Artykuł metodologiczny

Eksploracja genów i analiza sekwencji nukleozydazy purynowej na podstawie sekwencji RNA

DOI:

10.3791/61561

⸱

20 października 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Hepatopathy, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisano metodę eksploracji genów i analizy sekwencji nukleozydazy purynowej (PN, EC:3.2.2.1) opartej na RNA-Seq. Analizę ProtProm zastosowano w celu ukazania unikalnych drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur PN. Ponadto gen PN sklonowano z transkryptomu w celu zweryfikowania wiarygodności wyników RNA-Seq.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grzyb gąsienicowy (Ophiocordyceps sinensis) jest jednym z najbardziej cenionych grzybów tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM) i zawiera wiele aktywnych składników, takich jak adenozyna. Adenozyna jest uważana za biologicznie skuteczny składnik, który ma różnorodne działanie przeciwnowotworowe i immunomodulujące. W celu dalszego wyjaśnienia mechanizmu działania nukleozydazy purynowej (PN) w biosyntezie adenozyny, z powodzeniem zbadano gen kodujący PN i poddano go dalszej analizie w oparciu o bazę danych RNA-Seq grzyba gąsienicowego. Pełnej długości cDNA PN wynosił 855 pz, co kodowało 284 aminokwasy. Analiza BLAST wykazała najwyższą homologię wynoszącą 85,06% z hydrolazą nukleozydową w NCBI. Analiza ProtProm wykazała, że względna masa cząsteczkowa wynosiła 30,69 kDa, a punkt izoelektryczny 11,55. Drugorzędowa struktura PN została przewidziana przez Predict Protein; Wyniki pokazały, że struktura helisy alfa stanowiła 28,17%, struktura nici 11,97%, a struktura pętli 59,86%. Co więcej, gen PN został następnie sklonowany z transkryptomu i wykryty za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w celu weryfikacji. Badanie to dostarcza bardziej wystarczających podstaw naukowych i nowych pomysłów na genetyczną regulację biosyntezy adenozyny w TCM grzybów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grzybowa Tradycyjna Medycyna Chińska (TCM) ma obfite zasoby gatunkowe1,2. Grzyb gąsienicowy (Ophiocordyceps sinensis) jest dobrze znanym grzybem TCM i jest uważany za źródło innowacyjnych leków3,4. Grzyb gąsienicowy to mieszanina robaka i grzyba, która występuje na Wyżynie Tybetańskiej w południowo-zachodnich Chinach, gdzie Hirsutella sinensis pasożytuje na ciele gąsienicy5. Obecnie H. sinensis jest opisywany jako jedyny anamorf grzyba gąsienicowego zgodnie z dowodami biologii molekularnej i morfologicznej6,7, i ma mniejszą toksyczność i podobną skuteczność kliniczną w porównaniu z dzikim grzybem gąsienicowym8. Okazało się, że H. sinensis posiada różnorodne biologicznie skuteczne składniki, takie jak nukleozydy, polisacharydy i ergosterole, o rozległych efektach farmakologicznych, takich jak naprawa uszkodzenia wątroby9,10,11. Adenozyna jest typowym składnikiem aktywnym wyizolowanym z grzyba gąsienicowego i jest rodzajem alkaloidu purynowego12. Adenozyna ma różnorodne działania biologiczne: przeciwnowotworowe, przeciwbakteryjne i immunomodulujące13,14. Niestety, mechanizm biosyntezy adenozyny, jak również kluczowe geny biorące w nim udział, są nadal niejasne15,16.

Adenozyna wykazuje głównie swoje działanie przeciwnowotworowe poprzez działania immunosupresyjne w mikrośrodowisku guza17. Doniesiono, że adenozyna wykazuje funkcje immunosupresyjne, co miało kluczowe znaczenie dla zainicjowania naprawy tkanek po urazie i ochrony tkanek przed nadmiernym stanem zapalnym18,19. Ponadto wykazano, że tłumienie odporności za pośrednictwem adenozyny może poważnie upośledzać nadzór immunologiczny nad rakiem, a także sprzyjać wzrostowi guza20. Dlatego pilne jest zbadanie mechanizmu biosyntezy adenozyny w celu jej szerokiego zastosowania w przeciwnowotworowych.

Zgłoszono, że pełny wgląd w ekspresję genów i ich poziomów ekspresji może być systematycznie przeprowadzany przez sekwencjonowanie transkryptomu nowej generacji21. Ponadto sekwencjonowanie i analizę transkryptomu zastosowano w celu przewidywania genów zaangażowanych w szlak biosyntezy składników aktywnych i dalszego badania interakcji różnych szlaków biosyntezy22. Nukleozydaza purynowa (PN, EC 3.2.2.1) to klasa nukleozydaz o specyficzności substratowej dla nukleozydów purynowych, która może hydrolizować wiązania glikozydowe nukleozydów purynowych do cukrów i zasad23. Zazwyczaj odgrywa ważną rolę w biosyntezie adenozyny. Doniesiono, że przewidywano szlak biosyntezy adenozyny w grzybowym TCM; qPCR i ekspresja genów wykazały, że zwiększona akumulacja adenozyny jest wynikiem regulacji w dół genu PN, co wskazuje, że gen PN może odgrywać ważną rolę w biosyntezie adenozyny15. Dlatego należy pilnie wyjaśnić mechanizm PN w biosyntezie adenozyny. Jednak informacje o sekwencji i strukturze białka PN, a także inne kluczowe geny zaangażowane w biosyntezę adenozyny TCM grzybów nie były dalej badane.

W tym badaniu, nowa sekwencja genu PN została wydobyta z danych RNA-Seq grzyba gąsienicowego i zweryfikowana przez klonowanie genów. Ponadto kompleksowo przeanalizowano charakterystykę molekularną i strukturę białkową PN, co może dostarczyć nowych kierunków i pomysłów na regulację genów biosyntezy adenozyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Szczep anamorfa grzyba gąsienicowego (H. sinensis) został zdeponowany w naszym laboratorium. Escherichia coli (Escherichia coli) DH5 zostały zachowane przez Szpital Shenzhen Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie.

1. Przygotowanie do sekwencjonowania RNA

  1. Zbiór grzybni
    1. Przygotuj pożywkę fermentacyjną do fermentacji H. sinensis: sproszkowana mąka kukurydziana (1%), poczwarki jedwabników (1,5%), ekstrakt drożdżowy (0,5%), trypton (1%), glukoza (1,5%), otręby (1,5%), dekstryna (0,5%), KH2PO4 (0,02%) iMgSO4 (0,01%).
    2. Przygotować inokulację za pomocą 10% pożywki fermentacyjnej do hodowli na dużą skalę (dodać 10 ml pożywki na 100 ml pożywki). Fermentację zanurzeniową w temperaturze 16 °C na wytrząsarce obrotowej z prędkością 150 obr./min należy przeprowadzać przez 10 dni.
    3. Rozmnażaj się bezpłciowo i zbieraj grzybnię anamorfa grzyba gąsienicy przez 10 dni. Odwirować sfermentowaną pożywkę i odrzucić supernatant po odwirowaniu. Zawiesić grzybnię dodając 100 ml ultraczystej wody przez 3 razy i usunąć supernatant przez odwirowanie. Zmiel oczyszczoną grzybnię na proszek za pomocą ciekłego azotu.
  2. Sekwencja RNA
    1. Ekstrahować całkowite RNA anamorfa grzyba gąsienicowego zgodnie z protokołami producenta (Tabela materiałów) i dalej traktować próbkę wolną od RNaz DNazą I (Tabela materiałów).
    2. Wyizoluj mRNA z całkowitych systemów izolacji mRNA PolyATtract i wyizoluj mRNA poli(A) za pomocą kulek z oligo(dT) zgodnie z protokołami producenta (tabela materiałów).
    3. Weź krótkie fragmenty jako matryce do syntezy pierwszej nici cDNA za pomocą losowych starterów heksamerowych zgodnie z protokołami producenta (Tabela materiałów). Wykonaj syntezę drugiej nici cDNA zgodnie z protokołami producenta.
    4. Następnie wygeneruj biblioteki sekwencjonowania za pomocą zestawu Ultra RNA Library Prep Kit zgodnie z protokołami producenta (Tabela materiałów).
    5. Krótkie fragmenty należy oczyścić za pomocą zestawu do ekstrakcji PCR zgodnie z protokołami producenta (tabela materiałów) i rozpuścić odpowiednio za pomocą buforu EB.
    6. Połączyć krótkie fragmenty (próg 300 pz) za pomocą adapterów sekwencjonowania zgodnie z wynikiem elektroforezy w żelu agarozowym.
    7. Następnie należy przeprowadzić amplifikację za pomocą PCR przy użyciu szablonów wybranych z odpowiednich fragmentów.
    8. Sekwencjonowanie biblioteki przez Illumina HiSeq 4000 z sekwencjonowaniem sparowanych końców zgodnie z protokołami producenta. Filtruj brudne odczyty nieprzetworzone z nieprzetworzonych danych sekwencji, aby uzyskać czyste dane. Zastosuj zestaw denovo, aby uzyskać Unigenes z najmniejszą liczbą N, której nie można rozszerzyć na żadnym końcu.
    9. Dopasuj sekwencje Unigene przez blastx do baz danych białek, takich jak nr, Swiss-Prot, KEGG i COG (wartość e < 0,00001). Pobierz białka o największym podobieństwie sekwencji do podanych Unigenes wraz z ich adnotacjami funkcjonalnymi białek. Podsumuj wyniki RNA-Seq (tabela materiałów).
      UWAGA: W powyższych krokach użyto zestawów komercyjnych, a wszystkie operacje zostały wykonane zgodnie z protokołem producenta.

2. Wydobywanie genów nukleozydazy purynowej

  1. Pobierz pliki z wynikami sekwencji RNA na komputer. Znajdź pliki wyników adnotacji złożonych Unigenes w wynikach RNA-Seq.
    UWAGA: Odczyty sparowanych końców zostały ponownie użyte do wypełniania luk w rusztowaniach w celu uzyskania sekwencji o najmniejszej liczbie N, których nie można rozszerzyć na żadnym końcu. Takie sekwencje zostały zdefiniowane jako Unigenes. Adnotacja Unigene dostarcza informacji o wyrażeniu i adnotacji funkcjonalnej Unigene.
  2. Otwórz ścieżkę Annotation Files i wpisz map 00230 w pasku wyszukiwania, a następnie wyszukaj metabolizm puryn (map00230) w klasyfikacji plików adnotacji KEGG.
  3. Oznacz EC:3.2.2.1 (PN) na czerwono na mapie z adnotacjami00230 i wskaż, że zostały zmontowane Unigeny, które zostały oznaczone do PN.
    UWAGA: Trzy Unigeny (Unigene10777, Unigene14697 i Unigene17827) zostały oznaczone adnotacją PN po kliknięciu na numer WE 3.2.2.1 i pokazane na mapie z adnotacjami00230.
  4. Kliknij numer WE 3.2.2.1 i wyświetl informacje o Unigenes z adnotacjami.
  5. Otwórz oprogramowanie LTFViewer i zaimportuj plik Unigene.fa za pomocą skrótu Ctrl-O i pokaż informacje o sekwencji zmontowanych Unigenes.
  6. Wyszukaj informacje o sekwencji Unigene10777, Unigene14697 i Unigene17827 za pomocą skrótu Ctrl-F.
  7. Pobierz informacje o sekwencji Unigene10777, Unigene14697 i Unigene17827 za pomocą skrótów Ctrl-C i Ctrl-V.
  8. Wyeliminuj Unigene10777 i Unigene17827 za pomocą zbyt krótkich sekwencji otwartej ramki odczytu (ORF).
    UWAGA: Podstawowe informacje o sekwencji były wyświetlane w oprogramowaniu LTFViewer.
  9. Wybierz Unigene14697 (rozmiar 1,705 pz, przerwa 0,0%) z odpowiednią długością ORF do dalszych badań.

3. Analiza bioinformatyczna

  1. Przeanalizuj ORF genu PN za pomocą ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).
    1. Wklej sekwencję do pola. Wybierz parametry w następujący sposób: minimalna długość ORF (nt): 75, kod genetyczny: 1. standardowy, kodon start ORF do użycia: tylko ATG. Kliknij przycisk Prześlij, aby uzyskać informacje o ORF.
  2. Użyj narzędzia ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html), aby obliczyć teoretyczną masę cząsteczkową i punkt izoelektryczny.
    1. Wklej sekwencję aminokwasów (w jednoliterowym kodzie) w polu i kliknij przycisk Oblicz parametry, aby uzyskać wyniki.
  3. Zastosuj serwer SignalP5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) do przewidywania peptydów sygnałowych.
    1. Wprowadź sekwencje białek w formacie FASTA. Wybierz parametry w następujący sposób, grupa organizmów: Eukarya, format wyjściowy: Długie wyjście. Kliknij przycisk Prześlij, aby uzyskać wyniki.
  4. Zastosuj BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), aby przeanalizować homologię sekwencji białek.
    1. Kliknij przycisk Protein Blast i wprowadź sekwencję w polu. Wybierz parametry w następujący sposób, baza danych: Nieredundantne sekwencje białek (nr), algorytm: blastp (białko-białko BLAST). Kliknij przycisk Wybuch, aby uzyskać wyniki.
  5. Zastosuj program Clustal X (http://www.clustal.org/), aby wyrównać sekwencje kwasowe PN z różnych grzybów.
    1. Prześlij plik lub wklej sekwencje do pola. Ustaw parametry w następujący sposób, format wyjściowy: ClustalW z liczbą znaków. Kliknij przycisk Prześlij, aby uzyskać wyniki. Clustal X może rozpoznawać tylko pliki w formacie FASTA, a ścieżka do plików może zawierać tylko nazwy angielskie.
  6. Użyj MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/) do przeprowadzenia drzewa filogenetycznego.
    1. Otwórz oprogramowanie i kliknij przycisk Plik, aby przesłać sekwencje. Wybierz typ danych jako Sekwencje białek, kliknij przycisk OK, aby przejść do następnego kroku. Następnie kliknij przycisk Filogeneza i wybierz Filogeneza testu Bootstrap, a następnie kliknij Drzewo łączenia sąsiadów. Wybierz parametry domyślne i kliknij przycisk Oblicz, aby uzyskać wyniki.
  7. Zastosuj InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/), aby zidentyfikować domenę katalityczną PN.
    1. Wprowadź sekwencję w polu. Wybierz domyślne parametry i kliknij przycisk Szukaj, aby uzyskać wyniki.
  8. Zastosuj Predict Protein (http://www.predictprotein.org/) online, aby przewidzieć drugorzędową strukturę białka.
    1. Wprowadź sekwencję aminokwasów (jednoliterowy kod) w polu, a następnie kliknij przycisk predictProtein, aby uzyskać wyniki.
  9. Zastosuj narzędzia online SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) do oceny trójwymiarowej struktury PN24.
    1. Kliknij przycisk Rozpocznij modelowanie i wklej sekwencję docelową w polu. Wypełnij informacje o tytule projektu i adresie e-mail, a następnie kliknij przycisk Szukaj szablonów, aby uzyskać wyniki.

4. Klonowanie genów i budowa rekombinowanego plazmidu

  1. Zaprojektuj podkłady, których odwrotny podkład zawierał miejsce NotI, a przednie podkład miał miejsce EcoRI.
  2. Pokaż starter do przodu jako: AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3'), a starter odwrotny jako: ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') firmy Primer Express.
  3. Przygotuj startery, a także cDNA grzyba gąsienicowego do klonowania genu PN. Przeprowadzić PCR w następujący sposób: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 minut, denaturacja w temperaturze 94 °C przez 45 s, renaturyzacja w temperaturze 55 °C przez 60 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 90 s, powtórzenie przez 35 cykli i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.
  4. Pobrać fragmenty PCR i wykryć je za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w celu weryfikacji. Zwiąż fragmenty PCR za pomocą pMD18-T. Przeprowadź system ligacji PMD18-T w następujący sposób: 1 μl PMD18-T, 4 μl roztworu1 i 5 μl genu docelowego. Ustaw warunki w następujący sposób: utrzymywanie w temperaturze 16 °C przez 16 godzin, inaktywacja w temperaturze 65 °C przez 15 minut.
  5. Przenieś rekombinowane plazmidy do właściwych komórek E. coli JM109 zgodnie z instrukcją obsługi25.
  6. Trawić rekombinowane plazmidy pMD18-T/PN i wektor ppic9K za pomocą EcoRI i NotI. Ligować fragmenty po trawieniu przez ligazę DNA T4.
  7. Skonstruuj rekombinowany plazmid ppic9K / PN w celu dalszej ekspresji heterologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencja ORF genu PN miała długość 855 pz, która kodowała 284 aminokwasy o obliczonej masie cząsteczkowej 30,69 kDa i przewidywanym punkcie izoelektrycznym 11,55, co wskazuje, że PN jest białkiem alkalicznym. Zastosowanie serwera SignalP4.0 przeprowadzono w celu identyfikacji peptydu sygnałowego, a wyniki wykazały, że PN nie posiada peptydów sygnałowych. Ponadto wyniki poszukiwań BLASTP wykazały, że PN pochodzący z grzyba gąsienicowego miał największą tożsamość (85,06%, wartość E = 1e-88) z hydrolazą n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdrowie ludzkie stoi w obliczu szeregu poważnych problemów medycznych, takich jak choroby nowotworowe, sercowo-naczyniowe i naczyniowo-mózgowe26,27. TCM jest uważany za źródło badań i rozwoju medycyny innowacyjnej, ze względu na bogate zasoby gatunkowe oraz zróżnicowaną strukturę i funkcje składników aktywnych 28,29. Grzyb gąsienicowy jest pasożytem grzybowym na larwach Lepidoptera, a w tradycji chińskiej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31871244, 81973733, 81803652), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (2019A1515011555, 2018A0303100007), Fundację Zdrowia i Komisji Planowania Rodziny Shenzhen (SZBC2018016), Specjalny Fundusz Rozwoju Gospodarczego i Technologicznego Dystryktu Longgang w mieście Shenzhen (LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wolne od RNaz DNaza ITaKaRa2270B
Systemy izolacji mRNA PolyATtractPromegaIII
Losowe startery heksamerówThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra Zestaw do przygotowania biblioteki RNANEBE7530S
Zestaw do ekstrakcji PCRQiaQuick
AgarozaTransGen BiotechGS201-01
Sekwencer o wysokiej przepustowościIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
Program ORFNCBI
ProtParam narzędzieSIB Szwajcarski Instytut Bioinformatyki
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTProgram NCBI
Clustal Xw Dublinie
MEGACentrum Medycyny Ewolucyjnej i Informatyki4.0
InterProScanEuropejskie Laboratorium
Przewidywanie białka UniwersytetTechniczny w Monachium
WISS-MODELSzwajcarski Instytut Bioinformatyki
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agarozaSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Marker DNA Plus IISigma-AldrichBM121-01
6 i razy; Bufor ładujący DNASigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
System obrazowania żelowegoSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 Ligaza DNAEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983
Uniwersytet Kalifornijski Biologii Molekularnej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, C. J. The traditional Chinese medicine fungus Cordyceps and its biotechnological production. Research Journal of Biotechnology. 8, 1-2 (2013).
  2. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1806(2017).
  3. Koganti, P., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206(2013).
  4. Shen, C. Y., Jiang, J. G., Li, Y., Wang, D. W., Wei, Z. Anti-ageing active ingredients from herbs and nutraceuticals used in traditional Chinese medicine: pharmacological mechanisms and implications for drug discovery. British Journal of Pharmacology. 174, (2017).
  5. Jiang, Y., Yao, Y. J. Names related to Cordyceps sinensis anamorph. Mycotaxon. 84, 245-254 (2002).
  6. Chen, Y. Q., Wang, N., Qu, L. H., Li, T. H., Zhang, W. M. Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA. Biochemical Systematics and Ecology. 29, 597-607 (2001).
  7. Liu, Z. Y., et al. Molecular evidence for the anamorph-teleomorph connection in Cordyceps sinensis. Mycological Research. 105, 827-832 (2001).
  8. Yu, S. J., Zhang, Y., Fan, M. Z. Analysis of volatile compounds of mycelia of Hirsutella sinensis, the anamorph of Ophiocordyceps sinensis. Applied Mechanics and Materials. 140, 253-257 (2012).
  9. Singh, M., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206(2013).
