Wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez GMO

Podsumowanie

Prezentujemy metodę bez modyfikacji genetycznie (GMO) do uzyskania komórek z fenotypem neuronalnym z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej. Aktywacja szlaku sygnałowego powiązanego z nowym ludzkim białkiem połączonym z GPI ujawnia skuteczną, wolną od GMO metodę pozyskiwania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Streszczenie

Wiele ludzkich zaburzeń neurologicznych jest spowodowanych degeneracją neuronów i komórek glejowych w mózgu. Ze względu na ograniczenia w farmakologicznych i innych strategiach terapeutycznych, obecnie nie ma lekarstwa na uszkodzony lub chory mózg. Wymiana komórek wydaje się być obiecującą strategią terapeutyczną w chorobach neurodegeneracyjnych. Do dnia dzisiejszego neuronalne komórki macierzyste (NSC) są z powodzeniem generowane z tkanek płodowych, ludzkich komórek embrionalnych (ES) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Proces odróżnicowania został zainicjowany przez aktywację nowej ludzkiej glikoproteiny połączonej z GPI, która prowadzi do powstania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Te pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzenia krwi (BD-PSC) różnicują się in vitro w komórki o fenotypie neuronalnym, jak wykazano za pomocą mikroskopii jasnego pola i immunofluorescencji. Analiza ultrastrukturalna tych komórek za pomocą mikroskopii elektronowej potwierdza ich pierwotną budowę, a także morfologię neuronalną i charakterystykę subkomórkową.

Wprowadzenie

Rozwój podstawowych i przedklinicznych metod badań nad komórkami macierzystymi zachęca do klinicznego zastosowania terapii opartych na komórkach macierzystych w chorobach neurologicznych. Taka potencjalna terapia zależy w decydującym stopniu od metody generowania ludzkich komórek nerwowych prowadzących do funkcjonalnego odzyskiwania¹.

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) samoodnawiają się i różnicują w nowe neurony przez całe życie w procesie zwanym neurogenezą dorosłych. Tylko bardzo ograniczone obszary mózgu są siedliskiem NSC zdolnych do generowania neuronów noworodków w wieku dorosłym. Takie NSC mogą dać początek dojrzałym neuronom, które biorą udział w uczeniu się i pamięci, zastępując w ten sposób utracone lub uszkodzone neurony. Niestety, te NSC są obecne w ograniczonych ilościach, a ta ograniczona neurogeneza gwałtownie spada podczas rozwoju młodocianego². Dlatego w celu terapii komórkowej należy wziąć pod uwagę inne źródła komórek nerwowych.

Zwyrodnieniowe choroby neurologiczne są trudne do wyleczenia przy użyciu standardowych metod farmakologicznych. Nowe strategie terapeutyczne mające na celu objęcie wielu nieuleczalnych zaburzeń neurologicznych opierają się na terapiach wymiany komórek chorej i uszkodzonej tkanki. Przeszczep NSC może zastąpić uszkodzone komórki i przynieść korzystne efekty. Inne źródła wymiany komórek nerwowych obejmują ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ESC), które pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej blastocyst ssaków³, a także iPSCs⁴, które mają dużą zdolność do samoodnawiania się, podobnie jak ESC, i są zdolne do różnicowania się w różne linie komórkowe. NSC mogą być również generowane przez bezpośrednie przeprogramowanie z ludzkich fibroblastów, unikając stanu pluripotencjalnego⁵.

Terapia wymiany komórek jest nadal trudnym problemem. Chociaż ESC, płód lub iPS mogą być źródłem generowania komórek neuronalnych do leczenia wielu nieuleczalnych chorób neurologicznych, autologiczna wymiana uszkodzonych tkanek przez dorosłe komórki SC jest lepszą alternatywą, która pozwala obejść obawy immunologiczne, etyczne i bezpieczeństwa.

Aktywacja ludzkiego białka połączonego z GPI poprzez sieciowanie przeciwciał poprzez fosforylację PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicjuje dedyferencjację komórek progenitorowych krwi i generowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzenia krwi (BD-PSCs)⁶. Komórki te różnicują się in vitro w kierunku komórek neuronalnych, co potwierdzono za pomocą analizy jasnego pola, immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

W tej pracy opisujemy wolne od GMO pokolenie BD-PSC i ich udane ponowne różnicowanie się w komórki o fenotypie neuronalnym.

Protokół

Uzyskano zgody etyczne podczas przeprowadzania eksperymentów.

1. Izolacja ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC)

1. Upewnij się, że wszyscy dawcy podpisali świadomą zgodę przed pobraniem krwi zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Pobrać 30 ml krwi od zdrowych dawców przez przeszkolony personel medyczny zgodnie ze standardowym protokołem.
3. Wyizolować PBMNC za pomocą ośrodków o gradiencie gęstości. Użyć 10 ml pożywki z 25 ml krwi w stosunku 1:1 rozcieńczonej solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i odwirować przy 300 x g przez 30 minut.
4. Wyizolować warstwę interfazową między plazmą a ośrodkiem o gradiencie gęstości za pomocą pipetowania. Umyć wyizolowane komórki 5 ml sterylnego PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut. Powtórzyć dwukrotnie.
5. Policz liczbę komórek standardowymi metodami przy użyciu komory zliczającej.

2. Aktywacja ludzkiej glikoproteiny zakotwiczonej w GPI poprzez sieciowanie przeciwciał na powierzchni PBMNC

1. Umieścić 6 x 10⁶ komórek jednojądrzastych (MNC) w probówkach o pojemności 15 ml i przeprowadzić sieciowanie przeciwciał poprzez inkubację komórek z ludzkim przeciwciałem specyficznym dla białka błonowego połączonego z GPI (30 μg/ml) przez 30 minut w PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze 37 °C.
2. Zastąp pożywkę inkubacyjną zmodyfikowaną pożywką Dulbecco firmy Iscove uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
3. Hoduj komórki w probówkach polistyrenowych o pojemności 15 ml, umieść probówki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 8-10 dni (bez wstrząsania). Na D5 dodaj dodatkowe 1-2 ml pożywki Iscove uzupełnionej 10% FBS do każdej 15 ml probówki.

3. Sortowanie nowo wygenerowanych komórek odróżnicowanych

1. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (18 μl zawiesiny komórek + 2 μl barwnika fluorescencyjnego) lub w komorze zliczającej.
2. Odwirować zawiesinę komórek hodowlanych (5-7 x 10⁶) przy 300 x g przez 10 minut i odessać otrzymany supernatant sterylną pipetą Pasteura.
3. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 90 μl wstępnie schłodzonego PBS o pH 7,2, 0,5% BSA i 2 mM EDTA.
4. Dodać dodatnie nanokulki magnetyczne CD45 (80 μl) do zawiesiny komórek i inkubować na lodzie przez 15 minut.
5. Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut.
6. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu PBS.
7. Przemyć kolumnę 500 μl wstępnie schłodzonego buforu PBS i umieścić go w polu magnetycznym.
8. Umieścić zawiesinę komórek na kolumnie i przemyć ją 500 μl buforu PBS (dwa razy) i przepływem wirówki zawierającym komórki CD45 ujemne. Zbierz je w pożywce Iscove uzupełnionej 1% BSA.
9. Policz komórki w komorze liczącej.

4. Przygotowanie naczyń z hodowli komórkowych do różnicowania neuronów nowo powstałych komórek macierzystych

1. Pokryj naczynia hodowlane poli-L-ornityną i lamininą w celu wyhodowania komórek neuronalnych.
2. Umieścić szkiełka nakrywkowe na płytkach 4-dołkowych i pokryć je rozcieńczoną w stosunku 1:5 poli-L-ornityną (0,1 mg/ml w_ddH2O) w_ddH2O. Umieścić szkiełka nakrywkowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Następnie umyć z ddH₂O.
3. Powoli rozmrażaj lamininę (0,5-2,0 mg/ml) i dodaj do wierzchu szkiełek nakrywkowych. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
4. Przygotować pożywkę do indukcji neuronalnej N2 składającą się z 49 ml D-MEM/F12, 500 μl suplementu N2, 400 μl aminokwasów endogennych (NEAA), zasadowego roztworu FGF o stężeniu końcowym 20 ng/ml (przygotowanego ze 100 μg/ml roztworu podstawowego) i heparyny o stężeniu końcowym 2 ng/ml.
5. Usunąć nadmiar lamininy przez pipetowanie i dodać pożywkę neuronalną N2 do szalek hodowlanych.

5. Hodowla neuronalnych odróżnicowanych komórek krwi

1. Hodowla komórek CD45 ujemnych pochodzących z BD na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą/ornityną przez 2 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w pożywce N2 w celu zainicjowania różnicowania neuronalnego nowo wytworzonych komórek BD.
2. Hodowla komórek dalej w pożywce różnicowania neuronów składającej się z 48 ml pożywki neurobazalnej, 500 μl L-glutaminy, 1 ml suplementu B27, 500 μl NEAA, 50 μl rekombinowanego ludzkiego czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (GDNF) w stężeniu 5 μg/250 μl w PBS/0,1% BSA i 50 μl rekombinowanego czynnika neurotroficznego pochodzącego z ludzkiego mózgu (BDNF) w ssu 5 μg/200 μl w PBS/0,1% BSA i 50 μl roztworu kwasu askorbinowego 2,9 g/50 ml w PBS. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

6. Analiza mikroskopii immunofluorescencyjnej komórek nerwowych pochodzących z krwi

1. Hodować komórki zgodnie z powyższym opisem przez 16 dni i usunąć pożywkę.
   1. Inkubować z podgrzanym utrwalaczem składającym się z 75 ml sterylnej wody, 4 g paraformaldehydu. W razie potrzeby dodać 10 N NaOH i mieszać, aż roztwór się klaruje. Następnie dodaj 10 ml 10 x PBS, 0,5 ml MgCl_2, 2 ml 0,5 M EGTA i 4 g sacharozy. Miareczkować do pH 7,4 za pomocą 6 N HCl i doprowadzać do 100 ml sterylnej wody przez 15 minut, zgodnie z Marchenko et al.⁷.
   2. Wyrzuć utrwalacz i umyj komórki 3 razy przez 5 minut za każdym razem. Natychmiast dodaj świeżo przygotowany 0,3% roztwór Triton X i przepuszczaj komórki przez 5 minut. Umyj 3 razy PBS i dodaj roztwór blokujący wykonany z PBS i 5% BSA.
   3. Zablokuj komórki w temperaturze pokojowej na płycie kołyskowej na 1 godzinę.
   4. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał w 1% BSA/PBS i inkubować komórki z rozcieńczonymi przeciwciałami na płytce kołyskowej przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki 3 razy PBS przez 5 minut każda, inkubować komórki za pomocą DAPI i zamontować szkiełka nakrywkowe z mediami montażowymi do wizualizacji pod mikroskopem.
      UWAGA: Bezpośrednio znakowane przeciwciała użyte w tym eksperymencie są wymienione w Tabeli materiałów.

7. Analiza nowo wygenerowanych komórek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

1. Wysiewaj komórki do TEM w 8-dołkowych szkiełkach komorowych.
2. Utrwalić komórki w 3,5% aldehydzie glutarowym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, po utrwaleniu w 2% OsO₄ przez dodatkową godzinę w temperaturze pokojowej i zabarwić w 2% octanie uranylu w ciemności w temperaturze 4 °C przez 2 godziny 30 min.
3. Na koniec opłucz komórki w wodzie destylowanej, odwodnij je w etanolu i zanurz na noc w żywicy epoksydowej. Następnego dnia przenieść próbki do pieca o temperaturze 70 °C na 72 godziny w celu utwardzenia żywicy.
4. Odłącz osadzone kultury komórkowe od szkiełka komorowego i przyklej do bloków aralditowych.
5. Wytnij seryjnie półcienkie odcinki (1,5 μm) za pomocą maszyny, zamontuj na szkiełkach i lekko zabarwij 1% błękitem toluidynowym.
6. Przyklej wybrane półcienkie odcinki do bloków aralditowych i oderwij je od szkiełka poprzez wielokrotne zamrażanie (w ciekłym azocie) i rozmrażanie.
7. Przygotować ultracienkie skrawki (0,06-0,08 μm) za pomocą maszyny i dalej skontrastować z cytrynianem ołowiu.
8. Uzyskaj mikrofotografie za pomocą elektronowego mikroskopu skaningowego z kamerą cyfrową.

Wyniki

Wyniki dostarczają dowodów na to, że ta nowatorska metoda wolna od GM jest w stanie przywrócić komórki progenitorowe krwi do ich najbardziej prymitywnego stanu bez bezpośredniego oddziaływania na ludzki genom.

Wcześniej wykazaliśmy, że sieciowanie przeciwciał specyficznych dla białek zakotwiczonych przez GPI inicjuje poprzez PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN nadekspresję wysoce konserwatywnych genów istotnych dla rozwoju, takich jak WNT, NOTCH i C-Kit, zapoczątkowując tym samym proces dedyferen...

Dyskusja

Niemodyfikowana genetycznie metoda przeprogramowania komórek ludzkich opisana w tej pracy opiera się na aktywacji przez błonę do jądra maszynerii sygnalizacyjnej za ludzką glikoproteiną błonową połączoną z GPI, która inicjuje proces dedyferencjacji prowadzący do generowania ex vivo i ekspansji samoodnawiających się PSC uzyskanych z niemanipulowanej ludzkiej krwi obwodowej. Komórki te, gdy są hodowane w odpowiednich pożywkach, są zdolne do ponownego różnicowania się w komórki należące do różnych listków rozrodczy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina Frakcja V	Roth	T8444.4
Koniugat anty-GFAP Cy3	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
Zestaw do badania żywotności komórek AO/PI	Biozym	872045	Biozym wycofany z produkcji. Produkt wyprodukowany przez firmę Logos Biosystems.
Kwas askorbinowy 2-fosforan sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Bez surowicy 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Podstawowy roztwór FGF	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	gęstości
BSA Frac V 7,5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized kulki magnetyczne
Szkiełka do liczenia komórek Luna	Biozym	872010	Biozym wycofane z produkcji. Produkt wyprodukowany przez firmę Logos Biosystems.
Prowadnice komorowe Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoksydowa
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Wycofane z produkcji. Dostępne pod: TMS-013-B
GDNF rekombinowany człowiek	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamina
Aldehyd glutowy klasy	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparyna sodowa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Mysz Laminin	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Cytrynian ołowiu	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automatyczny licznik komórek	Biozym	872040	Biozym wycofany z produkcji. Produkt wyprodukowany przez firmę Logos Biosystems.
Bufor MACS	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsä ulen	Miltenyi	130-042-201
Aparat cyfrowy Morada	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 dołki	Fisher Scientific	10507591
N2 Suplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterylne	Roth	9143.2
Poli-L-ornityna	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400

gradient żywica