Artykuł metodologiczny

Mikrochirurgiczne rozwarstwienie i oczyszczanie tkanek w celu obrazowania całej siatkówki i ciała szklistego w nienaruszonym stanie w wysokiej rozdzielczości

DOI:

10.3791/61595

⸱

11 marca 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Neuroscience, Cell Biology, and Anatomy, University of Texas Medical Branch, 3Biomedical Engineering and Imaging Sciences Group, University of Texas Medical Branch, 4Department of Ophthalmology, University of Texas Medical Branch

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół obrazowania nienaruszonej całej siatkówki, w którym zewnętrzne nieprzezroczyste/pigmentowane warstwy gałki ocznej są chirurgicznie usuwane, a optyczne oczyszczanie jest stosowane w celu uczynienia siatkówki przezroczystością, umożliwiając wizualizację obwodowej siatkówki i hialoidalnego naczynia krwionośnego w nienaruszonej siatkówce za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszem światła.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktury neuronalne i naczyniowe siatkówki w warunkach fizjologicznych i patologicznych mogą być lepiej zobrazowane i scharakteryzowane przy użyciu technik obrazowania nienaruszonej całej siatkówki w porównaniu z konwencjonalnymi preparatami i przekrojami siatkówki flat mount. Jednak obrazowanie immunofluorescencyjne nienaruszonej całej siatkówki jest utrudnione przez nieprzezroczyste powłoki gałki ocznej, tj. twardówkę, naczyniówkę i nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) oraz właściwości rozpraszania światła warstw siatkówki, które uniemożliwiają obrazowanie optyczne o pełnej grubości w wysokiej rozdzielczości. Opisano chemiczne wybielanie warstw barwnikowych i protokoły oczyszczania tkanek w celu usunięcia tych przeszkód; jednak obecnie opisane metody nie są odpowiednie do obrazowania endogennych cząsteczek fluorescencyjnych, takich jak białko zielonej fluorescencji (GFP) w nienaruszonej całej siatkówce. Inne podejścia omijały to ograniczenie poprzez chirurgiczne usuwanie warstw barwnikowych i przedniego odcinka gałki ocznej, co umożliwiło nienaruszone obrazowanie oka, chociaż obwodowa siatkówka i struktury szkliste były zakłócone. Przedstawiono nienaruszony protokół obrazowania immunofluorescencyjnego całej siatkówki i ciała szklistego, który łączy chirurgiczne rozwarstwienie warstw nabłonka barwnikowego twardówki / naczyniówki / siatkówki (RPE) ze zmodyfikowaną metodą oczyszczania tkanek i mikroskopią fluorescencyjną z lekkim arkuszem (LSFM). Nowe podejście oferuje bezprecedensowy wgląd w niezakłócone elementy naczyniowe i neuronalne siatkówki, a także ciała szklistego i szklistego układu naczyniowego w stanach patologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcja między elementami neuronalnymi i naczyniowymi siatkówki w stanie zdrowia i choroby jest tradycyjnie badana przez badania immunofluorescencyjne na fizycznych przekrojach parafinowej lub krioutrwalonej tkance siatkówki lub na preparatach płaskich siatkówki1. Jednak wycięcie tkanek zaburza ciągłość neuronalną i naczyniową siatkówki i chociaż trójwymiarowa rekonstrukcja sąsiednich odcinków siatkówki jest sugerowana jako możliwe rozwiązanie, nadal jest ona obarczona błędami i artefaktami. Preparaty do płaskiego montażu siatkówki również wyraźnie zaburzają integralność elementów naczyniowych i neuronalnych siatkówki oraz geograficzne połączenie między sąsiednimi obszarami siatkówki2. Alternatywnie, niedawno wprowadzono obrazowanie całej siatkówki w celu wizualizacji trójwymiarowych projekcji składników neuronalnych i naczyniowych siatkówki w ich naturalnej pozycji anatomicznej2,3,4,5.

