Konstruowanie mutantów w serotypie 1 Streptococcus pneumoniae szczep 519/43

Summary

Tutaj opisujemy szczep S. pneumoniae serotyp 1 519/43, który może być genetycznie modyfikowany poprzez wykorzystanie jego zdolności do naturalnego pozyskiwania DNA i plazmidu samobójczego. Jako dowód tej zasady stworzono izogenicznego mutanta w genie pneumolizyny (ply).

Abstract

Streptococcus pneumoniae serotyp 1 pozostaje ogromnym problemem w krajach o niskich i średnich dochodach, szczególnie w Afryce Subsaharyjskiej. Pomimo jego znaczenia, badania nad tym serotypem były utrudnione ze względu na brak narzędzi genetycznych do jego modyfikacji. W tym badaniu opisujemy metodę genetycznej modyfikacji izolatu klinicznego serotypu 1 (szczep 519/43). Co ciekawe, udało się to osiągnąć dzięki wykorzystaniu zdolności pneumokoków do naturalnego pozyskiwania DNA. Jednak w przeciwieństwie do większości pneumokoków, zastosowanie liniowego DNA nie powiodło się; Aby zmutować ten ważny szczep, trzeba było użyć plazmidu samobójczego. Metodologia ta umożliwiła głębsze zrozumienie tego nieuchwytnego serotypu, zarówno pod względem biologicznym, jak i patogenności. Aby potwierdzić tę metodę, główna znana toksyna pneumokokowa, pneumolizyna, została zmutowana, ponieważ ma dobrze znany i łatwy do śledzenia fenotyp. Wykazaliśmy, że mutant, zgodnie z oczekiwaniami, utracił zdolność do lizy czerwonych krwinek. Dzięki możliwości zmutowania ważnego genu w interesującym nas serotypie, byliśmy w stanie zaobserwować różne fenotypy mutantów utraty funkcji w przypadku infekcji dootrzewnowych i donosowych od tych obserwowanych dla innych serotypów. Podsumowując, badanie to dowodzi, że szczep 519/43 (serotyp 1) może być modyfikowany genetycznie.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, pneumokoki) jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Do niedawna odkryto blisko 100 serotypów S. pneumoniae^{1,2,3,4,5,6,7}. Rocznie, inwazyjna choroba pneumokokowa (IPD) powoduje około 700 000 zgonów dzieci poniżej 5 roku życia⁸. S. pneumoniae jest główną przyczyną bakteryjnego zapalenia płuc, zapalenia ucha środkowego, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i posocznicy na całym świecie⁹.

W afrykańskim pasie zapalenia opon mózgowych, serotyp 1 jest odpowiedzialny za wybuchy zapalenia opon mózgowych, gdzie typ sekwencji (ST) ST217, niezwykle zjadliwy typ sekwencji, jest dominujący^{10,11,12,13,14,15}. Jego znaczenie w patologii zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych zostało porównane do znaczenia Neisseria meningitidis w afrykańskim zapaleniu opon mózgowych belt¹⁶. Serotyp 1 jest często główną przyczyną IChP; Jednak bardzo rzadko można go znaleźć w przewozie. W rzeczywistości w Gambii ten serotyp odpowiada za 20% wszystkich chorób inwazyjnych, ale stwierdzono go tylko u 0,5% zdrowych nosicieli^14,17,18,19. Wymiana genetyczna i rekombinacja genetyczna u kompetentnych pneumokoków zachodzi na ogół w nosicielstwie, a nie w chorobie inwazyjnej²⁰. Ponadto wykazano, że serotyp 1 ma jeden z najkrótszych wskaźników nosicielstwa opisanych wśród pneumokoków (tylko 9 dni). W związku z tym zaproponowano, że ten serotyp może mieć znacznie niższy współczynnik rekombinacji niż inne²¹.

Konieczne są dogłębne badania, aby zrozumieć przyczynę niskiej szybkości przenoszenia szczepów serotypu 1 i jego znaczenie w inwazyjnych chorobach w Afryce Subsaharyjskiej.

Tutaj przedstawiamy protokół, który pozwala na mutagenezę całego genomu określonego szczepu serotypu 1, 519/43. Szczep ten może łatwo pozyskiwać i rekombinować nowe DNA w swoim genomie. Metoda ta nie jest jeszcze międzyszczepowa, ale jest bardzo skuteczna, gdy jest wykonywana na tle 519/43 (inne cele zostały zmutowane, manuskrypty w przygotowaniu). Po prostu używając szczepu 519/43 i wykorzystując jego naturalne kompetencje, a także zastępując sposób, w jaki dostarczane jest egzogenne DNA, byliśmy w stanie zmutować gen pneumolizyny (ply) w tym szczepie serotypu 1. Ta metoda stanowi ulepszenie w stosunku do metody przedstawionej przez Harvey et al.²², ponieważ jest wykonywana w jednym kroku, bez konieczności przechodzenia DNA przez inny serotyp. Niemniej jednak, ze względu na zmienność między szczepami, żadna metoda nie została ustandaryzowana dla wszystkich szczepów. Zdolność do mutacji określonych genów i obserwowania jej skutków pozwoli na dogłębne zrozumienie szczepów S. pneumoniae serotypu 1 i dostarczy odpowiedzi na pytania dotyczące roli tych szczepów w zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych w Afryce Subsaharyjskiej.

Protocol

1. Generowanie mutującego amplikonu przez SOE-PCR²³ i amplifikacja kasety spektynomycyny

1. Zacznij od przeprowadzenia PCR w celu amplifikacji ramion homologii (odpowiednio 5' (488 pz) i ply3' (715 pz)) regionów flankujących gen ply ze szczepu 519/43. Użyj podkładów plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC,GGATCC, AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCT,GGATCC, GCGTCCTTTGGTTTTGG) i plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCATTTTCTCTCCTTATTATTCTC).
2. Dla warstwy 5' należy zastosować następujące warunki PCR: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 60 s, etap 2: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 30 s, etap 3: wyżarzanie w temperaturze 58 °C przez 30 s, etap 4: przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s, krok 5: powrót do kroku 2 i powtórzenie przez 35 cykli, Krok 6: końcowe przedłużenie w temperaturze 72°C przez 30 s.
   1. Stosować te same warunki PCR dla ply3', z wyjątkiem czasu przedłużenia w kroku 4 i kroku 6, gdzie powinien wynosić 60 s.
3. Analizować produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej i wyciąć amplikon z żelu.
4. Amplikony PCR należy oczyścić zgodnie z protokołem opisanym w instrukcjach producenta (tabela materiałów).
5. Użyj równomolowych ilości obu ramion homologii jako matryc w SOE-PCR. Połącz dwa amplikony za pomocą starterów plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCCCAGTAATGACTTTATACTAGCTATG) i plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCATTTTCTCTCCTTATCCTCTACC).
6. Stosować następujące warunki SOE-PCR (krok 1: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 2 minuty, krok 2: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 30 s, krok 3: wyżarzanie w temperaturze 58 °C przez 30 s, krok 4: przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 60 s, krok 5: wróć do kroku 2 i powtórz przez 25 cykli, krok 6: końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 90 s).
7. Analizować produkt SOE-PCR za pomocą elektroforezy żelowej. Wytnij go z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i postępuj zgodnie z dostarczonymi instrukcjami.
8. Amplifikować kasetę spektynomycyny z plazmidu pR412 przy użyciu następujących warunków PCR: etap 1: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 60 s, etap 2: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 30 s, etap 3: wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s, etap 4: przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 60 s, krok 5: powrót do kroku 2 i powtórzenie przez 25 cykli, Krok 6: końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 60 s.
   1. Użyj podkładów BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC, CC) i BamHI_SP2R2 (GGATCC, AAT, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG, ATC). Plazmid pR412 został pozyskany od dr Marca PrudHomme'a (CNRS-Universite Paul Sabatier Toulouse, Francja).
9. Analizować amplikony PCR za pomocą elektroforezy żelowej. Wyciąć i oczyścić otrzymany amplikon PCR, jak opisano powyżej.

