Artykuł metodologiczny

Badanie funkcji genu docelowego w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przeciwciałem agonistycznym CD40 przy użyciu technologii opartych na CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/61618

⸱

2 czerwca 2021

 ,  , 
1AbbVie, Cambridge Research Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodologię eliminacji interesującego genu w układzie odpornościowym za pomocą technologii opartych na zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeniach palindromicznych (CRISPR)/endonukleazie związanej z CRISPR (Cas9) oraz oceny tych myszy w klastrze różnicowania 40 (CD40) agonistycznego modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przeciwciałem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ odpornościowy funkcjonuje w celu obrony ludzi przed obcymi najeźdźcami, takimi jak bakterie i wirusy. Jednak zaburzenia układu odpornościowego mogą prowadzić do autoimmunizacji, chorób zapalnych i raka. Choroby zapalne jelit (IBD) - choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) - są chorobami przewlekłymi charakteryzującymi się nawracającym zapaleniem jelit. Chociaż IBD jest najbardziej rozpowszechnione w krajach zachodnich (1 na 1000), wskaźniki incydentów rosną na całym świecie. Dzięki badaniom asocjacyjnym naukowcy powiązali setki genów z patologią IBD. Jednak skomplikowana patologia stojąca za IBD i duża liczba potencjalnych genów stanowią poważne wyzwanie w znalezieniu najlepszych celów terapeutycznych. Ponadto narzędzia potrzebne do funkcjonalnego scharakteryzowania każdego związku genetycznego wprowadzają wiele czynników ograniczających szybkość, takich jak generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy dla każdego genu. Aby zbadać potencjał terapeutyczny genów docelowych, opracowano system modelowy wykorzystujący technologie oparte na zgrupowanych regularnych krótkich powtórzeniach palindromicznych (CRISPR)/endonukleazie związanej z CRISPR (Cas9) oraz przeciwciałie agonistycznym klastra różnicowania 40 (CD40). Obecne badanie pokazuje, że edycja za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w układzie odpornościowym może być wykorzystana do zbadania wpływu genów in vivo. Podejście to, ograniczone do przedziału krwiotwórczego, niezawodnie edytuje powstały w ten sposób zrekonstruowany układ odpornościowy. Myszy edytowane przez CRISPR/Cas9 są generowane szybciej i są znacznie tańsze niż tradycyjne myszy modyfikowane genetycznie. Co więcej, edycja CRISPR/Cas9 myszy ma znaczące zalety naukowe w porównaniu z generowaniem i hodowlą myszy modyfikowanych genetycznie, takie jak możliwość oceny celów, które są śmiertelne w zarodku. Wykorzystując CD40 jako cel modelowy w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przeciwciałami agonistycznymi CD40, badanie to pokazuje wykonalność tego podejścia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby autoimmunologiczne odnoszą się do stanów, w których układ odpornościowy pacjenta atakuje jego własne komórki i organy, powodując przewlekły stan zapalny i uszkodzenie tkanek. Do tej pory opisano prawie 100 różnych typów chorób autoimmunologicznych, dotykających 3-5% populacji ludzkiej1. Wiele chorób autoimmunologicznych, w tym toczeń rumieniowaty układowy i IBD, nie ma skutecznego leczenia i stanowi znaczne niezaspokojone potrzeby medyczne. Obecnie dotyka około 1,5 miliona ludzi w samych Stanach Zjednoczonych, IBD jest wyniszczającą chorobą charakteryzującą się postępującym, uporczywym i nawracającym zapaleniem jelit, na które nie ma lekarstwa. Odkrycie leżącej u podstaw patogenezy i patofizjologii jest konieczne, aby zapewnić nowe strategie leczenia i profilaktyki, których wymagają pacjenci z IBD2,3.

