Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza i specyfikacja rozkładu wielkości granulek skrobi

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61586

⸱

4 marca 2021

 ,  , 
1Cooperative Agriculture Research Center, College of Agriculture and Human Science, Prairie View A&M University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj jest procedura do powtarzalnego i statystycznie ważnego oznaczania rozkładów wielkości granulek skrobi, oraz do określania ustalonych rozkładów wielkości granulek logarytmicznie za pomocą dwuparametrowej formy multiplikatywnej. Ma zastosowanie do wszystkich analiz wielkości granulek próbek skrobi w skali gramowej do badań naukowych nad roślinami i żywnością.  

Streszczenie

Skrobia ze wszystkich źródeł roślinnych składa się z granulek o różnych rozmiarach i kształtach, które występują różnie, tzn. mają rozkład wielkości i kształtu. Dane dotyczące wielkości granulek skrobi określone przy użyciu kilku rodzajów technik wymiarowania cząstek są często problematyczne ze względu na słabą odtwarzalność lub brak istotności statystycznej wynikający z pewnych niemożliwych do przezwyciężenia błędów systematycznych, w tym wrażliwości na kształty granulek i limity wielkości próbek granulek. Przedstawiliśmy procedurę odtwarzalnych i statystycznie ważnych oznaczeń rozkładów wielkości granulek skrobi przy użyciu techniki strefy wykrywania elektrycznego oraz określania wyznaczonych rozkładów wielkości logarytmiczno-normalnych granulek przy użyciu przyjętej dwuparametrowej formy multiplikatywnej o zwiększonej dokładności i porównywalności. Ma ona zastosowanie do wszystkich analiz wielkości granulek próbek skrobi w skali gramowej, a zatem może ułatwić badania nad tym, w jaki sposób rozmiary granulek skrobi są formowane przez aparat i mechanizmy biosyntezy skrobi; oraz jak wpływają one na właściwości i funkcjonalność skrobi do zastosowań spożywczych i przemysłowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki powtórzonych analiz rozkładu wielkości granulek próbek skrobi ze słodkich ziemniaków przy użyciu opisanej procedury. Omówiliśmy również kilka kluczowych aspektów technicznych procedury, w szczególności multiplikatywną specyfikację logarytmiczno-normalnych rozkładów wielkości granulek oraz niektóre środki techniczne do przezwyciężenia częstego blokowania apertury przez agregaty granulatu.

Wprowadzenie

Ziarna skrobi są strukturami fizycznymi, w których dwa główne polimery homoglukanu zapasowego w tkankach fotosyntetyzujących i magazynujących roślin, liniowa lub słabo rozgałęziona amyloza oraz silnie rozgałęziona amylopektyna, są uporządkowane wraz z niektórymi składnikami mniejszościowymi, w tym lipidami i białkami. Ziarna skrobi z różnych gatunków roślin wykazują wiele kształtów trójwymiarowych (3D) (przegląd w ref.1,2), w tym sfery, elipsoidy, wielościany, płytki, sześciany, prostopadłościan oraz nieregularne rurki. Nawet ziarna pochodzące z tej samej tkanki lub z różnych tkanek tego samego gatunku rośliny mogą posiadać zestaw kształtów o różnej częstotliwości występowania. Innymi słowy, ziarna skrobi danego gatunku rośliny mogą charakteryzować się statystycznym rozkładem kształtów, a nie jednym konkretnym kształtem. Niejednorodne i niesferyczne kształty ziaren utrudniają prawidłowy pomiar i zdefiniowanie ich rozmiarów. Ponadto ziarna skrobi z tych samych tkanek danego gatunku rośliny mają różne rozmiary o odmiennych proporcjach, tzn. wykazują charakterystyczny rozkład wielkości. Rozkład ten dodatkowo komplikuje analizę i opis rozmiarów ziaren skrobi.

