Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek

Summary

Technika swobodnego pływania pozwala badaczom na wykonywanie barwień histologicznych, w tym immunohistochemii na stałych odcinkach tkanki, w celu wizualizacji struktur biologicznych, typu komórki oraz ekspresji i lokalizacji białek. Jest to wydajna i niezawodna technika histochemiczna, która może być przydatna do badania wielu tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba.

Abstract

Immunohistochemia jest szeroko stosowaną techniką do wizualizacji określonych struktur tkankowych, jak również ekspresji i lokalizacji białek. Dwa alternatywne podejścia są szeroko stosowane do obchodzenia się z skrawkami tkanek podczas procedury barwienia, jedno podejście polega na montażu skrawków bezpośrednio na szkiełkach szkiełkowych, podczas gdy drugie podejście, swobodne, pozwala na utrzymanie stałych odcinków i barwienie ich podczas zawieszenia w roztworze. Chociaż metody montowane na szkiełku i swobodnie pływające mogą dawać podobne wyniki, technika swobodnego pływania pozwala na lepszą penetrację przeciwciał i dlatego powinna być metodą z wyboru, gdy grubsze odcinki mają być używane do rekonstrukcji 3D tkanek, na przykład, gdy celem eksperymentu jest uzyskanie informacji na temat projekcji dendrytycznych i aksonalnych w obszarach mózgu. Ponadto, ponieważ skrawki są przechowywane w roztworze, pojedyncza podwielokrotność może z łatwością pomieścić od 30 do 40 sekcji, których obsługa jest mniej pracochłonna, szczególnie w badaniach biomedycznych na dużą skalę. Tutaj pokazujemy, jak zastosować metodę swobodnego pływania do fluorescencyjnego barwienia immunohistochemicznego, ze szczególnym naciskiem na wycinki mózgu. Omówimy również, w jaki sposób technika swobodnego pływania może być łatwo zmodyfikowana w celu dopasowania do indywidualnych potrzeb badaczy i dostosowana do innych tkanek, a także innych barwień histochemicznych, takich jak hematoksylina i eozyna oraz fiolet krezylowy, o ile próbki tkanek są odpowiednio utrwalone, zwykle za pomocą paraformaldehydu lub formaliny.

Introduction

Barwienie immunologiczne to popularna praktyka badawcza, która rozpoczęła się 130 lat temu od odkrycia przeciwciał w surowicy w 1890 roku przez Von Behringa¹. Na początku XX wieku barwniki były przyłączane do antygenów, a później do przeciwciał jako sposób na ilościowe określenie i wizualizację reakcji¹, a w 1941 roku Albert Coons opracował pierwsze fluorescencyjne etykiety przeciwciał, odkrycie, które zrewolucjonizowało mikroskopię świetlną^2,3. Termin "barwienie immunologiczne" obejmuje wiele technik, które zostały opracowane przy użyciu tej zasady, w tym Western blot, cytometrię przepływową, ELISA, immunocytochemię i immunohistochemię^3,4. Western blot wykrywa obecność określonych białek z ekstraktów tkankowych lub komórkowych⁵. Białka są rozdzielane według wielkości za pomocą elektroforezy żelowej, przenoszone do błony i sondowane za pomocą przeciwciał. Ta technika wskazuje na obecność białka i ilość białka; Nie ujawnia jednak żadnych informacji na temat lokalizacji białka w komórkach lub tkankach. Inna metoda, immunocytochemia (ICC), znakuje białka w komórkach, zazwyczaj komórkach hodowanych in vitro. ICC pokazuje zarówno ekspresję, jak i lokalizację białek w przedziałach komórkowych⁶. Aby wykryć i uwidocznić określone białko na poziomie tkanki, wykorzystuje się immunohistochemię (IHC).

