1
Rurki polistyrenowe okrągłodenne Falcon (rurki FACS)Fisher14-959-5
Rurki z polistyrenu okrągłodennego Falcon (z nakrętką)Fisher149591A
Płodowa surowica bydlęcaR& D Systems (Atlanta Biologicals)S11150
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Gibco PBS pH 7,4Fisher10-010-049
GlycogenSigma10901393001
Lasergene Biologia molekularna (MegAlign Pro)DNA Starwersja 15
PE anty-CD45R/B220BD553090klon RA3-6B2
Proteinaza KFisherBP1700-100
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0491L
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQiagen28706
Seal-Rite 1,5 ml mikrowirówkiUSA Scientific1615-5500
Streptawidyna APC-eFluor 780 KoniugateBioscience47-4317-82
Ligaza DNA T4NEBM020L
Zestaw do klonowania Thermo Scientific CloneJET PCRThermoFisherFERK1231
Płytka do hodowli tkankowej 6-dołkowaFisher08-772-1BSterylna
Nieoznakowana anty-mysz CD16/CD32 (blok Fc), BDFisherBDB553142Clone 2.4G2

Bibliografia

  1. Murphy, K., Weaver, C. Janeyway's Immunobiology. , Garland science. (2016).
  2. Alt, F. W., et al. VDJ recombination. Immunology Today. 13 (8), 306-314 (1992).
  3. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V (D) J recombination. Nature Reviews Immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
  4. Oettinger, M. A., Schatz, D. G., Gorka, C., Baltimore, D. RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V (D) J recombination. Science. 248 (4962), 1517-1523 (1990).
  5. Berek, C., Berger, A., Apel, M. Maturation of the immune response in germinal centers. Cell. 67 (6), 1121-1129 (1991).
  6. Linterman, M. A., et al. Foxp3+ follicular regulatory T cells control the germinal center response. Nature Medicine. 17 (8), 975(2011).
  7. Shulman, Z., et al. T follicular helper cell dynamics in germinal centers. Science. 341 (6146), 673-677 (2013).
  8. Good-Jacobson, K. L., et al. PD-1 regulates germinal center B cell survival and the formation and affinity of long-lived plasma cells. Nature Immunology. 11 (6), 535(2010).
  9. Kerfoot, S. M., et al. Germinal center B cell and T follicular helper cell development initiates in the interfollicular zone. Immunity. 34 (6), 947-960 (2011).
  10. Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 541-552 (2004).
  11. Alt, F. W., Zhang, Y., Meng, F. L., Guo, C., Schwer, B. Mechanisms of programmed DNA lesions and genomic instability in the immune system. Cell. 152 (3), 417-429 (2013).
  12. Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nature Reviews Immunology. 12 (7), 517-531 (2012).
  13. Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annual Reviews of Biochemistry. 76, 1-22 (2007).
  14. Peled, J. U., et al. The biochemistry of somatic hypermutation. Annual Review of Immunology. 26, 481-511 (2008).
  15. Liu, M., Schatz, D. G. Balancing AID and DNA repair during somatic hypermutation. Trends in Immunology. 30 (4), 173-181 (2009).
  16. Methot, S., Di Noia, J. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advances in Immunology. 133, 37-87 (2017).
  17. Muramatsu, M., et al. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102 (5), 553-563 (2000).
  18. Petersen-Mahrt, S. K., Harris, R. S., Neuberger, M. S. AID mutates E. coli suggesting a DNA deamination mechanism for antibody diversification. Nature. 418 (6893), 99(2002).
  19. Revy, P., et al. Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the Hyper-IgM syndrome (HIGM2). Cell. 102 (5), 565-575 (2000).
  20. Petersen-Mahrt, S. DNA deamination in immunity. Immunological Reviews. 203 (1), 80-97 (2005).
  21. Rada, C., Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Mismatch recognition and uracil excision provide complementary paths to both Ig switching and the A/T-focused phase of somatic mutation. Molecular Cell. 16 (2), 163-171 (2004).
  22. Rada, C., et al. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Current Biology. 12 (20), 1748-1755 (2002).
  23. Schrader, C. E., Vardo, J., Stavnezer, J. Role for mismatch repair proteins Msh2, Mlh1, and Pms2 in immunoglobulin class switching shown by sequence analysis of recombination junctions. The Journal of Experimental Medicine. 195 (3), 367-373 (2002).
  24. Martin, A., et al. Msh2 ATPase activity is essential for somatic hypermutation at AT basepairs and for efficient class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1171-1178 (2003).
  25. Imai, K., et al. Human uracil-DNA glycosylase deficiency associated with profoundly impaired immunoglobulin class-switch recombination. Nature Immunology. 4 (10), 1023-1028 (2003).
  26. Masani, S., Han, L., Yu, K. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 is the essential nuclease during immunoglobulin class switch recombination. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1468-1473 (2013).
  27. Guikema, J. E., et al. APE1-and APE2-dependent DNA breaks in immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3017-3026 (2007).
  28. Schrader, C. E., Guikema, J. E., Wu, X., Stavnezer, J. The roles of APE1, APE2, DNA polymerase β and mismatch repair in creating S region DNA breaks during antibody class switch. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1517), 645-652 (2009).
  29. Roa, S., et al. MSH2/MSH6 complex promotes error-free repair of AID-induced dU: G mispairs as well as error-prone hypermutation of A: T sites. PLoS One. 5 (6), 11182(2010).
  30. Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase η is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 17-23 (2007).
  31. Maul, R. W., Gearhart, P. J. AID and somatic hypermutation. Advances in Immunology. 105, 159-191 (2010).
  32. Shen, H. M., Tanaka, A., Bozek, G., Nicolae, D., Storb, U. Somatic hypermutation and class switch recombination in Msh6-/- Ung-/- double-knockout mice. The Journal of Immunology. 177 (8), 5386-5392 (2006).
  33. Cheng, H. L., et al. Integrity of the AID serine-38 phosphorylation site is critical for class switch recombination and somatic hypermutation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (8), 2717-2722 (2009).
  34. Lebecque, S. G., Gearhart, P. J. Boundaries of somatic mutation in rearranged immunoglobulin genes: 5'boundary is near the promoter, and 3'boundary is approximately 1 kb from V (D) J gene. The Journal of Experimental Medicine. 172 (6), 1717-1727 (1990).
  35. Jolly, C. J., Klix, N., Neuberger, M. S. Rapid methods for the analysis of immunoglobulin gene hypermutation: application to transgenic and gene targeted mice. Nucleic Acids Research. 25 (10), 1913-1919 (1997).
  36. Choi, J. E., Matthews, A. J., Michel, G., Vuong, B. Q. AID Phosphorylation Regulates Mismatch Repair-Dependent Class Switch Recombination and Affinity Maturation. The Journal of Immunology. 204 (1), 13-22 (2020).
  37. McBride, K. M., et al. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. The Journal of Experimental Medicine. 205 (11), 2585-2594 (2008).
  38. Liu, M., et al. Two levels of protection for the B cell genome during somatic hypermutation. Nature. 451 (7180), 841-845 (2008).
  39. Ross, M., Birbeck, M., Wills, V., Forrester, J., Davis, A. Peanut lectin binding properties of germinal centers of mouse lymphoid tissues. Nature. 284, 364-366 (1980).
  40. Zhang, J., MacLennan, I. C., Liu, Y. J., Lane, P. J. Is rapid proliferation in B centroblasts linked to somatic mutation in memory B cell clones. Immunology Letters. 18 (4), 297-299 (1988).
  41. Nieuwenhuis, P., Opstelten, D. Functional anatomy of germinal centers. American Journal of Anatomy. 170 (3), 421-435 (1984).
  42. Lau, A. W., Brink, R. Selection in the germinal center. Current Opinion in Immunology. 63, 29-34 (2020).
  43. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  44. Mesin, L., Ersching, J., Victora, G. D. Germinal center B cell dynamics. Immunity. 45 (3), 471-482 (2016).
  45. Reichert, R. A., Gallatin, W. M., Weissman, I. L., Butcher, E. C. Germinal center B cells lack homing receptors necessary for normal lymphocyte recirculation. The Journal of Experimental Medicine. 157 (3), 813-827 (1983).
  46. Rose, M., Birbeck, M., Wills, V., Forrester, J., Davis, A. Peanut lectin binding properties of germinal centers of mouse lymphoid tissues. Nature. 284, 364-366 (1980).
  47. Hamada, S., Fujita, S. DAPI staining improved for quantitative cytofluorometry. Histochemistry. 79 (2), 219-226 (1983).
  48. Otto, F. DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  49. Butcher, E., et al. Surface phenotype of Peyer's patch germinal center cells: implications for the role of germinal centers in B cell differentiation. The Journal of Immunology. 129 (6), 2698-2707 (1982).
  50. Rogerson, B. J., Harris, D. P., Swain, S. L., Burgess, D. O. Germinal center B cells in Peyer's patches of aged mice exhibit a normal activation phenotype and highly mutated IgM genes. Mechanisms of Ageing and Development. 124 (2), 155-165 (2003).
  51. Potapov, V., Ong, J. L. Examining sources of error in PCR by single-molecule sequencing. PloS One. 12 (1), 0169774(2017).
  52. Gonzalez-Fernandez, A., Milstein, C. Analysis of somatic hypermutation in mouse Peyer's patches using immunoglobulin kappa light-chain transgenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (21), 9862-9866 (1993).
  53. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer's patches: organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  54. Betz, A. G., Rada, C., Pannell, R., Milstein, C., Neuberger, M. S. Passenger transgenes reveal intrinsic specificity of the antibody hypermutation mechanism: clustering, polarity, and specific hot spots. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (6), 2385-2388 (1993).
  55. Rada, C., Gupta, S. K., Gherardi, E., Milstein, C. Mutation and selection during the secondary response to 2-phenyloxazolone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (13), 5508-5512 (1991).
  56. Heise, N., Klein, U. Somatic Hypermutation and Affinity Maturation Analysis Using the 4-Hydroxy-3-Nitrophenyl-Acetyl (NP) System. Methods in Molecular Biology. 1623, 191-208 (2017).
  57. Smith, F., Cumano, A., Licht, A., Pecht, I., Rajewsky, K. Low affinity of kappa chain bearing (4-hydroxy-3-nitrophenyl) acetyl (NP)-specific antibodies in the primary antibody repertoire of C57BL/6 mice may explain lambda chain dominance in primary anti-NP responses. Molecular Immunology. 22 (10), 1209-1216 (1985).
  58. Takahashi, Y., Dutta, P. R., Cerasoli, D. M., Kelsoe, G. In situ studies of the primary immune response to (4-hydroxy-3-nitrophenyl) acetyl. V. Affinity maturation develops in two stages of clonal selection. The Journal of Experimental Medicine. 187 (6), 885-895 (1998).
  59. Allen, D., Simon, T., Sablitzky, F., Rajewsky, K., Cumano, A. Antibody engineering for the analysis of affinity maturation of an anti-hapten response. The EMBO Journal. 7 (7), 1995-2001 (1988).
  60. Cumano, A., Rajewsky, K. Clonal recruitment and somatic mutation in the generation of immunological memory to the hapten NP. The EMBO Journal. 5 (10), 2459-2468 (1986).
  61. Smith, K., Nossal, G., Tarlinton, D. M. FAS is highly expressed in the germinal center but is not required for regulation of the B-cell response to antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (25), 11628-11632 (1995).
  62. Hao, Z., et al. Fas receptor expression in germinal-center B cells is essential for T and B lymphocyte homeostasis. Immunity. 29 (4), 615-627 (2008).
  63. Cervenak, L., Magyar, A., Boja, R., László, G. Differential expression of GL7 activation antigen on bone marrow B cell subpopulations and peripheral B cells. Immunology Letters. 78 (2), 89-96 (2001).
  64. Naito, Y., et al. Germinal center marker GL7 probes activation-dependent repression of N-glycolylneuraminic acid, a sialic acid species involved in the negative modulation of B-cell activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  65. Olson, W. J., et al. Orphan Nuclear Receptor NR2F6 Suppresses T Follicular Helper Cell Accumulation through Regulation of IL-21. Cell Reports. 28 (11), 2878-2891 (2019).
  66. Dorsett, Y., et al. MicroRNA-155 suppresses activation-induced cytidine deaminase-mediated Myc-Igh translocation. Immunity. 28 (5), 630-638 (2008).
  67. Goetz, C., Hammerbeck, C., Bonnevier, J. Flow Cytometry Basics for the Non-Expert. , Springer. (2018).
  68. Hawley, T. S., Herbert, D. J., Eaker, S. S., Hawley, R. G. Flow Cytometry Protocols. , Springer. (2004).
  69. Costa, E., et al. A new automated flow cytometry data analysis approach for the diagnostic screening of neoplastic B-cell disorders in peripheral blood samples with absolute lymphocytosis. Leukemia. 20 (7), 1221-1230 (2006).
  70. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
  71. McKinnon, K. M. Multiparameter Conventional Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. , 139-150 (2018).
  72. Lucchesi, S., et al. Computational Analysis of Multiparametric Flow Cytometric Data to Dissect B Cell Subsets in Vaccine Studies. Cytometry Part A. 97, 259-267 (2019).
  73. Longerich, S., Tanaka, A., Bozek, G., Nicolae, D., Storb, U. The very 5' end and the constant region of Ig genes are spared from somatic mutation because AID does not access these regions. The Journal of Experimental Medicine. 202 (10), 1443-1454 (2005).
  74. Retter, I., et al. Sequence and characterization of the Ig heavy chain constant and partial variable region of the mouse strain 129S1. The Journal of Immunology. 179 (4), 2419-2427 (2007).
  75. Shen, H. M., Peters, A., Baron, B., Zhu, X., Storb, U. Mutation of BCL-6 gene in normal B cells by the process of somatic hypermutation of Ig genes. Science. 280 (5370), 1750-1752 (1998).
  76. Richter, K., et al. Altered pattern of immunoglobulin hypermutation in mice deficient in Slip-GC protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (38), 31856-31865 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

sortowanie kom rek aktywowane fluorescencjreakcja a cuchowa polimerazysekwencjonowanie metod Sangeraekstrakcja DNAreceptor B220aglutynina fistaszkowa
Analiza hipermutacji somatycznej w intronie JH4 komórek B centrum rozrodczego z mysich plastrów Peyera
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.