W nienaruszonym obrazowaniu całej siatkówki, sygnały fluorescencyjne z elementów naczyniowych i neuronalnych sąsiednich obszarów siatkówki (płytek) nienaruszonej całej siatkówki są rejestrowane za pomocą mikroskopu z blachą świetlną; te płytki są następnie "zszywane" razem, aby zrekonstruować trójwymiarowy widok całej siatkówki2,3,4,5,6. Obrazowanie całej siatkówki w stanie nienaruszonym zapewnia niespotykany dotąd widok siatkówki do badania patogenezy chorób naczyniowych, zwyrodnieniowych i zapalnych siatkówki2,3,4,5,6. Na przykład, Prahst i wsp. ujawnili wcześniej "niedocenianą" morfologię węzłów dla patologicznych kępek naczyniowych, nieprawidłowej ruchliwości komórek i zmienionej dynamiki filopodiów w modelu retinopatii indukowanej tlenem (OIR) przy użyciu obrazowania na żywo nienaruszonej całej siatkówki2. Podobnie Henning i wsp., Singh i wsp. oraz Chang i wsp. wykazali złożoną trójwymiarową sieć naczyniową siatkówki w nienaruszonych całych siatkówkach3,4,6. Vigouroux i wsp. wykorzystali metodę obrazowania całego oka w stanie nienaruszonym, aby pokazać organizację siatkówki i projekcje wzrokowe w okresie okołoporodowym5. Aby móc stworzyć tak niezrównane trójwymiarowe widoki siatkówki, nienaruszone protokoły obrazowania całej siatkówki pokonały dwa główne ograniczenia: 1) obecność nieprzezroczystych i pigmentowanych powłok gałki ocznej (twardówka, naczyniówka i RPE) oraz 2) ograniczoną penetrację światła przez pełną grubość siatkówki spowodowaną właściwościami rozpraszania światła przez warstwy jądrowe i pleksiowate siatkówki. Henning i wsp. oraz Vigouroux i wsp. zastosowali wybielanie H2O2 pigmentów naczyniówki/RPE, aby móc zobrazować nienaruszoną siatkówkę3,5. Jednak wybielanie nie jest odpowiednie dla szczepów zwierzęcych z endogennymi fluoroforami, takimi jak białko zielonej fluorescencji (GFP) lub po barwieniu immunofluorescencyjnym in vivo3,5,7. Ponadto metoda Henninga i wsp. polegająca na leczeniuH2O2została przeprowadzona w warunkach wodnych, które mogą generować mikropęcherzyki powodujące odwarstwienie siatkówki. Ponadto zabiegH2O2przeprowadzono w temperaturze 55 °C, co dodatkowo pogarsza powinowactwo przeciwciał tkankowych. Ponadto wybielanie może wprowadzać silną autofluorescencję pochodzącą z utlenionej melaniny8. Inne protokoły depigmentacji dla odcinków oczu przy użyciu nadmanganianu potasu i kwasu szczawiowego były w stanie usunąć pigmenty RPE w skrawkach embrionalnych, ale wykazano również, że ta metoda depigmentacji zmniejsza skuteczność znakowania immunologicznego9,10. Jako alternatywę dla wybielania, Prahst i wsp., Singh i wsp. oraz Chang i wsp. usunęli twardówkę, naczyniówkę i rogówkę, aby cała siatkówka była dostępna dla mikroskopu świetlnego2,4,6. Jednak usunięcie rogówki, soczewki i siatkówki obwodowej może zniekształcić i zakłócić siatkówkę obwodową i naczynia szkliste, co sprawia, że metody te nie nadają się do badania siatkówki obwodowej i unaczynienia szklistego.