IHC to metoda, której naukowcy używają do celowania w określone antygeny w tkance, wykorzystując właściwości chemiczne układu odpornościowego^7,8. Poprzez generowanie specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych połączonych z enzymem lub barwnikiem fluorescencyjnym, antygeny będące przedmiotem zainteresowania mogą być znakowane i ujawniane w większości tkanek (zgodnie z przeglądem w Mepham i Britten)⁹. Termin "immunohistochemia" sam w sobie nie określa metody znakowania, która jest stosowana w celu ujawnienia antygenu będącego przedmiotem zainteresowania; w związku z tym terminologia ta jest często łączona z techniką wykrywania, aby wyraźnie określić metodę znakowania: immunohistochemia chromogenna (CIH) w celu wskazania, kiedy przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z enzymem, takim jak peroksydaza; lub fluorescencyjny IHC w celu wskazania, kiedy przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z fluoroforem, takim jak izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) lub tetrametylorodamina (TRITC). Selektywność IHC pozwala klinicystom i badaczom na wizualizację ekspresji i dystrybucji białek w tkankach, w różnych stanach zdrowia i choroby¹⁰. W sferze klinicznej IHC jest powszechnie stosowany do diagnozowania raka, a także do określania różnic w różnych typach raka. IHC był również używany do potwierdzania różnych rodzajów infekcji mikrobiologicznych w organizmie, takich jak wirusowe zapalenie wątroby typu B lub C¹¹. W badaniach biomedycznych IHC jest często używany do mapowania ekspresji białek w tkankach i jest ważny w identyfikacji nieprawidłowych białek obserwowanych w stanach chorobowych. Na przykład neurodegeneracji często towarzyszy akumulacja nieprawidłowych białek w mózgu, takich jak blaszki αβ i splątki neurofibrylarne w chorobie Alzheimera. Modele zwierzęce są często opracowywane w celu naśladowania tych patologicznych stanów, a IHC jest jedną z metod używanych przez naukowców do lokalizowania i ilościowego określania interesujących białek^10,12,13. Z kolei możemy dowiedzieć się więcej o przyczynach tych chorób i powikłaniach, które się z nimi wiążą.

Wykonywanie IHC składa się z wielu etapów. Najpierw pobiera się interesującą tkankę i przygotowuje ją do barwienia. Prawdopodobnie większość badaczy przygotowuje utrwalone próbki tkanek, przy czym perfuzja utrwalacza przez układ krążenia jest optymalna, ponieważ zachowuje morfologię^14,15. Można również zastosować post-fixing próbek tkanek, ale może to dać wyniki dalekie od idealnych¹⁶. Utrwalacze sieciujące, takie jak formaldehyd, działają poprzez tworzenie wiązań chemicznych między białkami w tissue¹⁷. Utrwalona tkanka jest następnie cięta na bardzo cienkie warstwy lub skrawki za pomocą mikrotomu, przy czym wielu badaczy woli zbierać zamrożone skrawki za pomocą kriostatu. Stamtąd tkanka jest pobierana i albo montowana bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym (metoda montowana na szkiełku), albo zawieszana w roztworze (metoda swobodnie pływająca), takim jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)¹⁸. Zastosowana metoda zbierania danych jest z góry określona w oparciu o potrzeby badacza, przy czym każda z tych dwóch metod ma swoje zalety i wady.