Ponad 230 różnych loci IBD zostało zidentyfikowanych za pomocą analiz asocjacyjnych całego genomu (GWAS)4. Chociaż powiązania te wyjaśniły nowe geny, które są potencjalnie ważnymi graczami w kluczowych mechanizmach i szlakach IBD, zbadano tylko kilka genów z tych loci. Niektóre geny są zaangażowane w określone szlaki. Na przykład szlak wykrywania drobnoustrojów został powiązany z białkiem 2 zawierającym domenę oligomeryzacji wiążącą nukleotydy (NOD2); szlak autofagii został powiązany z 16 podobnymi do autofagii 1 (ATG16L1), rodziną GTPazy M związaną z odpornością (IRGM) i członkiem rodziny rekrutacji kaspazy 9 (CARD9); a szlak prozapalny został powiązany z odpowiedziami limfocytów T napędzanymi interleukiną (IL)-234. Różne modele myszy in vivo zostały wykorzystane do funkcjonalnego scharakteryzowania genów zidentyfikowanych za pomocą GWAS5,6.

Jeden z kluczowych modeli używanych do badania patogenezy IBD7,8 to model zapalenia jelita grubego CD40, który wywołuje wrodzone immunologiczne zapalenie jelit po wstrzyknięciu przeciwciała agonistycznego CD40 myszom z niedoborem odporności (limfocyty T i B). Używany głównie do badania wpływu odporności wrodzonej na rozwój IBD, głównie makrofagów i komórek dendrytycznych9, nie jest jasne, czy choroba może być wywołana u w pełni kompetentnych immunologicznie myszy typu dzikiego (WT). Oprócz modeli zwierzęcych, do funkcjonalnej charakterystyki genu potrzebne są również narzędzia specyficzne dla genów, w tym związki chemiczne i leki biologiczne. Co ważniejsze, genetycznie modyfikowane zwierzęta są niezbędne do ujawnienia funkcji konkretnego genu. Jednak strategie zwykle stosowane do produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy - wstrzykiwanie i rozmnażanie zarodków - często trwają ponad rok i wiążą się ze znacznymi kosztami finansowymi. Ten proces ograniczania szybkości stanowi poważne wyzwanie w dążeniu do wyjaśnienia funkcji genów związanych z IBD zidentyfikowanych przez GWAS.

Przedstawiony tutaj protokół stanowi realną alternatywę dla hodowli genetycznie modyfikowanych myszy. Po pierwsze, jak pokazano na schemacie Rysunek 1, ujemne pod względem linii, antygen macierzysty1-dodatni, receptorowa kinaza tyrozynowa Kit-dodatnia (lineage-Sca1+c-Kit+ lub LSK) są izolowane ze szpiku kostnego myszy Cas9 knockin (KI) zawierających specyficzny allel (CD45.2), aby umożliwić śledzenie komórek odpornościowych dawcy. Następnie komórki te są wystawiane na działanie lentiwirusów zawierających różne przewodnikowe RNA (gRNA) i marker fluorescencyjny, fioletowo-wzbudzone zielone białko fluorescencyjne (VexGFP), aby umożliwić śledzenie transdukowanych komórek. Dwa dni później komórki VexGFP+ są sortowane i wstrzykiwane śmiertelnie napromieniowanym myszom Ly5.1 Pep Boy, które są myszami C57Bl/6 z allelem CD45.1, aby umożliwić śledzenie komórek odpornościowych biorcy. Dwanaście tygodni później układ odpornościowy jest w pełni zrekonstruowany, a myszy mogą zostać włączone do modeli in vivo.

Oprócz korzyści w postaci oszczędności kosztów i szybszego czasu do generacji w porównaniu do generacji i hodowli genetycznie modyfikowanych zwierząt, ta metodologia jest idealna dla celów, które są śmiertelne dla embrionalnej, ponieważ jest ona ukierunkowana na kompartment krwiotwórczy. Co więcej, w przypadku celów, w przypadku których nie ma dostępnych narzędzi, takich jak przeciwciało, system ten zapewnia wykonalne podejście. Podsumowując, aby sprostać opisanym do tej pory wyzwaniom, opracowano platformę do edycji genomu in vivo opartą na CRISPR/Cas9 w celu szybkiego generowania genetycznie zmodyfikowanych modeli zwierzęcych10,11,12,13,14. Badanie to pokazuje, że zapalenie jelit u myszy WT C57Bl/6 może być wywołane przez przeciwciało agonistyczne CD40. CD40 jest kluczowym regulatorem choroby w tym modelu i dlatego został wykorzystany jako cel modelowy do walidacji nokautu i utraty funkcji genu opartego na CRISPR/Cas9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone zgodnie z tym protokołem muszą zostać zatwierdzone przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez IACUC firmy AbbVie.