Wszystkie obecnie dostępne protokoły obrazowania całego oka w nienaruszonym stanie obejmują wykorzystanie etapu optycznego oczyszczania tkanek w celu przezwyciężenia właściwości rozpraszania światła przez warstwy siatkówki2,3,4,5. Optyczne oczyszczanie tkanek sprawia, że siatkówka jest przezroczysta dla światła mikroskopowego poprzez wyrównanie współczynnika załamania światła danej tkanki, w tym przypadku siatkówki, we wszystkich jej elementach komórkowych i międzykomórkowych, aby zminimalizować rozpraszanie i absorpcję światła11. Naczyniówka i RPE powinny zostać usunięte lub wybielone przed nałożeniem optycznego oczyszczania tkanek na siatkówkę, ponieważ pigmentowane powłoki gałki ocznej (naczyniówka i RPE) nie mogą być wystarczająco oczyszczone6,12,13,14,15,16,17,18.

Udział i wkład szklistego i szklistego układu naczyniowego w stanach patologicznych, takich jak retinopatia wcześniaków (ROP), przetrwałe unaczynienie płodu (PFV), choroba Norriego i choroba Sticklera, jest najlepiej badany, gdy siatkówka i naczynia szkliste nie są zakłócone podczas przygotowania tkanki19,20,21,22,23. Istniejące metody obrazowania nienaruszonej całej siatkówki albo usuwają przedni odcinek oka, co w naturalny sposób zakłóca ciało szkliste i jego unaczynienie, albo stosują środki wybielające, które mogą usunąć endogenne fluorofory. Brakuje opublikowanych metod wizualizacji ciała szklistego i naczyń krwionośnych w ich nienaruszonym, nietkniętym stanie. Opisujemy tutaj całą metodę obrazowania siatkówki i ciała szklistego, która składa się z chirurgicznego rozwarstwienia pigmentowanych i nieprzezroczystych powłok gałki ocznej, zmodyfikowanego optycznego oczyszczania tkanek zoptymalizowanego pod kątem siatkówki oraz mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Przygotowanie próbki, optyczne oczyszczanie tkanek, mikroskopia arkuszy świetlnych i etapy przetwarzania obrazu są szczegółowo opisane poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez University of Texas Medical Branch Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Użytkowanie i opieka nad zwierzętami były zgodne z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Wszystkie materiały potrzebne do przeprowadzenia tej procedury są wymienione w Tabeli Materiałów. Podczas wykonywania każdego kroku noś rękawice bezpudrowe. Aby zapoznać się z krokami 6 i 7, zapoznaj się również z oficjalną instrukcją obsługi mikroskopu.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Poddać myszy eksperymentalne eutanazji zgodnie z obowiązującym protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (zastosowano tutaj znieczulenie kombinacją ketaminy 60 mg/kg i deksmedetomidyny 0,5 mg/kg, a następnie zwichnięcie szyjki macicy). Natychmiast przystąp do stabilizacji zwierzęcia na platformie do sekcji i perfuzji serca.
    UWAGA: Zwierzęta doświadczalne są wybierane na podstawie projektu indywidualnego badania.
  2. Wypreparuj brzuch i klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Przeprowadzić perfuzję serca poprzez przetoczenie serca za pomocą igły 27 G umieszczonej w lewej komorze i utworzyć małe (~1 mm) nacięcie w prawym przedsionku, aby umożliwić wydostawanie się krwi24.
    1. Najpierw przetocz 30-50 ml lodowatego fosforanowego roztworu soli fizjologicznej (PBS), a następnie 30-50 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu (PFA).
    2. Aby sprawdzić, czy transfuzja PFA przebiegła pomyślnie, sprawdź, czy nie ma widocznych skurczów mięśni na całym ciele i ogonie. Przejdź do etapu enukleacji.