Metoda montowana na szkiełku jest zdecydowanie najczęściej stosowana, z ważną korzyścią jest to, że można przygotować bardzo cienkie odcinki (10-14 μm), co jest ważne, na przykład, do badania interakcji białko-białko. Obchodzenie się z próbką jest również ograniczone do minimum, co zmniejsza potencjalne uszkodzenia integralności strukturalnej tkanki¹⁹. Naukowcy często stosują tę technikę w przypadku świeżo zamrożonej tkanki (tkanki, która jest natychmiast zamrażana przy użyciu suchego lodu, izopentanu itp.), która jest bardzo delikatna w porównaniu z tkanką utrwaloną i należy zachować dużą ostrożność, aby zapobiec rozmrożeniu próbki. Kolejną zaletą stosowania sekcji montowanych na prowadnicach jest to, że zwykle nie są wymagane duże ilości roztworów do barwienia⁴. W ten sposób naukowcy mogą użyć mniejszej ilości drogich przeciwciał lub innych chemikaliów, aby uzupełnić barwienie. Dodatkowo możliwe jest zamontowanie na tym samym szkiełku przekrojów z kilku różnych grup eksperymentalnych, co może być korzystne, zwłaszcza podczas akwizycji obrazu. Z drugiej strony istnieją pewne wady stosowania odcinków montowanych na suwaku, w szczególności to, że wycinek tkanki jest przyklejony do szkiełka, ograniczając w ten sposób penetrację przeciwciał do jednej strony przekroju, co ogranicza grubość przekroju i reprezentację 3D tkanki. Może się również zdarzyć, że podczas płukania krawędzie tkanki i całe odcinki mogą oderwać się od szkiełka, co sprawi, że cały eksperyment stanie się bezużyteczny. Co więcej, IHC zwykle musi być wykonywane stosunkowo szybko przy użyciu podejścia montowanego na szkiełku, aby uniknąć degradacji epitopu antygenu ^20,21 z nieprzetworzonymi szkiełkami zwykle przechowywanymi w temperaturze -20 lub -80 °C, często przykrytymi i przechowywanymi poziomo lub w pudełkach na slajdy, co skutkuje stosunkowo dużą powierzchnią magazynowania. Wreszcie, technika montażu na szkiełku może być również czasochłonna, jeśli badacze muszą obsługiwać dużą liczbę szkiełek w celu przetworzenia dużej liczby skrawków tkanki.

Ze względu na niektóre z tych wyzwań związanych z wykorzystaniem metody montowanej na suwaku, modyfikacja zwana metodą swobodną stała się popularną alternatywą. Technika ta pojawiła się w literaturze w latach 1960-70^22,23,24, zyskując popularność w latach 80^{25,26,27,28,29}i jest obecnie dobrze znaną metodą, która polega na wykonywaniu barwienia na zebranych odcinkach w zawieszeniu, a nie przyklejonym do suwaka^12,30,31. Metoda swobodnego pływania nie jest zalecana, gdy skrawki tkanki są mniejsze niż 20 μm; Jednak z naszego doświadczenia wynika, że jest to podejście z wyboru, gdy mają być barwione grubsze (40-50 μm) odcinki. Jedną z wyraźnych korzyści jest to, że przeciwciała mogą przenikać do swobodnie unoszących się sekcji pod każdym kątem i generować mniej barwienia tła dzięki skuteczniejszemu myciu, co skutkuje lepszą sygnalizacją podczas obrazowania. Dodatkowo sekcje są montowane na szkiełkach po obróbce, eliminując w ten sposób możliwość oderwania się tkanki, a także skracając czas zajmowany przez kriostat. Metoda swobodnego pływania może być również znacznie mniej pracochłonna, zwłaszcza w przypadku badań biomedycznych na dużą skalę. Na przykład, możliwe jest barwienie wielu (18-40) odcinków tej samej próbki razem w tym samym dołku, co oszczędza czas podczas wykonywania zarówno etapów mycia, jak i inkubacji przeciwciał. Co więcej, ponieważ przy użyciu tego podejścia można zamontować większą liczbę (12-16) sekcji na jednym slajdzie, często wygodniej i szybciej jest badaczowi przeglądać i obrazować sekcje. Warto zauważyć, że podczas montażu plastrów tkanki na szkiełkach, sekcje mogą być mocowane i odłączane, aż do uzyskania pożądanej orientacji. Naukowcy często stosują również nieco niższe stężenia przeciwciał przy użyciu metody swobodnego pływania, a ponieważ inkubacje są wykonywane w probówkach do mikrowirówek, przeciwciała można łatwo zebrać i zakonserwować azydkiem sodu w celu ponownego użycia (patrz krok 5.1). Kolejną zaletą jest to, że skrawki mogą być bezpośrednio przechowywane w temperaturze -80 °C w małych probówkach do mikrowirówek z roztworem krioprotektantu³², minimalizując w ten sposób przestrzeń do przechowywania i maksymalizując żywotność próbek³³. Wadą stosowania tej techniki jest to, że sekcje są często obsługiwane, a tym samym są podatne na uszkodzenia. Można to jednak złagodzić, stosując niskie prędkości wytrząsania i obracania, a także odpowiednio szkoląc badaczy w zakresie przenoszenia próbek i montowania sekcji na szkiełkach.