2. Wytwarzanie plazmidu pSD1 i przemiana chemiczna E. coli Dh5α

1. Wykonać podwiązanie zgodnie z instrukcją producenta pGEMT-easy system I (Tabela materiałów). W probówce do mikrowirówki dodać 5 μl buforu do ligacji, 1 μl pGEMTeasy, 2 μl produktu ply_SOE, 1 μl ligazy DNA T4 i wodę do całkowitej objętości 20 μl. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. W ten sposób generowany jest plazmid pSD1.
2. Przekształć chemicznie kompetentną E. coli Dh5α za pomocą pSD1. Zacznij od inkubacji 50 μl chemicznie kompetentnej E. coli Dh5α z 3 μl reakcji ligacji pSD1 przez 15 minut na lodzie. Następnie kontynuuj, wystawiając ogniwa na szok termiczny (42 °C, 30 s). Umieść komórki na lodzie na 2 minuty.
3. Usuń komórki z lodu i dodaj 350 μl pożywki S.O.C. Inkubować kulturę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 120 obr./min.
4. Umieść transformację na agarze Luria Bertani (LBA) uzupełnionym 0,4 mM IPTG, 0,24 mg / ml X-Gal do selekcji niebiesko-białej i 100 μg / ml ampicyliny, aby upewnić się, że wszystkie kolonie rosnące na płytce mają szkielet plazmidowy. Białe kolonie zawierają pSD1.
5. Wybierz trzy białe kolonie i ustaw nocne wzrosty w 10 ml LB, uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając.
6. Następnego dnia odwirować kultury o masie 3,082 x g i użyć osadu do ekstrakcji plazmidu.

3. Ekstrakcja plazmidowego DNA, trawienie restrykcyjne genu pSD1 i spektynomycyny oraz składanie pSD2

1. Wyodrębnij plazmidowe DNA zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z zestawem komercyjnym (tabela materiałów).
2. Ustaw trawienie restrykcyjne BamHI zarówno dla plazmidu pSD1, jak i kasety spektynomycyny, uprzednio amplifikowanej i oczyszczonej. Należy zastosować następujące warunki i ilości opisane w tabeli 1.
3. Inkubować reakcje trawienia restrykcyjnego i kontrole w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
4. Przeanalizować trawienie restrykcji za pomocą elektroforezy, wyciąć banderolę i oczyścić zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z zestawem handlowym (tabela materiałów).
5. Następnie należy przygotować reakcję ligacji zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów) przy użyciu trawionego przez BamHI pSD1 i spektynomycyny (od kroku 3.2). Do probówki do mikrowirówki dodać następujące składniki reakcji: 5 μl buforu do ligacji, 2 μl pSD1, 2 μl kasety spektynomycyny, 1 μl ligazy DNA T4 i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. W ten sposób generowany jest plazmid pSD2.
6. Przekształć plazmid pSD2 w chemicznie kompetentny E. coli Dh5α, jak opisano w kroku 2.2.
7. Wybierz transformanty przenoszące plazmid pSD2 na podstawie ich zdolności do wzrostu w LBA uzupełnionym 100 μg/ml spektynomycyny i ampicyliny.
8. Wykonaj ekstrakcję plazmidowego DNA (pSD2) zgodnie z powyższym opisem i zgodnie z instrukcjami producenta (μL).