2. Wyłuszczenie i fiksacja gałki ocznej

  1. Użyj zakrzywionych kleszczyków jubilerskich, aby delikatnie popchnąć górną lub dolną powiekę, aby wypchnąć gałkę oczną z oczodołu. Użyj innego zestawu kleszczy jubilerskich lub podobnych, aby nakłuć spojówkę z boku i przytrzymaj gałkę od strony nerwu wzrokowego. Powoli podnieś gałkę ziemską z oczodołu, aż zostanie odcięta od nerwu wzrokowego.
  2. Przenieś kulę ziemską do probówki zawierającej świeżo przygotowany lodowaty 4% PFA. Oznacz odpowiednio rurkę. Pozostaw kulę ziemską w 4% PFA w lodówce o temperaturze 4 °C na 12 godzin (przez noc).
    UWAGA: Użyj plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką, aby przenieść kulę. Poszerzyć otwór odciętej końcówki za pomocą drugiej końcówki pipety, aby uniknąć uszkodzenia próbki ostrymi krawędziami.

3. Analiza próbki (Rysunek 1 i Rysunek 2)

  1. Pod mikroskopem stereoskopowym zlokalizuj połączenie rogówka-twardówka (Rysunek 1A) i użyj ostrej końcówki tnącej igły 30 G, aby wykonać bardzo powierzchowne cięcie na twardówce około 0,5–1 mm za połączeniem rogówka-twardówka (Rysunek 1B).
  2. Przesuń jedno z ostrzy nożyczek preparujących z ostrą końcówką przez nacięcie, które właśnie zostało wykonane w potencjalnej przestrzeni między twardówką/naczyniówką/RPE a siatkówką (Rysunek 1C). Przesuwaj nożyczki i tnij obwodowo, aż twardówka/naczyniówka/RPE będzie można oderwać od zewnętrznej powierzchni siatkówki (Rysunek 1D,E).
    UWAGA: Ważne jest, aby wykonać ten krok powoli i delikatnie, aby uniknąć przebicia siatkówki. Kilka pierwszych cięć jest szczególnie krytycznych, aby uniknąć przecięcia siatkówki.
  3. W razie potrzeby wykonaj promieniste nacięcia rozluźniające na twardówce/naczyniówce/RPE, aby ułatwić proces cięcia obwodowego i późniejszego złuszczania nerwu wzrokowego i twardówki/naczyniówki/RPE. Usuń małe plamy RPE (Rysunek 1F) za pomocą pędzla do malowania w rozmiarze 1 nasączonego PBS.
  4. Przenieść całą nienaruszoną gałkę oczną do probówki zawierającej PBS. Natychmiast przejść do następnego kroku lub przechowywać w temperaturze 4 °C w celu znakowania immunologicznego.
    UWAGA: Znaki mogą być umieszczane na gałce ocznej po wyłuszczeniu, a następnie po rozwarstwieniu, aby w razie potrzeby zachować orientację oka. W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany, a próbki mogą być przechowywane przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C przed przejściem do kolejnych kroków.

4. Barwienie naczyń krwionośnych

  1. Przepuszczalność tkanki poprzez zanurzenie jej w PBS zawierającym 0,2% Tween-20 w temperaturze pokojowej na 20 minut.
  2. Przemyć próbkę PBS 3 razy na wytrząsarce przez 10 minut.
  3. Inkubować próbkę z 5% normalną surowicą kozią (NGS) w PBS zawierającym 0,25% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C przez noc. W tym przypadku zastosowano przeciwciało anty-mysie Collagen IV (końcowe stężenie przygotowano w PBS zawierającym 0,2% Tween-20).
  5. Umyj 3 razy PBS, przez 5 minut na pranie.
  6. Inkubować próbkę z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluorescencyjnie. W tym przypadku przez 12 godzin w temperaturze 4 °C (rozcieńczenie 1:200 w PBS zawierającym 0,2% Tween-20) stosowano anty-króliczy środek przeciw królikom
    7. .
  7. Przemyj PBS 3 razy, po 1 godzinie, a następnie przejdź do etapów oczyszczania tkanek.

5. Oczyszczanie optyczne za pomocą 2,2′-tiodieetanolu (TDE)

  1. Przygotuj robocze stężenia TDE przy użyciu podstawowego roztworu TDE z PBS dla końcowego stężenia 10%, 20%, 30%, 40%, 50% i 60% objętości do objętości (v/v). Przygotować co najmniej 2 ml roztworu dla każdej próbki oka, aby umożliwić przeniknięcie nadmiaru objętości do tkanki.
  2. Inkubować próbki w 6- lub 12-dołkowej studzience płytkowej przy rosnącym stężeniu TDE. Zacznij od zanurzenia nienaruszonych całych gałek ocznych w 10% roztworze TDE na 2-4 godziny na shakerze w temperaturze pokojowej. Kolejno przenieś próbkę do wyższego stężenia TDE przez 2–4 godziny w każdym stężeniu TDE (Rysunek 2C).
    UWAGA: Siatkówka zaczyna się oczyszczać w stężeniach 40%-50%, ale maksymalne oczyszczanie następuje po inkubacji w 60% roztworze. Siatkówka staje się mniej przezroczysta w stężeniach 70% i wyższych (Rysunek 2D).
  3. W razie potrzeby przerwij proces rozliczania na noc, na którymkolwiek z kolejnych etapów wymiany rozliczeniowej.

6. Obrazowanie całego oka za pomocą mikroskopii z użyciem lekkiego arkusza

  1. Zamontuj nienaruszone próbki całego oka, biorąc pod uwagę konfigurację używanej platformy mikroskopu z arkuszem świetlnym. Postępuj zgodnie z instrukcjami mikroskopu i oprogramowania do akwizycji, aby ustawić parametry akwizycji, w tym wyrównanie arkusza świetlnego oraz oświetlenie i wykrywanie ścieżek optycznych.
    UWAGA: Próbki użyte w tym eksperymencie zostały przyklejone od strony rogówki do końcówki igły podskórnej na strzykawce insulinowej (Rysunek 2E). Próbka została następnie zawieszona w komorze mikroskopu.
  2. Napełnij komorę mikroskopu 60% TDE jako roztwór klarujący.
  3. Zanurzyć próbkę w komorze mikroskopu z arkuszem świetlnym w 60% roztworze TDE (końcowe stężenie czyszczące).
  4. Zobrazuj oczyszczone oko za pomocą różnych komercyjnych lub niestandardowych mikroskopów konfokalnych i arkuszowych. W tym protokole używany jest mikroskop z dwustronnym oświetleniem arkuszowym światła.
  5. Obrazowanie o niskiej rozdzielczości i małym powiększeniu (5x, NA 0,16) służy do obrazowania morfologii komórek i śledzenia procesów komórkowych, zwłaszcza w połączeniu z kafelkami. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i powiększeniu (20x, NA 1,0) umożliwia obrazowanie zarówno morfologii komórek, jak i dużych organelli subkomórkowych, takich jak jądra i klastry mitochondrialne.

7. Przetwarzanie obrazu po akwizycji

UWAGA: Przetwarzanie po przejęciu zależy od typu pliku i oprogramowania kompatybilnego z obrazowanymi plikami.

  1. Zastosuj usuwanie rozmycia lub dekonwolucję, aby jeszcze bardziej powiększyć surowe obrazy przed zszyciem obrazowanych kafelków. Do usunięcia rozmycia obrazów można zastosować filtr Weinera. Alternatywnie, obrazy mogą być iteracyjnie dekonwolucyjne po odszumieniu za pomocą dekonwolucji Richardsona-Lucy'ego i teoretycznie lub eksperymentalnie zmierzonego PSF za pomocą narzędzi do modelowania, takich jak wtyczka generatora ImageJ PSF25.
  2. Wykonaj zszywanie wstępnie przetworzonych stosów z oraz afinicznych i niesztywnych transformacji woluminów, a następnie rejestrację woluminów w wielu widokach i fuzję przy użyciu różnych pakietów oprogramowania komercyjnych lub należących do domeny publicznej (wtyczka ImageJ – BigStitcher)26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rzut o zerowym kącie sieci naczyniowej wokół brodawek i mikrogleju jest pokazany w Rysunek 3A. Również nienaruszony rozkład mikrogleju całej siatkówki u myszy CX3CR1-GFP przedstawiono w Rysunek 3B. Główną zaletą przedstawionej tu metody jest jej zdolność do obrazowania wrodzonych fluoroforów. Rysunek 3C,D pokazuje mikroglej w reprezentatywnych projekcjach Z (zielony kanał) z próbek przygotowanych obecną metodą nienaruszonego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój i patologie siatkówki i ciała szklistego najlepiej badać za pomocą nienaruszonych technik obrazowania całej siatkówki, w których siatkówka nie jest cięta na sekcje lub do preparatów do montażu płaskiego. Istniejące metody obrazowania całego oka obejmują wybielanie pigmentowe, które usuwa wrodzone fluorofory, lub obejmują fizyczne usunięcie nieprzezroczystych powłok gałki ocznej (RPE, naczyniówki i twardówki) wraz z przednim odcinkiem oka, co może zaburzać siatkówkę obwodową i ciało szkliste. Chang i wsp. oraz Prah...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak istotnego handlowego konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wykonana na Wydziale Medycznym Uniwersytetu w Teksasie. Autorzy doceniają Harald
Dr Junge, dr Debora Ferrington i dr Heidi Roehrich z University of Minnesota za pomoc w przygotowaniu rysunku 1 i filmu 2. LO było wspierane przez NIEHS T32 Training Grant T32ES007254.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zwierzę doświadczalne
CX3CR1-GFP MyszThe Jackson Laboratory5582
Anesthetic
DexmedetomidinePar Pharmaceutical42023-146-25
KetaminaFresenius Kabi
Pobieranie tkanek, utrwalanie i preparowanie próbek
pompa perfuzyjna sercaFisher scientificNC9069235
Cyjanoakrylowy superglueamazon.com
Cienkie nożyczkiOstre narzędzia naukowe14160-10
Drobna pęsetaFine Science Tools11412-11
Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa nauki15710-S
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Pędzel do malowania Gibco10010049
rozmiar 1dickblick.com
proste nożyczki sprężynoweFine Science Tools15000-03
strzykawka, końcówka igły, 27 x 1,25"
BD Probówki 1,5 ml, 15 ml, 50 mlThermo sceintific
Tween-20ThermoFisher85114
Barwienie immunofluorescencyjne
kolagenowi IVAbcamab198081:200 rozcieńczenie
Anty-królik Alexa Fluor 568InvitreogenA-110111:200 rozcieńczenie
Normalna koza surowicaThermoFisher50062Z10% stężenie
Oczyszczanie tkanek
2,2′-tiodieetanol (TDE)Fluka analyticaSTBD7772V
Wytrząsarka na biegunachFisher scientific02-217-765
Mikroskopia
Mikrosfery fluorescencyjneTetraSpeckT14792
Arkusz świetlny mikroskop fluorescencyjny (LSFM)ZeissZ1
Oznaczanie mikrogleju
ImageJNarodowy Instytut Zdrowia
Przeciwciało przeciw mysiemu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Usui, Y., et al. Neurovascular crosstalk between interneurons and capillaries is required for vision. Journal of Clinical Investigation. 125, 2335-2346 (2015).
  2. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779(2020).
  3. Henning, Y., Osadnik, C., Malkemper, E. P. EyeCi: Optical clearing and imaging of immunolabeled mouse eyes using light-sheet fluorescence microscopy. Experimental Eye Research. 180, 137-145 (2019).
  4. Chang, C. C., et al. Selective Plane Illumination Microscopy and Computing Reveal Differential Obliteration of Retinal Vascular Plexuses. bioRxiv. , (2020).
  5. Vigouroux, R. J., César, Q., Chédotal, A., Nguyen-Ba-Charvet, K. T. Revisiting the role of DCC in visual system development with a novel eye clearing method. eLife. 9, 51275(2020).