Podsumowując, IHC jest uznanym i niezbędnym narzędziem do wizualizacji i lokalizacji ekspresji białek zarówno w badaniach klinicznych, jak i biomedycznych. Swobodnie pływający IHC jest wydajną, elastyczną, a także ekonomiczną metodą, zwłaszcza przy wykonywaniu badań histologicznych na dużą skalę. W tym miejscu przedstawiamy niezawodny protokół fluorescencyjnego IHC dla społeczności naukowej, który można odpowiednio dostosować do chromogennego IHC i innych barwień, takich jak barwienie hematoksyliną i eozyną lub fioletem krezylowym.

Protocol

1. Przygotowanie tkanek do kriosekcji

1. Osadzone tkanki należy zatopić w odpowiedniej formie do zatapiania (patrz Tabela materiałów), aby utworzyć blok próbki przy użyciu odpowiedniej matrycy próbki (patrz Tabela materiałów) i zamrozić na suchym lodzie. Przechowywać bloki próbek w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do cięcia.
   UWAGA: Utrwalone tkanki są zazwyczaj przygotowywane przez perfuzję dorosłych (ok. 2,5 – 30 miesięcy) samców lub samic gryzoni (myszy lub szczurów) ³⁴, zgodnie z dostępnym zezwoleniem etycznym, z odpowiednim utrwalaczem (np. 10% formaliny), a następnie po utrwaleniu tkanek w tym samym utrwalaczu przez 12 godzin w temperaturze 4 °C, trzykrotnie myjąc tkanki 1x PBS, i umieszczanie tkanek w 15%, a następnie 30% sacharozie w 1x PBS na noc lub do momentu, gdy tkanki opadną³⁵. Badacze mogą próbować dostosować ten ogólny protokół do różnych etapów rozwoju.

2. Kriosekcja

1. Gdy są gotowe do cięcia, aklimatyzuj próbki w kriostacie przez co najmniej 1-2 godziny przed sekcją, aby zapobiec rozbiciu tkanki.
2. Za pomocą kriostatu pociąć tkankę na odcinki (20-50 μm) i zebrać w 6 lub 12-dołkowych wkładkach (patrz Tabela materiałów) wypełnionych 1x roztworem PBS.
   UWAGA: W zależności od grubości sekcji, ilości tkanki, która ma zostać pobrana, oraz liczby użytych wkładek studzienkowych, każda studzienka będzie zawierać zmienną liczbę sekcji obejmujących od około 10 do 40 plastrów dla studzienki. Na przykład, jeśli cały mózg zostanie podzielony na sekcje przy 40 μm, około 18-24 sekcje zostaną zebrane w każdym dołku za pomocą 12-dołkowych wkładek. Ponadto sekcje 20 μm mogą być nieco trudne w obsłudze, dlatego 40 μm jest zalecane do barwienia luzem (patrz Dyskusja).

3. Przechowywanie sekcji

1. Po zebraniu umyj skrawki świeżo przygotowanym 1x PBS przez 5 min. Powtórz 3 razy.
2. Przenieść skrawki do probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml wypełnionych 1-1,5 ml roztworu do przechowywania (na 250 ml zmieszać 70 g sacharozy, 75 ml glikolu etylenowego i uzupełnić do objętości 0,1 M buforem fosforanowym).
3. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do barwienia.

4. Dzień Barwienia I

1. Wyjąć próbki z zamrażarki i równoważyć w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 - 20 minut.
2. Wlej skrawki do studzienki, włóż do płytki 6-dołkowej, aby oddzielić roztwór do przechowywania od sekcji.
3. Przenieś wkład studzienki do innej studzienki zawierającej około 6 ml 1x TBS. Przemyć 3 razy 1x TBS przez 5 minut każdy na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości przy RT.
4. Podczas mycia skrawków przygotuj 7 ml (na próbkę) roztworu blokująco-przepuszczalnego, składającego się z 1x TBS z 0,3% Triton X-100 i 3% normalnej surowicy (np. normalnej surowicy końskiej). Blokuj sekcje przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej, używając niskiej prędkości.
   UWAGA: Blokowanie surowicami zapobiega nieswoistemu wiązaniu przeciwciał z tkankami lub nieswoistymi receptorami Fc – zalecana jest surowica pasująca do gatunku przeciwciała drugorzędowego, ale jeśli nie jest dostępna, można użyć dowolnej normalnej surowicy od gatunku innego niż pierwotne przeciwciało u zwierzęcia gospodarza. Detergent Triton X-100 pozwala na lepszą penetrację przeciwciał poprzez przepuszczalność tkanki.
5. Przygotować 1 ml na próbkę roztworu przeciwciała pierwszorzędowego składającego się z wybranego przeciwciała pierwszorzędowego (odpowiednio rozcieńczonego) w 1x TBS z 0,3% Triton X-100 i 1% normalnej surowicy (patrz Krok 4.4 Uwaga). Przenieść skrawki z dołka do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej pierwszorzędowy roztwór przeciwciała w celu związania się z interesującym antygenem (antygenami).
   UWAGA: Można zastosować wiele przeciwciał pierwszorzędowych (generowanych u różnych gatunków gospodarzy).
6. Umieścić probówkę do mikrowirówki o pojemności 2 ml z sekcjami na obracającym się mieszalniku przy niskiej prędkości (np. prędkość 7 obr./min) i inkubować przez noc przez 12-16 godzin w temperaturze 4 °C.

5. Dzień Barwienia II

1. Następnego dnia wlej skrawki do studzienki, włóż do płytki 6-dołkowej, aby oddzielić skrawki od pierwotnego roztworu przeciwciała.
   UWAGA: Roztwór przeciwciał można pobrać i ponownie użyć; Dodać 0,02% (w/v) azydku sodu, aby zahamować rozwój drobnoustrojów.
2. Umyj sekcje 3 razy z 1x TBS przy RT (30 s na pierwsze 2 prania i 10 min na pranie końcowe).
3. Przygotować 1 ml na próbkę roztworu przeciwciała drugorzędowego składającego się z odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego (odpowiednio rozcieńczonego) w 1x TBS z 0,3% Triton X-100 i 1% normalną surowicą (roztwór osłonowy przed światłem).
   UWAGA: Pośrednie znakowanie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym wzmacnia sygnał i pozwala na kolorymetryczną lub fluorescencyjną wizualizację celu białka.
4. Przenieść skrawki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej drugorzędowy roztwór przeciwciał. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przy użyciu niskiej prędkości (roztwór osłonowy przed światłem).
5. Wlej skrawki do studzienki, włóż do płytki 6-dołkowej, aby oddzielić skrawki od wtórnego roztworu przeciwciał.
6. Kontynuując osłanianie próbek przed światłem, przemyj je 2 razy 1x TBS przez 30 s w temperaturze pokojowej. Następnie prać przez 15 minut w 1x TBS, w razie potrzeby dodać DAPI (1-0,1 μg/ml).

6. Montaż

1. Wlej skrawki do szklanej, prostokątnej komory histologicznej wypełnionej w trzech czwartych 1x TBS.
2. Zanurz szklaną prowadnicę w 1x TBS i użyj cienkiego pędzla, aby nakłonić sekcje do zamka.
3. Delikatnie postukaj sekcjami o slajd, upewniając się, że nie ma zmarszczek ani fałd.
4. Powtarzaj, aż wszystkie sekcje zostaną zamontowane na prowadnicy.
   UWAGA: Gdy na przykład cały mózg jest podzielony na sekcje pod kątem 40 μm, zebrany w 12-dołkowych wkładkach z jedną podwielokrotnością zawierającą 18-24 sekcje; Plasterki są zwykle montowane na 1-2 szkiełkach, ale można również zamontować mniej sekcji na szkiełku, w zależności od preferencji badacza.

7. Szkiełko nakrywkowe

1. Po wysuszeniu skrawków na szkiełku, około 10-15 minut w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy skrawki będą wyglądać na nieprzezroczyste (pamiętaj o osłonie szkiełek przed światłem), nałóż odpowiedni wodny środek montażowy (utwardzający lub nietwardniejący). Przeciwdziałanie blaknięciu jest preferowane w przypadku stosowania fluorescencyjnego sprzężonego przeciwciała drugorzędowego.
   UWAGA: Jakość fluorescencji może być gorsza w przypadku stosowania utwardzającego medium montażowego, ale szkiełka powinny wytrzymać dłużej.
2. Za pomocą pęsety umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu. Przykryj bibułą filtracyjną i mocno dociśnij, aby usunąć nadmiar medium montażowego.
   UWAGA: Jeśli używasz nietwardniejącego mocowania, pomaluj krawędzie prowadnicy nakrywkowej przezroczystym lakierem do paznokci, aby uszczelnić.
3. Wycinki obrazu przy użyciu odpowiedniego mikroskopu. Przechowywać w ciemnym pudełku na szkiełka w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Przekroje można obrazować za pomocą różnych mikroskopów, takich jak skaning laserowy konfokalny i odwrócona lub pionowa fluorescencja szerokokątna, przy powiększeniach (np. 10x, 20x, 40x) w zależności od potrzeb badacza.

Results

Ogólny schemat użycia metody swobodnego wykonywania fluorescencyjnego testu immunohistochemicznego jest zilustrowany w Rysunek 1. Reprezentatywny przykład fluorescencyjnego IHC przy użyciu metody swobodnej pływania w mózgu myszy badającego ekspresję kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) pokazano na Rysunek 2 zarówno w mniejszym, jak i wyższym powiększeniu, aby zilustrować ogólną jakość barwienia. Podejście to jest również odpowiednie do ujawniania białek o n...

Discussion

Immunohistochemia (IHC) to wszechstronna technika, która stała się kluczowa w identyfikacji ekspresji i lokalizacji białek w skrawkach tkanek. Test ten jest stosowany w całej społeczności naukowej w celu lepszego zrozumienia charakterystyki tkanki na różnych etapach normalnego funkcjonowania do stanów chorobowych. IHC jest stosowany w różnych dziedzinach, od klinicznej diagnostyki chorób, takich jak rak, po wstępne odkrycia w badaniach przedklinicznych^10,36.

...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Płytki 12-dołkowe	Corning	3513
Płytki 6-dołkowe	Corning	3516
Bezbarwny lakier do paznokci	Preferencje użytkownika	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Formy do zatapiania	Thermo Scientific	1841
Glikol etylenowy	Preferencje użytkownika	N/A
Roztwór formaliny	Fisher Scientific	SF98-4
Surowica końska, inaktywowana termicznie	Gibco	26050088
Pudełka na szkiełka mikroskopowe	Usługi mikroskopu	71370
PBS	Preferencje użytkownika	Nie dotyczy Przeciwciało
pierwotne	Preferencje użytkownika	Nie dotyczy
Szkiełka nakrywkowe prostokątne	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Prostokątne naczynie do barwienia	Usługi mikroskopii elektronowej	70312
Okrągły pędzel artystyczny #2	Princeton Select Series	3750R	Marka nieważna
Przeciwciało wtórne	Preferencja użytkownika	Nie dotyczy Matryca
próbki do zatapiania	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Tacka na plamy – system barwienia szkiełek	Usługi mikroskopii elektronowej	71396-B	Użyj ciemnej pokrywy
Sacharoza	Preferencje użytkownika	Nie dotyczy
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS Preferencje	użytkownika	Nie dotyczy
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade medium montażowe	Wektor Laboratories	H-1000	Nietwardniejące
wkłady studzienne do płytek 12-dołkowych	Corning Netwells	3477
Wkłady studzienne do płytek 6-dołkowych	Corning Netwells	3479
Bibuła filtracyjna Whatman	Millapore-Sigma	WHA1440042