Odróżnianie wewnątrzpłucnych komórek odpornościowych od wewnątrznaczyniowych populacji komórek odpornościowych: podejście wewnątrzszyjne

Podsumowanie

Celem obecnego badania jest opisanie protokołu różnicowania między wewnątrznaczyniowymi i intrapażowymi komórkami odpornościowymi w badaniach nad zapaleniem płuc. Używamy dożylnego wstrzyknięcia fluorescencyjnego znakowanego przeciwciała przed pobraniem płuc. Ponadto stosujemy proces trawienia płuc oparty na inflacji, aby poprawić wydajność leukocytów z płuc.

Streszczenie

Rytmy okołodobowe odnoszą się do oscylacji w różnych procesach biologicznych, które występują w ciągu 24 godzin. Na poziomie molekularnym takie rytmy składają się z sieci pętli transkrypcyjno-translacyjnego sprzężenia zwrotnego (TTFL) genów zegara rdzeniowego. Poszczególne tkanki i układy narządów, w tym układ odpornościowy, mają swój własny zegar. W krążeniu ogólnoustrojowym różni członkowie populacji CD45⁺ oscylują w ciągu dnia; jednak wiele z tych rytmów nie jest identycznych ani nawet podobnych w populacji leukocytów CD45 ⁺ rezydujących w tkance. Podczas badania roli dobowej regulacji stanu zapalnego płuc może być konieczne zbadanie CD45⁺ w płucach. Jednak pomimo zoptymalizowanych metod perfuzji, leukocyty uwięzione w krążeniu utrzymują się w płucach. Celem opracowania tego protokołu było rozróżnienie leukocytów wewnątrznaczyniowych i intrapażąszowych. W tym celu myszom wstrzykuje się doszyjnie znakowane fluorescencyjnie przeciwciało CD45 na krótko przed pobraniem płuc. Następnie płuca są trawione przy użyciu dostosowanej techniki trawienia płuc w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Próbka jest barwiona pod kątem regularnego panelu przeciwciał dla intraparenchymalnych komórek odpornościowych (w tym innego przeciwciała CD45). Analizy cytometryczne wskazują na wyraźne wyjaśnienie populacji. W związku z tym metoda znakowania i definiowania wewnątrzpłucnych komórek CD45⁺ będzie szczególnie ważna tam, gdzie zachowanie wewnątrzpłucnych i krążących komórek odpornościowych jest numerycznie i funkcjonalnie różne.

Wprowadzenie

Opisujemy tutaj skuteczne i niezawodne metody różnicowania leukocytów wewnątrznaczyniowych od leukocytów płucnych. Nawet przy najlepszych technikach perfuzji badania wykazały, że resztki CD45 ⁺ z krążenia utrzymują się w płucach. Upośledza to zdolność rozróżniania rytmów w krążeniu i w płucach. Efekt ten jest dodatkowo wzmocniony w przypadku zapalenia płuc. Jest to szczególnie istotne dla badań nad dobową regulacją stanu zapalnego.

Rytmy okołodobowe odnoszą się do dziennych oscylacji w różnych procesach biologicznych, które zachodzą w okresie 24 godzin. System okołodobowy jest ewolucyjnie konserwatywnym mechanizmem antycypacyjnym, który zapewnia ochronę gospodarzowi, gdy stoi on w obliczu zmian w swoim środowisku, takich jak zagrożenie infekcjami. Na poziomie komórkowym zegar jest zorganizowany w samopodtrzymujące się transkrypcyjne i translacyjne pętle sprzężenia zwrotnego składające się z genów zegara rdzeniowego¹. Układ odpornościowy ma swój własny zegar, który wpływa na jego reakcję na patogeny i zniewagi zapalne^2,3. Rytmy okołodobowe, jako narząd stale narażony na działanie środowiska, są szczególnie ważne w klasie płuc4. Różne procesy immunologiczne w płucach są pod kontrolą zegara^5,6,7. Jednak faza różnych procesów biologicznych w płucach i krążenie ogólnoustrojowe nie są takie same⁸, co z kolei sugeruje również, że oscylacje leukocytów w płucach i krążenie mogą nie być identyczne. W związku z tym posiadanie metody skutecznego rozróżniania leukocytów płucnych i wewnątrznaczyniowych będzie miało kluczowe znaczenie w kontekście okołodobowym.

Celem tego badania było opracowanie metody, która niezawodnie odróżnia leukocyty wewnątrznaczyniowe od intrapażowych. W tym celu zastosowaliśmy znakowanie leukocytów wewnątrznaczyniowych i metodę trawienia płuc. Do znakowania leukocytów wewnątrznaczyniowych stosujemy wstrzyknięcie doszyjne, które jest ukierunkowane na duże naczynie krwionośne i może być powtarzalnie stosowane u myszy wszystkich szczepów i rozmiarów. Wiele innych metod wykorzystywało iniekcję żył ogonowych ^9,10, które są notorycznie trudniejsze do wykonania u myszy Bl6¹¹. Wstrzyknięcie doszyjkowe wymaga użycia znieczulenia i najlepiej wykonać je pod bezpośrednią wizualizacją za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub lup powiększających. W związku z tym należy rozważyć łatwość i niezawodność wstrzyknięcia doszyjkowego w stosunku do konieczności zastosowania znieczulenia i specjalnego sprzętu. Biorąc jednak pod uwagę łatwą dostępność tego sprzętu w większości laboratoriów badawczych, nie uważamy tego za czynnik ograniczający. Jednak rozsądna wydaje się rozwaga w każdym przypadku z osobna.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Pensylwanii i spełniły wymagania Przewodnika po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych.

UWAGA: Cały proces można podzielić na 1) dożylne znakowanie CD45, 2) zbiory, 3) trawienie i 4) barwienie i cytometrię przepływową. Kroki te zostały podsumowane w Rysunek 1.

1. Roztwory/Przygotowanie odczynników

1. Przygotuj pożywkę dysocjacyjną, dodając 5 ml 2 ml 2 mM L-glutaminy, 20 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1 ml 2-merkaptoetanolu i 10 ml Pen/Strep do 500 ml DMEM.
   UWAGA: Media dysocjacyjne są stabilne do 2 miesięcy przy przechowywaniu w temperaturze 2-4 °C.
2. Przygotuj bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), dodając 10 ml FBS i 500 mg azydku sodu do 500 ml PBS bez magnezu i wapnia.
   UWAGA: Po dodaniu azydku sodu bufor FACS może być przechowywany w temperaturze 2-4 °C przez wiele miesięcy.
3. W dniu pobrania próbki dodać roztwory DNazy i Liberazy do pożywki dysocjacyjnej w rozcieńczeniu 1:100 (tj. dodać 10 μl DNazy i liberazy na każdy 1 ml pożywki dysocjacyjnej).
   UWAGA: Dla każdej myszy trawienie całego płuca wymaga 10 ml / mysz, a połowa płuc wymaga 5 ml / mysz.

2. Dożylne oznaczanie CD45

1. Do tego eksperymentu użyj dorosłych myszy C57Bl6 w wieku 8-12 tygodni.
2. Znieczulij myszy wybranymi środkami. W tym celu zastosowano kombinację ksylazyny i ketaminy, ale dopuszczalne są również inne środki. Celem jest uzyskanie umiarkowanego lub głębokiego poziomu znieczulenia, który trwa około 5 -10 minut.
   UWAGA: Mieszaninę ksylazyny i ketaminy do znieczulenia podaje się dootrzewnowo. Stosować 10-15 mg/kg ksylazyny i 120-150 mg/kg ketaminy.
3. Gdy odruch pedałowania jest ujemny, ułóż zwierzę na grzbiecie i delikatnie przyklej mu kończyny, aby głowa była jak najbardziej centralna.
4. Odsłoń żyłę szyjną i mięsień piersiowy, podnosząc skórę kleszczami i przecinając ostrymi nożyczkami chirurgicznymi.
5. Wstrzyknąć 200 μl przeciwciała anty-CD45 (przeciwciało klasy cytometrii przepływowej; rozcieńczone w stosunku 1:300 w PBS) do żyły szyjnej za pomocą igły 28 G. Odczekaj 2-4 minuty, aby przeciwciało mogło krążyć w całym układzie krwionośnym.
   UWAGA: Wejście przez mięsień piersiowy do żyły szyjnej pod płytkim kątem zapobiega wystąpieniu znacznego krwawienia.
6. Następnie należy poddać zwierzę eutanazji poprzez wystawienie na działanie CO₂ przez 10 minut. Przystąp do perfuzji płuc i zbierz płuca i inne tkanki.
   UWAGA: Każda inna metoda humanitarnej eutanazji, która jest zgodna z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt, jest również dopuszczalna.

3. Sekcja/Żniwa (Rysunek 1)

1. Ułóż zwierzę na plecach na płaskiej desce i przypnij łapy w dół, trzymając głowę centralnie.
2. Spryskaj ciało 70% etanolem. Otwórz klatkę piersiową za pomocą kleszczy i nożyczek, aby odsłonić płuco, serce i tchawicę.
3. Wykonaj fuzję płuca, wykonując małe nacięcie w lewej komorze serca i wstrzykując 10 ml zimnego PBS przez prawą komorę.
4. Wytnij otwór w tchawicy i włóż kaniulę dożylną. Po włożeniu kaniuli przełóż pod tchawicą sznurek do szycia o długości około 6-8 cm i przywiąż go dwukrotnie do kaniuli.
5. Wsuń sznurek chirurgiczny do kaniuli i podłącz strzykawkę zawierającą pożywkę dysocjacyjną (5 ml na pół płuca lub 10 ml na całe płuco), jak pokazano na Rysunek 1B.
6. Delikatnie odciąć płuco od reszty ciała i umieścić strzykawkę z podłączonym płucem w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.

4. Trawienie do zawiesiny jednokomórkowej

1. Inkubować płuca w temperaturze 37 °C przez 30-40 minut, wkraplając 1 ml (na połowę płuca) lub 2 ml (na całe płuco) pożywki dysocjacyjnej co 5 minut.
2. Po wkropleniu wszystkich pożywek wyjmij strzykawkę i kaniulę, a następnie umieść stożkową rurkę o pojemności 50 ml w łaźni wodnej z wytrząsaniem z prędkością 180 obr./min na pozostałą część inkubacji, aby uzyskać lepszą wydajność.
   UWAGA: Alternatywnie probówki można ręcznie wstrząsać co 5 minut.
3. Dodaj 10 ml PBS i energicznie wstrząsaj przez 1 minutę, aby zatrzymać reakcję.
4. Przepuścić roztwór przez sitko do komórek (70 μm) do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Użyj gumowego korka do strzykawki o pojemności 5 ml, aby przepuścić wszelkie grudki tkanki przez sitko. Dodaj PBS tak, aby końcowa objętość wynosiła 30 ml.
5. Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 1 200 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu. Odpipetować pozostały roztwór.
6. Dodać 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) i wymieszać z osadem komórkowym przez pipetowanie.
7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60-90 s. Dodać PBS tak, aby końcowa objętość wynosiła 30 ml, aby zatrzymać reakcję.
   UWAGA: Czas inkubacji zależy od ilości krwi w osadzie komórkowym; Im bardziej czerwony osad komórkowy, tym dłuższy czas inkubacji.
8. Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 1 200 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu. Odpipetować pozostały roztwór.
9. Dodać 1 ml buforu FAC do osadu komórkowego i wymieszać pipetując.

5. Barwienie komórek do cytometrii przepływowej

1. Użyj licznika komórek, aby określić całkowitą liczbę komórek w zawiesinie komórki.
2. Przenieść zawiesinę komórek do każdej oznakowanej probówki FACS tak, aby w próbce było łącznie 3 x 10⁶ komórek.
3. Dodaj Fc Block (rozcieńczony w stosunku 1:100) i inkubuj przez 15 minut na lodzie.
4. Odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 1 200 x g i w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.
5. Wybarwić próbki określoną mieszaniną przeciwciał i inkubować przez 20 minut na lodzie chronionym przed światłem (tj. przez przykrycie folią aluminiową). Wymieszać, przykładając probówki do uchwytu probówki w połowie inkubacji.
6. Dodać 1 ml buforu FACS do przepłukania i wymieszać pipetując.
7. Przenieść zawiesinę komórek do innej probówki FACS, powoli pipetując zawiesinę przez sitko o średnicy 35 μm.
8. Odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 1 200 x g i w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.
9. Dodać 150 μl buforu FACS i wymieszać pipetując.
10. Dodać 10 μl DAPI (1:100) do każdej probówki bezpośrednio przed uruchomieniem próbek.
    UWAGA: Próbki są teraz gotowe do badania na cytometrze przepływowym.

Wyniki

Stosując tę technikę, całkowita liczba komórek w naiwnych, dysocjowanych płucach (do reprezentatywnych danych wykorzystano wyłącznie lewe płaty) wynosiła od 27,3 x 10⁶ do 71,1 x 10⁶ komórek/mL. Po bramkowaniu według wielkości oraz odrzuceniu dubletów i martwych komórek (schemat bramkowania na Rysunku 2), liczba leukocytów mieściła się w przedziale od 6,9 x 10⁶ do 13,5 x 10⁶ komórek/mL. Leukocyty krążące, które pozostają uwięzione nawet po perfuzji ...

Dyskusja

Dokładne badania nad stanem zapalnym płuc i odpowiedzią immunologiczną płuc mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia wielu schorzeń. Cytometria przepływowa jest rutynowo stosowana do wyliczania i przypisywania funkcjonalnego znaczenia leukocytów płucnych. Funkcja leukocytów zależy przynajmniej częściowo od tego, gdzie się znajdują. Chociaż istnieje coraz więcej dowodów na to, że nawet po doskonałych protokołach perfuzji wiele leukocytów wewnątrznaczyniowych utrzymuje się w płucach, większość badań nie rozróżnia leukocytów...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
kąpieli wodnej Boekel Scientific Grant	Scientific	290200
10 ml strzykawki BD z końcówką BD Luer-Lok 309604
Anti-CD45- Pac Blue	Biolegend	103114
Anti-CD45- Pe/Cy7	Biolegend	103114
Sitko do komórek 70 i mikro; m Nylon	Fisher	352350
Probówka wirówkowa ze stożkowym dnem Corning 50 ml	Avantor	21008-714
Probówka Corning Falcon z sitkiem do komórek Zatrzask	EMSCO	10004637
Mikroskop preparacyjny	Olympus	SZX-SDO2
DMEM, technologie życia o wysokim poziomie glukozy		11965084
Dnase	Roche
DPBS bez Ca++ & Mg++		14190136
Fc Block	Biolegend	101320
Hyklon Płodowa surowica bydlęca	GE Healthcare	SH30071.03
L-glutamina (200 mM)	Life Technologies	25030-081
Liberase Research Grade	Sigma	5401127001
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
Precyzyjna kąpiel wodna z wytrząsaniem	Thermo Fisher	TSSWB15
Bufor lizujący czerwone krwinki	Sigma	R7757
Jedwab do szwów 4-0	Roboz	SUT-15-2

Strzykawka do Strzykawki BD 5 ml z końcówką BD Luer-Lok 309646 10104159001