Artykuł metodologiczny

Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/61629

⸱

19 listopada 2020

 ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje dostosowaną metodę pozyskiwania, rozszerzania i kriokonserwacji mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu uzyskanych przez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, oraz badania właściwości bariery krew-mózg w modelu ex vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mózgu (BMEC) mogą być odróżniane od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu opracowania modeli komórkowych ex vivo do badania funkcji bariery krew-mózg (BBB). Ten zmodyfikowany protokół zawiera szczegółowe kroki w celu uzyskania, namnażania i krioprezerwacji BMEC z ludzkich iPSC przy użyciu innego dawcy i odczynników niż te zgłoszone w poprzednich protokołach. iPSC są traktowane pożywką essential 6 przez 4 dni, a następnie przez 2 dni pożywką hodowlaną bez surowicy śródbłonka ludzkiego uzupełnioną podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów, kwasem retinowym i suplementem B27. W 6 dniu komórki są hodowane na matrycy kolagenu/fibronektyny przez 2 dni. Immunocytochemię przeprowadza się w 8 dniu w celu analizy markerów BMEC przy użyciu CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 i SLC2A1. Western blot jest wykonywany w celu potwierdzenia ekspresji markera BMEC i braku SOX17, markera endodermalnego. Potencjał angiogenny wykazuje się za pomocą testu kiełkowania. Prześródbłonkowy opór elektryczny (TEER) mierzy się za pomocą elektrod pałeczek i woltoomomierza, począwszy od 7 dnia. Aktywność transportera wypływu dla podrodziny B kasety wiążącej ATP członka 1 i podrodziny C kasety wiążącej ATP 1 mierzy się za pomocą czytnika wielopłytkowego w 8 dniu. Pomyślne wyprowadzenie BMEC potwierdza obecność odpowiednich markerów komórkowych, niski poziom SOX17, potencjał angiogenny, aktywność transportera i wartości TEER ~2000 Ω xcm2. BMEC są ekspandowane do 10 dnia przed przejściem na świeżo pokryte płytki kolagenu/fibronektyny lub kriokonserwowane. Protokół ten pokazuje, że BMEC pochodzące z iPSC mogą być rozszerzane i pasażowane co najmniej raz. Po krioprezerwacji zaobserwowano jednak niższe wartości TEER i gorszą lokalizację markerów BMEC. BMEC mogą być wykorzystywane w eksperymentach z innymi typami komórek (neurony, glej, perycyty), w trójwymiarowych modelach mózgu (narząd-chip i hydrożel), do unaczynienia organoidów mózgowych oraz do badania dysfunkcji BBB w zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcja bariery krew-mózg
Bariera krew-mózg (BBB) tworzy granicę, która ogranicza przepływ substancji z krwi do mózgu. Bariera krew-mózg składa się z komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC), które tworzą monowarstwę wyściełającą naczynia krwionośne. BMEC wraz z astrocytami, neuronami, perycytami, mikroglejem i macierzą zewnątrzkomórkową tworzą jednostkę nerwowo-naczyniową. BMEC mają ściśle regulowaną strukturę parakomórkową, która pozwala BBB utrzymywać wysoki przezśródbłonkowy opór elektryczny (TEER), który ogranicza bierną dyfuzję i służy jako wskaźnik integralności bariery1,2. BMEC zawierają również białka, które pomagają w ruchu międzykomórkowym, takim jak endocytoza, transcytoza i transmigracja, a także wynaczynienie leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej3. BMEC polegają na transporterach napływu i odpływu w celu odżywiania i usuwania produktów przemiany materii, w celu utrzymania równowagi homeostatycznej w mózgu3. Na przykład nośnik substancji rozpuszczonej z rodziny 2 członek 1 (SLC2A1) jest transporterem napływu odpowiedzialnym za ruch glukozy przez BBB4, podczas gdy transportery wypływu, takie jak podrodzina kasety wiążącej ATP B member 1 (ABCB1) i podrodzina kasety wiążącej ATP C Member 1 (ABCC1) są odpowiedzialne za powrót substratów z powrotem do krwiobiegu3, 5,6,7. Substraty ABCB1 obejmują morfinę, werapamil4 oraz leki przeciwpsychotyczne, takie jak olanzapina i risperidon8, podczas gdy transporter ABCC1 ma różne substraty, w tym koniugaty siarczanowe, winkrystynę i koniugaty glukuronidowe4.

Zastosowanie modeli BBB w zaburzeniach psychicznych
Dysfunkcja BBB jest związana z wieloma zaburzeniami neurologicznymi i psychiatrycznymi, w tym schizofrenią i chorobą afektywną dwubiegunową9,10. Ostatnio modele komórkowe ex vivo pochodzące z iPSC są wykorzystywane do badania komórkowych i molekularnych podstaw zaburzeń psychicznych, ale modele te obecnie nie uwzględniają potencjalnej roli odgrywanej przez neurovasculature11,12,13. Przypuszcza się, że cytokiny zapalne obwodowe krążące we krwi mogą niekorzystnie wpływać na BBB14,15,16,17, ale istnieją również dowody na paracellular18,19,20,21,22, transcellular23,24,25,26,27,28,29, and extracellular matrix20,29,30,31,32 nieprawidłowości przyczyniające się do dysfunkcji bariery krew-mózg. Zaburzenie bariery krew-mózg może spowodować, że zawartość krwi dostanie się do miąższu mózgu i aktywuje astrocyty i/lub mikroglej w celu uwolnienia cytokin prozapalnych, które z kolei inicjują reakcję zapalną33, która może mieć szkodliwy wpływ na mózg34. BMEC są głównym składnikiem bariery krew-mózg, a badanie struktury i funkcji tych komórek może poprawić zrozumienie dysfunkcji bariery krew-mózg w zaburzeniach neurologicznych i psychiatrycznych.

Alternatywne modele BMEC
Przed opracowaniem wydajnych protokołów do wyprowadzania BMEC z iPSCs1,6,35,36, naukowcy wykorzystali unieśmiertelnione BMECs37 do zbadania funkcji BBB. Jednak wielu z tych modeli nie udało się osiągnąć pożądanych fenotypów BBB, takich jak fizjologiczny zakres wartości TEER38,39. Wykorzystanie iPSC ma tę zaletę, że zachowuje tło genetyczne osoby, od której pochodzą komórki. Naukowcy aktywnie pracują nad stworzeniem modeli mikrośrodowiska ex vivo opartych na iPSC, które podsumowują strukturę i funkcje ludzkiego mózgu. Naukowcy opracowali metody uzyskiwania BMEC, które są strukturalnie i fizjologicznie podobne do BMEC znalezionych in vivo. Metody uzyskiwania oczyszczonych populacji BMEC pochodzących z iPSC wymagają wielu różnych kroków, a protokoły zostały zoptymalizowane w ciągu ostatnich kilku lat1,6,35,36. Ogólnie rzecz biorąc, BMEC pochodzące z iPSC są hodowane w pożywce Essential 6 (E6) przez 4 dni, a następnie przez 2 dni w pożywce wolnej od surowicy śródbłonka (hESFM) uzupełnionej podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF), kwasem retinowym (RA) i suplementem B27. Komórki są następnie hodowane na matrycy kolagenu IV (COL4) i fibronektyny (FN) w celu uzyskania >90% jednorodnych BMECs1.

Tożsamość BMEC jest potwierdzona przez immunofluorescencję wykazującą koekspresję białek BMEC, w tym cząsteczki adhezyjnej komórek płytkowo-śródbłonkowych-1 (PECAM1), SLC2A1 i białek o ścisłym połączeniu, takich jak białko ścisłego połączenia 1 (TJP1), okludyna (OCLN) i klaudyna-5 (CLDN5)6. Testy kiełkowania zostały wykorzystane do potwierdzenia potencjału angiogennego BMEC pochodzących z iPSC. 6 Integralność BBB BMEC jest oceniana na podstawie obecności fizjologicznych wartości TEER in vitro (~2000Ω x cm2)37 oraz mierzalnej aktywności dla transporterów wypływu, takich jak ABCB1 i ABCC11,6,36. Ostatnie postępy metodologiczne grupy Lippmanna doprowadziły do powstania protokołów BMEC opartych na iPSC o zmniejszonej zmienności eksperymentalnej i zwiększonej odtwarzalności1. Nie wiadomo jednak, czy można je rozszerzać i przechodzić poza etap podhodowli. Nasz zmodyfikowany protokół ma na celu rozwiązanie tego problemu poprzez przejście BMEC pochodzących z iPSC po 8 dniu i ocenę, czy można je dalej rozszerzać, aby zachować właściwości BBB po krioprezerwacji. Chociaż żadne badania nie opisywały pasażowania BMEC pochodzących z iPSC, istnieje protokół kriokonserwacji BMEC, który zachowuje fizjologiczne właściwości BBB po przejściu cyklu zamrażania i rozmrażania40. Nie wiadomo jednak, czy BMEC po krioprezerwacji mogą być pasażowane i zachowywać właściwości BBB.

BMEC pochodzące z iPSC za pomocą protokołu Lippmanna zostały wykorzystane do modelowania zaburzeń BBB w zaburzeniach neurologicznych, takich jak choroba Huntingtona7. Takie BMEC pochodzące z iPSC zostały również wykorzystane do zbadania wpływu infekcji bakteryjnej, takiej jak Neisseria meningitidis lub Streptococcus grupy B, na zakłócenie bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy i odpowiednio BBB41,42. Ponadto, wykorzystując BMEC pochodzące z iPSC od pacjentów ze schizofrenią z zespołem delecji 22q, naukowcy zaobserwowali wzrost międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej-1 (ICAM-1), głównej cząsteczki adhezyjnej w BMEC, która pomaga w rekrutacji i wynaczynieniu leukocytów do mózgu43. Podsumowując, badania te wykazują przydatność BMEC pochodzących z iPSC do badania zaburzeń bariery krew-mózg w złożonych zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie iPSC zostały przeprogramowane z fibroblastów zdrowych dawców przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital i McLean Hospital, i scharakteryzowane zgodnie z opisem w poprzednich badaniach44,45,46.

UWAGA: Krótko mówiąc, fibroblasty zostały przeprogramowane do iPSC za pomocą genetycznego przeprogramowania opartego na mRNA47. iPSC utrzymywano w pożywce z komórek macierzystych (SCM) (patrz lista materiałów) i przechowywano w gęstości ~1,2 x 102 komórek/ml z 1 ml SCM, 10 μM z inhibitorem kinazy białkowej związanej z rho (ROCKi) Y-27632 i 10% (v/v) siarczkiem dimetylu (DMSO), w kriokonserwowanych fiolkach w ciekłym azocie w temperaturze -160 °C. Wszystkie poniższe procedury są przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Rozcieńczanie matrycy membrany podstawowej i powlekanie płyty

  1. Rozcieńczony (1:50) czynnik wzrostu zmniejszył macierz błony podstawnej oczyszczony z guza Engelbreth-Holm-Swarm w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) bez czerwieni fenolowej.
  2. Pokryć płytki do hodowli komórkowych odpowiednią ilością rozcieńczonej matrycy błony podstawnej (tj. płytka 6-dołkowa = 1 ml, płytka 12-dołkowa = 0,5 ml) i inkubować te płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.

2. Konserwacja iPSC

UWAGA: Maksymalna konfluencja na dołek w 6-dołkowej płycie z płaskim dnem wynosi ~1,2 x 106 komórek.

  1. Rozmrozić kriokonserwowane iPSC do SCM za pomocą 10 μM Y-27632 i płytkę na 6-dołkowej płytce pokrytej rozcieńczoną matrycą błony podstawnej zredukowanej przez czynnik wzrostu.
  2. Utrzymuj iPSC w SCM za pomocą 10 μM Y-27632 przez pierwsze 24 godziny po rozmrożeniu. Przełącz się na świeże podłoże po 24 godzinach.
  3. Utrzymuj iPSC w SCM, aż komórki osiągną 80-90% konfluencji przed pasażacją.
    1. Oblicz, ile iPSC będzie potrzebnych do różnicowania, mnożąc pożądaną gęstość do różnicowania (15 600 komórek/cm2) przez powierzchnię studzienki. W przypadku 6-dołkowej płytki z płaskim dnem pomnóż 15 600 komórek/cm2 przez 9,6cm2, co daje w sumie 149 760 komórek/studzienkę.
  4. Aby przejść, umyj komórki zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBBS). Następnie inkubować komórki z nieenzymatycznym kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (patrz wykaz materiałów) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    1. Użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie podnieść komórki. Zbierz komórki w świeżym SCM.
    2. Umieść komórki na płytkach do hodowli komórkowych pokrytych rozcieńczonym SCM i utrzymuj komórki zgodnie z opisem w kroku 2.3 lub przechowuj je w temperaturze ~1,2 x 106 komórek/ml w 1 ml SCM, 10 μM Y-27632 i 10% DMSO (v/v) w kriokonserwowanych fiolkach w ciekłym azocie w temperaturze -160 °C.

3. Różnicowanie iPSC do BMEC

UWAGA: Nieenzymatyczne EDTA rozdziela komórki na grudki. Enzymatyczne EDTA (patrz tabela materiałów) rozdziela komórki na zawiesinę jednokomórkową. Kwas retinowy (RZS) należy chronić przed światłem.

  1. Jednokrotne umycie iPSC solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (DPBS) firmy Dulbecco. Inkubować z enzymatycznym EDTA (1 ml dla płytki 6-dołkowej, 0,5 ml dla płytki 12-dołkowej i 0,25 ml dla płytki 24-dołkowej) przez około 5 minut w temperaturze 37 °C, aby otrzymać zawiesinę jednokomórkową.
  2. Zebrać komórki i odwirować przy 300 x g (względna siła odśrodkowa) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osady komórkowe w SCM zawierające 10 μM Y-27632.
  3. Określ gęstość komórek za pomocą Trypan Blue i automatycznego licznika komórek lub urządzenia do hemocytometru. Komórki płytkowe o gęstości 15 600 komórek/cm2 lub 149 760 komórek/basenik 6-dołkowej płytki o płaskim dnie (o powierzchni 9,6cm2/studzienkę) w SCM zawierającym 10 μM Y-27632 przez 24 godziny.
  4. Rozpocznij różnicowanie po 24 godzinach, zmieniając pożywkę SCM na E6. Zmieniaj pożywkę E6 codziennie przez następne 4 dni.
  5. W 4 dniu różnicowania zastąp pożywkę E6 hESFM uzupełnioną rozcieńczonym (1:200) suplementem B27, 20 ng / ml bFGF i 10 μM RA. Nie zmieniaj tego podłoża przez następne 48 godzin.
  6. Przygotować 200 ml hESFM z rozcieńczoną (1:200) witaminą B27, wymieszać 1 ml 50x skoncentrowanego suplementu B27 ze 199 ml hESFM.
  7. Przygotować 20 ng/ml bFGF, rozpuszczając 50 μg bFGF w 250 μl buforu Tris (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) w celu uzyskania 200 μg/ml roztworu podstawowego. Przygotować 200 ml hESFM zawierającego 20 ng/ml bFGF, mieszając 20 μl 200 μg/ml bFGF z 200 ml hESFM.
  8. Przygotować 10 μM RA, najpierw sporządzając 40 mg/ml roztworu podstawowego RA, dodając 2,5 ml DMSO do 100 mg proszku RA. Rozcieńczyć to stężenie do 3 mg/ml w celu uzyskania 10 mM roztworu podstawowego. Przygotować 200 ml hESFM zawierającego 10 μM RZS, mieszając 200 μL 10 μM RA w 200 ml hESFM.

4. Kolagen powlekany IV (COL4) i matryca fibronektyny (FN) do oczyszczania BMEC pochodzącego z iPSC

  1. Dodać 2 ml sterylnej wody do 2 mg FN, aby uzyskać 1 mg/ml roztworu podstawowego FN. Dodać 5 ml sterylnej wody do 5 mg COL4, aby uzyskać roztwór podstawowy COL4 o stężeniu 1 mg/mL.
    1. Pozostawić FN do rozpuszczenia przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C, a COL4 do rozpuszczenia w temperaturze pokojowej.
  2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy FN w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 100 μg/ml, a roztwór podstawowy COL4 do końcowego stężenia 400 μg/ml.
  3. Pokryj żądane płytki (płytka 6-dołkowa = 1 ml roztworu COL4/FN, płytka 12-dołkowa = 0,5 ml, płytka 24-dołkowa = 0,25 ml i płytka 12-transwell z filtrem = 0,25 ml) mieszaniną 400 μg/ml COL4 i 100 μg/ml FN.
  4. Inkubować płytki przez co najmniej 2 godziny lub przez noc w temperaturze 37 °C; w przypadku płytek z filtrem Transwell zaleca się co najmniej 4 godziny.

5. Subkultura i oczyszczanie BMEC pochodzących z iPSC

UWAGA: Inkubacja z enzymatycznym EDTA może trwać dłużej niż 15 minut, w zależności od zbiegu komórek w 6 dniu różnicowania.

  1. W 6 dniu różnicowania przemyć komórki dwukrotnie DPBS. Inkubować z 1 ml enzymatycznego EDTA przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 °C, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
  2. Zbierać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić granulki komórkowe świeżym hESFM z rozcieńczonym (1:200) suplementem B27, 20 ng / ml bFGF i 10 μM RA.
  3. Komórki nasienne na płytkach pokrytych mieszaniną 400 μg/ml COL4 i 100 μg/ml FN. Komórki nasienne przy użyciu stosunku 1 dołka płytki 6-dołkowej do 3 dołków płytki 12-dołkowej, 3 dołków płytki 12-dołkowej lub 6 dołków płytki 24-dołkowej.
  4. Zasiaj niezróżnicowane iPSC z tej samej linii komórkowej na pokrytej COL4 / FN 12-transwell przefiltrowanej płytce jako kontrola ujemna do analizy TEER.
  5. Po 24 godzinach podhodowli zmień pożywkę na hESFM tylko z suplementem B27. Po tym kroku nie są potrzebne żadne zmiany podłoża.

6. Test kiełkowania

  1. Zbierz BMEC pochodzące z iPSC dnia 8 i wysiej je w 100 000 komórek/studnię na 24-dołkowej płaskiej płytce świeżo pokrytej 200 μl /cm2 macierzy błony podstawnej.
  2. Potraktuj te komórki hESFM z rozcieńczoną (1:200) witaminą B27 i 40 ng / ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGFA165).
  3. Obserwuj komórki co 24 godziny i zmieniaj pożywkę co dwa dni.

7. Immunocytochemia (ICC)

UWAGA: ICC jest przeprowadzany na 24-dołkowych płytach płaskodennych.

  1. Po 48 godzinach hodowli cząstkowej (dzień 8) należy dwukrotnie przemyć komórki preparatem DPBS. Napraw komórki 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut.
  2. Umyj komórki trzy razy DPBS, 5 minut na pranie. Wstępnie zablokuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w DPBS za pomocą 5% surowicy osła i 0,3% Triton X-100 (v/v).
  3. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi: mysim anty-human-PECAM1 (1:100, zapas 0,5 mg/ml), króliczym anty-human-TJP1 (1:200, zapas 0,53 mg/ml), mysim anty-human-CLDN5 (1:200, zapas 0,5 mg/ml), mysi anty-human-OCLN (1:200, zapas 0,5 mg/ml) i króliczy anty-ludzki SLC2A1 (1:100, zapas 0,2 mg / ml) w DPBS zawierającym 5% surowicy osła przez noc w temperaturze 4°C.
    1. Wypłucz komórki raz za pomocą DPBS, a następnie umyj pięć razy przez 5 minut na każde mycie DPBS.
  4. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi: osłem przeciwko królikowi Alexa Fluor 555 (1:200) i osłem-anty-myszowi 488 (1:200) w DPBS zawierającym 5% surowicy osła przez 1 godzinę.
  5. Po tej inkubacji dodać Hoechst 33342 trichlorowodorek trójwodny rozcieńczony (1:1000) w DPBS przez 10 minut.
    1. Usunąć roztwór Hoechst 33342 i spłukać raz DPBS, a następnie przemyć cztery razy DPBS przez 5 minut na pranie.
  6. Wizualizuj komórki na mikroskopach fluorescencyjnych, aby szukać ekspresji i lokalizacji twórców komórek.

8. Pomiar i analiza TEER

UWAGA: Płytki filtrowane Corning 12-Transwell są wyposażone w filtry składające się z membran z politereftalanu etylenu o średnicy 1,12cm2 i porów 0,4 mikrometra. Pomiary TEER uzyskuje się w kontrpróbach technicznych (3 na studzienkę) i biologicznych (3 dołki na linię komórkową i/lub kondycję).

  1. 24 godziny po podhodowli (dzień 7) mierz TEER za pomocą elektrod pałeczkowych i woltoomomierza co 24 godziny. Zapoznaj się z instrukcją obsługi woltoomomierza, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące uzyskiwania pomiarów.
    1. Aby zmierzyć TEER, naładuj woltoomomierz poprzedniej nocy. Delikatnie przetrzyj elektrody instrumentu i pałeczek 70% etanolem przed umieszczeniem ich w kapturze bezpieczeństwa.
    2. Włącz zasilanie i skalibruj omomierz zgodnie z zaleceniami producenta.
    3. Podłącz elektrody pałeczek i opłucz elektrody 70% etanolem, a następnie DPBS.
    4. Umieść krótszą elektrodę końcową we wkładzie trans-well (komorze wierzchołkowej), a dłuższy koniec w komorze podstawno-bocznej.
    5. Najpierw zmierz ślepą studzienkę, która jest pokryta tylko COL4 / FN. Następnie zmierz pozostałe studzienki.
    6. Szybko przepłucz elektrody pałeczek 70% etanolem, a następnie DPBS podczas pomiaru różnych warunków (tj. pomiaru różnych linii komórkowych).
  2. Po wykonaniu wszystkich pomiarów (w Ω) należy opłukać elektrody pałeczek 70% etanolem, a następnie sterylną wodą. Delikatnie wytrzyj elektrodę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w kapturze bezpieczeństwa.
  3. Uśrednić trzykrotne wartości TEER (w Ω) ze ślepej próby i odjąć tę średnią wartość od każdej surowej wartości TEER według warunków.
    1. Uśrednij odjęte wartości i pomnóż je przez 1,12cm2 (pole powierzchni wkładki 12-transwell).
    2. Użyj przekształconych wartości z kroku 6, aby wygenerować wykres przedstawiający wartość TEER i błędy standardowe dla każdego dnia pomiaru TEER.

9. Aktywność i analiza transportera Efflux

UWAGA: Test aktywności transportera wypływu jest wykonywany na 24-dołkowej płytce o płaskim dnie. Interesujące transportery wypływu to ABCB1 i ABCC1. Zaleca się, aby każdy warunek był wykonywany w trzech egzemplarzach ze studzienkami kontrolnymi (tj. studzienkami ślepymi bez odpowiednich inhibitorów).

  1. Po 48 godzinach od podhodowli (dzień 8) inkubować komórki z 10 μM Valspodar (inhibitor ABCB1) lub 10 μM MK571 (inhibitor ABCC1) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    1. Przygotować 10 mM bulionu Valspodar, rozpuszczając 5 mg proszku (1214,64 g/mol) w 412 μl DMSO i rozcieńczyć do stężenia roboczego 10 μM. Na przykład, aby uzyskać 10 ml hESFM z 10 μM Valspodar, zmieszaj 10 μl 10 mM bulionu Valspodar z 10 ml hESFM.
    2. Przygotować 10 mM wywaru MK571, rozpuszczając 5 mg proszku (537,07 g/mol) w 931 μl i rozcieńczyć do stężenia roboczego 10 μM. Na przykład, aby zrobić 10 ml hESFM z 10 μM MK571, wymieszaj 10 μl 10 mM bulionu MK571 z 10 ml hESFM.
  2. Po upływie 1 godziny inkubować komórki z 10 μM rodaminą 123 (substrat ABCB1) lub 10 μM dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (H2DCFDA, substrat ABCC1) z odpowiednimi inhibitorami lub bez nich przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    1. Przygotować 10 mM rodaminy 123 przez rozpuszczenie 10 mg proszku (380,82 g/mol) w 875 μl DMSO i rozcieńczyć do stężenia roboczego 10 μM. Na przykład, aby uzyskać 10 ml hESFM z 10 μM rodaminy 123, zmieszaj 10 μl 10 mM rodaminy 123 z 10 ml hESFM.
    2. Przygotować 10 mM H2DCFDA, rozpuszczając 50 mg proszku (487,29 g/mol) w 10,26 ml DMSO i rozcieńczyć do stężenia roboczego 10 μM. Na przykład, aby uzyskać 10 ml hESFM z 10 μM rodaminy 123, zmieszaj 10 μl 10 mM rodaminy 123 z 10 ml hESFM.
  3. Przemyć komórki dwukrotnie 0,5 ml DPBS i poddać je lizie przy użyciu DPBS zawierającego 5% Triton-X (v/v).
  4. Zmierzyć fluorescencję lizowanych komórek za pomocą czytnika wielopłytkowego lub mikropłytki (patrz lista materiałów).
    1. Ustaw czytnik płytek fluorescencyjnych na wzbudzenie 485 nanometrów i emisję 530 nanometrów i zmierz fluorescencję na tych długościach fal
      2. .
    2. W przypadku studzienek, które nie są używane w teście transportera, należy dwukrotnie przepłukać komórki DPBS przed utrwaleniem ich 4% PFA w celu ilościowego oznaczania jąder komórkowych.
  5. Inkubować komórki z trójwodzianem trichlorowodorku Hoechst 33342 rozcieńczonym (1:1000) w DPBS przez 10 minut. Zobrazuj wiele pól wizualnych w każdym dołku, aby obliczyć średnią liczbę jąder komórkowych za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych.
  6. Policz jądra za pomocą Fidżi i znormalizuj wartości fluorescencji dla każdej komórki do tych liczb.
    1. Obliczyć średnią akumulację fluorescencji, odejmując wartość akumulacji fluorescencji surowej dla każdego warunku od odpowiedniej wartości ślepej próby.
    2. Średnie odjęte wartości dla każdego warunku.
    3. Podziel wartości średnie z kroku 9.6.1 przez średnią liczbę komórek. Użyj tych wartości, aby znormalizować wartości fluorescencji dla poszczególnych komórek.
    4. Użyj znormalizowanych wartości, aby wygenerować graficzną reprezentację dla każdego stanu inhibitora i przeprowadzić niezbędną analizę statystyczną.

10. Przejścia, rozszerzanie i kriokonserwacja BMEC

  1. Uzupełnij kultury BMEC dnia 8 świeżym hESFM uzupełnionym rozcieńczoną (1:200) B27 i pozwól komórkom rozszerzać się przez kolejne dwa dni na matrycy COL4 / FN.
  2. Pokryć nową 12-płynną płytkę z filtrem i 24-dołkową płytkę z płaskim dnem z 400 μg/ml COL4 i 100 μg/ml FN i inkubować przez 4 godziny.
  3. W dniu 10 przemyć komórki DPBS i inkubować z 1 ml enzymatycznego EDTA przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37°C, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
  4. Zbierać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    1. Aby kriokonserwować te komórki, ponownie zawieś granulki komórkowe ze świeżym hESFM z 30% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 10% DMSO.
    2. Przechowywać BMEC pochodzące z iPSC w kriokonserwowanych fiolkach w pojemniku izopropanolowym przez pierwsze 24 godziny w temperaturze -80 °C, a następnie umieścić w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania w temperaturze -160 °C.
    3. Aby przejść przez te komórki, należy ponownie zawiesić osady komórkowe ze świeżym hESFM uzupełnionym rozcieńczoną (1:200) witaminą B27.
  5. Komórki nasienne na powlekane płytki przygotowane w kroku 10.2. Komórki nasienne przy użyciu stosunku 1 dołka płytki 6-dołkowej do 3 dołków płytki z filtrem 12-transdołkowym i do 6 dołków płytki 24-dołkowej. Pozwól komórkom rosnąć i rozszerzać się przez 24 godziny.
  6. W dniu 11 zmierz TEER, wykonując czynności wymienione w kroku 8.
  7. W dniu 12 wykonaj ICC, wykonując czynności wymienione w kroku 9.
  8. Aby rozmrozić kriokonserwowane BMEC, umieść kriokonserwowane fiolki w ciepłej wodzie lub kąpieli perełkowej w temperaturze 37oC. Następnie przenieś rozmrożone BMEC do 5 ml hESFM uzupełnionego rozcieńczoną (1:200) B27.
    1. Zbierać komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w hESFM uzupełnionym rozcieńczoną (1:200) B27, 10 μM RA i 10 μM Y-27632.
    2. Po 24 godzinach zmień pożywkę na hESFM uzupełnioną rozcieńczonym (1:200) B27 i 10 μM Y-27632 bez RA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zróżnicowanie BMEC
Należy dokładnie wykonać kilka krytycznych kroków w tym protokole (Rysunek 1). Stosowanie pożywki E6 w pierwszym dniu jest ważne, ponieważ jest ona często używana do wyprowadzania linii neuroektodermy z iPSC w stosunkowo krótkim czasie, dając powtarzalne wyniki na wielu liniach komórkowych36. Kolejnym ważnym krokiem jest 4 dzień różnicowania, w którym pożywka E6 powinna zostać zmieniona na hESFM z rozcieńczoną (1:200) B27, 20 ng...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

W tym protokole dokonaliśmy pewnych modyfikacji w użyciu powszechnie stosowanej macierzy zewnątrzkomórkowej i pożywki do hodowli komórkowych podczas hodowli iPSC w celu wyprowadzenia BMEC (Figura 1). Zmiany te nie wpłynęły na zdolność do wyprowadzania BMECS z ludzkich iPSC, jak opisano w protokole Lippmanna1. Zastosowano linię iPSC od innego zdrowego dawcy, aby wykazać, że ten zmodyfiko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (dla R.K.), National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). Nagroda National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (dla R.K.), grant Fundacji Sydney R Baer Jr (dla P.L.) Nagroda Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (dla R.K.), Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (do R.K.), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (do R.K.), Harvard Stem Cell Institute (do R.K.) oraz przez Steve'a Willisa i Elissę Freud (do R.K.). Dziękujemy dr Annie Kathurii za jej krytyczną lekturę i opinie na temat rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2′,7&-dichlorodihydrofluoresceina dioctanSigma AldrichD6883-50MG
AccutaseSigma AldrichA6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anty-mysi IgGLife TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anty-królik IgGLife TechnologiesA-31572
B27 SuplementThermo Fisher Scientific17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mysiakomórkowa3528S
CLDN5 (Claudin-5)Thermo Fisher Scientific35-2500
Kolagen IV z ludzkiego łożyskaSigma AldrichC5533-5mg
Corning 2 mL Fiolka kriogeniczna z polipropylenu z gwintem wewnętrznym Corning  8670
Corning  Płytki do hodowli komórkowych Costar z płaskim dnem (6-dołkowe)Corning353046
Corning  Płytki do hodowli komórkowych Falcon z płaskim dnem (24-dołkowe)Corning353047
Płytka wielodołkowa Corning Transwell z przepuszczalnymi wkładkami z membrany poliestrowej (12-dołkowa)Prowadnice Corning3460
CountessThermo Fisher ScientificC10228
DMEM/F12 (bez czerwieni fenolowej)Thermo Fisher Scientific 
DMSOSigma AldrichD2438-50mL
Serum osłaSigmaAldrich D9663-10ML
DPBS (+/+)Gibco/Thermo Fisher Scientific14040-117
Nabłonkowy miernik napięcia/oma (TEER) (EVOM2) STX2World Precision InstrumentsN/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher)Thermo Fisher Scientific
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma AldrichF2442
FibronektynaSigma AldrichF2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Obniżony czynnik wzrostu Matrix Matryca błony podstawnejThermo Fisher ScientificA1413202
Roztwór soli Hanksa z wapniem i magnezem Thermo Fisher Scientific24020-117
Hoechst 33342, Trójchlorowodorek, TrójwodzianThermo Fisher ScientificH3570
Pożywka bez ludzkiej surowicy śródbłonkaThermo Fisher Scientific11111044
InCell Analyzer 6000General ElectricN/A
Invitrogen  Countess Automatyczny licznik komórekThermo Fisher ScientificN/A
MK-571Sigma AldrichM7571-5MG
NutriStemStemgent01-0005
OccludinThermo Fisher Scientific33-1500
Paraformaldehyd 16%Usługi mikroskopii elektronowej15710
Perkin Elmer Envision 2103 wielopłytkowy CzytelnikPerkin ElmerN/A Rekombinowany
ludzki VEGF 165Peprotech100-20
Rekombinowany ludzki FGF-basic (154 a.a.)Peprotech100-18B
Kwas retinowySigma AldrichR2625-100MG
Rodamina 123Sigma Aldrich83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)ThermoFisherPA1-21041
SOX17Sygnalizacja komórkowa81778S
TJP-1 (ZO-1)ThermoFisherPA5-28869
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0,4%) do stosowania z automatycznym licznikiem komórek CountessThermo Fisher ScientificT10282
Valspodar (Sigma) (cyklosporyna A)Sigma AldrichSML0572-5MG
Roztwór VerseneThermo Fisher Scientific15040066
Y-27632 dichlorowodorek (inhibitor ROCK)Tocris/ Thermo Fisher Scientific1254
sygnalizacja mAb A1413202A1516401

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83(2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321(2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964(2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3(2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15(2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879(2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9(2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33(2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181(2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398(2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321(2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34(2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099(2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Brain Microvascular Endothelial CellsHuman Induced Pluripotent Stem CellsBlood Brain BarrierEndothelial DifferentiationTEER MeasurementEfflux Transporter ActivityImmunocytochemistryWestern BlottingSprouting AssayCryopreservation

Powiązane artykuły