  6. Singh, J. N., Nowlin, T. M., Seedorf, G. J., Abman, S. H., Shepherd, D. P. Quantifying three-dimensional rodent retina vascular development using optical tissue clearing and light-sheet microscopy. Journal of Biomedical Optics. 22, 076011(2017).
  7. Kim, S. Y., Assawachananont, J. A new method to visualize the intact subretina from retinal pigment epithelium to retinal tissue in whole mount of pigmented mouse eyes. Translational Vision Science and Technology. 5, 1-8 (2016).
  8. Kayatz, P., et al. Oxidation causes melanin fluorescence. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42, 241-246 (2001).
  9. Iwai-Takekoshi, L., et al. Retinal pigment epithelial integrity is compromised in the developing albino mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 524, 3696-3716 (2016).
  10. Alexander, R. A., Cree, I. A., Foss, A. J. The immunoalkaline phosphatase technique in immunohistochemistry: the effect of permanganate-oxalate melanin bleaching upon four final reaction products. British Journal of Biomedical Science. 53, 170-171 (1996).
  11. Ueda, H. R., et al. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
  12. Hillman, E. M. C., Voleti, V., Li, W., Yu, H. Light-Sheet Microscopy in Neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 42, 295-313 (2019).
  13. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  14. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  15. Hohberger, B., Baumgart, C., Bergua, A. Optical clearing of the eye using the See Deep Brain technique. Eye. 31, London, England. 1496-1502 (2017).
  16. Kuwajima, T., et al. ClearT: A detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development (Cambridge). 140, 1364-1368 (2013).
  17. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14, 48(2014).
  18. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859-867 (2016).
  19. Hegde, S., Srivastava, O. Different gene knockout/transgenic mouse models manifesting persistent fetal vasculature: Are integrins to blame for this pathological condition. Life Sciences. 171 (15), 30-38 (2016).
  20. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and Management of Retinopathy of Prematurity. New England Journal of Medicine. 367, 2515-2526 (2012).
  21. Pierce, E. A., Foley, E. D., Smith, L. E. H. Regulation of vascular endothelial growth factor by oxygen in a model of retinopathy of prematurity. Archives of Ophthalmology. 114, 1219-1228 (1996).
  22. Ash, J., McLeod, D. S., Lutty, G. A. Transgenic expression of leukemia inhibitory factor (LIF) blocks normal vascular development but not pathological neovascularization in the eye. Molecular Vision. 11, 298-308 (2005).
  23. Reichel, M. B., et al. High frequency of persistent hyperplastic primary vitreous and cataracts in p53-deficient mice. Cell Death and Differentiation. 5, 156-162 (1998).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 3564(2012).
  25. Kirshner, H., Aguet, F., Sage, D., Unser, M. 3-D PSF fitting for fluorescence microscopy: Implementation and localization application. Journal of Microscopy. 249, 13-25 (2013).
  26. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  28. Tian, B., et al. Efficacy of novel highly specific bromodomain-containing protein 4 inhibitors in innate inflammation–driven airway remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60, 68-83 (2019).
  29. Zaman, R. T., et al. Changes in morphology and optical properties of sclera and choroidal layers due to hyperosmotic agent. Journal of Biomedical Optics. 16, 077008(2011).
  30. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  31. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  32. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808(2015).
  33. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PLoS One. 10, 0116280(2015).
  34. Icha, J., et al. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. Journal of Visualized Experiments. (110), e53966(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Intact Whole RetinaTissue ClearingLight Sheet MicroscopySclera Choroid RPE DissectionVitreous ImagingRetinal Vascular ImagingNeuronal Structure ImagingEndogenous Fluorescent ImagingGFP Retina ImagingHigh Resolution Retina
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły