Artykuł metodologiczny

Zapisy elektrokardiogramu u znieczulonych myszy przy użyciu odprowadzenia II

DOI:

10.3791/61583

⸱

20 czerwca 2020

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Kyung Hee University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokół EKG, który jest technicznie łatwy, tani, szybki i przystępny cenowo dla małych myszy, i może być wykonywany z większą czułością. Sugerujemy tę metodę jako podejście przesiewowe do badania czynników farmakologicznych, modyfikacji genetycznych i modeli chorób u myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrokardiogram jest cennym narzędziem do oceny układu przewodzącego serce. Badania na zwierzętach pomogły w uzyskaniu nowych informacji genetycznych i farmakologicznych dotyczących elektrokardiogramu. Jednak wykonywanie pomiarów elektrokardiogramu u małych zwierząt in vivo, takich jak myszy, było wyzwaniem. W tym celu zastosowaliśmy metodę zapisu elektrokardiogramu u znieczulonych myszy, która ma wiele zalet: jest to procedura prosta technicznie, niedroga, ma krótki czas pomiaru i jest przystępna cenowo, nawet u młodych myszy. Pomimo ograniczeń związanych ze stosowaniem znieczulenia, porównania między grupą kontrolną a grupą eksperymentalną mogą być przeprowadzane ze zwiększoną czułością. Leczyliśmy myszy agonistami i antagonistami autonomicznego układu nerwowego, aby określić ważność tego protokołu i porównaliśmy nasze wyniki z poprzednimi raportami. Nasz protokół EKG wykrył zwiększoną częstość akcji serca i odstępy QTc podczas leczenia atropiną, zmniejszone tętno i odstępy QTc po leczeniu karbacholem oraz wyższe częstości akcji serca i odstępy QTc po podaniu izoprenaliny, ale nie odnotował żadnych zmian w parametrach EKG po podaniu propranololu. Wyniki te są poparte wcześniejszymi raportami, potwierdzającymi wiarygodność tego protokołu EKG. W związku z tym metoda ta może być stosowana jako podejście przesiewowe do wykonywania pomiarów EKG, które w przeciwnym razie nie zostałyby podjęte ze względu na wysokie koszty i trudności techniczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrokardiogram (EKG), test, który mierzy aktywność elektryczną bicia serca, jest cennym narzędziem do oceny układu przewodzącego serce. Parametry mierzone za pomocą EKG obejmują tętno, interwał PR, czas trwania QRS i odstęp QT. Krótko mówiąc, odstęp PR odpowiada czasowi wymaganemu do przebycia impulsu elektrycznego z węzła zatokowego przedsionkowego przez węzeł przedsionkowo-komorowy do włókien Purkinjego; Czas trwania zespołu QRS to czas, w którym następuje depolaryzacja komór przez układ Purkinjego i mięsień sercowy komorowy; a odstęp QT to czas trwania repolaryzacji komorowej.

Zapisy EKG u myszy pomogły badaczom zbadać funkcję serca i określić fizjologiczne i patofizjologiczne mechanizmy fenotypów serca, takich jak arytmia, migotanie przedsionków i niewydolność serca. Większość badań sercowo-naczyniowych obejmowała badania na genetycznie modyfikowanych modelach myszy. Często trudno jest uzyskać miarodajne dane na temat zapisów EKG od małych myszy, które zostały genetycznie zmanipulowane.

Istnieje kilka metod wykonywania EKG u myszy1. Badania sugerują, że zapisy EKG u zwierząt przytomnych są preferowane w stosunku do zwierząt znieczulonych, jeśli to możliwe, ponieważ wpływ znieczulenia na czynność serca jest dobrze znany2. Warto zauważyć dwa protokoły, które rejestrują EKG u świadomych myszy1. System radiotelemetrii EKG jest złotym standardem w ciągłym, długotrwałym monitorowaniu EKG u świadomych myszy1,3. Pomimo ich siły w rejestrowaniu w stanie świadomości, pomiary EKG sprzężone z radiotelemetrią mają kilka ograniczeń, w tym wysokie koszty konfiguracji i implantu, wymóg bardzo doświadczonego operatora, okres stabilizacji ponad 1 tydzień, zapotrzebowanie na duże myszy (> 20 g) i nabycie tylko jednego odprowadzenia zapisu EKG1. Inny system, który wykorzystuje elektrody przewodzące wielkości łapy osadzone w platformie, umożliwia zapisy EKG u świadomych myszy bez znieczulenia lub implantów1,4. Ten nieinwazyjny system jest alternatywną metodą w sytuacjach, w których systemy radiotelemetryczne są niedostępne, ponieważ ma wiele zalet: brak konieczności leczenia chirurgicznego, brak konieczności znieczulenia, niski koszt w przeliczeniu na mysz (tylko początkowa konfiguracja jest droga), krótki czas pomiaru i przystępność cenowa noworodków1,4. Główną wadą tego systemu jest to, że nie nadaje się on do ciągłego, długoterminowego monitorowania1.

Tutaj wprowadzamy kolejną niedrogą, prostą i szybką metodę zapisu EKG u znieczulonych myszy i demonstrujemy jej ważność i czułość, wykonując EKG po autonomicznej blokadzie/stymulacji układu przewodzącego serce. Sugerujemy tę metodę EKG do badań przesiewowych działania środków farmakologicznych, modyfikacji genetycznych i modeli chorobowych u myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, Uniwersytet Kyung Hee (numer licencji: KHUASP(SE)-18-108) i są zgodne z Przewodnikiem Amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Zwierzęta doświadczalne

  1. Trzymaj wszystkie myszy (39 myszy, Balb/c, samiec, 7-9 tygodni) w obiekcie wolnym od patogenów, zgodnie z przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
  2. Utrzymuj myszy w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w stałej temperaturze ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.

2. Przygotowanie środków znieczulających

UWAGA: Tribromoetanol jest stosowany zamiast kombinacji ketaminy i izofluranu, w oparciu o stabilność częstości akcji serca i odtwarzalność echokardiografii u myszy znieczulonych tribromoetanolem1,5,6

  1. Przygotować roztwór podstawowy 2,2,2-tribromoetanolu o stężeniu 1 g na 1 ml trzeciorzędowego alkoholu amylowego. Ciepło w temperaturze 40\u201245 °C przez 24 h. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 12 miesięcy.
  2. Aby uzyskać roztwór roboczy, rozcieńczyć 0,5 ml roztworu podstawowego w 19,5 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl) do 25 mg/ml. Ciepło w temperaturze 40\u201245 °C przez 1 h. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.

3. Ustawienia systemu EKG

  1. Upewnij się, że system jest skonfigurowany w taki sposób, aby w promieniu 2 m nie było hałasu ani wibracji, ponieważ sygnały EKG w myszy są wrażliwe na hałas i ruch otoczenia.
  2. Przygotuj konfigurację sprzętową: system akwizycji danych, biowzmacniacz i komputer z zainstalowanym oprogramowaniem do analizy danych EKG.
    1. Podłącz system akwizycji danych do sieci (AC) za pomocą zasilającego.
    2. Podłącz system akwizycji danych do komputera za pomocą USB.
    3. Podłącz wyjście sygnału na tylnym panelu bio amplifier do wejścia analogowego na przednim panelu systemu akwizycji danych za pomocą.
    4. Podłącz wyjście I2C systemu akwizycji danych do wejścia I2C biowzmacniacza za pomocą I2C.
    5. Podłącz 3-żyłowy bio amplifier do 6-pinowego gniazda wejściowego na panelu przednim bio amplifier.
    6. Włącz system akwizycji danych za pomocą przełącznika na tylnym panelu.
      UWAGA: W skrócie, sygnały są wzmacniane przez biowzmacniacz i rejestrowane za pomocą skomputeryzowanego systemu akwizycji i analizy danych z następującymi ustawieniami kanałów: częstotliwość próbkowania 2 k/s, zakres 20 mV i ustawienie filtra dolnoprzepustowego 200 Hz.
  3. Otwórz oprogramowanie do analizy i skonfiguruj je do akwizycji danych EKG.
    1. Przejdź do punktu Ustawienia | Ustawienia kanału. Ustaw częstotliwość próbkowania na 2 k/s. Ustaw zakres na 20 mV. Ustaw wzmacniacz wejściowy na 200 Hz dolnoprzepustowego.
    2. Przejdź do analizy EKG | Ustawienia EKG. Wybierz "Mysz" w ustawieniach wstępnych ustawień wykrywania i analizy.
    3. W panelu Uśrednianie wybierz, czy chcesz połączyć N (np. 4 uderzenia lub 60 s) kolejnych cykli pracy serca w jeden średni sygnał dla widoku uśredniania i widoku tabelarycznego.
    4. W panelu QTc wybierz metodę "Bazett", która jest zdefiniowana jako skorygowana wartość tętna w przedziale QT: QTc = QT / (RR/100)0,5, interwał RR = 60 / tętno7.

4. Pomiar EKG

  1. Umieść mysz na precyzyjnej wadze i zapisz jej wagę.
  2. Wywołać znieczulenie u myszy poprzez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie roztworu roboczego tribromoetanolu (18 ml roztworu roboczego na kg masy ciała (m.c.)).
  3. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona (mniej niż 2 minuty).
  4. Elektrody z igłami do akupunktury wprowadzić podskórnie w prawą i lewą kończynę przednią oraz lewą kończynę tylną zgodnie ze schematem EKG odprowadzenia II i przymocować taśmą (Rysunek 1). Upewnij się, że głębokość i położenie włożonych elektrod są spójne przez cały czas trwania eksperymentów.
  5. Podłącz drugie końce elektrod, wciskając je w trzy złącza zatrzaskowe na drugim końcu przewodów doprowadzających 3-odprowadzeniowego biowzmacniacza.
  6. Wstrzyknij leki (i.p.) 3 minuty po podaniu środków znieczulających (Rysunek 2).
  7. Rozpocznij rejestrację EKG 10 minut po wstrzyknięciu środków znieczulających. Po zakończeniu zapisu należy wykorzystać do analizy dane EKG od 12 do 17 minut po wstrzyknięciu środków znieczulających.
  8. Pod koniec sesji zapisu EKG ostrożnie wyjmij elektrody.

5. Analiza danych EKG

  1. Przejdź do analizy EKG | Uśrednianie Wyświetl i upewnij się, że oprogramowanie poprawnie identyfikuje początek i koniec fali P, zespołu QRS i załamka T w poszczególnych uderzeniach. W razie potrzeby możliwa jest ręczna korekta tych fal i interwałów poprzez przesunięcie zagubionych kursorów w odpowiednie pozycje.
    UWAGA: Jak pokazano w Rysunek 3A, interwał PR rozciąga się od początku załamka P do wystąpienia zespołu QRS (w większości przypadków brakuje załamka Q w EKG myszy). Czas trwania załamka QRS rozciąga się od początku załamka Q (głównie załamka R w EKG myszy) do końca załamka S. Odstęp QT obejmuje początek załamka Q (głównie załamka R w EKG myszy) do końca załamka T. Zwróć uwagę na krótszy czas trwania i brak załamka Q i odcinka ST w EKG myszy w porównaniu z ludzkim EKG class<="xref">8.
  2. Przejdź do analizy EKG | Wyświetl tabelę i wybierz poprawnie zidentyfikowane dane EKG, sprawdzając poszczególne dudnienia w oknie Widok uśredniania.
    UWAGA: Rysunek 3 pokazuje kilka przykładów rzeczywistych sygnałów EKG myszy. Rysunek 3A przedstawia normalny sygnał typu dzikiego, który został poprawnie zidentyfikowany w odniesieniu do załamka P, kompleksu QRS i załamka T. Komputerowy wybór fal PQRS może powodować błędne umiejscowienia, takie jak w Rysunek 3B normalny sygnał typu dzikiego, który nieprawidłowo umieszcza początek fali P. W Rysunek 3C sygnał EKG, który nieprawidłowo przesuwa koniec zespołu QRS, co skutkuje przeszacowaniem czasu trwania zespołu QRS. W Rysunek 3D sygnał EKG, który nieprawidłowo umieszcza koniec zespołu QRS, co skutkuje niedoszacowaniem zespołu QRS z powodu niejednoznacznego załamka T i Rysunek 3E sygnał EKG z niezidentyfikowanym załamkiem T. Bez wykluczenia lub ręcznych korekt interwały PQRS mogą być zawyżone lub niedoszacowane. Upewnij się, że wybrałeś sygnały EKG, które zostały prawidłowo zidentyfikowane, oraz sygnały, które nie pomijają docelowych szczytów. W związku z tym takie przypadki, w tym B, C, D i E (Rysunek 3), są ogólnie wykluczone z dokładnego szacowania parametrów EKG.
  3. Wybierz interesujące Cię dane EKG w widoku tabeli i skopiuj/wklej je do pliku arkusza kalkulacyjnego.

6. Analiza statystyczna

  1. Wykonaj analizę statystyczną za pomocą programu statystycznego. Analizuj dane z zaślepionymi warunkami eksperymentalnymi. Wykonaj test t-Studenta i test U-Manna-Whitneya dla porównań w 2 grupach. Liczby na każdym rysunku wskazują liczbę myszy używanych dla każdej grupy. Podaj wyniki jako średnią ± SEM.
  2. Rozważ, że różnice z p < 0,05 w teście U są statystycznie istotne: *, p < 0,05; **, p < 0,01; i ***, p < 0,005 w porównaniu z odpowiednimi kontrolami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty farmakologiczne

Aby ustalić, czy nasz nieinwazyjny pomiar EKG odzwierciedla wpływ autonomicznej modulacji na układ przewodnictwa serca, normalne myszy Balb/c zostały poddane działaniu agonistów i antagonistów autonomicznego układu nerwowego (ANS). Atropinę i karbachol stosowano odpowiednio w celu wywołania przywspółczulnej blokady autonomicznej i stymulacji, podczas gdy propranolol i izoprenalina podawano odpowiednio w celu wywołania i stymulacji współczulnej blok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Otaczające środowisko powinno być wolne od hałasu i wibracji. Elektrody EKG muszą być wprowadzane pod skórę stabilnie i konsekwentnie, a etap wprowadzania wymaga wstępnych eksperymentów, dopóki badacz nie uzyska doświadczenia technicznego. Ponadto środek znieczulający powinien być odpowiednio przygotowany i przechowywany oraz stosowany w odpowiedniej dawce. Na koniec fale PQRS powinny być odpowiednio zlokalizowane w poszczególnych dudnieniach EKG w oknie Widoku uśrednian...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów, finansowych lub innych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Programy Badań Podstawowych, które są zarządzane przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) (2015R1C1A2A01052419 i 2018R1D1A1B07042484).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,2,2-tribromoetanolSigma-AldrichT48402-25Gśrodki znieczulające, Avertin
AnimalJapan SLC, Inc., Shizuoka, JaponiaMyszy Balb/c, samce, w wieku 7-9 tygodni
AtropinaSigma-AldrichA0123przywspółczulny antagonista
BioAmpAD Instruments, Bella Vista, AustraliaML132biowzmacniacz
CarbacholSigma-AldrichC4382agonista przywspółczulny
Elektrody z igłami do akupunkturyDongBang Acupuncture Inc., Sungnam, KoreaDB1060,20 x 15 mm
Izoprenalina Agonistaukładu współczulnegoSigma-AldrichI2760
LabChart 8AD Instruments, Bella Vista, Australiaoprogramowanie do analizy danych
Pokarm dla myszyLabDiet, St. Louis, MO, USA5L79Dieta myszy
PowerLab 2/28AD Instruments, Bella Vista, Australiasystem gromadzenia danych
PropranololSigma-AldrichP0884sympatyczny antagonista
statystyczny SPSSstatystycznySPSSSPSS 25.0
Program Program

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ho, D., et al. Heart rate and electrocardiography monitoring in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 1, 123-139 (2011).
  2. Vatner, S. F., Takagi, G., Asai, K., Shannon, R. P. Cardiovascular physiology in mice: Conscious measurements and effects of anesthesia. Cardiovascular Physiology in the Genetically Engineered Mouse. , 257-275 (2002).
  3. Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ecg, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. Journal of visualized experiments : JoVE. (57), (2011).
  4. Chu, V., et al. Method for non-invasively recording electrocardiograms in conscious mice. BMC Physiology. 1, 6(2001).
  5. Kim, M. J., Lim, J. E., Oh, B. Validation of non-invasive method for electrocardiogram recording in mouse using lead ii. Biomedical Science Letters. 21, 135-143 (2015).
  6. Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 2134-2140 (2002).
  7. Mitchell, G. F., Jeron, A., Koren, G. Measurement of heart rate and q-t interval in the conscious mouse. The American Journal of Physiology. 274 (3), 747-751 (1998).
  8. Farraj, A. K., Hazari, M. S., Cascio, W. E. The utility of the small rodent electrocardiogram in toxicology. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 121 (1), 11-30 (2011).
  9. Gehrmann, J., et al. Impaired parasympathetic heart rate control in mice with a reduction of functional g protein betagamma-subunits. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (2), 445-456 (2002).
  10. Chu, V., et al. Electrocardiographic findings in mdx mice: A cardiac phenotype of duchenne muscular dystrophy. Muscle & Nerve. 26 (4), 513-519 (2002).
  11. Merentie, M., et al. Mouse ecg findings in aging, with conduction system affecting drugs and in cardiac pathologies: Development and validation of ecg analysis algorithm in mice. Physiological Reports. 3 (12), (2015).
  12. Calvillo, L., et al. Propranolol prevents life-threatening arrhythmias in lqt3 transgenic mice: Implications for the clinical management of lqt3 patients. Heart Rhythm : the Official Journal of the Heart Rhythm Society. 11 (1), 126-132 (2014).
  13. Zhang, Y., et al. Acute atrial arrhythmogenicity and altered ca(2+) homeostasis in murine ryr2-p2328s hearts. Cardiovascular Research. 89 (4), 794-804 (2011).
  14. Kmecova, J., Klimas, J. Heart rate correction of the qt duration in rats. European Journal of Pharmacology. 641 (2-3), 187-192 (2010).
  15. Kim, H. O., et al. Garem1 regulates the pr interval on electrocardiograms. Journal of Human Genetics. 63 (3), 297-307 (2018).
  16. Nam, J. M., Lim, J. E., Ha, T. W., Oh, B., Kang, J. O. Cardiac-specific inactivation of prdm16 effects cardiac conduction abnormalities and cardiomyopathy-associated phenotypes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (4), 764-777 (2020).
  17. Knollmann, B. C., et al. Isoproterenol exacerbates a long qt phenotype in kcnq1-deficient neonatal mice: Possible roles for human-like kcnq1 isoform 1 and slow delayed rectifier k+ current. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 310 (1), 311-318 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja elektrokardiogramuEKG w odprowadzeniu IIpozyskiwanie danych EKGanaliza EKG myszyautonomiczny uk ad nerwowyleczenie atropinleczenie karbacholemleczenie izoprenalinrozmieszczenie elektrod EKG

Powiązane artykuły