1. Generowanie wymaganych lentiwirusów oraz pozyskiwanie zwierząt dawców i biorców

UWAGA: Tabela materiałów zawiera szczegóły dotyczące źródła i numeru zamówienia dla wszystkich zwierząt, instrumentów i odczynników używanych w tym protokole.

  1. Skonstruuj plazmidy za pomocą wektora lentiGuide-puro zmodyfikowanego do VexGFP lub mCherry.
    1. Sklonuj zaszyfrowane gRNA nieukierunkowane (SgNone) lub gRNA ukierunkowane na CD40 do zmodyfikowanego wektora.
      UWAGA: W tym badaniu sekwencje dla każdego gRNA były następujące: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTGTTCCAC; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA; oraz SgCD40.3, ACGTAACACTGCCCTAGA.
    2. Wyprodukuj cząstki lentiwirusa zgodnie z wcześniejszym opisem15.
      1. Kotransfekcja plazmidów kodujących gRNA do komórek 293T za pomocą plazmidów pakujących VSV-G i pLEX.
      2. Zmienić pożywkę hodowlaną po 18 godzinach od transfekcji i zebrać supernatanty zawierające wirusa po 24-48 godzinach od zmiany pożywki.
      3. Aby ocenić wydajność gRNA CD40, wygeneruj stabilną linię komórkową 293T CD40 poprzez transfekcję plazmidu pcDNA3.1, który koduje CD40.
    3. Przetransfekować komórki za pomocą opisanych lentiwirusów i ocenić je za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) dwa tygodnie później.
      UWAGA: Myszy Cas9 KI były używane jako myszy dawcy. Upewnij się, że myszy Cas9 KI znajdują się na tle C57Bl / 6 (i wyrażają allel CD45.2) podczas używania myszy C57Bl / 6-Ly5.1 Pep Boy (wyrażających allel CD45.1) jako biorców, aby uniknąć GvHD i śledzić komórki dawcy i biorcy.
  2. Zaprojektuj eksperyment. W przypadku nokautu genów (KO) użyj 3-6 gRNA na gen. Dla każdej gRNA należy przygotować 20% dodatkowych myszy biorców, aby uwzględnić utratę zwierząt podczas i po przeszczepie.
    UWAGA: Model agonistycznego zapalenia jelita grubego wywołanego przeciwciałami CD40 wymaga co najmniej 8 myszy na grupę do statystycznego zasilania. W związku z tym w tym badaniu przygotowano 10 myszy na gRNA. Liczba myszy potrzebnych do innych modeli in vivo będzie się różnić w zależności od użytego modelu.
  3. Używaj myszy tej samej płci dawców i biorców w wieku 8-12 tygodni.
    UWAGA: Myszy poddano eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi przez IACUC wytycznymi przy użyciu co najmniej 5% izofluranu i potwierdzono zwichnięcie szyjki macicy jako metodę wtórną.

2. Pobieranie szpiku kostnego i przygotowanie do sortowania komórek

  1. Za pomocą kleszczy i nożyczek zbierz kości od każdej myszy dawcy (kość udowa, piszczelowa, ramienna i łokciowa), ostrożnie usuwając jak najwięcej mięśni/tkanki.
  2. Nakłuć dno probówki do mikrowirówki o pojemności 0,6 ml igłą o pojemności 23 g i umieścić probówkę w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zrób 2 zestawy na zwierzę.
  3. Rozetnij jeden koniec kości i umieść 4-8 kości w probówce mikrowirówki z otwartymi końcami skierowanymi w stronę otworu na igłę 23 G.
    UWAGA: Liczba kości w rurce zależy od kości, np. zmieści się 8 kości piszczelowych, ramiennych i łokciowych lub 4 kości udowe.
  4. Odwirować probówki (z probówką do mikrowirówki o pojemności 0,6 ml zawierającą kości znajdujące się w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml) o stężeniu 300 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Wyrzuć probówkę do mikrowirówki o pojemności 0,6 ml, która teraz zawiera kości bez szpiku, pozostawiając tylko probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml pełną szpiku. Dodać 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (zawierającego chlorek amonu) do każdej probówki wirówkowej i ponownie zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. W razie potrzeby powtórz etap lizy.
  6. Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco bez wapnia i magnezu (co najmniej dwukrotnie większą objętość zawiesiny komórkowej) w celu zneutralizowania buforu do lizy. Komórki w granulkach po 300 × g przez 5 min. Całkowicie odessać supernatant.
  7. Załaduj filtr 70 μm na stożkową probówkę o pojemności 50 ml i przefiltruj komórki, używając DPBS do umycia rurki i filtra. Wyrzuć filtr i policz komórki.
    UWAGA: Użycie 30 myszy dawców (w wieku 12 tygodni) da średnio 200-300 × 106 komórek.

