Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Sovannarath Pong; Paulo Lizano; Rakesh Karmacharya

doi:10.3791/61629

Artykuł metodologiczny

Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61629

⸱

19 listopada 2020

Sovannarath Pong¹^,²^,³ , Paulo Lizano¹^,²^,³^,⁴ , Rakesh Karmacharya¹^,³^,⁴^,⁵

¹Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, ²Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, ³Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, ⁴Department of Psychiatry, Harvard Medical School, ⁵Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje dostosowaną metodę pozyskiwania, rozszerzania i kriokonserwacji mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu uzyskanych przez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, oraz badania właściwości bariery krew-mózg w modelu ex vivo.

Streszczenie

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu (BMEC) mogą być odróżniane od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu opracowania modeli komórkowych ex vivo do badania funkcji bariery krew-mózg (BBB). Ten zmodyfikowany protokół zawiera szczegółowe kroki w celu uzyskania, namnażania i krioprezerwacji BMEC z ludzkich iPSC przy użyciu innego dawcy i odczynników niż te zgłoszone w poprzednich protokołach. iPSC są traktowane pożywką essential 6 przez 4 dni, a następnie przez 2 dni pożywką hodowlaną bez surowicy śródbłonka ludzkiego uzupełnioną podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów, kwasem retinowym i suplementem B27. W 6 dniu komórki są hodowane na matrycy kolagenu/fibronektyny przez 2 dni. Immunocytochemię przeprowadza się w 8 dniu w celu analizy markerów BMEC przy użyciu CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 i SLC2A1. Western blot jest wykonywany w celu potwierdzenia ekspresji markera BMEC i braku SOX17, markera endodermalnego. Potencjał angiogenny wykazuje się za pomocą testu kiełkowania. Prześródbłonkowy opór elektryczny (TEER) mierzy się za pomocą elektrod pałeczek i woltoomomierza, począwszy od 7 dnia. Aktywność transportera wypływu dla podrodziny B kasety wiążącej ATP członka 1 i podrodziny C kasety wiążącej ATP 1 mierzy się za pomocą czytnika wielopłytkowego w 8 dniu. Pomyślne wyprowadzenie BMEC potwierdza obecność odpowiednich markerów komórkowych, niski poziom SOX17, potencjał angiogenny, aktywność transportera i wartości TEER ~2000 Ω x^cm2. BMEC są ekspandowane do 10 dnia przed przejściem na świeżo pokryte płytki kolagenu/fibronektyny lub kriokonserwowane. Protokół ten pokazuje, że BMEC pochodzące z iPSC mogą być rozszerzane i pasażowane co najmniej raz. Po krioprezerwacji zaobserwowano jednak niższe wartości TEER i gorszą lokalizację markerów BMEC. BMEC mogą być wykorzystywane w eksperymentach z innymi typami komórek (neurony, glej, perycyty), w trójwymiarowych modelach mózgu (narząd-chip i hydrożel), do unaczynienia organoidów mózgowych oraz do badania dysfunkcji BBB w zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Wprowadzenie

Funkcja bariery krew-mózg
Bariera krew-mózg (BBB) tworzy granicę, która ogranicza przepływ substancji z krwi do mózgu. Bariera krew-mózg składa się z komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC), które tworzą monowarstwę wyściełającą naczynia krwionośne. BMEC wraz z astrocytami, neuronami, perycytami, mikroglejem i macierzą zewnątrzkomórkową tworzą jednostkę nerwowo-naczyniową. BMEC mają ściśle regulowaną strukturę parakomórkową, która pozwala BBB utrzymywać wysoki przezśródbłonkowy opór elektryczny (TEER), który ogranicza bierną dyfuzję i służy jako wskaźnik integralności bariery¹^,²