Wielkość ziarn skrobi analizowano przy użyciu kilku kategorii technik pomiaru wielkości cząstek (przegląd w ref.3), w tym mikroskopii, sedymentacyjnej/sterycznej frakcjonacji przepływem polowym (Sd/StFFF), dyfrakcji laserowej oraz elektrycznej strefy detekcji (ESZ). Techniki te nie są jednak w równym stopniu odpowiednie do wyznaczania wielkości ziarn skrobi w przypadku występowania zróżnicowanych kształtów ziarn i rozkładu wielkości. Mikroskopia, w tym świetlna, konfokalna i skaningowa elektronowa, jest doskonała do badań morfologii4,5,6,7, struktury8,9 i rozwoju10,11 ziarn skrobi, lecz ze względu na pewne nieodłączne ograniczenia rzadko nadaje się do określania rozkładu ich wielkości. Bezpośrednie pomiary mikroskopowych obrazów ziarn lub wspomagana programowo analiza obrazów z mikroskopii optycznej (IAOM), stosowane do wyznaczania wielkości ziarn skrobi u kilku gatunków, w tym kukurydzy12, pszenicy13,14, ziemniaka15 i jęczmienia16, pozwalają na pomiar jedynie wymiarów 1D (zazwyczaj długości maksymalnej) lub 2D (powierzchni) bardzo ograniczonej liczby (od dziesiątek do kilku tysięcy) obrazów ziarn skrobi. Małe próbki ziarn, wynikające z ograniczeń tych technik, rzadko mogą być statystycznie reprezentatywne, biorąc pod uwagę ogromną liczbę ziarn na jednostkę masy skrobi (~120 x 106 na gram, przy założeniu, że są to sfery o średnicy 10 µm i gęstości 1,5 g/cm³), co może prowadzić do słabej powtarzalności wyników. Technika Sd/StFFF może charakteryzować się wysoką prędkością i rozdzielczością oraz wąskimi frakcjami wielkości ziarn skrobi17, ale jest rzadko stosowana, prawdopodobnie dlatego, że jej dokładność może być poważnie zaburzona przez uszkodzenia, zróżnicowane kształty i gęstość ziarn skrobi. Technika dyfrakcji laserowej jest najszerzej stosowana i była wykorzystywana do analiz wielkości ziarn skrobi u wszystkich głównych gatunków uprawnych3,14,16. Mimo wielu zalet, technika ta nie nadaje się w rzeczywistości do wyznaczania wielkości ziarn skrobi w przypadku występowania rozkładu kształtów ziarn. Większość współczesnych instrumentów do dyfrakcji laserowej opiera się na teorii rozpraszania światła Mie18 dla jednorodnych cząstek sferycznych oraz zmodyfikowanej teorii Mie18 dla niektórych innych jednorodnych kształtów. Technika ta jest zatem z natury bardzo wrażliwa na kształt cząstek i nie nadaje się w pełni nawet dla pewnych jednorodnych kształtów19, a tym bardziej dla ziarn skrobi o różnorodnych proporcjach kształtów. Technika ESZ mierzy zaburzenie pola elektrycznego proporcjonalne do objętości cząstki przechodzącej przez otwór. Dostarcza ona informacji o objętości ziarn, a także o ich liczbie i rozkładzie objętościowym itp., przy wysokiej rozdzielczości. Ponieważ technika ESZ jest niezależna od właściwości optycznych cząstek, w tym od koloru, kształtu, składu czy współczynnika załamania światła, a wyniki są bardzo powtarzalne, jest ona szczególnie odpowiednia do wyznaczania rozkładów wielkości ziarn skrobi o zróżnicowanych kształtach.

Wielkość ziarn skrobi definiowano również przy użyciu wielu parametrów. Często opisywano je w sposób uproszczony za pomocą średnic średnich, które w niektórych przypadkach stanowiły średnie arytmetyczne mikroskopowo zmierzonych maksymalnych długości obrazów 2D12,20, lub średnie średnic sfer równoważnych3. W innych przypadkach rozkłady wielkości ziaren określano za pomocą zakresów wielkości21,22, średniej objętości rozkładu lub średniej średnicy (równoważnej sferze, ważonej liczbą, objętością lub powierzchnią) przy założeniu rozkładu normalnego14,23,24,25,26. Te deskryptory wielkości ziaren skrobi z różnych analiz mają zupełnie różny charakter i nie są ściśle porównywalne. Bezpośrednie porównywanie tych „wielkości” ziaren skrobi pochodzących od różnych gatunków, a nawet z tych samych tkanek tego samego gatunku, mogłoby być bardzo mylące. Ponadto w większości badań pomijano parametr rozproszenia (lub kształtu) przyjętych rozkładów normalnych, tzn. odchylenie standardowe σ (lub graficzne odchylenie standardowe σg) mierzące szerokość rozkładu (tj. rozrzut wielkości).

Aby rozwiązać wspomniane krytyczne problemy związane z analizą wielkości ziaren skrobi, opracowaliśmy procedurę powtarzalnego i statystycznie poprawnego wyznaczania rozkładów wielkości ziaren w próbkach skrobi z wykorzystaniem techniki ESZ oraz właściwego określania wyznaczonych lognormalnych rozkładów wielkości ziaren przy użyciu przyjętej dwuparametrowej formy multiplikatywnej27 z poprawioną dokładnością i porównywalnością. W celu walidacji i demonstracji przeprowadziliśmy powtórne analizy wielkości ziaren w próbkach skrobi z batata zgodnie z tą procedurą oraz określiliśmy lognormalne rozkłady różnicowego procentu objętości w funkcji średnicy równoważnej sfery objętościowej, wykorzystując ich geometryczne średnie graficzne figure-introduction-1 oraz multiplikatywne odchylenia standardowe s* w formie figure-introduction-2 x/ (mnożenie i dzielenie) s*

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbek skrobi

  1. Przygotować dwie (lub trzy) powtórne próbki skrobi w skali gramowej z tkanek kumulujących skrobię różnych gatunków roślin zgodnie z ustalonymi procedurami (np. ziemniaków15, batatów28, ziaren pszenicy13,29 oraz ziaren kukurydzy30 itd.).
  2. Próbki skrobi dokładnie przemyć acetonem lub toluenem 3–4 krotnie, aby zminimalizować obecność agregatów granulek, a następnie całkowicie wysuszyć.
    UWAGA: Należy stosować procedury ekstrakcji, które pozwalają uzyskać więcej niż 1 g skrobi z jednej preparacji. W celu analizy wielkości granulek jednego ekstraktu skrobi pobiera się odpowiednio jedną lub dwie alikwoty o masie 0,5 g z każdego z trzech lub dwóch powtórnych ekstraktów.

2. Przygotowanie elektrolitu

  1. Przygotować 500 mL 50 g/L chlorku litu w metanolu na cztery serie pomiarów wielkości dla powtórzeń próbek skrobi (100 mL na serię plus dodatkowe 100 mL). Zaleca się przygotowanie elektrolitu w dużych partiach, np. od 4 do 8 L na raz, aby zminimalizować różnice w stężeniu.
  2. Schłodzić pojemnik w lodzie lub w komorze o temperaturze 4 °C, aby przyspieszyć rozpuszczanie chlorku litu.

3. Konfiguracja analizatora

  1. Wybierz rurkę z aperturą o zakresie średnicy cząstek obejmującym znany (z literatury lub z prób wstępnych) zakres wielkości ziarn próbek skrobi przeznaczonych do analizy, np. aperturę 100 μm dla skrobi z batatów. Dla próbek skrobi o nieznanym zakresie wielkości ziarn dobierz odpowiednią aperturę w drodze prób wstępnych, wykorzystując kilka rurek z aperturami o nakładających się zakresach średnic cząstek.
    UWAGA: Zakres średnicy cząstek rurki z aperturą to jej dokładny zakres pomiarowy od 2 do 60% średnicy otworu, z rozszerzonym zakresem pomiarowym do 80% tej średnicy. W Tabeli 1 przedstawiono właściwości trzech najużyteczniejszych rurek z aperturami do pomiaru wielkości ziarn głównych skrobi roślinnych. Jeśli zakres wielkości ziarn próbki skrobi jest szerszy niż zakres pomiarowy pojedynczej rurki z aperturą, przeprowadź analizę z nakładaniem wielu rurek, łącząc do pięciu rozkładów wielkości cząstek zmierzonych aperturami o różnych rozmiarach. Każdą aperturę można zidentyfikować po jej średnicy i numerze części naniesionym na rurkę. Jej średnicę oraz numer seryjny zawarty w kodzie kreskowym na rurce można zeskanować do oprogramowania analizatora za pomocą czytnika kodów kreskowych na panelu sterowania analizatora.
  2. Do oznaczania wielkości ziarn skrobi wybierz zlewkę analityczną o pojemności 100 lub 200 mL (zamiast kuwet) i ustaw automatyczne mieszanie (opisane poniżej), aby utrzymać odpowiednią zawiesinę ziarn podczas pomiaru.
  3. Utwórz Standardową Metodę Operacyjną (SOM), aby określić ustawienia pomiaru, oraz plik Preferencji do analizy, przeglądania i drukowania wyników. W razie potrzeby połącz SOM i plik Preferencji w Standardową Procedurę Operacyjną (SOP).
    UWAGA: W przypadku analiz niestandaryzowanych używaj SOM do przeprowadzania analiz i w razie potrzeby koryguj ustawienia SOM między pomiarami w oknie Edit the SOM (patrz poniżej). Po zakończeniu pomiaru przeanalizuj, przejrzyj i wydrukuj wyniki, zmieniając Preferencje według uznania. W przypadku standaryzowanych analiz wielkości ziarn używaj SOP do przeprowadzania analiz.
    1. Uruchom oprogramowanie analizatora. W menu głównym kliknij SOP | Create SOM Wizard lub Edit the SOM, lub w panelu statusu kliknij Edit SOM. Użyj kreatora lub okna Edit the SOM, aby wybrać ustawienia dla SOM. Ustawienia zazwyczaj stosowane do pomiaru wielkości ziarn próbek skrobi z batatów podsumowano w Tabeli 2.
    2. Zapisz utworzoną SOM jako plik w oknie Create SOM Wizard-Summary of Settings lub w oknie Edit the SOM.
    3. W menu głównym kliknij SOP | Create Preferences Wizard lub Edit Preferences. Użyj kreatora lub kart w oknie edycji Preferencji, aby wybrać ustawienia preferencji zgodne z Tabelą 3 lub inne według uznania.
    4. Zapisz wybrane Preferencje w pliku w oknie Create Preferences Wizard-Summary of Settings lub w oknie Edit Preferences.
    5. W menu głównym kliknij SOP | Create SOP Wizard. Postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku w kreatorze, wprowadź opis, wybierz plik SOM oraz plik Preferencji, aby utworzyć i zapisać SOP.

4. Analizy wielkości ziarn skrobi w próbkach

  1. Przygotowanie analizatora
    1. Włącz analizator, uruchom oprogramowanie na komputerze i po automatycznym połączeniu z urządzeniem sprawdź status Ready w górnej części panelu Status Panel.
    2. Napełnić naczynie z elektrolitem nowym roztworem; w razie potrzeby opróżnić naczynie z odpadami.
    3. Należy prawidłowo zainstalować i zamocować wybraną rurkę przysłony zgodnie z instrukcją zawartą w podręczniku użytkownika. W przypadku nowej, nie skalibrowanej rurki przysłony, należy ją skalibrować zgodnie z instrukcją krok po kroku w sekcji Kalibracja | Kalibracja apertury w Menu Głównym. W przypadku skalibrowanej rurki aperturowej należy zweryfikować kalibrację zgodnie z instrukcją krok po kroku w Kreator zmiany rurki aperturowej pod Uruchomienie lub Kalibracja | Weryfikacja kalibracji apertury w Menu głównym.
    4. Odblokuj platformę analizatora, naciskając klips zwalniający blokadę (znajdujący się na środku przedniej ścianki lewej komory na próbki), a następnie ręcznie opuść platformę na dół. Umieść na platformie zlewkę analityczną zawierającą 100 ml elektrolitu, przesuń mieszadło do pozycji mieszania i ręcznie podnieś platformę do samoblokującej się pozycji górnej, aby zanurzyć rurkę wlotową i mieszadło w elektrolicie.
    5. Kliknij Wypełnij na dolnym pasku narzędzi instrumentu, aby analizator automatycznie napełnił system elektrolitem, a następnie kliknij Przepłukanie aby analizator automatycznie przepłukał system.
    6. Załaduj SOM, klikając Standardowa Procedura Operacyjna (SOP) | Wczytaj SOM w menu głównym, i użyj SOM do przeprowadzenia analizy bez pliku Preferencji. Alternatywnie załaduj SOP, klikając SOP | Wczytaj SOP w Menu głównym lub Załaduj SOP na Panelu Statusu, a następnie należy użyć SOP do przeprowadzenia analizy.
    7. Jeśli korzystasz z SOP, kliknij Standardowa Procedura Operacyjna (SOP) | Informacje o SOM lub Informacje o preferencjach w Menu głównym, aby zweryfikować ustawienia SOM i preferencje. Kliknij Próbka | Wprowadź informacje o próbce w Menu głównym lub Informacje o edycji w panelu statusu (Status Panel), aby wprowadzić informacje o próbkach dla danego przebiegu.
  2. Przygotowanie próbek skrobi w metanolu oraz zawiesin do wymiarowania
    1. Odważ dwie lub jedną próbkę o masie 0,5 g z odpowiednio dwóch lub trzech powtórzeń ekstraktów skrobi.
    2. Każdą z aliquot 0,5 g skrobi należy dodać do 5 ml metanolu w stożkowatej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie w pełni rozproszyć granulki skrobi, stosując kilka impulsów ultradźwięków o niskiej intensywności (12–24 W/cm²).2) z procesora ultradźwiękowego.
    3. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej nanieś jedną małą kroplę zawiesiny skrobi w metanolu (~0,2 mL) do 100 mL elektrolitu LiCl w metanolu o stężeniu 50 g/L, znajdującego się w zlewce pod stałym mieszaniem. Zamknij drzwiczki komory z próbką.
  3. Przeprowadź analizę wyznaczającą wielkość fragmentów
    1. Kliknij Podgląd w dolnym pasku narzędzi instrumentu (Instrument Toolbar), aby rozpocząć uruchomienie próbne. Na panelu stanu (Status Panel) należy zweryfikować, czy dynamicznie wyświetlany pasek stężenia jest zielony i wskazuje nominalny zakres stężenia zawiesiny od 5 do 8%.
    2. Kliknij Zatrzymaj na dolnym pasku narzędzi, aby zatrzymać uruchomienie funkcji Preview. W razie potrzeby rozcieńczyć zawiesinę skrobiowo-elektrolityczną, zastępując część zawiesiny elektrolitem, a następnie powtórzyć uruchomienie funkcji Preview.
      UWAGA: Nominalny zakres stężenia zawiesiny od 5% do 8% ma krytyczne znaczenie dla ukończenia pomiaru bez przestojów spowodowanych zablokowaniem otworu przez zagregowane granulki. W razie potrzeby należy dostosować objętość kropli próbki i/lub stężenie zawiesiny skrobi w metanolu, aby przygotować nową zawiesinę skrobiowo-elektrolityczną o nominalnym stężeniu mieszczącym się w optymalnym zakresie.
    3. Po weryfikacji kliknij Start na dolnym pasku narzędzi, aby rozpocząć pomiar. Analizator automatycznie kończy pomiar po osiągnięciu całkowitej liczby granul o określonym rozmiarze, która jest wyświetlana wraz z czasem trwania pomiaru na Status Panel podczas pomiaru osiąga ustawioną całkowitą liczbę zliczeń (125 000 lub 250 000) do Tryb kontrolny SOM. W zależności od stężenia zawiesiny (w zakresie 5–8% lub niższym), pojedynczy pomiar trwa od 2 do 5 min lub dłużej.
      UWAGA: Gdy analizator automatycznie wykryje zablokowanie otworu zgodnie z ustawieniami wykrywania blokad w SOM, przerwie on pomiar, przeprowadzi płukanie w celu odblokowania otworu, a następnie rozpocznie nowy pomiar. Działanie to w przypadku blokady może zostać powtórzone maksymalnie cztery razy, zanim analizator anuluje operację pomiarową. Problem z przerywaniem pomiaru z powodu blokady można rozwiązać, stosując dwie metody techniczne opisane w Tabela 2 or szczegółowo opisane w dyskusji.
    4. W razie potrzeby przeprowadź powtórzenie techniczne (patrz Tabela 2 i szczegółowo opisano w sekcji Dyskusja) przy użyciu tej samej zawiesiny skrobiowo-elektrolitowej poprzez proste kliknięcie Start lub Powtórz na dolnym pasku narzędzi.
    5. Po zakończeniu pomiaru lub serii pomiarów opróżnić zlew, wypłukać go metanolem, a następnie ponownie napełnić 100 ml świeżego roztworu elektrolitu przed kolejnym pomiarem.
    6. W trakcie pomiaru, jeżeli Rozszerzony zakres rozmiarów okno powiadomienia pojawia się, gdy liczba granul większych niż 60 µm przekracza 0,1% całkowitej liczby (zgodnie z ustawieniem SOM), kliknij Uruchomić w zakresie od 60% do 80% do przeprowadzenia pomiarów w rozszerzonym zakresie dynamicznym wielkości cząstek, obejmującym do 80% średnicy apertury.
      UWAGA: Rozszerzony zakres rozmiarów ustalanie działań kontrolnych dla granulek o rozmiarze przekraczającym 60% średnicy otworu (100 µm, w tym przypadku). Ustawienia w SOM określają włączenie ziaren skrobi o rozmiarach większych niż 60 µm gdy ich liczba przekroczy 0,1% całkowitej liczby zdarzeń. Zakończenie pomiaru jest nadal kontrolowane przez całkowitą liczbę zdarzeń i może zająć nieco mniej czasu niż w przypadku nieuwzględnienia większych granul, których suma stanowi mniej niż 0,1% (zakładana statystycznie nieistotna ilość) całkowitej liczby zdarzeń.
  4. Analiza wyników przebiegu
    1. Jeśli do kontroli przebiegu analiz wykorzystano moduł SOM, należy wybrać odpowiednie ustawienia w zakładce Preferences w celu wyświetlania, drukowania i przeprowadzania analiz statystycznych wyników przy użyciu Kreator preferencji lub dla Preferencje edycji pod Standardowa procedura operacyjna (SOP) w Menu głównym.
    2. Nałóż wyniki z wielu serii pomiarowych na jeden wykres w celu ich porównania.
      1. Kliknij Nałożenie na Główny pasek narzędzi lub Plik | Nałożenie w Menu głównym, aby przejść do okna Overlay. W polu Files przejdź do żądanych plików z wynikami i zaznacz kilka z nich, a następnie kliknij Dodaj aby przenieść je do pola Wybrane pliki, a następnie kliknąć Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. aby nałożyć wybrane wyniki na jeden wykres.
      2. Aby dodać plik do otwartej nakładki, kliknij PlikUruchamiania | Otwórz do nałożenia w menu Run, aby uzyskać dostęp do okna Overlay, przejdź do żądanego pliku i kliknij, aby go dodać.
    3. Średnie wyniki z analiz powtórzonych (2 ekstrakty x 2 pobrania skrobi lub 3 ekstrakty x 1 pobranie skrobi) oraz możliwość wyświetlenia lub wydrukowania średniego rozkładu wielkości ziaren i statystyk w formie listy lub wykresu.
      1. W menu głównym kliknij Plik | NarzędziePlikowy | Średnia aby otworzyć okno Average. Przejdź do pola Files i zaznacz wiele wybranych plików z wynikami, a następnie kliknij Dodaj aby przenieść je do okna Wybrane pliki, a następnie kliknąć Proszę podać tekst do tłumaczenia. aby uśrednić wybrane wyniki i wyświetlić średnią na jednym wykresie.
      2. Aby dodać dodatkowy plik z wynikami do średniej dystrybucji, w menu Run kliknij Plik uruchamiający Otwórz i dodaj do średniej Aby otworzyć okno Add to Average (Dodaj do średniej), przejdź do odpowiedniego pliku i dodaj go. Nowa średnia pojawi się na wykresie w oknie Run (result) lub na liście.

5. Określanie średniego rozkładu

  1. W oknie Run-Menu wyświetlającym średni rozkład, kliknij Calculate | Averaged Statistics w menu Run Menu, aby otworzyć okno podsumowania statystyk, w którym średnie statystyki są wyświetlane w wierszach, a statystyki wykresu dla średniego rozkładu w kolumnach.
  2. Użyj graficznej średniej geometrycznej (figure-protocol-1) oraz S.D. (s*) w kolumnie statystyk wykresu, aby określić średni rozkład w formie figure-protocol-2 x/ s*. Oblicz CV, mierzące zmienność pomiędzy uśrednionymi rozkładami powtórzeń, dzieląc średnią (µ, to samo co figure-protocol-3 średniego rozkładu) średnich geometrycznych uśrednionych rozkładów przez średnie S.D. (σ) podane w wierszu średnich statystyk.
    UWAGA: Średnie S.D. (dla µ) oceniające zmienność pomiędzy średnimi rozkładów powtórzeń różni się od graficznego geometrycznego S.D. (dla figure-protocol-4), które mierzy rozrzut średniego rozkładu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu zweryfikowania procedury i zademonstrowania odtwarzalności określonego rozkładu wielkości granulek przeprowadzono powielone analizy rozmiarów próbek skrobi z batatu. Przygotowano powielone próbki skrobi (S1 i S2) z batatów uprawianych w polu, należących do linii hodowlanej SC1149-19, o podobnym stopniu dojrzałości, stosując wcześniej opisaną procedurę28. Z każdego ekstraktu skrobi pobrano dwie alikwoty po 0,5 g (a i b), zawieszono w 5 mL metanolu i poddano sonifikacji przy użyciu kilku impu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana procedura rozwiązała kilka krytycznych problemów występujących w istniejących metodach analizy wielkości ziaren skrobi, w tym niewłaściwe pomiary 1D lub 2D ziaren trójwymiarowych, zniekształcenia pomiarów wynikające z niejednorodnych kształtów ziaren, słabą powtarzalność i wątpliwą istotność statystyczną ze względu na ograniczoną liczebność próbek ziaren oraz niedokładne lub niewłaściwe określanie wielkości ziaren (zwłaszcza stosowanie średniej wielkości) w przypadku występowania zróżnicowanych kształtów ziaren i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Ta praca jest częściowo wspierana przez Centrum Badań nad Rolnictwem Spółdzielczym oraz Centrum Badań nad Zintegrowanym Bezpieczeństwem Żywnościowym Kolegium Rolnictwa i Nauk Humanistycznych, Prairie View A&M University. Dziękujemy Hua Tian za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka analitycznaBeckman Coulter Life SciencesA35595Zlewka Smart-Technology (ST)
Rurka apertury, 100 i mikro; mBeckman Coulter Life SciencesA36394Do MS4E Jednorazowy
pipet transferowy,FisherScientific (Fishersci.com)13-711-9AMMożna również stosować inne jednorazowe pipety transferowe z podobnym otworem.
Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu Fisherbrand, 50 mlFisher Scientific (Fishersci.com)05-539-13Można użyć innych podobnych typów probówek.
Zlewki szklane, od 150 do 250 mlFisher Scientific (Fishersci.com)02-540KTe zlewki są używane do przechowywania metanolu do mycia rurki przysłony i mieszadła między cyklami.
LiClFisher ChemicalL121-100
MetanolFisher ChemicalA412-500Kupuj hurtowo, ponieważ analiza wykorzystuje dużą ilość metanolu.
Wagi precyzyjne ML-T METTLER TOLEDO30243412się każda inna waga precyzyjna o dokładności odczytu od 0,01 g do 1 mg.
Multisizer 4e Coulter CounterBeckman Coulter Life SciencesB23005Stary model, Multisizer 3 może być również używany z niewielką korektą parametrów. Model 4e jest wyposażony w 100 μ m tubus przysłony. Inne rurki aperturowe o różnej średnicy można kupić osobno od firmy.
Procesor ultradźwiękowy UP50HHielscher Ultrasound TechnologyUP50HInny sonograf laboratoryjny o małej mocy (< 50 Watt) wyjście może być również używane. Zarówno sonotrody MS1, jak i MS2 dla konkretnego sonikatora mogą być używane do dyspersji granulek skrobi w 5 ml metanolu. Zawsze najpierw używaj najniższego ustawienia, 20% amplitudy i cyklu 0,1 lub 0,2, a następnie zwiększaj ustawienie, jeśli agregaty utrzymują się w zawieszeniu.
Sprawdzi

Bibliografia

  1. Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. BeMiller, J., Whistler, R. , Academic Press. Ch. 3 23-82 (2009).
  2. Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
  3. Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch - Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
  4. Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
  5. Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
  6. Matsushima, R. Starch: Metabolism and Structure. Nakamura, Y. , Ch. 13 425-441 (2015).
  7. Wang, S. -q, Wanf, L. -l, Fan, W. -h, Cao, H., Cao, B. -s Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
  8. Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
  9. Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
  10. Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
  11. Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
  12. Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
  13. Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
  14. Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
  15. Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
  16. Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
  17. Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
  18. Wriedt, T. The Mie Theory: Basics and Applications. Wolfram, H., Wriedt, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 53-71 (2012).
  19. Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. ÅS., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
  20. Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
  21. Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
  22. Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
  23. Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
  24. Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch - Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
  25. Li, W. -Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
  26. Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
  27. Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
  28. Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259(2016).
  29. Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
  30. Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
  31. Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , QLD. Australia. 309-320 (2004).
  32. Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Techniki okre lania wielko ci cz stekelektryczna strefa pomiarowalognormalne rozk ady wielko cibiosynteza skrobiprzygotowanie pr bek granuldob r rurki przys onyprzygotowanie roztworu elektrolitumetody analizy statystycznejskrobia z batata
Analiza i specyfikacja rozkładu wielkości granulek skrobi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.