3. Sortowanie komórek w celu wyizolowania komórek LSK do transdukcji

  1. Ponownie zawiesić komórki zliczone w kroku 2.7 w buforze do magnetycznego sortowania komórek (MACS) (DPBS, 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 10 μg/ml penicyliny-streptomycyny) w żądanej objętości (90 μL na10-7 komórek).
  2. Dodaj 10 μl kulek CD117+ na 107 komórek. Dobrze wymieszać, chronić przed światłem i inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  3. Przygotuj kolumnę MACS LS, umieszczając kolumnę w polu magnetycznym i przepłukując ją buforem MACS.
  4. Umyj komórki z kroku 3.2 odpowiednią objętością buforu MACS (co najmniej dwukrotnie większą objętość) i odwiruj przy 300 × g przez 10 minut.
  5. Całkowicie odessać supernatant. Ponownie zawiesić osad tak, aby końcowe stężenie wynosiło 10-8 komórek w 500 μl buforu MACS.
  6. Nałóż zawiesinę komórek na kolumnę LS. Przemyć 3 razy 3 ml buforu MACS.
    UWAGA: Jedna kolumna LS może pomieścić do 108 oznaczonych komórek i 2 × 109 komórek.
  7. Wyjmij kolumnę z separatora magnetycznego i umieść ją w odpowiedniej probówce zbiorczej. Dodać 5 ml buforu MACS i natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny.
  8. Granulować komórki w ilości 300 × g przez 10 minut. Całkowicie odessać supernatant.
  9. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu MACS na 107 komórek i dodać przeciwciała barwiące dla linii (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) i Sca-1,
    UWAGA: Użycie 30 myszy dawców (w wieku 12 tygodni) da średnio 100-180 × 106 komórek.
  10. Dobrze wymieszać, chronić przed światłem i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  11. Przemyć komórki, dodając 5-10 ml buforu MACS i odwirować przy 300 × g przez 10 minut. Całkowicie odessać supernatant.
  12. Ponowne zawieszenie do 108 komórek w 500 μl buforu MACS
  13. Przefiltruj komórki za pomocą sitka komórkowego 70 μm i wykonaj FACS dla populacji linii-Sca1+.
    UWAGA: Około 1,8-2,6% populacji powinno należeć do linii Sca1+.
  14. Zbierz komórki w pożywce hodowlanej LSK (100 μl na 10 000 komórek): pożywka ekspansywna bez surowicy, 100 ng / ml trombopoetyny, czynnik mysich komórek macierzystych, ligand kinazy tyrozynowej 3 związanej z FMS i IL-7 ze 100 μg / ml penicyliny-streptomycyny.
  15. Osadzać komórki w ilości 300 × g przez 10 min. Całkowicie odessać supernatant.