  10. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  11. Lin, S., et al. Enhancement of cordyceps polysaccharide production via biosynthetic pathway analysis in Hirsutella sinensis. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 872-880 (2016).
  12. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7, 1806(2017).
  13. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  14. Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nature Reviews. Cancer. 13, 842-857 (2013).
  15. Lin, S., Zou, Z., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Transcriptome analysis reveals the molecular mechanisms underlying adenosine biosynthesis in anamorph Strain of caterpillar fungus. BioMed Research International. 2019, 1864168(2019).
  16. Lin, S., et al. Biosynthetic pathway analysis for improving the cordycepin and cordycepic aid production in Hirsutella sinensis. Applied Biochemistry and Biotechnology. 179, 633-649 (2016).
  17. Allard, B., Beavis, P. A., Darcy, P. K., Stagg, J. Immunosuppressive activities of adenosine in cancer. Current Opinion in Pharmacology. 29, 7-16 (2016).
  18. Fredholm, B. B. Adenosine, an endogenous distress signal, modulates tissue damage and repair. Cell Death and Differentiation. 14, 1315-1323 (2007).
  19. Ohta, A., Sitkovsky, M. Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage. Nature. 414, 916-920 (2001).
  20. Allard, B., Turcotte, M., Stagg, J. CD73-generated adenosine: orchestrating the tumor-stroma interplay to promote cancer growth. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 485156(2012).
  21. Zhang, Y., Wang, X., Nan, P., Li, J., Jin, L. De novo transcriptome sequencing of genome analysis provides insights into Solidago canadensis invasive capability via photosynthesis. Journal of Plant Interactions. 14, 572-579 (2019).
  22. Liu, Z. Q., et al. Transcriptome sequencing and analysis of the entomopathogenic fungus Hirsutella sinensis isolated from Ophiocordyceps sinensis. BMC Genomics. 16, 106(2015).
  23. Ogawa, J., et al. Purification, characterization, and gene cloning of purine nucleosidase from Ochrobactrum anthropi. Applied and Environmental Microbiology. 67, 1783-1787 (2001).
  24. Konstantin, A., et al. The swiss-model workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 16, 195-201 (2006).
  25. Chung, C., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 2172-2175 (1989).
  26. Lin, S., et al. Association between aldose reductase gene C(-106)T polymorphism and diabetic retinopathy: A systematic review and Meta-Analysis. Ophthalmic Research. 63, 1-10 (2020).
  27. Peng, Y., et al. Inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT) transplantation model of murine islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
  28. Zhang, T. T., Jiang, J. G. Active ingredients of traditional Chinese medicine in the treatment of diabetes and diabetic complications. Expert Opinion on Investigational Drugs. 21, 1625-1642 (2012).
  29. Lin, S., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Expression, purification and characterization of 5'-nucleotidase from caterpillar fungus by efficient genome-mining. Protein Expression and Purification. 168, 105566(2020).
  30. Kinjo, N., Mu, Z. Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China. Mycoence. 42, 567-574 (2001).
  31. Xiao, J. H., Ying, Q., Xiong, Q. Nucleosides, a valuable chemical marker for quality control in traditional Chinese medicine Cordyceps. Recent Patents on Biotechnology. 7, 2(2013).
  32. Tu, P., Yong, J., Guo, X. Discovery, research and development for innovative drug of traditional Chinese medicine under new situations. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40, 3423-3428 (2015).
  33. Zheng, P., et al. Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine. Genome Biology. 12, 116(2011).
  34. Covarrubias, R., et al. Role of the CD39/CD73 purinergic pathway in modulating arterial thrombosis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36, 1809-1820 (2016).
  35. Ogawa, Y., Murayama, N., Yanoshita, R. Molecular cloning and characterization of ecto-5'-nucleotidase from the venoms of Gloydius blomhoffi. Toxicon. 54, 408-412 (2009).
  36. Lin, S., et al. Mining and characterization of two novel chitinases from Hirsutella sinensis using an efficient transcriptome-mining approach. Protein Expresion and Purification. 133, 81-89 (2017).
  37. Ueda, M., Hirano, Y., Fukuhara, H. Gene cloning, expression, and X-ray crystallographic analysis of a β-mannanase from Eisenia fetida. Enzyme and Microbial Technology. 117, 15-22 (2018).
  38. Rebets, Y., Kormanec, J., Luzhetskyy, A., Bernaerts, K., Anné, J. Cloning and expression of metagenomic DNA in Streptomyces lividans and subsequent fermentation for optimized production. Methods in Molecular Biology. 1539, 99(2017).
  39. Wang, S. S., Ning, Y. J., Wang, S. N., Zhang, J., Chen, Q. J. Purification, characterization, and cloning of an extracellular laccase with potent dye decolorizing ability from white rot fungus Cerrena unicolor GSM-01. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 920-927 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza RNA Seqgrzyb g sienicowybiosynteza adenozynyanaliza BLASTprzewidywanie struktury bia ekelektroforeza w elu agarozowymklonowanie transkryptomuhydrolaza nukleozydowa
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły