Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków chemicznych w celu wyjaśnienia ich wpływu na trwałość bakterii

DOI:

10.3791/61597

⸱

23 lutego 2021

 , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Houston

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule metodycznym prezentujemy strategię wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu identyfikacji związków chemicznych, takich jak osmolity, które mają znaczący wpływ na trwałość bakterii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przetrwacze bakterii są definiowane jako mała subpopulacja wariantów fenotypowych zdolnych do tolerowania wysokich stężeń antybiotyków. Są one ważnym problemem zdrowotnym, ponieważ są związane z nawracającymi przewlekłymi infekcjami. Chociaż wiadomo, że stochastyczna i deterministyczna dynamika mechanizmów związanych ze stresem odgrywa znaczącą rolę w trwałości, mechanizmy leżące u podstaw fenotypowego przejścia do/ze stanu trwałości nie są w pełni zrozumiałe. Chociaż czynniki trwałości wyzwalane przez sygnały środowiskowe (np. wyczerpywanie się źródeł węgla, azotu i tlenu) zostały szeroko zbadane, wpływ osmolitów na trwałość nie został jeszcze określony. Korzystając z mikromacierzy (tj. 96-dołkowych płytek zawierających różne substancje chemiczne), opracowaliśmy podejście do wyjaśnienia wpływu różnych osmolitów na trwałość Escherichia coli w sposób wysokoprzepustowy. Podejście to jest przełomowe, ponieważ można je łatwo zaadaptować do innych macierzy przesiewowych, takich jak panele leków i biblioteki nokautów genowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kultury bakteryjne zawierają małą subpopulację trwałych komórek, które są tymczasowo odporne na niezwykle wysokie poziomy antybiotyków. Komórki stałe są genetycznie identyczne ze swoimi wrażliwymi na antybiotyki krewnymi, a ich przetrwanie przypisuje się przejściowemu hamowaniu wzrostu1. Komórki Persister zostały po raz pierwszy odkryte przez Gladys Hobby2, ale termin ten został po raz pierwszy użyty przez Josepha Bigerma, kiedy zidentyfikował je w kulturach Staphylococcus pyogenes leczonych penicyliną3. Przełomowe badanie opublikowane przez Balaban et al.4 odkryło dwa typy uporczywości: warianty typu I, które powstają głównie w wyniku przejścia przez fazę stacjonarną, oraz warianty typu II, które są generowane w sposób ciągły podczas wykładniczego wzrostu. Przetrwały są wykrywane za pomocą testów przeżycia klonogennego, w których próbki hodowli są pobierane w różnych odstępach czasu podczas leczenia antybiotykami, myte i posiewane na typowej pożywce wzrostowej w celu zliczenia komórek, które przeżyły, które mogą skolonizować przy braku antybiotyków. Istnienie substancji trwałych w hodowli komórkowej ocenia się za pomocą dwufazowej krzywej zabijania4,5, gdzie początkowy rozkład wykładniczy wskazuje na śmierć komórek wrażliwych na antybiotyki. Jednak trend zabijania zmniejsza się z czasem, ostatecznie prowadząc do obszaru plateau, który reprezentuje ocalałe trwałe komórki.  

Komórki stałe są związane z różnymi chorobami, takimi jak gruźlica6, mukowiscydoza7, kandydoza8 i infekcje dróg moczowych9. Stwierdzono, że prawie wszystkie przebadane do tej pory mikroorganizmy generują trwałe fenotypy, w tym wysoce zjadliwe Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 i Candida albicans8. Ostatnie badania dostarczają również dowodów na wzrost liczby mutantów opornych na wiele leków w subpopulacjach przetrwałych11,12. Znaczne wysiłki w tej dziedzinie ujawniły, że mechanizmy trwałości są bardzo złożone i zróżnicowane; zarówno czynniki stochastyczne, jak i deterministyczne związane z odpowiedzią SOS13,14, reaktywne formy tlenu (ROS)15, systemy toksyny/antytoksyny (TA)16, autofagia lub samotrawienie17 i rygorystyczna odpowiedź związana z ppGpp18 są znane z tego, że ułatwiają tworzenie się uporczywych.

Pomimo znacznego postępu w zrozumieniu fenotypu trwałości, wpływ osmolitów na trwałość bakterii nie został w pełni zrozumiany. Ponieważ utrzymanie optymalnego ciśnienia osmotycznego jest niezbędne dla wzrostu, prawidłowego funkcjonowania i przetrwania komórek, dogłębne badanie osmolitów może doprowadzić do potencjalnych celów dla strategii anty-persister. Chociaż jest to pracochłonne, wysokoprzepustowe badania przesiewowe są bardzo skutecznym podejściem do identyfikacji metabolitów i innych substancji chemicznych, które odgrywają kluczową rolę w fenotypie trwałości19,20. W tej pracy omówimy naszą opublikowaną metodę19, w której użyliśmy mikromacierzy, tj. 96-dołkowych płytek zawierających różne osmolity (np. chlorek sodu, mocznik, azotyn sodu, azotan sodu, chlorek potasu), aby zidentyfikować osmolity, które znacząco wpływają na trwałość E. coli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywki wzrostowej, roztworu ofloksacyny i zapasów komórek E. coli

  1. Zwykła pożywka Luria-Bertani (LB): Dodać 10 g/l tryptonu, 10 g/l chlorku sodu (NaCl) i 5 g/l ekstraktu drożdżowego do wody dejonizowanej (DI). Wysterylizuj pożywkę przez autoklawowanie.
  2. Płytki agarowe LB: Dodać 10 g/l tryptonu, 10 g/l NaCl, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 15 g/l agaru w wodzie DI i wysterylizować podłoże przez autoklawowanie. W żądanej temperaturze (~55 °C) wlej ~30 ml podłoża agarowego na kwadratowe płytki (10 x 10 cm). Wysuszyć płytki i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Zmodyfikowane podłoże LB: Dodaj 10 g/l tryptonu i 5 g/l ekstraktu drożdżowego do wody demineralizowanej. Wysterylizuj pożywkę przez autoklawowanie.
  4. Zmodyfikowana pożywka LB zawierająca osmolit: Wymieszaj 2x zmodyfikowaną pożywkę LB z 2x roztworem osmolitu w równych objętościach. Aby przygotować 2x zmodyfikowane podłoże LB, dodaj 20 g/L tryptonu i 10 g/L ekstraktu drożdżowego do wody DI i sterylizuj w autoklawie. Aby przygotować 2x roztwór osmolitu, rozpuść interesujący Cię osmolit (2x ilość) w wodzie DI, a następnie przefiltruj roztwór wysterylizowany.
    UWAGA: Interesujący osmolit i jego stężenia można określić na podstawie testów przesiewowych mikromacierzy fenotypu (patrz Protokół 4). Jednak badany osmolit i związane z nim stężenie 2x można dostosować w zależności od charakteru badania. Na przykład, aby zbadać wpływ 1 mM chlorku sodu, 2x roztwór osmolitu byłby 2 mM roztworem chlorku sodu.
  5. Roztwór podstawowy ofloksacyny (5 mg/ml): Dodać 5 mg soli ofloksacyny (OFX) w 1 ml wody demineralizowanej. Dodać 10 μl 10 M wodorotlenku sodu, aby zwiększyć rozpuszczalność OFX w wodzie, a następnie przefiltrować wysterylizować roztwór. Przygotować porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Ofloksacyna jest antybiotykiem chinolonowym, który jest szeroko stosowany zarówno w przypadku rosnących, jak i nierosnących komórek bakteryjnych14,21. Minimalne stężenie hamujące (MIC) OFX dla komórek E. coli MG1655 mieści się w zakresie 0,039–0,078 μg/mL19,20. Należy również pamiętać, że inne antybiotyki, takie jak ampicylina i kanamycyna, są powszechnie stosowane w badaniach nad trwałością. Wybór antybiotyków zależy od charakteru badania.
  6. Zapasy komórek E. coli MG1655: Zaszczepić 2 ml zwykłej pożywki LB pojedynczą kolonią w probówce o pojemności 14 ml (z zatrzaskową nakrętką) i hodować komórki w wytrząsarce orbitalnej przy 250 obr./min i 37 °C. Gdy komórki osiągną fazę stacjonarną, zmieszać 500 μl kultury komórkowej z 500 μl 50% glicerolu (sterylnego) w fiolce kriogenicznej i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Propagacja komórek w celu wyeliminowania istniejących wcześniej persisterów

  1. Aby przygotować hodowlę przez noc, zeskrob niewielką ilość komórek z zamrożonego materiału komórkowego za pomocą sterylnej końcówki pipety (nie rozmrażaj zapasu komórek gliceryny) i zaszczep komórki w 2 ml zmodyfikowanej pożywki LB w 14 ml probówce z zatrzaskową nakrętką. Hodować komórki w wytrząsarce orbitalnej przy prędkości 250 obr./min i temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
  2. Pierwsza propagacja
    1. Po 12 godzinach przenieść 250 μl hodowli przez noc do 25 ml świeżo zmodyfikowanej pożywki LB w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml pokrytej sterylną folią aluminiową.
    2. Hodować kulturę komórkową w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 250 obr./min i w temperaturze 37 °C, aż komórki osiągną środkową fazę wykładniczą (OD600 = 0,5).
    3. Mierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) za pomocą czytnika mikropłytek co 30 minut.
  3. Druga propagacja
    1. Przy OD600 = 0,5 rozcieńczyć 250 μl hodowli komórkowej z pierwszej kolby na 25 ml świeżej modyfikowanej pożywki LB w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml.
    2. Hodować drugą kulturę komórkową w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 250 obr./min i w temperaturze 37 °C, aż do OD600=0,5.
    3. Mierz gęstość optyczną co 30 min.
      UWAGA: Hodowla przeprowadzona przez noc może zawierać znaczną ilość komórek trwałych4,5,22. Metoda rozcieńczania/cyklu wzrostu5 opisana powyżej może być użyta do wyeliminowania tych wcześniej istniejących persisterów przed przeniesieniem komórek do mikromacierzy. Ich eliminacja może być zwalidowana poprzez ilościowe określenie poziomów trwałości kultur nocnych za pomocą testu opisanego w Protokole 3. Metoda ta została już zweryfikowana w poprzednim badaniu19.

3. Walidacja eliminacji wcześniej istniejących komórek trwałych

  1. Po drugim rozmnażaniu (patrz krok 2.3) rozcieńczyć 250 μl kultury komórkowej (OD600 = 0,5) w 25 ml świeżej zmodyfikowanej pożywki LB w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml.
    UWAGA: W przypadku kontroli rozcieńczyć 250 μl hodowli przez noc (patrz krok 2.1) w 25 ml świeżej zmodyfikowanej pożywki LB w kolbie z przegrodą o pojemności 250 ml. Przed przeniesieniem komórek do kolby, gęstość komórek w nocnej hodowli powinna być dostosowana w świeżej zmodyfikowanej pożywce LB w celu uzyskania OD600 = 0,5.
  2. Dodać 25 μl roztworu podstawowego OFX (5 mg/ml) do zawiesiny komórek i delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby uzyskać jednorodność badanej hodowli. Końcowe stężenie OFX wynosi 5 μg/ml w kulturze testowej.
  3. Inkubować kulturę testową w wytrząsarce orbitalnej przy prędkości 250 obr./min i temperaturze 37 °C.
  4. Co godzinę podczas poddawania działaniu substancji (w tym 0 godzin, punkt czasowy przed dodaniem OFX do kultury testowej) przenieść 1 ml kultury testowej z kolby do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  5. Odwirować kulturę testową w probówce mikrowirówki przy 17 000 x g przez 3 minuty.
  6. Ostrożnie usunąć 950 μl supernatantu, nie naruszając osadu komórkowego.
  7. Dodać 950 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do probówki mikrowirówkowej.
  8. Powtórzyć kroki płukania 3,5-3,7 łącznie 3x, aż stężenie antybiotyku spadnie poniżej minimalnego stężenia hamującego (MIC).
  9. Po końcowym płukaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl roztworu PBS, uzyskując 10-krotnie zagęszczoną próbkę.
  10. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i seryjnie rozcieńczyć sześć razy w 90 μl roztworu PBS, używając 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
  11. Umieścić 10 μl rozcieńczonych zawiesin komórkowych na świeżych płytkach agarowych bez antybiotyków. Aby zwiększyć granicę wykrywalności, pozostałe 90 μl zawiesiny komórek należy umieścić na świeżej płytce agarowej.
  12. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C przez 16 godzin, a następnie policzyć jednostki tworzące kolonie (CFU). Uwzględnij współczynniki rozcieńczenia przy obliczaniu całkowitej liczby jtk w 1 ml kultury testowej. Krzywe zabijania są generowane przez wykreślenie logarytmicznych wartości CFU w odniesieniu do czasu trwania antybiotykoterapii.
    UWAGA: 6-godzinna kuracja OFX jest wystarczająca do uzyskania dwufazowej krzywej zabijania komórek E. coli19,20. Poziom trwałości rozmnożonych komórek (mierzony liczbą CFU po 6 godzinach) powinien być znacznie niższy niż w hodowli nocnej. Procedury opisane w Protokole 2 i 3 mogą być wykonywane przy użyciu zwykłego LB w zależności od projektu badawczego.  

4. Badania przesiewowe na płytkach z mikromacierzą

  1. Przygotowanie kultur komórkowych w mikromacierzach
    1. Przenieść 250 μl komórek o fazie wykładniczej do 25 ml świeżo zmodyfikowanej pożywki LB w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, aby uzyskać jednorodną konsystencję.
      UWAGA: Ogniwa o fazie wykładniczej (OD600 = 0,5) uzyskuje się z drugiego etapu propagacji (patrz krok 2.3).
    2. Rozcieńczoną zawiesinę komórkową przenieść do sterylnego zbiornika o pojemności 50 ml.
    3. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 150 μl zawiesiny komórek do każdego dołka mikromacierzy, tj. 96-dołkowej płytki zawierającej różne osmolity.
      UWAGA: Studnie, które nie mają osmolitów, służą jako kontrole.
    4. Przykryj mikromacierz membraną uszczelniającą przepuszczającą gaz.
    5. Inkubować płytkę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min przez 24 godziny
      UWAGA: W tych eksperymentach użyto dostępnych na rynku płytek, takich jak mikromacierze fenotypowe (PM-9 i PM-10), które zawierają szeroką gamę osmolitów, pH i innych substancji chemicznych w stanie suchym w różnych stężeniach. Te mikromacierze są w formatach płytek 96-dołkowych o połowie powierzchni. Objętość kultur należy dostosować w zależności od rodzaju używanych płytek. Mikromacierze można również generować ręcznie (patrz poniżej).
  2. Ręczne przygotowanie płytek mikromacierzowych
    1. Przenieś 75 μl 2x roztworów osmolitu do studzienek płytki 96-dołkowej o połowie powierzchni.
    2. Przenieś 500 μl komórek o fazie wykładniczej do 25 ml 2x zmodyfikowanej pożywki LB w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, aby uzyskać jednorodną konsystencję.
      UWAGA: Szybkość inokulacji została dostosowana tak, aby była zgodna z protokołem badań przesiewowych mikromacierzy opisanym w 4.1.  
    3. Dodać 75 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o połowie powierzchni zawierającej 2x roztwory osmolitów.
    4. Inkubować płytkę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min przez 24 godziny.
  3. Przygotowanie płytek do oznaczania trwałości
    1. Przygotować 25 ml zmodyfikowanej pożywki LB zawierającej 5 μg/ml OFX w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i przenieść tę pożywkę do sterylnego zbiornika.
    2. Przenieść 190 μl zmodyfikowanej pożywki LB z OFX ze zbiornika do każdej studzienki ogólnej płaskodennej płytki 96-dołkowej (płytka do badania trwałego) za pomocą pipety wielokanałowej.
    3. Wyjąć mikromacierz z wytrząsarki (po 24 godzinach hodowli) i przenieść 10 μl kultur komórkowych z mikromacierzy do dołków płytki do oznaczania trwałości, zawierających zmodyfikowaną pożywkę LB z OFX.
    4. Pobrać 10 μl zawiesin komórkowych z płytki do oznaczania trwałości i seryjnie rozcieńczyć trzykrotnie w 290 μl roztworu PBS za pomocą okrągłodennej 96-dołkowej płytki i pipety wielokanałowej.
    5. Po seryjnym rozcieńczeniu, za pomocą pipety wielokanałowej umieścić 10 μl wszystkich seryjnie rozcieńczonych zawiesin komórkowych na świeżych płytkach agarowych bez antybiotyków.
    6. Inkubować płytkę do badania trwałości (przygotowaną w kroku 4.3.3) w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min przez 6 godzin po pokryciu płytki membraną uszczelniającą przepuszczającą gaz.
    7. Po 6 godzinach inkubacji w wytrząsarce wyjąć płytkę do oznaczania trwałości i powtórzyć czynności opisane w pkt 4.3.4-4.3.5.
    8. Inkubować płytki agarowe przez 16 godzin w temperaturze 37 °C, a następnie policzyć jtk. Poziomy jtk przed i 6 godzin po antybiotykoterapii pozwalają na obliczenie frakcji trwałej w każdym dołku. Liczba CFU przed leczeniem OFX pomaga również ocenić wpływ osmolitów i na żywotność E. coli.

5. Walidacja zidentyfikowanych warunków

  1. Przenieść 250 μl komórek fazy wykładniczej z etapu 2.3 do 25 ml świeżej zmodyfikowanej pożywki LB zawierającej osmolit zidentyfikowany w wyniku badania przesiewowego mikromacierzy (patrz protokół 4).
  2. Inkubować kolbę w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 250 obr./min i w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  3. Po 24 godzinach wyjąć kolbę z wytrząsarki i przenieść 250 μl kultury komórkowej do 25 ml świeżej zmodyfikowanej pożywki LB w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml.
  4. Dodać 25 μl roztworu podstawowego OFX (5 mg/ml) do zawiesiny komórek i delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby uzyskać jednorodność badanej hodowli. Inkubować kolbę w wytrząsarce w temperaturze 37 °C i 250 obr./min.
  5. Co godzinę podczas leczenia należy przenieść 1 ml kultury testowej z kolby do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  6. Odwirować kulturę testową w probówce mikrowirówki przy 17 000 x g przez 3 minuty.
  7. Usunąć 950 μl supernatantu i dodać 950 μl PBS.
  8. Powtórz kroki prania 5.6 i 5.7 3x.
  9. Po ostatnim przemyciu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl roztworu PBS.
  10. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i seryjnie rozcieńczyć 6x w 90 μl roztworu PBS za pomocą 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
  11. Umieścić 10 μl rozcieńczonych zawiesin komórkowych na świeżej płytce agarowej bez antybiotyków. Aby zwiększyć granicę wykrywalności, pozostałe 90 μl zawiesiny komórek należy umieścić na świeżej płytce agarowej.
  12. Inkubować płytkę agarową w temperaturze 37 °C przez 16 godzin, a następnie policzyć jtk.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 opisuje nasz eksperymentalny protokół. Eksperymenty z rozcieńczeniem/cyklem wzrostu (patrz Protokół 2) zostały zaadaptowane z badania przeprowadzonego przez Keren et al.5 w celu wyeliminowania przetrwałych składników pochodzących z kultur nocnych. Rysunek 2A to reprezentatywny obraz płytek agarowych używanych do określania poziomów CFU w hodowlach komórkowych przed i po leczeniu OFX. W tych eksperymentach komórki hodowano w zmodyfikowanym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj wysokoprzepustowy test trwałości został opracowany w celu wyjaśnienia wpływu różnych substancji chemicznych na trwałość E. coli . Oprócz komercyjnych płytek PM, mikromacierze mogą być konstruowane ręcznie, jak opisano w kroku 4.2. Co więcej, przedstawiony tutaj protokół jest elastyczny i może być używany do badań przesiewowych innych mikromacierzy, takich jak panele leków i biblioteki komórkowe, które są w formatach płytek 96-dołkowych. Warunki eksperymentalne, w tym faza wzrostu, szybkość inokulac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować członkom Orman Lab za ich cenny wkład podczas tego badania. Badanie to zostało sfinansowane przez NIH/NIAID K22AI125468 nagrodę za przejście do kariery oraz grant dla startupów Uniwersytetu w Houston.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
14-ml probówkaFisher Scientific14-959-1B
Szczep E. coli MG1655UniwersytetUzyskany z laboratorium Brynildsen
Płaska denna 96-dołkowa płytkaUSA Scientific5665-5161
Membrana uszczelniająca przepuszczająca gazVWR102097-058Sterylizowana promieniowaniem gamma i wolna od cytotoksyn
Połowa powierzchni płaska 96-dołkowa płytkaVWR82050-062
LB agarFisher ScientificBP1425-2Klasa genetyki molekularnej
Sól ofloksacynyVWR103466-232HPLC ≥ 97.5
Mikromacierz fenotypowa (PM-9 i PM-10)Płytki BiologN/APM-9 i PM-10 zawierały odpowiednio różne osmolity i
Okrągłodenna 96-dołkowa płytkaUSA Scientific5665-0161
Chlorek soduFisher ScientificS271-500Certyfikowany stopień ACS
Azotan soduFisher ScientificAC424345000Klasa odczynnika ACS
Azotyn soduFisher ScientificAAA186680Bczystości 98%
Kwadratowa szalka PetriegoFisher ScientificFB0875711A
TryptoneFisher ScientificBP1421-500Wielomodowy
czytnik mikropłytek Varioskan luxThermo Fisher ScientificVLBL00D0Służy do pomiaru gęstości optycznej przy 600 nm
Ekstrakt drożdżowyFisher ScientificBP1422-100Klasa genetyki molekularnej
Princeton klasy genetyki molekularnej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
  2. Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
  3. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
  4. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
  5. Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
  6. Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
  7. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  8. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  9. Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
  10. Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
  11. Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177(2019).
  12. Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
  13. Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760(2009).
  14. Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
  15. Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
  16. Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
  17. Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983(2015).
  18. Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
  19. Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393(2020).
  20. Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472(2020).
  21. Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
  22. Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
  23. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008(2006).
  24. Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
  25. Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wp yw osmolit wp ytka do mikrotablictest persystencjirozcie czenia seryjnejednostki tworz ce kolonietraktowanie ofloksacynmodyfikowana po ywka LBmembrana przepuszczaj ca gazy

Powiązane artykuły