Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test degranulacji komórek tucznych ex vivo przy użyciu surowych komórek wysięku otrzewnowego i naturalnej stymulacji antygenowej

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61556

⸱

27 kwietnia 2021

 ,  , 
1College of Pharmacy, Chungnam National University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ustaliliśmy test degranulacji komórek tucznych ex vivo, przeprowadzany przez inkubację prymitywnych komórek wysięku otrzewnowego wyizolowanych od myszy, potraktowanych środkiem farmakologicznym będącym przedmiotem zainteresowania i wcześniej podanych anty-dinitrofenolu (DNP) IgE, z DNP na białku nośnikowym.

Streszczenie

Stabilizatory komórek tucznych są niezbędnym elementem leków przeciwalergicznych. Pasywna anafilaksja układowa (PSA) to test na zwierzętach szeroko stosowany do badania wpływu czynnika farmakologicznego będącego przedmiotem zainteresowania na komórki tuczne in vivo. Ponieważ objawy anafilaktyczne przypisuje się przede wszystkim egzocytozie ziarnistości komórek tucznych, uważa się, że czynnik powodujący złagodzenie objawów ma działanie stabilizujące komórki tuczne. Pomimo tego faktu, rozsądne jest potwierdzenie aktywności poprzez bezpośrednie wykazanie spadku aktywności funkcjonalnej komórek tucznych po ich leczeniu. W tym celu rutynowo stosuje się testy degranulacji in vitro z wykorzystaniem unieśmiertelnionej linii komórek tucznych lub hodowanych pierwotnych komórek tucznych. Wyniki testów in vitro i in vivo nie zawsze muszą być do siebie podobne; jednakże, ponieważ warunki leczenia (np. dawka poddana zabiegowi, czas, środowisko otoczenia) w przypadku testów in vitro często różnią się od warunków stosowanych w testach in vivo, takich jak PSA. W dążeniu do przeprowadzenia testu in vitro (lub ex vivo), aby dokładniej odzwierciedlić wpływ środka farmakologicznego na komórki tuczne in vivo, opracowaliśmy test degranulacji komórek tucznych ex vivo, w którym surowe komórki wysiękowe otrzewnej (PEC) wyizolowane od myszy, traktowane środkiem i podawane anty-dinitrofenol (DNP) IgE, inkubowano bezpośrednio z DNP na białku nośnikowym. Okazało się, że test był nie tylko przydatny w walidacji aktywności stabilizującej komórki tuczne środka farmakologicznego wskazanego w teście in vivo, ale także praktyczny i wysoce powtarzalny.

Wprowadzenie

Komórki tuczne odgrywają kluczową rolę w alergii1,2. Kiedy IgE zlokalizowane na powierzchni komórek tucznych poprzez interakcję z receptorem o wysokim powinowactwie do IgE (FcεRI) napotyka pokrewny alergen, wywoływana jest kaskada sygnalizacyjna, która przyspiesza uwalnianie granulek. W rezultacie uwalniane są różne cząsteczki efektorowe alergii, w tym monoaminy (np. histamina, serotonina), cytokiny (np. TNF-α) i enzymy proteolityczne (np. tryptaza, chymaza), które wywołują szereg reakcji immunologicznych, neurologicznych i naczyniomięśniowych3,4.

Klasa farmaceutyków nazywana jest stabilizatorem komórek tucznych, który łagodzi objawy alergii poprzez osłabienie funkcji komórek tucznych5. Pasywna anafilaksja układowa (PSA) to model zwierzęcy często używany do badania stabilizującej aktywność komórek tucznych środków farmakologicznych. Ponieważ objawy anafilaktyczne wynikają przede wszystkim z aktywacji komórek tucznych po interakcji biernie przenoszonej IgE specyficznej dla haptenu z haptenem z haptenem na białku nośnikowym wstrzykniętym później zwierzęciu, dobrze przyjmuje się, że środek farmakologiczny będący przedmiotem zainteresowania wykazuje działanie stabilizujące komórki tuczne, gdy jego leczenie powoduje złagodzenie objawów6. Mimo to często konieczne jest bezpośrednie wykazanie upośledzenia funkcji komórek tucznych przez czynnik w oddzielnym eksperymencie, aby wykluczyć możliwość, że poprawa objawów wynika z mechanizmu innego niż supresja funkcji komórek tucznych.

Test degranulacji komórek tucznych, który jest przeprowadzany przez stymulację komórek tucznych za pomocą odczynnika chemicznego lub specyficznego antygenu IgE tworzącego kompleks z FcεRI na powierzchni komórek tucznych w celu wywołania egzocytozy granulek wydzielniczych (tj. degranulacji), jest zwykle używany do określania aktywności stabilizującej komórki tuczne odczynnika farmakologicznego in vitro7. W tym teście stosuje się kilka typów komórek, w tym linię komórek szczurzej białaczki zasadochłonnej (RBL)8, komórki tuczne pochodzące ze szpiku kostnego (BMMC)9 oraz komórki tuczne pochodzące z komórek otrzewnej (PCMC)10. Chociaż jest to przydatne, ponieważ można łatwo uzyskać dużą liczbę komórek, RBL jest nieśmiertelną linią komórek rakowych, której właściwości komórkowe nie są już podobne do właściwości komórek tucznych w organizmie. Uzyskanie wystarczającej liczby BMMC lub PCMC, mimo że ich właściwości komórkowe mogą bardziej przypominać właściwości komórek tucznych w organizmie, jest często kosztowne i czasochłonne.

Test degranulacji z użyciem oczyszczonych pierwotnych komórek tucznych jest pożądaną alternatywą11. Niemniej jednak zastosowanie takiego testu nie jest rozpowszechnione jako łatwa metoda oczyszczania komórek tucznych z tkanki zwierzęcej, w szczególności z tkanki myszy, z wysoką wydajnością, a czystość nie jest jeszcze dostępna. Ponadto, ponieważ stężenie i czas trwania leczenia środkiem farmakologicznym hamującym funkcję komórek tucznych in vitro mogą nie zawsze pokrywać się z tymi in vivo, wyniki uzyskane za pomocą testu degranulacji in vitro mogą fałszywie przedstawiać wyniki testu in vivo, takiego jak PSA, i odwrotnie. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na nowatorski test degranulacji, nie tylko ściśle naśladujący sposób aktywacji komórek tucznych zachodzący in vivo, ale także dokładnie odzwierciedlający działanie odczynnika farmakologicznego wywieranego na komórki tuczne in vivo. Aby sprostać tym potrzebom, opracowaliśmy test degranulacji komórek tucznych ex vivo, w którym komórki tuczne w komórkach wysięku otrzewnowego (PEC) wyizolowane od myszy, leczone interesującym czynnikiem farmakologicznym i wcześniej podawane IgE specyficzne dla dinitrofenolu (DNP), są stymulowane albuminą surowicy bydlęcej (BSA) sprzężoną z DNP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dostarczonymi przez IACUC (Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt) Narodowego Uniwersytetu Chungnam (Numer Protokołu dla Zwierząt: CNU-00996).

1. Kwantyfikacja cząsteczek specyficznych dla komórek tucznych w lizacie surowych PEC

  1. Wyizoluj komórki z jamy otrzewnowej myszy 12.
    1. Znieczulić mysz (8 tygodni, samiec, BALB/C) izofluranem. Eutanazja przez zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Umieść mysz na bloku piankowym. Przetrzyj brzuch 70% etanolem.
    3. Przetnij brzuszną skórę wzdłużnie nożyczkami o krawędziach. Zdejmij skórę myszy za pomocą kleszczy i nożyczek.
    4. Wstrzyknąć 6 ml lodowatego buforu B firmy Tyrode's B13 do jamy otrzewnej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 26 G. Delikatnie wprowadzić igłę, aby uniknąć ukłucia jakichkolwiek narządów.
    5. Masuj brzuch myszy przez 60-90 sekund, aby zebrać komórki otrzewnej do buforu B Tyrode'a. Rób to delikatnie, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych.
    6. Wprowadzić igłę (20 g) dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml pod kątem do góry. Powoli odsysaj płyn z jamy otrzewnej (zwykle 5-6 ml).
    7. Wyjąć igłę ze strzykawki. Dozuj płyn otrzewnowy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Trzymaj probówkę na lodzie.
    8. Powtórz kroki 1.1.4 - 1.1.7.
    9. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 10 °C. Zawiesić komórki w 1 ml 1x buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC). Trzymaj komórki na lodzie przez 3 minuty.
    10. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową w 2 ml buforu B Tyrode'a. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 10 °C.
    11. Usunąć supernatant. Zawieś komórki w 0,5 ml buforu A Tyrode'a A class=13.
    12. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Dostosuj numer komórki do 5 x 106/ml za pomocą bufora A Tyrode'a.
  2. Przygotuj PEC zubożone w komórki tuczne za pomocą magnetycznego systemu oczyszczania komórek14.
    1. Odwirować 5 x 105 surowych PEC przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 10 °C. Zawiesić osad w 200 μl buforu do oczyszczania komórek PBSBE (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7,4).
    2. Dodaj 1 μl blokera Fc (0,5 mg/ml) do komórek, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciała monoklonalnego anty-c-kit (mAb), które ma być dodane w następnej kolejności. Trzymaj komórki na lodzie przez 5 minut.
    3. Dodać 1 μl biotynylowanego przeciw myszom c-kit mAb15 (0,5 mg/ml). Trzymaj komórki na lodzie przez 10 minut.
    4. Dodać 2 ml buforu PBSBE. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 10 °C.
    5. Usunąć supernatant. Ponownie przemyć komórki 2 ml buforu PBSBE.
    6. Ponownie zawiesić komórki w 90 μl buforu PBSBE. Dodać 10 μl mikrogranulek sprzężonych ze streptawidyną. Trzymaj komórki na lodzie przez 15 minut.
    7. Dodać 2 ml buforu PBSBE. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 10 °C.
    8. Załadować 500 μl buforu PBSBE na średnią kolumnę magnetyczną podczas wirowania. Pozwól buforowi przepływnąć przez kolumnę.
    9. Usunąć supernatant po odwirowaniu. Zawiesić komórki w 500 μl buforu PBSBE.
