Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie in vitro aktywnie dojrzewających eksplantatów chrząstki stawowej bydła do obrazowania z kontrastem fazy rentgenowskiej

938 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61607

⸱

31 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm UA07, Rayonnement Synchrotron pour la Recherche Biomédicale (STROBE), 2Centre of Nanohealth, Swansea University Medical School, 3ISTerre, Université Grenoble Alpes, CS, Grenoble Cedex 9, 4Novitom, R&D Grenoble, 5ESRF, European Synchrotron Radiation Facility, CS, Grenoble Cedex 9

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje przygotowanie in vitro bydlęcej chrząstki stawowej do obrazowania w wysokiej rozdzielczości za pomocą promieni rentgenowskich. Te eksplantaty aktywnie przechodzą dojrzewanie pourodzeniowe. Opisujemy tutaj niezbędne kroki od biopsji do analizy danych z obrazowania 3D z kontrastem fazowym rentgenowskim, przechodząc przez hodowlę eksplantatów, stabilizację tkanek i przygotowanie synchrotronowe.

Streszczenie

Zrozumienie mechanizmów, które leżą u podstaw poporodowego dojrzewania chrząstki stawowej, ma kluczowe znaczenie dla projektowania nowej generacji strategii inżynierii tkankowej i potencjalnej naprawy chorej lub uszkodzonej chrząstki. Ogólnie rzecz biorąc, dojrzewanie pourodzeniowe chrząstki stawowej, które jest całościową zmianą w strukturze kolagenu i funkcji tkanki w celu dostosowania się do wzrostu organizmu, zachodzi w skali czasowej od miesięcy do lat. I odwrotnie, rozpuszczenie organizacji strukturalnej chrząstki, które również zachodzi w długich skalach czasowych, jest cechą charakterystyczną zwyrodnienia tkanek. Nasza zdolność do szczegółowego badania tych procesów biologicznych została zwiększona dzięki odkryciom, że czynniki wzrostu mogą indukować przedwczesne dojrzewanie in vitro niedojrzałej chrząstki stawowej. Zmiany rozwojowe i związane z chorobą, które zachodzą w stawie, obejmują kości i chrząstki, a zdolność do współobrazowania tych tkanek znacznie zwiększyłaby nasze zrozumienie ich splecionych ról.

Jednoczesna wizualizacja zmian w tkankach miękkich, chrzęstnych i kostnych jest obecnie wyzwaniem do pokonania dla konwencjonalnych metod obrazowania przedklinicznego stosowanych w obserwacji choroby stawów. Metody trójwymiarowego obrazowania rentgenowskiego z kontrastem fazowym (PCI) są stale rozwijane od 20 lat ze względu na wysoką wydajność obrazowania obiektów o niskiej gęstości i ich zdolność do dostarczania dodatkowych informacji w porównaniu z konwencjonalnym obrazowaniem rentgenowskim.

W tym protokole szczegółowo opisujemy procedurę stosowaną w naszych eksperymentach, począwszy od biopsji chrząstki, poprzez wytwarzanie dojrzałej chrząstki in vitro, aż po analizę danych z obrazu zebranego za pomocą rentgenowskiego obrazowania z kontrastem fazowym.

Wprowadzenie

Niedojrzała chrząstka stawowa jest odpowiednim wsparciem do zainicjowania zmian morfologicznych, strukturalnych i biomolekularnych1 w celu uzyskania funkcji specyficznej dla stawu dorosłego. Główną zmianą jest reorganizacja włókien kolagenowych z takich, które wykazują równoległą orientację względem powierzchni w niedojrzałej chrząstce, do takiej, w której włókienka głębiej w tkance są prostopadłe w dojrzałej chrząstce. Pseudostratyfikacja dorosłej chrząstki jest widoczna poprzez reorganizację rezydujących chondrocytów wzdłuż kierunku orientacji włókien kolagenowych, z komórkami na powierzchni dyskowatymi i równoległymi do powierzchni, a w głębszych strefach komórki stają się stopniowo większe i zorganizowane w kolumny. Wiadomo, że dojrzewanie poporodowe trwa wiele miesięcy i zasadniczo kończy się pod koniec okresu dojrzewania, uważano, że długa skala czasowa sprawia, że szczegółowe badanie tego ważnego przejścia rozwojowego jest w najlepszym razie trudne lub technicznie niemożliwe2. Pewne postępy w rozwiązaniu tego problemu zostały poczynione dzięki odkryciu, że czynnik wzrostu fibroblastów-2 i transformujący czynnik wzrostu-β1 razem są w stanie wywołać ważne zmiany fizjologiczne i morfologiczne, które replikują dojrzewanie chrząstki stawowej2,3 (Rysunek 1). Dojrzewanie in vitro wywołane czynnikiem wzrostu następuje w ciągu trzech tygodni i nie wymaga żadnego wkładu biomechanicznego. Po hodowli ekspresja kolagenu typu II jest znacznie zmniejszona, a stosunek dojrzałych trójwartościowych do niedojrzałych dwuwartościowych usieciowań kolagenowych wzrasta, co widać w dojrzewającej chrząstce. Ponadto organizacja macierzy zewnątrzkomórkowej i włókien kolagenowych jest bliższa tej obserwowanej w dojrzałej chrząstce, chociaż ten aspekt przejścia nie jest kompletny. Pod względem biochemicznym skład chrząstki traktowanej czynnikiem wzrostu naśladuje chrząstkę stawową dorosłego osobnika3.

Model użyty w artykule opiera się na hodowli in vitro eksplantatów o średnicy 4 lub 6 mm, które zostały wycięte w sterylnych warunkach z bocznej strony kłykcia przyśrodkowego stawu śródręczno-paliczkowego od niedojrzałych samców (7 dni) wołów bydlęcych. Cienka warstwa zwapniałej chrząstki i kości podchrzęstnej była utrzymywana na podstawowym aspekcie każdego eksplantatu. Chrząstkę stawową hodowano w klasycznym podłożu bez surowicy, zmodyfikowanym pożywką Eagles firmy Dulbecco (wysoka glukoza 4,5 g/l), do której dodano insulinę-transferynę-selen (ITS), 10 mM bufor HEPES pH 7,4, kwas askorbinowy i 50 μg/ml gentamycyny. Ta pożywka hodowlana jest uzupełniona czynnikiem wzrostu fibroblastów 2 (FGF-2) o stężeniu 100 ng/ml i transformującym czynnikiem wzrostu β1 o stężeniu 10 ng/ml (TGF-β1), które są uzupełniane co trzeci dzień zmianami pożywki2. Wysoce przyspieszone dojrzewanie chrząstki jest indukowane przez połączenie czynników wzrostu. Zmiany te następują w ciągu 21 dni. Stymulacja czynnika wzrostu dodatkowo indukuje apoptozę i resorpcję od strony podstawowej oraz proliferację komórkową w chondrocytach powierzchniowych3. Skład pożywki przedstawiono w tabeli 1. Zgodnie z modelem opracowanym przez Khan et al. 20112, eksplantaty chrząstki stawowej są hodowane za pomocą TGF-β1 w stężeniu 10 ng/μL i FGF2 w stężeniu 100 ng/μL (stężenia podstawowe 10 μg/ml i 100 μg/ml rozpuszczone w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem/0,1% BSA). Stosuje się 1 μl każdego czynnika wzrostu na 1 ml pożywki. DMEM-F12 z L-glutaminą i wysoką glukozą jest sztucznym podłożem, które po uzupełnieniu insuliną, transferyną i selenem (ITS), kwasem askorbinowym, gentamycyną i HEPES zapewnia kompletną suplementację pożywki ze wszystkimi fizjologicznymi wymaganiami wzrostu specyficznymi dla różnych linii komórkowych i kultur eksplantatów. DMEM-F12 składa się z kilku różnych soli nieorganicznych (tj. NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, NaH2PO4), glukozy, aminokwasów (źródeł azotu), witamin, kofaktorów i wody. Sole te zapewniają odpowiednie wkłady energetyczne, aby utrzymać przetrwanie komórek i normalny wzrost w kulturze. Jony mineralne przyczyniają się do utrzymania osmolarności w pobliżu naturalnego środowiska fizjologicznego. Wyższe stężenie glukozy (4,5 g/l) jest wykorzystywane do oddychania chondrocytów głównie poprzez glikolizę. Suplementacja pożywką F12 jest stosowana, ponieważ oferuje wiele źródeł siarczanów, CuSO4,FeSO4,ZnSO4 iMgSO4 wymaganych do syntezy siarczanowych glikozaminoglikanów. Jak sprawdzają kolorowe wskaźniki (tutaj czerwień fenolowa) i bufor CO2 / HCO-3 w połączeniu z fosforanami, pH pozostaje stałe na poziomie wartości bliskiej 7,4. Główną drogą oddechową wykorzystywaną przez chondrocyty jest glikoliza, w której kwas mlekowy jest produktem końcowym, który powoduje wzrost pH, dlatego przy braku sił biomechanicznych, które pomogłyby usunąć lokalnie wytwarzany kwas mlekowy, HEPES działa w celu utrzymania buforowanego środowiska dla procesów fizjologicznych. Gentamycyna jest antybiotykiem aminoglikozydowym, który kontroluje zewnętrzne zanieczyszczenie bakteryjne poprzez hamowanie wzrostu. Kwas askorbinowy jest używany jako dopełniacz pożywki ze względu na jego działanie przeciwutleniające4. Kwas askorbinowy jest kofaktorem enzymów, hydroksylaz prolilowych, które działają do hydroksylacji reszt proliny w kolagenie, stabilizując jego strukturę potrójnej helisy. Transferyna zwykle służy jako przeciwutleniacz zewnątrzkomórkowy (toksyczność i redukcja ROS)5,6. Jest również dodawany do pożywki hodowlanej ze względu na jego zdolność do dostarczania i ułatwiania zewnątrzkomórkowego magazynowania i transportu żelaza w hodowli komórkowej. Transferyna wiąże żelazo tak ściśle w warunkach fizjologicznych, że praktycznie nie istnieje wolne żelazo, które katalizowałoby produkcję wolnych rodników7. Hormon insuliny sygnalizujący ze swojego związanego receptora zwiększa wchłanianie kilku pierwiastków, takich jak glukoza, aminokwasy. Bierze również udział w kilku procesach, takich jak transport wewnątrzkomórkowy, lipogeneza, synteza białek i kwasów nukleinowych. Insulina ma działanie stymulujące wzrost. Selen występuje dodatkowo w roztworze złożonym "insulina-transferyna-selen", jako selenin sodu. Jest stosowany głównie jako kofaktor dla białek (seleno-), takich jak peroksydaza gluthationowa (GPX), jako dodatkowy środek przeciwutleniający w hodowli. W chondrocytach stawowych in vitro ITS wydaje się zwiększać proliferację komórkową i zachowanie fenotypu poprzez hamowanie ekspresji genów związanych z dedyferencjacją komórkową i różnicowaniem przerostowym8. Czynniki wzrostu, takie jak czynnik wzrostu fibroblastów-2 i transformujący czynnik wzrostu-β1, są dodawane do pożywki hodowlanej. Są one używane do indukowania i regulowania różnicowania, wzrostu, gojenia i rozwoju komórek2,3. FGF-2 i TGF-β1 w połączeniu również silnie promują proliferację komórkową w hodowanych komórkach i tkankach9.

Ten model dojrzewania chrząstki stawowej in vitro jest przydatny z trzech głównych powodów. Po pierwsze, przyspieszone przejście fazowe rozwoju w tym modelu pozwala nam badać niezauważalne zmiany, które zachodzą przez wiele miesięcy w modelach in vivo, takie jak podwyższona ekspresja oksydazy lizowej-L1 podczas dojrzewania10. Po drugie, inżynieria tkankowa chrząstki stawowej cierpi z powodu faktu, że wytwarzana jest chrząstka o izotropowej morfologii i strukturze, która jest funkcjonalnie niewystarczająca po przeszczepieniu do stawów w celu naprawy ubytków ogniskowych. Zrozumienie, w jaki sposób indukować zmiany dojrzewające, przyspieszy rozwój w pełni funkcjonalnych urządzeń wszczepialnych. Po trzecie i istotne dla tego badania, istnieją choroby zwyrodnieniowe stawów, takie jak choroba Kashina-Becka, występujące w dzieciństwie, które prowadzą do poważnych deformacji stawów w wieku dorosłym. Ta konkretna choroba jest silnie związana z obszarami geograficznymi (Chiny) z endemicznymi niedoborami selenu i jodu, potencjalnie dotykającymi dziesiątki milionów mieszkańców11,12,13. Badania wad kośćca w chorobie Kashina-Becka wskazują, że występuje ona w okresie okołopokwitaniowym, co implikuje zaburzenia procesów dojrzewania kośćca. Dlatego, aby lepiej zrozumieć rolę selenu w chrząstce stawowej (AC), potrzebny jest solidny model wzrostu i rozwoju chrząstki. Model dojrzewania indukowany czynnikiem wzrostu in vitro stanowi użyteczny punkt wyjścia do badań nad wzrostem i metabolizmem chrząstki stawowej podczas dojrzewania w obecności lub braku jonów selenu14,15,16. Nasza wiedza na temat wpływu niedoboru selenu (Se) na złożone i wzajemnie powiązane procesy biologiczne pozostaje bardzo uboga. Główny problem polega na tym, że selen pozostaje pierwiastkiem do zbadania ze względu na jego restrykcyjny zakres działania (wymagane stężenie od 40 do 400 μg/kg17) i bardzo niskie stężenie. Model przyspieszonego dojrzewania z wykorzystaniem niedojrzałej chrząstki bydlęcej oferuje bezprecedensową możliwość przyjrzenia się zmianom biologicznym, które zachodzą w ważnej fazie rozwoju. Stężenie Se w organizmach jest ściśle kontrolowane, a model ten stanowi punkt wyjścia do opracowania technik obrazowania pozwalających na jego precyzyjne śledzenie podczas dojrzewania. Techniki te mogą stać się potężnym narzędziem do badania strategii zapobiegania degradacji AC i potencjalnie do opracowania podstaw nowych terapii opartych na medycynie regeneracyjnej.

Jednoczesna wizualizacja zmian w tkankach miękkich, chrzęstnych i kostnych jest głównym wyzwaniem w konwencjonalnych metodach obrazowania przedklinicznego. Byłaby to rzeczywiście ważna pomoc w obserwacji chorób stawów18,19 . Na przykład konwencjonalna rentgenowska mikrotomografia komputerowa (μCT) wykazuje słabe wyniki w przypadku tkanek miękkich, które ograniczają jej zastosowanie do przedstawiania ubytków kostnych, osteofitów i pośredniej wizualizacji chrząstki. Z drugiej strony obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) jest konwencjonalnie stosowane do obrazowania tkanek miękkich, pomimo jego słabej zdolności do precyzyjnego oddawania zmian w kości (np. mikrozwapnień) w początkowych stadiach choroby. Zdolność do wrażliwości na kości i chrząstki oraz do rozróżniania komórek składowych chrząstki, chondrocytów ma ogromne znaczenie. Obrazowanie z kontrastem fazowym (PCI) opiera się na właściwości, że współczynnik załamania promieniowania rentgenowskiego materiałów może być tysiąc razy większy niż współczynnik absorpcji dla lekkich pierwiastków. Generuje to wyższy kontrast dla tkanek miękkich w porównaniu z konwencjonalnymi metodami opartymi na wchłanianiu podeszwy. W związku z tym PCI jest w stanie zobrazować wszystkie tkanki, które składają się na staw, mając jednoczesną reprezentację zarówno tkanek o wysokiej absorpcji (np. kości), jak i mniej absorbujących (np. chrząstki włóknistej, więzadeł, ścięgien, łąkotki i powiązanych tkanek miękkich (błony maziowe i mięśnie))18,19,20,21.

Jak wykazano w ref.20, rentgenowskie PCI przewyższa inne przedkliniczne metody obrazowania chrząstki. Celem niniejszego protokołu jest uszczegółowienie procedury i przedstawienie reprezentatywnych wyników. Schemat wpływu czynników wzrostu na niedojrzałe eksplantaty chrząstki przedstawiono w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet Badań Etycznych Uniwersytetu w Swansea, a materiały do biopsji zostały nabyte na podstawie licencji od Departamentu Środowiska, Żywności i Spraw Wiejskich (DEFRA), UK. Protokół ten jest zgodny z wytycznymi naszych instytucji dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Kultury eksplantatów

  1. Przygotowanie eksplantatów ze skóry głowy bydła
    1. Przygotuj ochraniacz chłonny i skalpel, standardowy skalpel chirurgiczny z ostrzem skalpela #10.
    2. Spryskaj wszystkie materiały 70% roztworem etanolu.
    3. Nogę bydlęcą (7-dniowe samce wołów bydlęcych pozyskane z rzeźni za zgodą lekarza weterynarii) namoczyć w wodzie, aby usunąć całą krew i błoto.
    4. Oczyść nogę mydłem i wyszoruj szczotką.
    5. Po odpowiednim oczyszczeniu spryskaj nogę 70% etanolem.
    6. Połóż go na chłonnym papierze.
    7. Naciąć wokół stóp skalpelem.
    8. Narysuj delikatną linię wzdłuż nogi.
    9. Zachowaj szczególną ostrożność w strefie stawów.
    10. Ostrożnie usuń skórę nogi wzdłuż podłużnej linii skalpela.
    11. Odpady (skórę, zużyte chusteczki higieniczne, papier i rękawiczki) należy umieścić w worku na odpady medyczne.
    12. Oczyść/wyszczotkuj nogę mydłem i ponownie wysterylizuj etanolem po usunięciu skóry.
    13. Nie uszkadzaj obszaru w pobliżu jamy stawowej. Jeśli jama zostanie otwarta lub uszkodzona przez naciekanie krwi, nie jest już sterylna i noga nie może być używana.
    14. Umieść nogę w folii aluminiowej, która została spryskana 70% etanolem.
    15. Umieść rękawiczki lateksowe o odpowiednim rozmiarze na końcach nogi, aby zapobiec wydostawaniu się krwi z bliższego końca lub ewentualnemu zanieczyszczeniu z kopyta.
    16. Odpady należy utylizować w odpowiedni sposób, zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
  2. Ekstrakcja i hodowla eksplantatów
    UWAGA: Eksplantaty muszą być uzyskane z wewnętrznej części złącza (Rysunek 2, dwa pierwsze etapy). Aby warunki były porównywalne, cztery (lub sześć) eksplantatów muszą zostać wybite z tej samej strefy w celu zastosowania czterech (lub sześciu) różnych zabiegów na próbkach o prawie takim samym kształcie i właściwościach.
    1. Otwórz okap z przepływem laminarnym 25 minut przed użyciem, wyczyść alkoholem 70%.
    2. Umieść pożywkę hodowlaną do ogrzania w łaźni wodnej.
    3. Przygotuj 24-dołkową płytkę z 1,5 ml podłoża zasadowego, tylko DMEM-F12 (medium myjące) w każdym dołku.
    4. Przygotować kolejną płytkę dołka z 1,5 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Przechowywać w inkubatorze do hodowli w temperaturze 37 °C do czasu użycia
    5. Przygotuj materiał na stojaku: jedna uniwersalna tubka z 70% etanolem i druga uniwersalna tuba z medium myjącym.
    6. Przygotuj skalpel i stempel do biopsji o średnicy 4 lub 6 mm (umieszczony w uniwersalnej tubce z alkoholem).
    7. Umieść rurki i materiały pod maską.
    8. Pod maską umieść ochraniacz chłonny spryskany 70% etanolem.
    9. Przygotuj kilka chusteczek spryskanych 70% etanolem.
    10. Weź płytkę preparacyjną, przykryj ją folią aluminiową.
    11. Same, wcześniej przygotowane, nóżki wyjmujemy z lodówki (4°C) i spryskujemy je 70% etanolem.
    12. Worki niebezpieczne i kliniczne należy wyrzucać w pobliżu okapu, aby później autoklawować odpady.
    13. Spryskaj stopę 70% etanolem.
    14. Przesuń staw, aby znaleźć linię środkową stawu, w której należy wykonać nacięcie. Zrób to pod maską.
    15. Weź sterylny skalpel.
    16. Ciąć ostrożnie wzdłuż linii środkowej, podążając za konturem krawędzi połączenia. Nie dotykać chrząstki kłykcia przyśrodkowego stawu śródręczno-paliczkowego.
    17. Ostrożnie przeciąć więzadło, gdy staw jest otwarty.
    18. Wyrzuć dolną część stóp do torby z autoklawem.
    19. Usuń wszystkie inne tkanki, aby odsłonić całą chrząstkę stawu (Rysunek 2).
      UWAGA: Uważaj, aby niczego nie dotknąć stopami.
    20. Umieść skalpel i stempel do biopsji w alkoholu, a następnie w medium myjącym.
    21. Za pomocą tego stempla wykonaj kilka kółek (4-5 na twarz) z pewną siłą wzdłuż wewnętrznych powierzchni kości.
    22. Po zakończeniu umieść stempel biologiczny w alkoholu, aby go wyczyścić.
    23. Weź skalpel i przetnij (narysuj linię) między każdym okręgiem i wzdłuż środkowej linii kości.
    24. Aby usunąć chrząstkę, należy ją wyciąć pionowo na jednej z granic biopsji koła, a następnie bardzo ostrożnie przeciąć poziomo na kości podchrzęstnej.
    25. Aby usunąć eksplant chrząstki przecięty poziomo poniżej linii puenty wzdłuż kości podchrzęstnej i zwapniałej chrząstki, eksplantaty wyskoczą.
      UWAGA: Eksplantaty powinny mieć jednolitą grubość, jeśli to możliwe.
    26. Umieść eksplant w płytce studzienkowej wypełnionej 1,5 ml środka myjącego.
      UWAGA: Zawsze wykonuj kontrolę eksperymentalną i leczenie eksplantatów pochodzących z tego samego miejsca w stawie.
    27. Sprawdź, czy eksplant jest dobrze zorientowany. Powierzchnia eksplantatu powinna być skierowana do góry, a część kości podchrzęstnej eksplantatu powinna być skierowana w stronę dna płytki studzienki.
    28. Utrzymuj płytkę studzienki zamkniętą między każdą biopsją.
    29. Usuń medium myjące.
    30. Umyć ponownie środkiem myjącym. Pozostawić w podłożu myjącym na 2-3 godziny. Resztki kości, krew będzie miała czas, aby wypłynąć w pożywce.
    31. Przenieść eksplantaty do nowej płytki dołka zawierającej kompletną pożywkę hodowlaną. Bądź ostrożny: nie dotykaj niczego pipetą.
    32. Sprawdź, czy eksplantaty są nadal we właściwej pozycji (kość skierowana w stronę dolnej części płytki studzienki).
    33. Wyczyść wszystko i wyrzuć odpady kliniczne w odpowiednie miejsce.
    34. Po umieszczeniu eksplantatów w hodowli w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 należy co dwa dni zmieniać pożywkę hodowlaną eksplantatów na ciepłą, świeżą pożywkę, aby zaspokoić różnorodne potrzeby komórek/tkanek. Sprawdź, czy eksplantaty są nadal we właściwej pozycji (kość skierowana w stronę dolnej części płytki studzienki).
  3. Utrwalanie próbki (opcjonalnie)
    UWAGA: Wykonaj ten krok dopiero po zakończeniu hodowli komórkowej, czyli po 3 tygodniach hodowli. Eksplantaty osiągnęły wtedy fazę dojrzałości.
    1. Umyj eksplantaty za pomocą DMEM-F12 pipetą pod kapturem hodowli tkankowej.
    2. Umyj eksplantaty dwukrotnie za pomocą PBS pipetą pod kapturem do hodowli tkankowej.
    3. Napraw je na noc w temperaturze 4 °C, mocząc w 10% NBFS (Neutral Buffer Formalin Saline).
    4. Umieść utrwalone eksplantaty w PBS w probówce do mikrowirówki
    5. Eksplantaty należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Eksplantaty na stałe mogą pozostawać w tych warunkach do 6 miesięcy.

2. Przygotowanie próbki do sesji obrazowania

  1. Używaj stożkowych plastikowych końcówek o odpowiednim rozmiarze (zwykle końcówka 1 ml) w odniesieniu do próbki i pola widzenia kamery.
  2. Uszczelnić końcówkę stożka (poprzez podgrzanie jej płomieniem) w celu uzyskania wodoodpornego pojemnika na próbkę.
  3. Napełnij końcówkę PBS. Przytrzymaj próbkę pęsetą i włóż ją do probówki. Usuń pęcherzyki powietrza powolnymi wstrząsami.
  4. Zamontuj rurkę na stoliku tomografii i wyrównaj ją, wykonując proste zdjęcia rentgenowskie.

3. Sesja obrazowania z kontrastem w fazie rentgenowskiej

  1. Umieść detektor w odległości 2.5 m od próbki
  2. Ustaw energię fotonów promieniowania rentgenowskiego na 17 keV za pomocą układu podwójnych kryształów krzemu w geometrii Bragga-Bragga.
  3. Detektor Mount Imaging składał się z naukowej kamery CMOS22 na optyce z wynikowym izotropowym rozmiarem woksela 3,5 μm na obrazie 3D.
  4. Użyj sita scyntylacyjnego oksysiarczku gadolinu o grubości 60 μm, aby przekształcić promieniowanie rentgenowskie w światło widzialne
  5. Gromadzenie danych: Uzyskaj 2000 projekcji podczas skanowania 360° próbki z czasem naświetlania wynoszącym 2 s dla każdej projekcji.
  6. Użyj algorytmu odzyskiwania fazy, aby wyodrębnić sygnał fazowy zgodnie z opisem w ref.23. Algorytm wykorzystuje wiedzę a priori na temat złożonego rozkładu współczynnika załamania światła w próbce. Główna hipoteza, niezweryfikowana w tym przypadku, jest taka, że jest jeden materiał do zrekonstruowania. W tym konkretnym przypadku stosunek między refrakcją a wskaźnikiem absorpcji wynosił 1200, co zostało eksperymentalnie zaobserwowane jako najlepszy kompromis dla wizualizacji kości i chrząstek.
  7. Użyj standardowego algorytmu rekonstrukcji CT z filtrowaną projekcją wsteczną przy użyciu implementacji procesora graficznego (GPU) opartej na procesorze graficznym (GPU) o otwartym kodzie źródłowym PyHST2 code24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowano prosty układ obrazowania oparty na propagacji25, przedstawiony schematycznie na Rysunku 3. W synchrotronowym obrazowaniu opartym na propagacji spójna wiązka promieni rentgenowskich oświetla obiekt, co powoduje powstanie przestrzennie zmiennych przesunięć fazowych19. W miarę propagacji wiązki promieni rentgenowskich za próbką, zniekształcony front fali generuje charakterystyczny wzór. Poprzez analizę tych charakterystycznych wzorów z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy kompletne badanie od przygotowania próbki do wizualizacji obrazu, w tym protokoły pozyskiwania danych, do badania in vitro szybko dojrzewającej chrząstki stawowej. Wyniki sesji obrazowania synchrotronowego pokazały dobroć modelu.

W przedstawionym tu modelu należy wspomnieć o pewnych obserwacjach i ograniczeniach. To "przyspieszone dojrzewanie" następuje w ciągu 21 dni od hodowli. W przypadku dłuższych okresów hodowli czopki eksplantatywne zaczynają ulegać degradacji wr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Autorzy dziękują ESRF za udostępnienie własnego czasu badawczego. Autorzy pragną podziękować Ericowi Zieglerowi za dyskusję naukową. Opisywany eksperyment PCI został przeprowadzony na linii badawczej BM05 Europejskiego Ośrodka Promieniowania Synchrotronowego (ESRF) w Grenoble we Francji. CB dziękuje Explora'doc Auvergne Rhone Alpes oraz stypendiom z Uniwersytetu w Swansea i Université Grenoble Alpes za sfinansowanie części tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał: Produkty biologiczne
DMEM/F-12 (1:1) (1X) + GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Mieszanka odżywcza (szynka) 500mLGibco firmy life technologies31331-028
Roztwór odczynnika gentamycyny, 50 mg/mlGibco firmy life technologies15750-060
HEPES, specjalny preparat, 1M, pH 7,5 filtrowanySigmaH-3375
ITS, Insulina-Transferyna-SelenGibco firmy life technologies51500-057
Kwas L-askorbinowy-2-Fosforan, hydrat salf seskwimagnezowy, 95%SigmaA8960-5G
Neutralny bufor buforowy Formalina (NBF)Sigma AldrichHT501128
sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) pH 7,4Gibco firmy life technologies10010023
< mocny> sprzęt do hodowli: < / mocny>
Absordent Protector, BenchkoteWhatmanTMCat nr 2300731,z podkładem polistyreńskim, 460 cm * 50 m
Autoklawowalny
W celu usunięcia zanieczyszczonych plastikowych naczyń laboratoryjnych szyjka powinna być otwarta, aby umożliwić przenikanie pary, Odpady niebezpieczne, STERILIN (biała torba)
stemple do biopsjiMILTEX by KAIref 33-36o średnicy 4 i 6 mm
Odpady kliniczne do alternatywnego leczenia Medium Duty(zatwierdzone przez ONZ waga 5 kg, metody bez zamykania, UN-SH4/Y5/S/II/GB/4/06 (pomarańczowa torba)
ProbówkiEppendorfProbówki Falcon 0,5 ml i 1,5 ml
15ml i 50 ml
wolne od wykrywalnych RNazy, DNazy, DNA i Pyrogens 1000ul Beveled Gradd, końcówka filtraStarlab, TipOne (sterylna)S1122-1830
wolna od wykrywalnych RNazy, DNazy, DNA i Pirogeny 20&mikro; l Skośna z podziałką, końcówka filtraStarlab, TipOne (sterylna)S1120-1810
wolna od wykrywalnych RNaz, DNazy, DNA i Pyrogens 200ul Beveled Stopniowany, końcówka filtraStarlab, TipOne (sterylny)Inkubator S1110-1810
Inkubatorprzy 37° C, nawilżona atmosfera z 5% CO2
Mikroskop
Pipeta25 mL, 10 ml i 5 ml sterylne pipety plastikowe
Pipety (25-10-5 ml)CellStar, Greiner Bio-one
Pęseta plastikowaInstrumentAGT 5230
Końcówki
P1000, P200 i P10 z końcówkami P1000, P200 i P10 (sterylne)
hodowli tkankowych
Pompa
Łaźnia wodna 37° Płytki dołkowe C
12 i 24 dołkowe płytki
< silny>Sprzęt do akwizycji danych: oprogramowanie < / strong>
Fidżioprogramowanie open source
Zestawoprogramowanie open source
worek na odpady VWR optyczny Oxford skalpela Kaptur do próżniowa < mocne> Sprzęt ochronny: < / mocne> rękawice ochronne fartuch laboratoryjny narzędzi do rekonstrukcji PyHST

Bibliografia

  1. Little, C. B., Ghosh, P. Variation in proteoglycan metabolism by articular chondrocytes in different joint regions is determined by post-natal mechanical loading. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (1), 49-62 (1997).
  2. Khan, I. M., et al. Fibroblast growth factor 2 and transforming growth factor β1 induce precocious maturation of articular cartilage. Arthritis and Rheumatology. 63 (11), 3417-3427 (2011).
  3. Khan, I. M., et al. In vitro growth factor-induced bio engineering of mature articular cartilage. Biomaterials. 34 (5), 1478-1487 (2013).
  4. Ascorbate in Cell Culture. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/ascorbate.html (2020).
  5. McNulty, A. L., Vail, T. P., Kraus, V. B. Chondrocyte transport and concentration of ascorbic acid is mediated by SVCT2. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembrane. 1712 (2), 212-221 (2005).
  6. Clark, A. G., Rohrbaugh, A. L., Otterness, I., Kraus, V. B. The effects of ascorbic acid on cartilage metabolism in guinea pig articular cartilage explants. Matrix Biology. 21 (2), 175-184 (2002).
  7. Transferrin in Cell Culture. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/transferrin.html (2020).
  8. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in Vitro. International Journal of Molecular Sciences. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  9. French, M. M., Athanasiou, K. A. Differentiation Factors and Articular Cartilage Regeneration. Topics in Tissue Engineering. Ashammakhi, N., Ferretti, P. , (2003).
  10. Zhang, Y., et al. Platelet-rich plasma induces post-natal maturation of immature articular cartilage and correlates with LOXL1 activation. Science Reports. 7 (1), 3699(2017).
  11. Schepman, K., Engelbert, R. H. H., Visser, M. M., Yu, C., De Vos, R. Kashin Beck Disease: More than just osteoarthrosis - A cross-sectional study regarding the influence of body function-structures and activities on level of participation. International Orthopedics. 35 (5), 767-776 (2011).
  12. Sudre, P., Mathieu, F. Kashin-Beck disease: From etiology to prevention or from prevention to etiology. International Orthopedics. 25 (3), 175-179 (2001).
  13. Allander, E. Kashin-Beck Disease. An analysis of Research and public health activities based on a bibliography 1849-1992. Scandinavian Journal of Rheumatology. 23 (99), 1-36 (1994).
  14. Bissardon, C., et al. Sub-ppm level high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), (2019).
  15. Bissardon, C. Role of Selenium in Articular Cartilage Metabolism, Growth and Maturation. , University of Swansea. Swansea (GB). Available from: https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01942169 (2020).
  16. Bissardon, C., Charlet, L., Bohic, S., Khan, I. Role of the selenium in articular cartilage metabolism, growth, and maturation. Global Advances in Selenium Research from Theory to Application - Proceedings of the 4th International Conference on Selenium in the Environment and Human Health, 2015. , (2016).
  17. Winkel, L. H. E., et al. Environmental selenium research: From microscopic processes to global understanding. Environment Science Technology. 46 (2), 571-579 (2012).
  18. Bravin, A., Coan, P., Suortti, P. X-ray phase-contrast imaging: From pre-clinical applications towards clinics. Physics in Medicine and Biology. 87 (1034), 20130606(2014).
  19. Horng, A., et al. Cartilage and soft tissue imaging using X-rays: Propagation-based phase-contrast computed tomography of the Human Knee in comparison with clinical imaging techniques and histology. Investigative Radiology. 49 (9), 627-634 (2014).
  20. Labriet, H., et al. High-Resolution X-Ray Phase Contrast Imaging of Maturating Cartilage. Microscopy and Microanalysis. 24, S2 382-383 (2018).
  21. Rougé-Labriet, H., et al. X-ray Phase Contrast osteo-articular imaging: a pilot study on cadaveric human hands. Science Reports. 10 (1911), 41598(2020).
  22. Mittone, A., et al. Characterization of a sCMOS-based high-resolution imaging system. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (6), 1226-1236 (2017).
  23. Paganin, D., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206 (1), 33-40 (2002).
  24. Mirone, A., Brun, E., Gouillart, E., Tafforeau, P., Kieffer, J. The PyHST2 hybrid distributed code for high speed tomographic reconstruction with iterative reconstruction and a priori knowledge capabilities. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 324, 41-48 (2014).
  25. Bravin, A., Coan, P., Suortti, P. X-ray phase-contrast imaging: from pre-clinical applications towards clinics. Physics in Medicine and Biology. 58 (1), 1-35 (2013).
  26. Vo, N. T., Atwood, R. C., Drakopoulos, M. Superior techniques for eliminating ring artifacts in X-ray micro-tomography. Optic Express. 26 (22), 28396(2018).
  27. Moo, E. K., Osman, N. A. A., Pingguan-Murphy, B. The metabolic dynamics of cartilage explants over a long-term culture period. Clinics. 66 (8), 1431-1436 (2011).
  28. Stender, M. E., et al. Integrating qPLM and biomechanical test data with an anisotropic fiber distribution model and predictions of TGF-β1 and IGF-1 regulation of articular cartilage fiber modulus. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (6), 1073-1088 (2013).
  29. Labriet, H., et al. 3D histopathology speckle phase contrast imaging: from synchrotron to conventional sources. Medical Imaging 2019: Physics of Medical Imaging. Bosmans, H., Chen, G. H., Gilat Schmidt, T. , (2019).
  30. Zdora, M. C., et al. X-ray Phase-Contrast Imaging and Metrology through Unified Modulated Pattern Analysis. Physics Review Letters. 118 (20), 203903(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dojrzewanie chrz stki stawowejprzygotowanie chrz stki in vitroeksplanty chrz stki bydl cejstrategie in ynierii tkankowejanaliza struktury kolagenuobrazowanie chrz stki i ko cizmiany w chorobach rozwojowychprzedkliniczne metody obrazowaniaobrazowanie tr jwymiarowe

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.