Tutaj opisujemy dokładną metodę pobierania limfocytów przewodu piersiowego i obserwacji migracji limfocytów tropikalnych jelitowych w plamach Peyera szczura przez 3 godziny za pomocą fotografii poklatkowej. Ta technika może wyjaśnić, w jaki sposób dynamika limfocytów wpływa na stan zapalny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obserwacja mikroskopowa dynamiki limfocytów w szczurzych łatach Peyera
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naiwne limfocyty recyrkulują z krwi do tkanek limfatycznych w warunkach fizjologicznych i są powszechnie uznawane za ważne zjawisko w odporności jelitowej. Zrąb wtórnych narządów limfatycznych, takich jak łaty Peyera (PP) lub krezkowe węzły chłonne, to miejsca, w których naiwne limfocyty wyczuwają antygeny. Naiwne limfocyty krążą w krwiobiegu, aby dotrzeć do wysokich żyłek śródbłonka, wrota wejścia do PP. Szacuje się, że niektóre immunomodulatory wpływają na migrację limfocytów, ale dokładna ocena dynamiki mikrokrążenia jest bardzo trudna, a ustalenie metody obserwacji migracji limfocytów in vivo może przyczynić się do wyjaśnienia dokładnych mechanizmów. Udoskonaliliśmy metodę pobierania limfocytów z przewodu chłonnego i obserwacji szczegółowej dynamiki limfocytów jelitowo-tropikalnych w PP szczurów. Wybraliśmy konfokalną laserową mikroskopię skaningową do obserwacji PP szczurów in vivo i zarejestrowaliśmy to za pomocą fotografii poklatkowej. Możemy teraz uzyskać wyraźne obrazy, które mogą przyczynić się do analizy dynamiki limfocytów.
Wprowadzenie
Plamy Peyera (PPs) składają się z setek pęcherzyków limfoidalnych w blaszce właściwej jelita cienkiego. PP są podzielone na pęcherzyki, obszar międzypęcherzykowy i centra rozrodcze znajdujące się w dolnej części pęcherzyków, gdzie limfocyty są stymulowane przez prezentację antygenu. Nie ma doprowadzających naczyń limfatycznych, a antygeny atakują blaszkę właściwą ze światła jelita przez warstwę komórek nabłonka. Obszar nabłonka pokrywający pęcherzyki limfoidalne nazywany jest nabłonkiem związanym z pęcherzykami, w którym wyspecjalizowane przeplatające się komórki M wychwytują antygeny błony śluzowej. Limfocyty M pobierają antygeny od strony światła, a antygeny są następnie wychwytywane przez komórki dendrytyczne i prezentowane w kierunku naiwnych limfocytów, które przepływają do PP przez śródbłonek żyłek o wysokim śródbłonku (HEV)1. PP odgrywają ważną rolę w odporności jelitowej i są związane z wczesnym stadium stanu zapalnego. Wiele interakcji molekularnych obejmuje wnikanie limfocytów do wtórnych narządów limfatycznych (SLO), w tym cząsteczek adhezyjnych, chemokin2,3, oraz sfingozyno-1-fosforan4; W związku z tym istnieje wiele oczekiwanych celów terapeutycznych. Dlatego obserwacja dynamiki limfocytów w obrębie PP pozwala nam dostrzec bardzo wczesny etap zapalenia i zbadać przydatność kilku obiecujących leków.
Metoda tutaj skupia się na migracji limfocytów w PPs, która obejmuje kilka procedur (kaniulacja do przewodu piersiowego5 i pobieranie limfocytów oraz długoterminowa obserwacja po wstrzyknięciu do pobranych limfocytów). Ponieważ procedury te są skomplikowane i trudno było dokładnie zobaczyć, jak każda procedura została wykonana w poprzednich raportach, wspomnieliśmy tutaj o kilku wskazówkach, jak osiągnąć udaną obserwację. Na przykład kaniulacja rurek do przewodu piersiowego była bardzo trudna, a początkowy wskaźnik powodzenia kaniulacji wynosił mniej niż 50%. Udoskonaliliśmy jednak metodę i osiągnęliśmy wskaźnik sukcesu przekraczający 80%. W tym manuskrypcie wspomnieliśmy o kilku innych wskazówkach, które są niezbędne do udanej obserwacji, aby umożliwić ilościową ocenę transśródbłonkowej migracji limfocytów w kilku warunkach.
W poprzednich raportach trudno było zrozumieć trójwymiarowe zmiany w czasie, takie jak dożylne wstrzyknięcie tuszu indyjskiego w celu zabarwienia struktury naczyniowej PPs6, czy mikroskop jest monofokalny7. W ostatnich latach metoda obserwacyjna wykorzystująca niektóre transgeniczne zwierzęta z fotokonwertowalnym białkiem fluorescencji, takie jak myszy Kaede, wyjaśniła systematyczne ruchy komórkowe in vivo8. Drugie badanie wyjaśniło niezależne od CD69 wyłączanie wyjścia limfocytów z klasy PPs9. Zastosowaliśmy konfokalną laserową mikroskopię skaningową (CLSM) ze względu na jej wysokie możliwości analityczne. Teraz możemy łatwo uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości i wykorzystać je do analizy dynamiki limfocytów.
W tym raporcie zademonstrowaliśmy szereg metod oceny migracji limfocytów w PPs. Po pierwsze, pokazaliśmy udoskonalone metody kaniulacji przewodu piersiowego w celu pobrania limfocytów. Po drugie, udoskonaliliśmy metody obserwacyjne na kilka sposobów, aby utrzymać obiektywne narządy, gdy tylko jest to możliwe, pod obserwacją mikroskopową, co pozwoliło nam uzyskać wysokiej jakości obrazy przez 3 godziny. Po trzecie, określiliśmy ilościowo ruchy komórkowe migracji limfocytów, aby ocenić wpływ niektórych leków. Te zmodyfikowane protokoły przyczynią się do rozwoju oceny immunologii błony śluzowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Badań nad Zwierzętami National Defense Medical College (nr 16058). Zwierzęta były utrzymywane na standardowej karmie laboratoryjnej (CLEA Japan Inc, Tokio, Japonia). Zwierzęta laboratoryjne były traktowane zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health.
1. Pobieranie i rozdzielanie limfocytów
UWAGA: Ponieważ limfocyty muszą być świeże i nie mogą być przechowywane, muszą być pobierane od szczurów do każdego eksperymentu. Ponadto limfocyty tropikalne jelitowe muszą być pobierane bezpośrednio z przewodu piersiowego, w którym krążą. Oczekuje się, że wszystkie procedury zostaną zakończone w ciągu 6 godzin, a wszystkie narzędzia, rękawice i powierzchnie są czyste. Aby utrzymać zwierzęta w fizjologicznie stabilnym stanie, wszystkie sole fizjologiczne i inne płyny użyte w eksperymencie powinny być utrzymywane w cieple.
- Po zanurzeniu w gorącej wodzie (około 80–90 °C) uformuj rurkę kaniulacyjną (średnica 1 mm) przypominającą krzywą heparyny (promień około 5 mm) i przymocuj ją do plastikowej płyty za pomocą taśmy klejącej na kilka godzin wcześniej.
- Znieczulić samca szczura rasy Wistar (8–12 tygodni) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny Midazolamu (2 mg/kg), Domitora (0,15 mg/kg) i Betulphar (2,5 mg/kg) i przyciąć włosy na ciele brzucha za pomocą maszynki do strzyżenia włosów. Po goleniu mocno usuń włosy, aby włosy nie dostały się do jamy brzusznej.
- Po potwierdzeniu, że stabilna głębokość znieczulenia wymagana do zabiegu została uzyskana przez uszczypnięcie palca u nogi, należy wykonać nacięcie nożyczkami chirurgicznymi poziomo od linii środkowej do lewej okolicy podżebrowej. Uważaj, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych w otrzewnej ciemieniowej, obserwując naczynia pod światłem.
- Owiń brzuch mokrą gazą i delikatnie przesuń żołądek w prawo na zewnątrz ciała, aby odsłonić narządy zaotrzewnowe. Za pomocą nożyczek chirurgicznych włóż wgłębienie między mięśnie prostowników kręgosłupa a tkankę tłuszczową i tępo oddziel je palcami.
- Ostrożnie usuń tkankę łączną wokół przewodu piersiowego. Nadmiar tkanki łącznej zwiększa się wraz z wiekiem. Odsłoń przewód piersiowy tuż pod lewym podbrzuszem przepony doogonowo, aż będzie widoczny przewód piersiowy o długości 20 mm. Delikatnie oddziel zrosty między przewodem piersiowym a aortą za pomocą precyzyjnej pęsety lub wilgotnych wacików.
- Wykonuj ten proces ostrożnie, ponieważ niektóre szczury mają tętniczki rozgałęziające się od tętnicy brzusznej przecinającej przewód piersiowy lub krótki przewód piersiowy z powodu wyższego położenia splotu limfatycznego (małe przewody piersiowe rozprzestrzeniające się jak pajęczyny). Unikaj niepotrzebnego kontaktu z przewodem piersiowym, aby uniknąć wywołania obrzęku.
- Nałóż ligaturę za pomocą sznurka (jedwab 3-0) na przewód piersiowy tuż pod lewym podudziem przepony. Ogonowy przewód piersiowy ulega rozdęciu.
- Wykonaj otwór (o średnicy 5 mm) w ścianie brzucha, wbijając krawędź tnącą nożyczek chirurgicznych, przełóż rurkę kaniulacyjną zakrzywioną jak spinka do włosów i w pewnym momencie podwiąż rurkę na mięśniu biodrowo-lędźwiowym. Napełnij probówkę kaniulacyjną zwykłą solą fizjologiczną zawierającą 10 j./ml heparyny.
- Po umieszczeniu sznurka (jedwab 3-0) pod rozszerzonym przewodem piersiowym, nakłuj przewód piersiowy ostro ściętą krawędzią rurki kaniulacji, nachyl go w kierunku ogona na około 5 mm i podwiąż przewód piersiowy rurką kaniulacyjną w celu zamocowania.
- Aby dostarczyć sól fizjologiczną zapobiegającą odwodnieniu, za pomocą precyzyjnej pęsety wykonaj otwór (o średnicy 3 mm) na przedniej ścianie antrum żołądka i przełóż rurkę silikonową (o średnicy 2 mm) do dwunastnicy przez pierścień odźwiernika. Po zszyciu rany i umieszczeniu zwierząt w klatkach Bollmana, zacznij wlewać sól fizjologiczną z cukrem do dwunastnicy każdego szczura z rurki silikonowej z szybkością przepływu 3 ml / h. Przykryj całą klatkę ręcznikiem papierowym, aby była ciepła.
- Przymocuj probówkę do kaniulacji do otworu pośrodku pokrywy stożkowej probówki o pojemności 50 ml na lodzie zawierającym 6 U/ml heparyny, 10% płodowej surowicy bydlęcej i pożywki RPMI 1640 (pH 7,4; patrz tabela materiałów) i zbierz limfocyty przewodu piersiowego (TDL) na lodzie. Należy uważać, aby nie zetknąć końcówki rurki ze ścianką stożkowej rurki, aby zapobiec niedrożności rurki kaniulowanej z powodu tworzenia się skrzepów fibryny wewnątrz rurki. Płyn limfatyczny (około 20 ml), w tym około 1,0 x 108 ~ 109 limfocytów, można uzyskać w ciągu 6 godzin. Aby uzyskać limfocyty w pełnym znieczuleniu, monitorowana jest płaszczyzna znieczulenia i odpowiednio obserwowany jest przepływ limfy. Te same środki znieczulające dodaje się w tej samej dawce około 3 godziny po umieszczeniu szczurów w klatce Ballmana w celu uzyskania głębokiego znieczulenia w sposób ciągły przez 6 godzin.
2. Znakowanie limfocytów estrem sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFDSE)
- Rozpuścić CFDSE (Tabela materiałów) w sulfotlenku dimetylu (DMSO) do 15,6 mM (500 μg CFDSE rozpuszczonego w 60 μL DMSO).
- Inkubować limfocyty (1 x 108 ~ 109) w 50 ml RPMI 1640 z 50 μl roztworu CFDSE przez 30 minut w temperaturze 37 °C, jak opisano wcześniej10.
3. Konfiguracja eksperymentalna do badań mikrokrążenia
- Znieczulić szczury biorcy (8-12 tygodni) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny Midazolamu (2 mg/kg), Domitora (0,15 mg/kg) i Betulphar (2,5 mg/kg) i potwierdzić głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca. Zwilż brzuch przed pielęgnacją sierści, aby zminimalizować zanieczyszczenie włosów. Następnie otwórz brzuch biorcy szczura Wister przez nacięcie w linii środkowej.
- Umieść szczura na przenośnej płycie ze stali nierdzewnej (około 120 x 300 mm) z prostokątnym otworem wokół środka pokrytym szklanym szkiełkiem (24 x 50 mm). Wybierz około 10 cm odcinka jelita krętego, w tym PP do obserwacji.
- Utrzymuj jelito tak ciepłe, jak to możliwe i wilgotne, solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) ogrzaną do 37 °C. Nasącz PBS gazę, która jest używana do przykrycia jelita cienkiego.
- Podczas ciągłego znieczulenia 2 % izofluranem (patrz tabela materiałów), należy umieścić szkiełko na stoliku mikroskopu i wybrać odpowiednie obszary do obserwacji mikrokrążenia w PP, gdzie niektóre HEV przebiegają przez błonę surowiczą. PP różnią się wielkością; większe nadają się do obserwacji mikrokrążenia za pomocą CLSM. Jelito cienkie nie jest miejscami proste; Do obserwacji nadaje się prosty odcinek o długości co najmniej 2 cm bez żadnego naprężenia.
- Przykryj sąsiedni odcinek jelita i krezkę chłonną bawełną nasączoną PBS. Umieść odcinek jelita między dwoma zwiniętymi wacikami i umieść go jak najdalej od ciała szczura, aby zapobiec jego wibracjom spowodowanym biciem serca i oddychaniem szczura.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml powoli wstrzykuj (przez 1 minutę) znakowane CFSE TDL (1 x 108 komórek) do żyły szyjnej szczurów biorców. Szybkie wstrzyknięcie dożylne może wpływać na krążenie ogólnoustrojowe.
4. Mikrokrążenie limfocytów
- Ciągłe monitorowanie TDL w mikrokrążeniu PP za pomocą CLSM i nagrywanie na komputerze przez 3 godziny za pomocą fotografii poklatkowej w odstępach 30 sekund. Głębokość od błony surowiczej do HEV PP wynosi około 25 μm, co umożliwia obserwację zrębu i naczyń limfatycznych naczyń włosowatych do głębokości 30 μm.
- Wstrzyknąć Texas Red-dextran (25 mg / kg) do żyły szyjnej każdego szczura biorcy w celu zabarwienia krwiobiegu i Hoechest 33342 (5 mg / kg) w celu zabarwienia jąder komórkowych.
- (Opcjonalnie) Aby określić ilościowo dynamikę limfocytów, zdefiniuj limfocyty przylegające do HEV dłużej niż 30 sekund jako "limfocyty adhezyjne", a limfocyty emigrujące z HEV do zrębu jako "limfocyty migrujące". Następnie oblicz średni procent migracji (migrujące limfocyty / limfocyty adhezyjne + migrujące limfocyty) na pole widzenia (około 0,3 mm2).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pozyskiwanie limfocytów z chłonki
Aby przygotować szczura do kaniulacji przewodu piersiowego, należy wykonać nacięcie w napiętym przewodzie piersiowym, jak pokazano na Ryc. 1, a następnie umieścić szczura w klatce Bollmana, jak pokazano na Ryc. 2.
Po prawidłowym zebraniu limfocytów można uzyskać około 20 mL/6 h chłonki zawierającej około 107～108/mL limfocytów. Wśród TDLs 70% wykazuje ekspresj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj opisaliśmy protokół pobierania naiwnych limfocytów jelitowych i obserwacji ich migracji w szczurzych PP. Procedury te mogą ujawnić, w jaki sposób limfocyty poruszają się w mikrokrążeniu PP i umożliwić wizualne porównanie ich dynamiki w warunkach normalnych lub leczniczych. Bezpośrednia obserwacja tej dynamiki ma wiele zalet w uzyskaniu wskazówki dotyczącej modyfikacji immunologicznej przez niektóre leki, chociaż okres obserwacji jest ograniczony do zaledwie kilku godzin.
Wspomnieliśmy o ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez granty z National Defense Medical College oraz przez grant badawczy Health and Labour Sciences na badania nad nieuleczalnymi chorobami z Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej Japonii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| A1R + | Nikon | Komfokalna laserowa mikroskopia skaningowa | |
| Karboksyfluoresceina dioctan sukcynimidylu ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 średni | GIBCO | 11875093 | |
| Teksański czerwony– dekstran | Thermo Fisher Scientific | D1863 |
Bibliografia
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