    10. Załaduj komórki w kolumnie. Zbierz komórki swobodnie przechodzące przez kolumnę.
    11. Przemyć kolumnę 500 μl buforu PBSBE. Ponownie zbierz komórki przechodzące przez kolumnę.
    12. Powtórz krok 1.2.11.
    13. Połącz komórki z kroków 1.2.9-1.2.11 w jednej probówce. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 10 °C.
    14. Ponownie zawieś komórki w buforze A Tyrode'a. Policz komórki. Dostosuj liczbę komórek do 5 x 106 komórek/ml.
  3. Przygotować lizat PEC.
    1. Płytki PEC (np. 5 x 105) odpowiednio w okrągłodennej płytce 96-dołkowej. Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 10 °C w celu zebrania komórek. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
    2. Dodać 100 μl buforu do lizy komórek do osadu komórkowego. Zawiesić komórki, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Trzymaj talerz na lodzie przez 60 minut.
    3. Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 10 °C w celu usunięcia resztek komórek. Przenieść supernatant (lizat komórkowy) na nową płytkę 96-dołkową.
  4. Zmierz aktywność enzymatyczną β-heksozaminidazy16.
    1. Dodać lizat komórkowy (50 μl) do wstępnie podgrzanego roztworu substratu β-heksozaminidazy (50 μl) na 96-dołkowej mikropłytce. Wymieszaj je delikatnie pipetą.
    2. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Po 30 minutach dodać 50 μl roztworu zatrzymującego (100 mM glicyny, pH 10,7), aby zakończyć reakcję enzymatyczną.
    3. Odczytać średnicę zewnętrzną mieszanin reakcyjnych za pomocą czytnika mikropłytek absorbancji w zakresie promieniowania UV w ustawieniu podwójnej długości fali; odpowiednio 405 nm dla określenia poziomu reakcji enzymatycznej i 620 nm dla automatycznego odejmowania tła.
  5. Zmierz stężenie histaminy17.
    1. Przenieść 100 μl oczyszczonych lizatów komórkowych na płytkę pokrytą przeciwciałami monoklonologicznymi przeciwhistaminowymi dostarczonymi z zestawem ELISA z mutacją histaminy. Wykonaj konkurencyjny test ELISA histaminy zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Odczyt średnicy zewnętrznej próbek za pomocą czytnika mikropłytek absorbancji w promieniowaniu UV o długości fali 450 nm.
  6. Określ stosunek komórek tucznych w PEC za pomocą cytometrii przepływowej18.
    1. Przenieść 1 x 105 surowych lub zubożonych w komórki tuczne PEC na okrągłodenną płytkę 96-dołkową. Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 10 °C.
    2. Ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu FACS. Dodać 1 μl anty-mysiego c-kit (0,5 mg/ml) i anty-mysie przeciwciała IgE (0,5 mg/ml).
    3. Krótko zawiruj komórki. Trzymaj komórki na lodzie przez 20 minut w ciemności.
    4. Napełnij studzienki 150 μl buforu FACS. Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 10 °C. Wyrzucić bufor, szybko obracając płytkę.
    5. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 150 μl buforu FACS zawierającego jodek propidyny (1 μg/ml). Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.

2. Test degranulacji komórek tucznych przy użyciu surowych PEC

  1. Określ zakres degranulacji komórek tucznych (degranulacja %).
    1. Wstrzyknij dożylnie 3 myszom BALB/C (8 tygodni, samiec) (dożylnie) 3 μg mAb anty-DNP (mysich IgE). Wyizolować PEC jeden dzień po wstrzyknięciu Ab (patrz krok 1.1).
    2. Umieścić 90 μl surowych PEC (5,5 x 106/ml) w płaskodennej płytce 96-dołkowej (łącznie 4 dołki). Inkubować płytkę w inkubatorze z nawilżonym CO2 o temperaturze 37 o temperaturze 37 o C przez 30 minut.
    3. Dodaj 10 μl DNP-BSA (5 ng / ml w 1x PBS) do studzienek zawierających PEC. Inkubować płytkę przez 10 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °CCO 2 .
    4. Odwirować płytkę o sile 300 g przez 5 minut w temperaturze 10 °C natychmiast po inkubacji. Pobrać supernatanty (100 μl) ostrożnie za pomocą pipety. Zachowaj je w nowej okrągłodennej 96-dołkowej płytce na lodzie.
    5. Dodać 100 μl buforu do lizy komórek (0,1% Triton X-100 w 1 x PBS, pH 7,4) do studzienek mikropłytek zawierających PEC. Trzymaj talerz na lodzie przez 60 minut.
    6. Przeprowadzić test β-heksozaminidazy.
      1. Pobrać odpowiednio dwa zestawy supernatantów i odpowiadających im lizatów komórkowych z czterech, które były przechowywane w lodzie po oznaczeniu degranulacji (patrz kroki 2.1.4 i 2.1.5). Podzielić supernatant i lizat komórkowy na dwie oddzielne studzienki (po 50 μl każda) w celu powtórzenia testu.
      2. Do każdej studzienki dodać 50 μl roztworu substratu β-heksozaminidazy. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego (100 mM glicyny, pH 10,7) do mieszaniny reakcyjnej.
      3. Odczytać średnicę zewnętrzną mieszanin reakcyjnych (patrz krok 1.4.3). Oblicz zakres degranulacji komórek tucznych w następujący sposób.
        % Degranulacji =supernatant OD /(supernatant OD +lizat OD) X 100%
    7. Przeprowadzić test histaminowy.
      1. Dodać 100 μl 1x PBS do kolejnych dwóch dołków supernatantów i odpowiednich lizatów komórkowych zapisanych po degranulacji, aby doprowadzić całkowitą objętość próbek do 200 μl. Podzielić każdą próbkę na dwie oddzielne studzienki na płytce ELISA z histaminą dostarczonej z zestawem ELISA z histaminą.
      2. Wykonaj test ELISA zgodnie z instrukcją producenta. Odczyt średnicy zewnętrznej próbek za pomocą czytnika mikropłytek absorbancji w promieniowaniu UV o długości fali 450 nm. Obliczyć zakres degranulacji jak w 2.1.6.3.
        % Degranulacja = [histamina]sup /([histamina]sup + [histamina]lizat) X 100%
  2. Oceń wpływ leków przeciwalergicznych na komórki tuczne wywierane in vivo za pomocą testu degranulacji komórek tucznych ex vivo.
    1. Podawać doustnie (p.o.) 200 μl deksametazonu19 (DEX) i ketotifen20 (KET), odpowiednio, myszom (6 tygodni, samiec) raz dziennie przez 3 dni (6 myszy/grupę).
    2. Wstrzyknąć myszom dożylnie (dożylnie) 3 μg anty-DNP IgE po 3. zabiegu. Podziel każdą grupę myszy na dwie oddzielne klatki (3 myszy / klatkę); jeden do testu PSA, a drugi do testu degranulacji komórek tucznych ex vivo.
    3. Przeprowadzić test PSA
      1. Wstrzyknąć myszom DNP-BSA (80 μg) dzień po wstrzyknięciu anty-DNP IgE. Mierzyć temperaturę ciała termometrem doodbytniczym co 15 minut przez 1 godzinę, zaczynając natychmiast po wstrzyknięciu DNP-BSA.
      2. Krew należy pobrać dzień po wstrzyknięciu DNP-BSA. Zmierz poziom MCPT-1 w surowicy za pomocą testu ELISA.
    4. Przeprowadzić test degranulacji komórek tucznych ex vivo.
      1. Wyizoluj PEC od myszy jeden dzień po wstrzyknięciu anty-DNP IgE. Policz liczbę izolowanych PEC.
      2. Umieść 90 μl surowych PEC (5,5 x 106/mL) na płytce 96-dołkowej (4 dołki na mysz). Inkubować płytki w inkubatorze z nawilżonym roztworem CO2 w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
      3. Dodać 10 μl DNP-BSA (5 ng/ml). Inkubować płytkę przez 10 minut w nawilżonym inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C.
      4. Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 10 °C. Supernatanty (100 μl) należy pobrać ostrożnie, pozostawiając komórki w studzienkach.
      5. Dodać 100 μl buforu do lizy komórek do studzienek. Inkubować płytkę na lodzie przez 60 minut.
      6. Przeprowadzić test β-heksozoaminidazy i test ELISA histaminy zgodnie z opisem w ppkt 2.1.6 i 2.1.7. Oblicz % degranulacji jak w kroku 2.1.6.3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyznaczenie optymalnej liczby PEC w teście degranulacji komórek tucznych ex vivo

Komórki tuczne (komórki podwójnie dodatnie c-kit+·IgE+)15 stanowią jedynie około 2% PEC (Rycina 1A). Aby oszacować maksymalne poziomy specyficznych dla komórek tucznych cząsteczek, które można wykryć w supernatantach hodowlanych, przy założeniu, że 10% ziarnistości zostało uwolnionych przez komórki tuczne w PEC, zmierzono ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Odkrycie, że test degranulacji komórek tucznych można przeprowadzić przy użyciu stosunkowo niewielkiej liczby surowych mysich PEC, jest znaczące. Mimo że PEC muszą być doskonałym źródłem pierwotnych mysich komórek tucznych, oczyszczanie komórek tucznych w PEC jest wymagające. Chociaż pożywka o gradiencie gęstości, taka jak Percoll25 , była z powodzeniem stosowana do oczyszczania komórek tucznych z PEC szczurów, jej zastosowanie do oczyszczania mysich komórek tucznych otrzewnowej było ograniczone, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Panu Wonhee Lee i Pani Eunjoo Lee za ich pomoc techniczną i administracyjną. Dziękujemy również dr Thi Minh Nguyet Nguyen za jej przemyślane komentarze. Prace te były wspierane przez granty badawcze z Chungnam National University (CNU Research Grant 2017-2098-01) oraz z National Research Foundation of Korea (NRF-2019R1F1A1061894 i NRF-2019M3A9G4067293).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka1757589701
mikroprobówka 1,5 mlHisolMT-15003
Strzykawka1757593161
15 ml rurka stożkowaThermo Fisher scientific14-959-53A
20xPBSTech & InnowacjaBPB-9121-500mL
4-nitrofenylo-N-acetylo-β-D-glukozaminidSIGMAN9376
5 ml probówka okrągłodenna z polistyrenuNauki przyrodnicze352003
50 mlThermo Fisher scientific14-959-49A
Aluminium FiolBioFactTS1-3330
Anti-mouse CD117(c-kit)Biolegend135129utrzymać na poziomie 2-8 stopni; C
Anty-mysie IgE mAbsThermo Fisher scientific11-5992-81przechowywać w temperaturze 2-8° C
Antiti-DNP-IgESIGMAD8406-.2MGutrzymywać na poziomie -20°
C WirówkaHANIL396150
D-(+)-gluouseSIGMAG8270
DeksametazonSIGMAD2915-100MG
DNP-BSAInvitrogen2079360utrzymywać w temperaturze -20° C
EDTABiofactPB131-500
Surowica bydlęcaThermo Fisher 11455035
ŻelatynaSIGMAG1890
GlicynaJUNSEI27185-0350
hemocytometrZEISS176045
HEPESThermo Fisher 15630130
Zestaw ELISA z histaminąAbcamGK3275957-4utrzymuj w temperaturze 2-8° C
Mieszadło z płytą grzejnąLab teachzso-9001
IsofluranceTroikaaI29159
sól fumaranu ketotifenuSIGMAK2628
MCPT-1 Zestaw ELISAThermo Fisher scientific88-7503-22utrzymuj w 2-8° C
Mouse Fc blockBD Biosciences553141utrzymać na poziomie 2-8° C
Jodiole propidżowySIGMA81845przechowywać w temperaturze 2-8°
C Bufor do lizy RBCBiolegend420301
Okrągłodenny 96-dołkowySPL-nauki przyrodnicze30096
Jednorazowy filtr strzykawkowyStartoriusag16555
Mikrogranulki streptawidynyMilteryiBiotec130-048-101przechowywać w temperaturze 2-8° C
Triton X-100JUNSEIchemical49415-1601
TWEEN 20SIGMA9005-64-5
Łaźnia wodnaCHANGSHINSCIENCE190107
1 ml 10 ml płodu naukowanaukowy

Bibliografia

  1. Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
  2. Holgate, S., et al. The anti-inflammatory effects of omalizumab confirm the central role of IgE in allergic inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 115 (3), 459-465 (2005).
  3. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693(2012).
  4. Roth, K., Chen, W. M., Lin, T. J. Positive and negative regulatory mechanisms in high-affinity IgE receptor-mediated mast cell activation. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 56 (6), 385-399 (2008).
  5. Finn, D., Walsh, J. Twenty-first century mast cell stabilizers. British Journal of Pharmacology. 170 (1), 23-37 (2013).
  6. Lu, Y., et al. Emodin, a naturally occurring anthraquinone derivative, suppresses IgE-mediated anaphylactic reaction and mast cell activation. Biochemical Pharmacology. 82 (11), 1700-1708 (2011).
  7. Demo, S., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 36 (4), 340-348 (1999).
  8. Passante, E., Ehrhardt, C., Sheridan, H., Frankish, N. RBL-2H3 cells are an imprecise model for mast cell mediator release. Inflammation Research. 58 (9), 611-618 (2009).
  9. Fukuishi, N., et al. Does β-hexosaminidase function only as a degranulation indicator in mast cells? The primary role of β-hexosaminidase in mast cell granules. The Journal of Immunology. 193 (4), 1886-1894 (2014).
  10. Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. The Journal of Immunology. 178 (10), 6465-6475 (2007).
  11. Arock, M., Le Nours, A., Malbec, O., Daëron, M. Innate Immunity. , Springer. 241-254 (2008).
  12. Befus, A., Pearce, F., Gauldie, J., Horsewood, P., Bienenstock, J. Mucosal mast cells. I. Isolation and functional characteristics of rat intestinal mast cells. The Journal of Immunology. 128 (6), 2475-2480 (1982).
  13. Yoon, S. C., et al. Anti-allergic and anti-inflammatory effects of aqueous extract of Pogostemon cablin. International Journal of Molecular Medicien. 37 (1), 217-224 (2016).
  14. Mierke, C. T., et al. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. Journal of Experimental Medicien. 192 (6), 801-812 (2000).
  15. Hermes, B., et al. Altered expression of mast cell chymase and tryptase and of c-Kit in human cutaneous scar tissue. Journal of Investigative Dermatology. 114 (1), 51-55 (2000).
  16. Wendeler, M., Sandhoff, K. J. Hexosaminidase assays. Glycoconjugate Journal. 26 (8), 945-952 (2009).
  17. Russell, M., et al. Learned histamine release. Science. 225 (4663), 733-734 (1984).
  18. Darzynkiewicz, Z., et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).
  19. Kitamura, Y., et al. Dexamethasone suppresses histamine synthesis by repressing both transcription and activity of HDC in allergic rats. Allergology International. 55 (3), 279-286 (2006).
  20. Grant, S. M., Goa, K. L., Fitton, A., Sorkin, E. M. Ketotifen. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in asthma and allergic disorder. Drugs. 40 (3), 412-448 (1990).
  21. Cook, E., Stahl, J., Barney, N., Graziano, F. Mechanisms of antihistamines and mast cell stabilizers in ocular allergic inflammation. Current Drug Targets-Inflammation & Allergy. 1 (2), 167-180 (2002).
  22. Schoch, C. In vitro inhibition of human conjunctival mast-cell degranulation by ketotifen. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 75-81 (2003).
  23. Franchimont, D., et al. Inhibition of Th1 immune response by glucocorticoids: dexamethasone selectively inhibits IL-12-induced Stat4 phosphorylation in T lymphocytes. The Journal of Immunology. 164 (4), 1768-1774 (2000).
  24. Simmons, C. P., et al. The clinical benefit of adjunctive dexamethasone in tuberculous meningitis is not associated with measurable attenuation of peripheral or local immune responses. The Journal of Immunology. 175 (1), 579-590 (2005).
  25. Cavalher-Machado, S. C., et al. The anti-allergic activity of the acetate fraction of Schinus terebinthifolius leaves in IgE induced mice paw edema and pleurisy. International Immunopharmacology. 8 (11), 1552-1560 (2008).
  26. Dhakal, H., et al. Gomisin M2 inhibits mast cell-mediated allergic inflammation via attenuation of FcεRI-mediated Lyn and Fyn activation and intracellular calcium levels. Frontiers in Pharmacology. 10, 869(2019).
  27. Galli, S. J., Wedemeyer, J., Tsai, M. Analyzing the roles of mast cells and basophils in host defense and other biological responses. International Journal of Hematology. 75 (4), 363-369 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

test ex vivoizolacja surowych PECtraktowanie przeciwcia ami IgE anty DNPinkubacja z bia kiem no nikowym DNPwalidacja stabilizator w kom rek tucznychtestowanie lek w przeciwalergicznychpasywna anafilaksja systemiczna
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.