4. Transformacja szczepu S. pneumoniae 519/43

1. Przygotować nocną hodowlę S. pneumoniae 519/43 w BHI i pozostawić do statycznego wzrostu w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
2. Następnego dnia rozcieńczyć kultury w stosunku 1:50 i 1:100 w 10 ml świeżego bulionu BHI. Inkubować kultury statycznie w temperaturze 37 °C, aż OD_{595 nm} znajdzie się między 0,05 a 0,1 (optymalne pobieranie DNA bliższe 0,1 OD).
3. Po osiągnięciu OD 0,1 weź 860 μl i przenieś do probówki mikrowirówkowej. Do tej samej probówki do mikrowirówki dodaj: 100 μL 100 mM NaOH, 10 μL 20% (w/v) BSA, 10 μL 100 mM CaCl₂, 2 μL 50 ng/ml CSP1²⁴ i 500 ng pSD2.
4. Inkubować reakcję statycznie w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
5. Umieść 330 μl na 5% płytkach z agarem z krwią (BA) uzupełnionych 100 μg/ml spektynomycyny, co godzinę przez 3 godziny inkubacji.
6. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Plastrować kolonie oporne na spektynomycynę na inną płytkę BA uzupełnioną 100 μg/ml spektynomycyny, a także na płytki BA uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować oba zestawy płytek przez noc w warunkach określonych powyżej. Płytki ampicyliny mają na celu zbadanie obecności szkieletu plazmidowego.
7. Potwierdzić obecność kasety z spektynomycyną metodą PCR przy użyciu starterów plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) i SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Potwierdź mutację metodą PCR przy użyciu starterów plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) i plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), które przyczepiają się poza zmutowanym regionem.
8. Potwierdź integrację we właściwej lokalizacji genomu poprzez sekwencjonowanie za pomocą starterów plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACACGGCTGAT), a także starterów z miejscem ich wiązania w kasecie spektynomycyny sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) i spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

Results

Opisany tutaj protokół zaczyna się od użycia PCR do wzmocnienia lewego i prawego ramienia homologii, jednocześnie usuwając 191 pz ze środkowego regionu genu ply. Podczas wykonywania PCR miejsce BamHI jest wprowadzane na 3' lewego ramienia homologii i na końcu 5' prawego ramienia homologii (Figura 1A). Następnie następuje PCR-SOE, w którym lewe i prawe ramię homologiczne są połączone w jeden amplikon (Rysunek 1B). Ten amplikon SOE-PCR jest następnie klonowany do pGEMTeasy p...

Discussion

Streptococcus pneumoniae, w szczególności serotyp 1, nadal stanowi globalne zagrożenie powodujące inwazyjną chorobę pneumokokową i zapalenie opon mózgowych. Pomimo wprowadzenia różnych szczepionek, które powinny chronić przed serotypem 1, w Afryce ten serotyp jest nadal zdolny do wywoływania epidemii, które prowadzą do wysokiej zachorowalności i śmiertelności¹³. Możliwość genetycznej manipulacji tym serotypem ma kluczowe znaczenie ze względu na jej znaczenie kliniczne. Metoda opisana w ty...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuPrime Pfx polimeraza DNA	Invitrogen	12344024	Służy do amplifikacji fragmentów
Sól sodowa ampicyliny	Sigma	Aldrich A9518	Służy do selekcji bakterii na etapie 1 (pSD1)
Agar z krwi Oxoid		CM0055	Służy do powlekania S. pneumoniae transformanty
Surowica bydlęca Albumina	sigma	55470	używany do S. pneumoniae Transformacja
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135	używany do wzrostu komórek S. pneumoniae
Chlorek wapnia Cacl2	Sigma	449709 stosowany	do S. pneumoniae Kompetencja transformacji
peptyd stymulujący 1	AnaSpec	AS-63779	używany do S. pneumoniae Transformacja
Luria Bulion Agar	Gibco	22700025	używany do posiewu i selekcji pSD1 i pSD2
Luria Bulion Base (formulacja Millera)	Gibco	12795027	używany do posiewu i selekcji pSD1 i pSD2
Zestaw do ekstrakcji żelu Monarch	NEB	T1020S	Służy do ekstrakcji prążków z żelu DNA
Plasmid Monarch Zestaw Miniprep NEB		T1010S	Służy do ekstrakcji plazmidu z komórek
pGEM T-easy	Promega	A1360	stosowany jako plazmid
samobójczy S.O.C.	Invitrogen	15544034	stosowany do odzyskiwania komórek po przemianie
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma	S0899	stosowany do S.pneumoniae Transformacja
Chlorowodorek spektynomycyny	SigmaAldrich	PHR1426	Stosowany do selekcji
bakterii Skuteczność subklonowania DH5α Kompetentne komórki	Invitrogen	18265017	wykorzystywane do tworzenia pSD1 i pSD2