W tym artykule metodycznym prezentujemy strategię wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu identyfikacji związków chemicznych, takich jak osmolity, które mają znaczący wpływ na trwałość bakterii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków chemicznych w celu wyjaśnienia ich wpływu na trwałość bakterii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przetrwacze bakterii są definiowane jako mała subpopulacja wariantów fenotypowych zdolnych do tolerowania wysokich stężeń antybiotyków. Są one ważnym problemem zdrowotnym, ponieważ są związane z nawracającymi przewlekłymi infekcjami. Chociaż wiadomo, że stochastyczna i deterministyczna dynamika mechanizmów związanych ze stresem odgrywa znaczącą rolę w trwałości, mechanizmy leżące u podstaw fenotypowego przejścia do/ze stanu trwałości nie są w pełni zrozumiałe. Chociaż czynniki trwałości wyzwalane przez sygnały środowiskowe (np. wyczerpywanie się źródeł węgla, azotu i tlenu) zostały szeroko zbadane, wpływ osmolitów na trwałość nie został jeszcze określony. Korzystając z mikromacierzy (tj. 96-dołkowych płytek zawierających różne substancje chemiczne), opracowaliśmy podejście do wyjaśnienia wpływu różnych osmolitów na trwałość Escherichia coli w sposób wysokoprzepustowy. Podejście to jest przełomowe, ponieważ można je łatwo zaadaptować do innych macierzy przesiewowych, takich jak panele leków i biblioteki nokautów genowych.
Wprowadzenie
Kultury bakteryjne zawierają małą subpopulację trwałych komórek, które są tymczasowo odporne na niezwykle wysokie poziomy antybiotyków. Komórki stałe są genetycznie identyczne ze swoimi wrażliwymi na antybiotyki krewnymi, a ich przetrwanie przypisuje się przejściowemu hamowaniu wzrostu1. Komórki Persister zostały po raz pierwszy odkryte przez Gladys Hobby2, ale termin ten został po raz pierwszy użyty przez Josepha Bigerma, kiedy zidentyfikował je w kulturach Staphylococcus pyogenes leczonych penicyliną3. Przełomowe badanie opublikowane przez Balaban et al.4 odkryło....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie pożywki wzrostowej, roztworu ofloksacyny i zapasów komórek E. coli
- Zwykła pożywka Luria-Bertani (LB): Dodać 10 g/l tryptonu, 10 g/l chlorku sodu (NaCl) i 5 g/l ekstraktu drożdżowego do wody dejonizowanej (DI). Wysterylizuj pożywkę przez autoklawowanie.
- Płytki agarowe LB: Dodać 10 g/l tryptonu, 10 g/l NaCl, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 15 g/l agaru w wodzie DI i wysterylizować podłoże przez autoklawowanie. W żądanej temperaturze (~55 °C) wlej ~30 ml podłoża agarowego na kwadratowe płytki (10 x 10 cm). Wysuszyć płytki i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Zmodyfikowane podłoże LB: Dodaj 10 g/l try....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia nasz protokół eksperymentalny. Eksperymenty z cyklem rozcieńczania/wzrostu (patrz Protokół 2) zostały zaadaptowane z badania przeprowadzonego przez Keren i wsp.5 w celu wyeliminowania persisterów pochodzących z kultur nocnych. Rysunek 2A to reprezentatywny obraz płytek agarowych użytych do oznaczenia poziomu CFU kultur komórkowych przed i po traktowaniu OFX. W tych eksperymentach komórki hodowano w zmodyfikowanym med.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj wysokoprzepustowy test trwałości został opracowany w celu wyjaśnienia wpływu różnych substancji chemicznych na trwałość E. coli . Oprócz komercyjnych płytek PM, mikromacierze mogą być konstruowane ręcznie, jak opisano w kroku 4.2. Co więcej, przedstawiony tutaj protokół jest elastyczny i może być używany do badań przesiewowych innych mikromacierzy, takich jak panele leków i biblioteki komórkowe, które są w formatach płytek 96-dołkowych. Warunki eksperymentalne, w tym faza wzrostu, szybkość inokulac.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować członkom Orman Lab za ich cenny wkład podczas tego badania. Badanie to zostało sfinansowane przez NIH/NIAID K22AI125468 nagrodę za przejście do kariery oraz grant dla startupów Uniwersytetu w Houston.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 14-ml probówka | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| Szczep E. coli MG1655 | Uniwersytet | Uzyskany z laboratorium Brynildsen | |
| Płaska denna 96-dołkowa płytka | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Membrana uszczelniająca przepuszczająca gaz | VWR | 102097-058 | Sterylizowana promieniowaniem gamma i wolna od cytotoksyn |
| Połowa powierzchni płaska 96-dołkowa płytka | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Klasa genetyki molekularnej |
| Sól ofloksacyny | VWR | 103466-232 | HPLC ≥ 97.5 |
| Mikromacierz fenotypowa (PM-9 i PM-10) | Płytki Biolog | N/A | PM-9 i PM-10 zawierały odpowiednio różne osmolity i |
| Okrągłodenna 96-dołkowa płytka | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Chlorek sodu | Fisher Scientific | S271-500 | Certyfikowany stopień ACS |
| Azotan sodu | Fisher Scientific | AC424345000 | Klasa odczynnika ACS |
| Azotyn sodu | Fisher Scientific | AAA186680B | czystości 98% |
| Kwadratowa szalka Petriego | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Wielomodowy |
| czytnik mikropłytek Varioskan lux | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Służy do pomiaru gęstości optycznej przy 600 nm |
| Ekstrakt drożdżowy | Fisher Scientific | BP1422-100 | Klasa genetyki molekularnej |
Bibliografia
- Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
- Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