4. Transdukcja i hodowla LSK do generowania komórek kontrolnych i nokautujących

  1. Ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej LSK.
  2. Wysiewaj 10 000 komórek na dołek na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkanek płaskodennych (TC) w pożywce LSK.
  3. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 95% w warunkach aseptycznych.
  4. Przygotować 50 μg/ml roztworu retronektyny w DPBS i dodać 300 μl do każdego dołka 24-dołkowej płytki polistyrenowej niepoddanej działaniu TC. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Następnego dnia wyrzucić roztwór retronektyny, przepłukać pokrytą płytkę 300 μl DPBS i powtórzyć czynność.
  6. Przenieść 50 000 komórek LSK w 500 μl pożywki (5 dołków z płytki 96-dołkowej w kroku 4.2) do każdej studzienki pokrytej retronektyną 24-dołkowej płytki polistyrenowej z kroku 4.4. Użyj dodatkowych 100 μl podłoża LSK na 5 dołków, aby przepłukać i zebrać wszelkie dodatkowe komórki pozostałe na płytce 96-dołkowej. Upewnij się, że 600 μl to objętość na studzienkę w płytce 24-dołkowej zgodnie z tym krokiem (5 × 100 μl studzienek z płytki 96-dołkowej + 100 μl użytych do umycia tych 5 dołków).
    UWAGA: Po przeniesieniu spójrz pod mikroskopem na pustą teraz płytkę 24-dołkową, aby potwierdzić, że wszystkie komórki zostały zebrane. Użyj pożywki LSK, aby zebrać komórki, które nie zostały przeniesione, aby zminimalizować utratę komórek z tej małej populacji.
  7. Dodać 300 μl supernatantu wirusa do każdego dołka i wstrząsać płytką o wartości ustawienia 500 przez 5 minut. Obracać płytkę w temperaturze 600 × g i temperaturze 37 °C przez 20 minut. Stosować co najmniej 5 × 106 cząstek wirusa na ml.
    UWAGA: W tym badaniu zastosowano wektor zmodyfikowany z pLentiPuro, w którym element oporności na puromycynę został zamieniony na VexGFP. Wirus był dodawany przy wielokrotności infekcji 50-100.
  8. Inkubować przez 1 godzinę. Dodać 500 μl wstępnie podgrzanego podłoża LSK.
  9. Inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 95% w warunkach aseptycznych.

5. Napromienianie zwierząt w celu przygotowania do wszczepienia komórek macierzystych dawcy

  1. Po 2 dniach inkubacji należy dwukrotnie napromienić zwierzęta biorcy 475 cGy w odstępie 4 godzin. Po drugiej rundzie napromieniania umieść zwierzęta w klatkach w autoklawie i traktuj je jako zwierzęta z niedoborem odporności przez 12 tygodni. Myszy otrzymały wzbogacenie, hydrożel i monitorowanie po stronie klatki, aby zapewnić wspomagającą opiekę i interwencję w razie potrzeby. Myszy mogą otrzymywać antybiotykowy pokarm lub wodę oprócz leczenia wspomagającego i metod interwencji.
    NUTA. Dawki napromieniania mogą się różnić w zależności od napromieniacza. Wykonać miareczkowanie dawki napromieniacza, aby określić najlepszą dawkę. Dawki od 700 do 1300 cGy dla myszy C57Bl/6 są skuteczne w różnych przykładach literatury17. Wybierz 3-4 dawki w tym zakresie i oceń 5 myszy na dawkę pod kątem przeżycia i wszczepienia. Jeśli wszczepienie się nie powiedzie lub dawka promieniowania jest zbyt wysoka, myszy nie przeżyją dłużej niż 3 tygodnie po wszczepieniu. Po 4 tygodniach od wszczepienia należy wykrwawić myszy, które przeżyły, aby ocenić wszczepienie za pomocą FACS. Wykonujemy pobieranie krwi zaoczodołowej (RO) w ilości ~50-100 μL na mysz w celu oceny wszczepienia. Myszy były pod narkozą (2-3% izofluranu) podczas pobierania i otrzymywały lubrykant do oczu i 1,0 ml podskórnej soli fizjologicznej jako leczenie wspomagające po pobraniu krwi RO.

6. Przygotowanie komórek i wstrzyknięcie do napromieniowanych zwierząt biorców

  1. Odpipetować komórki z każdej studzienki z kroku 4.9, utrzymując grupy oddzielnie teraz, gdy komórki zostały transdukowane różnymi gRNA, i zagnieżdżać je w ilości 300 × g przez 10 minut.
  2. Zawieś komórki w buforze MACS, przefiltruj za pomocą sitka 70 μm i posortuj populację VexGFP+.
    UWAGA: Około 10-15% komórek powinno być VexGFP+.
  3. Osadzaj komórki w masie 300 × g przez 10 minut. Zawieś je ponownie w zrównoważonym roztworze soli Hanka: 5 000 lub więcej komórek na mysz w 200 μl.
    UWAGA: HBSS jest klasy niefarmaceutycznej. Możesz również rozważyć użycie sterylnego soli fizjologicznej klasy farmaceutycznej do wstrzykiwań.
  4. Komórki należy wstrzyknąć dożylnie 3 godziny po ostatniej dawce napromieniowania.
    UWAGA: Dwanaście tygodni później myszy będą miały w pełni wszczepiony układ odpornościowy i będą mogły zostać włączone do modeli in vivo.

7. Model zapalenia jelita grubego wywołanego przeciwciałami agonistycznymi CD40 u myszy typu dzikiego

UWAGA: Codziennie waż i oceniaj zwierzęta. W razie potrzeby należy zapewnić opiekę wspomagającą: 1,0 ml podskórnego roztworu chlorku sodu przy 10% utracie masy ciała lub w przypadku odwodnienia. Kontrolą pozytywną dla tego modelu jest anty-p40 podawana dootrzewnowo w dawce 25 mg/kg dwa razy w tygodniu, począwszy od dnia -1.

UWAGA: W tym badaniu, grupy eksperymentalne obejmowały grupy kontrolne naiwne, kontrolne (negatywne) i kontrolne anty-p40 (pozytywne). Razem grupy te kontrolują normalne zachowanie modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przeciwciałami agonistycznymi CD40. Grupy wektorowe, SgNone i SgRNA: Kontrole wektorowe dla wspólnego wektora lentiwirusowego, SgNone jest zaszyfrowaną kontrolą przewodnika bez celu, a grupy SgRNA to grupy "leczenia" o zmniejszonej ekspresji docelowego gRNA.

  1. Dzień 0: Wstrzyknąć przeciwciało agonistyczne CD40 w dawce 10 mg/kg dootrzewnowo w DPBS wszystkim zwierzętom, z wyjątkiem wcześniejszej kontroli.
  2. Dzień 3 i 6: Wykonaj endoskopię wideo, aby ocenić postęp choroby zgodnie z wcześniejszym opisem16.
    1. Znieczulij myszy 2-3% izofluranem. Zapewnij wsparcie termiczne za pomocą mechanizmu znieczulenia wewnętrznego i/lub zewnętrznej poduszki grzewczej podczas rekonwalescencji.
    2. Gdy myszy są pod narkozą, podaj lewatywę DPBS (bez wapnia i magnezu), aby przygotować okrężnicę do endoskopii.
      UWAGA: Do wykonania lewatywy potrzeba około 1-2 ml.
    3. Po lewatywie i w znieczuleniu przesuń mysz do stożka nosowego aparatu do znieczulenia.
    4. Delikatnie włóż endoskop do okrężnicy, powoli przesuwaj się do bliższej okrężnicy, trzymając kamerę wyśrodkowaną, a okrężnicę napompowaną powietrzem (za pomocą dołączonej pompy powietrza lub zamocuj rurkę/strzykawkę do ręcznego napompowania), a następnie powoli wyjmij endoskop i zbierz film i obrazy w odległości 3 cm, 2 cm i 1 cm od odbytu.
      UWAGA: Aby zminimalizować podrażnienie jelita grubego, do końcówki endoskopu można dodać sterylny lubrykant.
    5. Oceń każdy obraz indywidualnie na podstawie wzoru naczyniowego i pogrubienia błony śluzowej, jak opisano w Tabeli 1. Połącz wyniki z 3 obrazów na mysz, aby przypisać sumę punktów każdemu zwierzęciu.
  3. Dzień 7: Eutanazja wszystkich myszy przez przedawkowanie izofluranu lub komory CO2 i pobranie jak największej ilości krwi przez nakłucie serca do surowicy. Zważ śledzionę, aby zmierzyć splenomegalię i zbierz do cytometrii przepływowej, a następnie zbierz okrężnicę do histopatologii.
    UWAGA: Utrwalone formaliną i zatopione w parafinie skrawki tkanki okrężnicy myszy zostały przygotowane i użyte do immunohistochemii (IHC), jak wcześniej opisano przez Wang et al19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z procedurą opisaną powyżej, wygenerowano myszy wykazujące ekspresję gRNA ukierunkowanego na CD40. Do 2 tygodnia wszczepiono limfocyty B, makrofagi CD11b + i komórki dendrytyczne CD11c + (DC) (Figura 2). Jednak limfocyty T, zgodnie z oczekiwaniami opartymi na poprzedniej literaturze18, potrzebowały więcej czasu, aby w pełni się wszczepić i wymagały 12 tygodni po wszczepieniu, aby osiągnąć ~90% (Ryc. 2). Narządy odporn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj wyniki wprowadzają nową platformę edycji genomu opartą na CRISPR/Cas9, zdolną do badania funkcji genów w tym modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przeciwciałami CD40. Sortowanie komórek wzbogaciło pulę genetycznie zmodyfikowanych komórek LSK, co spowodowało ponad 90% zmniejszenie ekspresji CD40 u odtworzonych zwierząt - w ciągu zaledwie 4 miesięcy. Co więcej, zmniejszona ekspresja CD40 w układzie odpornościowym miała głęboki wpływ na model zapalenia jelita grubego wywołanego przeciwciałami CD40,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt, przeprowadzenie badania i wsparcie finansowe dla tego badania zostało zapewnione przez firmę AbbVie. Firma AbbVie brała udział w interpretacji danych, przeglądzie i zatwierdzeniu publikacji. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękuję Ruoqi Peng, Donnie McCarthy, Jamiemu Eriksonowi, Liz O'Connor, Robertowi Dunstanowi, Susan Westmoreland i Tariqowi Ghayurowi za wasze wysiłki wspierające tę pracę. Dziękuję liderom farmakologii, w tym Rajeshowi Kamathowi i innym, za ich przywództwo w ustanowieniu modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przeciwciałami agonistycznymi CD40 u myszy WT C57Bl / 6. Ponadto dziękuję wszystkim pracownikom AbbVie Bioresearch Center i Cambridge Research Center w Wschodnim Zakładzie Medycyny Porównawczej, którzy wspierają eksperymenty in vivo.

Chcielibyśmy podziękować laboratorium Zhang z Broad Institute i McGovern Institute of Brain Research w Massachusetts Institute of Technology za dostarczenie odczynników CRISPR [multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Cong, L, Ran, FA, Cox, D, Lin S, Barretto, R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F Science. 2013 3 stycznia].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCorning/Costar#3506
TransIT-LT1Mirus BioMIR 2300/5/6
Bufor MACS (bufor do biegania autoMACS)Miltenyi Biotec130-091-221
0,45 i mikro; m jednostka filtrującaMillipore#SLHV013SL
0,6 ml mikrowirówka ProbówkaAxygenMCT-060-C-S
1,5 ml Probówka EppendorfAxygenMCT-150-C-S
15mL StożkowaVWR21008-918
23 G IgłaVWR#305145
24-dołkowe płytki Non-TCFalcon#351147
24-dołkowe płytki TCFalcon#353047
50 ml Probówka stożkowaVWR21008-951
Strzykawka 5 mlBD Biosciences#309647
70 µ m FiltrMiltenyi#130-098-462
96-dołkowe płaskie płytkidenne Corning#3599
96-dołkowe płyty dolne w kształcie litery UCorning/Costar#3365
Maszyna anestezjologicznaVetEquip - COMPAC5#901812
Przeciwciało monoklonalne anty-CD40Agonista BioXcellBE-0016
Przeciwciało monoklonalne anty-p40BioXcellBE-0051
B220 PE PrzeciwciałoBioLegend#103208
Albumina surowicy bydlęcejSigmaAldrich A7906-100G
Cas9 Knock-in MyszyJackson Labs#026179C57Bl/6 tło
CD117+ KoralikiMiltenyi#130-091-224
CD11b PE PrzeciwciałoBioLegend#101208
CD3 PE PrzeciwciałoBD Biosciences#553240
WirówkaBeckman CoulterAllegra 6KR Wirówka
nablatowaWirówka Eppendorf5424
DPBSThermoFisher#14190136
Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle MediumMediatech#10-013-CV
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Endoskop InvitrogenAM9260G
StorzN/AColoview Tower
BD BiosciencesFACS Aria II
Ligand 3 kinazy tyrozynowej związanej z Fms (Flt-L)PeproTech#250-31L
Przeciwciało Gr-1 PEBD Biosciences#553128
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)ThermoFisher#14170120
Inaktywowany termicznie płodowy surowicę bydlęcąHyklon#SH30071.03
IL-7PeproTech#217-17
Spoiwoinkubatora#9040-0116
IzofluranHenrySchein#6679401710
KolumnaLS Miltenyi#130-042-041
Ly5.1 Pepboy MiceJackson Labs#002014C57Bl/6 czynnik
tła mysich komórek macierzystych (mSCF)PeproTech#250-03
Chlorek sodu (NaCl)Hospira#00409488850
Pożywka bez surowicy OPTI-MEMInvitrogen#31985-070
Penicylina-streptomycyna (PenStrep)ThermoFisher#15140-122
Wytrząsarka do płytekThermoFisher#88880023
pLentiPuroAddgene#52963
Polybrene (10 µ g/&mikro; L)Sigma Aldrich#TR-1003-G
Bufor do lizy czerwonych krwinekeBioscience#00-4333
RetronectinTakarbio#T100B
Sca-1 APC PrzeciwciałoBioLegend#108112
StemSpanStemCell Technologies#09600
Ter119 PE PrzeciwciałoeBioscience#12-5921
Trombopoetyna (TPO)PeproTech#315-14
Promiennik rentgenowski Precyzyjny promiennikrentgenowskiX-Rad 320
Karl Niestandardowy cytometr przepływowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., Wang, F. S., Gershwin, M. E. Human autoimmune diseases: a comprehensive update. Journal of Internal Medicine. 278 (4), 369-395 (2015).
  2. Uhlig, H. H., Powrie, F. Translating immunology into therapeutic concepts for inflammatory bowel disease. Annual Review of Immunology. 36, 755-781 (2018).
  3. Gajendran, M., Loganathan, P., Catinella, A. P., Hashash, J. G. A comprehensive review and update on Crohn's disease. Disease-a-Month. 64 (2), 20-57 (2018).
  4. Uhlig, H. H., Muise, A. M. Clinical genomics in inflammatory bowel disease. Trends in Genetics. 33 (9), 629-641 (2017).
  5. Sollid, L. M., Johansen, F. E. Animal models of inflammatory bowel disease at the dawn of the new genetics era. PLoS Medicine. 5 (9), 198(2008).
  6. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29(2015).
  7. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cell Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  8. Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
  9. Uhlig, H. H., et al. Differential activity of IL-12 and IL-23 in mucosal and systemic innate immune pathology. Immunity. 25 (2), 309-318 (2006).
  10. Dow, L. E. Modeling disease in vivo With CRISPR/Cas9. Trends in Molecular Medicine. 21 (10), 609-621 (2015).
  11. Hochheiser, K., Kueh, A. J., Gebhardt, T., Herold, M. J. CRISPR/Cas9: A tool for immunological research. European Journal of Immunology. 48 (4), 576-583 (2018).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Fellmann, C., Gowen, B. G., Lin, P. C., Doudna, J. A., Corn, J. E. Cornerstones of CRISPR-Cas in drug discovery and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 89-100 (2017).
  14. Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).
  15. Bagley, J., Tian, C., Iacomini, J. Prevention of type 1 diabetes in NOD mice by genetic engineering of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 2008 (433), 277-285 (2008).
  16. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1 (6), 2900-2904 (2006).
  17. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
  18. Haynes, B. F., Martin, M. E., Kay, H. H., Kurtzberg, J. Early events in human T cell ontogeny. Phenotypic characterization and immunohistologic localization of T cell precursors in early human fetal tissues. Journal of Experimental Medicine. 168 (3), 1061-1080 (1988).
  19. Wang, R., et al. CRISPR/Cas9-targeting of CD40 in hematopoietic stem cells limits immune activation mediated by anti-CD40. PLoS One. 15 (3), 0228221(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Edycja gen wprzedzia krwiotw rczynieswoiste zapalne choroby jelitcele terapeutycznepowi zanie genetycznemiertelno embrionalnauk ad odporno ciowy
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły