Artykuł metodologiczny

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

DOI:

10.3791/61648

⸱

15 września 2020

 ,  , 
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synteza białek zależna od kapu jest dominującym szlakiem translacyjnym w komórkach eukariotycznych. Podczas gdy różne podejścia biochemiczne i genetyczne umożliwiły szeroko zakrojone badania nad translacją zależną od czapeczki i jej regulacją, nadal brakuje wysokiej rozdzielczości kinetycznej charakterystyki tego szlaku translacji. Niedawno opracowaliśmy test in vitro do pomiaru kinetyki translacji zależnej od czapeczki z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki. Test opiera się na fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałie wiążącym się z powstającym polipeptydem znakowanym epitopem. Obrazując wiązanie i dysocjację przeciwciał do i z powstających kompleksów peptyd-rybosom-mRNA, można śledzić postęp translacji na poszczególnych mRNA. W tym miejscu przedstawiamy protokół tworzenia tego testu, w tym preparaty mRNA i szkiełek pegylowanych, obrazowanie translacji w czasie rzeczywistym oraz analizę trajektorii pojedynczych cząsteczek. Test ten umożliwia śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji zależnych od czapeczki i rozwiązuje kluczowe kwestie związane z kinetyką translacji, takie jak szybkość inicjacji i wydłużenia. Test ten może być szeroko stosowany do różnych systemów translacji i powinien przynieść szerokie korzyści w badaniach in vitro kinetyki translacji zależnej od czapeczki i mechanizmów kontroli translacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translacja w systemach eukariotycznych zachodzi głównie poprzez szlaki zależne od kapu 7-metylopanozyny (m7G)1. Badania wskazują, że etap inicjacji translacji eukariotycznej ogranicza szybkość i jest wspólnym celem regulacji2,3,4. Mechanizmy translacji zależnej od czapeczki zostały szeroko zbadane przy użyciu podejść zbiorczych genetic5, biochemical6,7,8, structural9 i genomic10 masowych. Chociaż metody te zidentyfikowały różne mechanizmy, które regulują inicjację zależną od czapeczki, ich rozdzielczość ogranicza je do grupowego uśredniania sygnałów z heterogenicznych i asynchronicznych zdarzeń inicjacyjnych. Ostatnio poszczególne zdarzenia translacji in vivo zostały zobrazowane za pomocą metod, które mierzą wiązanie przeciwciał fluorescencyjnych z epitopami na powstających polipeptydach11,12,13,14. Jednak te nowe podejścia mają również ograniczoną zdolność do rozwiązywania indywidualnych zdarzeń inicjacyjnych, ponieważ wiele przeciwciał fluorescencyjnych musi związać powstający peptyd, aby umożliwić rozwiązanie pojedynczych zdarzeń translacji na tle o wysokiej fluorescencji wewnątrzkomórkowej. W wielu interakcjach biologicznych rozwiązane pojedyncze zdarzenia kinetyczne dostarczyły krytycznych informacji na temat zrozumienia złożonych, wieloetapowych i powtarzalnych procesów biologicznych, których nie można zsynchronizować na poziomie molekularnym. Potrzebne są nowe metody, które mogą śledzić dynamikę poszczególnych zdarzeń translacji, aby lepiej zrozumieć inicjację i regulację zależną od CAP.

Niedawno opracowaliśmy test in vitro, który mierzy kinetykę inicjacji zależnej od czapeczki z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki15. Biorąc pod uwagę dużą liczbę znanych i nieznanych czynników białkowych zaangażowanych w ten szlak inicjacji3,16, test pojedynczej cząsteczki został opracowany tak, aby był kompatybilny z istniejącymi systemami translacji bezkomórkowej in vitro, aby czerpać korzyści z zachowania czynników komórkowych i solidnej aktywności translacyjnej17,18,19,20,21,22,23,24,25. Co więcej, zastosowanie bezkomórkowych systemów translacji pozwala na bardziej kompatybilne porównania między obserwacjami pojedynczych cząsteczek a wcześniejszymi wynikami masowymi. Podejście to zapewnia prostą integrację nowych spostrzeżeń kinetycznych pojedynczych cząsteczek z istniejącymi mechanistycznymi ramami inicjacji zależnej od czapeczki. Aby ustalić test pojedynczej cząsteczki, tradycyjny bezkomórkowy system translacji jest modyfikowany na trzy sposoby: sekwencja kodująca epitop jest wprowadzana na początku otwartej ramki odczytu (ORF) reporterowego mRNA; koniec 3′ mRNA reporterowego jest biotynylowany, aby ułatwić wiązanie mRNA z powierzchnią wykrywania pojedynczej cząsteczki; a przeciwciała znakowane fluorescencyjnie są uzupełniane do ekstraktu translacyjnego. Modyfikacje te wymagają jedynie podstawowych technik biologii molekularnej i powszechnie dostępnych odczynników. Co więcej, te modyfikacje i warunki obrazowania pojedynczej cząsteczki zachowują kinetykę translacji masowych reakcji translacji bez komórek15.

W tym teście (Rysunek 1), 5′-endowe i 3′-końcowe biotynylowane mRNA reporterowe jest unieruchomione na pokrytej streptawidyną powierzchni detekcyjnej w komorze przepływowej. Komora przepływowa jest następnie wypełniana bezkomórkową mieszaniną translacyjną uzupełnioną fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Po tym, jak nastąpiła translacja mRNA dla około 30-40 kodonów poniżej sekwencji epitopu26,27, epitop wyłania się z tunelu wyjściowego rybosomu i staje się dostępny do interakcji z przeciwciałem znakowanym fluorescencyjnie. Oddziaływanie to jest szybkie, a jego wykrywanie za pomocą technik obrazowania fluorescencji pojedynczej cząsteczki umożliwia śledzenie kinetyki translacji z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki podczas aktywnej translacji bezkomórkowej. Test ten powinien przynieść szerokie korzyści w badaniach in vitro kinetyki translacji zależnej od czapeczki i jej regulacji, szczególnie w przypadku systemów z testem in vitro o masie roboczej.

Warunkiem wstępnym do ustanowienia tego testu pojedynczej cząsteczki jest działający masowy test translacji bez komórek, który można osiągnąć przy użyciu ekstraktu translacyjnego, który jest dostępny na rynku lub przygotowany zgodnie z wcześniej opisanymi metodami28. Ekstrakt z translacji eukariotycznej można uzyskać z różnych komórek, w tym grzybów, ssaków i roślin28. Do obrazowania test ten wymaga mikroskopu TIRF wyposażonego w przestrajalną intensywność lasera i kąt padania, zmotoryzowany stolik na próbkę, zmotoryzowany system fluidyki i urządzenie do kontroli temperatury próbki. Wymagania te są ogólne dla nowoczesnych eksperymentów in vitro z pojedynczymi cząsteczkami TIRF i mogą być spełnione w różny sposób. W przedstawionym tu eksperymencie wykorzystano obiektywny system TIRF składający się z dostępnego na rynku mikroskopu, oprogramowania i akcesoriów, które są wymienione w Tabeli Materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generacja reporterowego mRNA

  1. Zmodyfikuj szablon transkrypcji DNA, który koduje "nieoznakowany" mRNA reporterowy testu masowego, wstawiając sekwencję kodującą znacznik epitopu N-końcowego w celu wygenerowania szablonu transkrypcji DNA dla "oznakowanego" reporterowego mRNA (Figura 2A).
    UWAGA: Interakcja 3xFLAG/anti-FLAG jest zalecana dla tego testu ze względu na jego doskonałą czułość i krótką długość znacznika 3xFLAG. Jednak test jest zgodny z innymi parami epitop/przeciwciało.
  2. Syntetyzuj nieoznakowane i znakowane RNA przy użyciu linearyzowanych matryc DNA i zestawu do transkrypcji in vitro (patrz tabela materiałów). Zazwyczaj 10–20 pmol transkrybowanego RNA in vitro wystarcza do późniejszego przetwarzania RNA, aby umożliwić systematyczne badanie pojedynczej cząsteczki.
  3. Zakończ koniec 5′ RNA (Rysunek 2B) za pomocą zestawu do zamykania m7G (patrz tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta.
  4. Biotynyluj koniec RNA 3′ (Rysunek 2B) za pomocą zestawu do biotynylacji (patrz Tabela materiałów) zgodnie z protokołem dostarczonym z zestawem. Oczyszczać RNA przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie oczyszczanie za pomocą kolumny wirowej. Eluować RNA w 10–20 μl wody wolnej od RNaz. Odzyskuje się około 40–50% nieograniczonego wejściowego RNA.
  5. Oceń integralność i stężenie RNA poprzez denaturację elektroforezy w żelu akryloamidowym i barwienie RNA, jak opisano wcześniej29.
  6. Wykonaj masową translację bez komórek30 z 3′-end-biotynylowanym, oznakowanym mRNA reporterowym, aby potwierdzić, że zmodyfikowane mRNA zachowuje interesujące właściwości translacji. Na przykład translację zależną od czapeczki można potwierdzić, mierząc i porównując aktywność reporterową w masowych reakcjach translacji bezkomórkowej z niezamkniętymi i zamkniętymi mRNA reporterowymi (patrz Reprezentatywne wyniki).

2. Przygotowanie komory przepływowej

  1. Wybierz odpowiednią grubość szkiełka nakrywkowego, zgodnie z danymi w zestawie parametrów obiektywu mikroskopu. Wybierz szkiełko szklane lub kwarcowe dla obiektywowych lub pryzmatycznych systemów obrazowania fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), odpowiednio31.
  2. Wykonaj czyszczenie, zasolenie, PEGylację i montaż komory szkiełka nakrywkowego i szkiełka zgodnie z protokołem opisanym przez Chandradoss et al.32 z następującymi modyfikacjami.
    1. Myć szkiełka zawierające wywiercone otwory w 10% alkalicznym płynnym detergencie (v/v) przez 20 minut z sonikacją. Połącz szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe dla wszystkich pozostałych etapów czyszczenia.
    2. Pomiń etap mycia acetonem. Wydłuż czas inkubacji wytrawiania Piranha z 20 minut do 1 godziny. Inkubować pegylację pierwszej rundy przez 3 godziny. Inkubować drugą rundę pegylacji z MS(PEG)4 przez 3 godziny.

3. Przygotowanie sprzętu

  1. Co najmniej 3 godziny przed wykonaniem eksperymentu z pojedynczą cząsteczką włącz inkubator mikroskopowy i zmniejsz przepływ powietrza do niskiej prędkości, aby uniknąć nadmiernych zakłóceń akustycznych eksperymentów. Ustawić temperaturę inkubatora na optymalną temperaturę dla bezkomórkowego systemu translacji.
    UWAGA: Translacja jest niezwykle wrażliwa na temperaturę. Optymalna temperatura reakcji jest specyficzna dla każdego systemu ekstrakcji komórek. Charakterystyka temperatury reakcji jest istotnym krokiem w rozwoju systemu translacji bez komórek. Ten test jednocząsteczkowy powinien być przeprowadzany w tej samej optymalnej temperaturze, co odpowiadający mu warunek translacji masowej.
  2. Co najmniej 1 godzinę przed wykonaniem eksperymentu z pojedynczą cząsteczką włącz laser, naciskając przycisk zasilania lasera za skrzynką laserową, przekręć laserowy klucz bezpieczeństwa i naciśnij przycisk start; włącz mikroskop i dotknij panelu sterowania ekranu dotykowego, aby wybrać tryb obrazowania, obiektyw i zestaw filtrów.
  3. Włącz kamerę EMCCD, Prior stage kontroler i pompę strzykawkową, naciskając ich przyciski zasilania. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie Andor Solis (oprogramowanie 1) do sterowania kamerą EMCCD, TirfCtrl (oprogramowanie 2) do sterowania laserem, PriorTest (oprogramowanie 3) do sterowania zmotoryzowanym stolikiem i Coolterm do sterowania pompą strzykawkową. Poczekaj, aż kamera ostygnie i ustabilizuje się do wyznaczonej temperatury roboczej przed rozpoczęciem zbierania danych.
  4. W oprogramowaniu 2 upewnij się, że ustawiono prawidłowe parametry długości fali lasera, typu obiektywu i współczynnika załamania światła szkła i próbki. Kliknij przycisk Połącz. Aby ustawić intensywność lasera, kliknij przycisk Control obok długości fali lasera, a następnie w wyskakującym oknie sterowania laserem przeciągnij suwak intensywności. Ustaw laser pod żądanym kątem, przeciągając suwak pozycji światłowodu lub wprowadzając odpowiednią głębokość penetracji. Upewnij się, że pole migawki jest zaznaczone, aby laser działał w trybie wyłączenia, gdy nie obrazuje.
    UWAGA: Otwórz i zamknij migawkę lasera, zaznaczając pole Migawka. Podczas wstępnego ustalania testu należy przetestować różne intensywności lasera i kąty padania w celu optymalnego wykrywania pojedynczych cząsteczek. Optymalna intensywność lasera równoważy jasną fluorescencję pojedynczych cząsteczek i szybkie fotowybielanie fluoroforów. Kąt padania należy zwiększyć poza kąt krytyczny, aby zredukować tło o wysokiej fluorescencji z dyfuzyjnych znakowanych przeciwciał, aż przeciwciała związane z mRNA zostaną wyraźnie rozwiązane. Jako odniesienie, laser o długości fali 532 nm został ustawiony na 10 μW na obiektywie, a kąt padania lasera ustawiony na 71,5° w badaniu15 przy użyciu anty-FLAG znakowanej Cy3 ze stosunkiem znakowania 2–7 barwników na przeciwciało.
  5. W oprogramowaniu 1 wybierz Kinetic w trybie akwizycji, wprowadź parametry czasu ekspozycji, długości serii kinetycznej i wartości wzmocnienia EM. Wybierz katalog i przypisz nazwy plików do zapisania pliku obrazu danych.
  6. Ustawić pompę strzykawkową na skromne lub szybkie natężenie przepływu dla kolejnego etapu mycia przewodów.
    Odpipetuj porcję 70% etanolu do probówki do mikrofuge, włóż końcówkę rurki pompy strzykawkowej do roztworu etanolu i użyj Coolterm, aby trzykrotnie przełączyć pompę strzykawkową między trybem pobierania i dozowania, aby umyć rurkę. Powtórz przy użyciu wody wolnej od RNaz.
    UWAGA: Długość rurki musi być wystarczająco długa, aby umożliwić dozowanie mieszanki translacyjnej w kroku 5, tak aby stykała się tylko z rurką, a nie ze strzykawką. Objętość płukania w tym miejscu powinna być większa niż objętość dozowanej mieszanki tłumaczeniowej, aby zapewnić, że mieszanina tłumaczeniowa w kroku 5 pozostaje w kontakcie z odkażonymi rurkami.
  7. Po dozowaniu ostatniego płukania wodą usuń resztki wody z wnętrza rurki, przecierając końcówkę rurki w czystą chusteczkę. Utrzymuj końcówkę rurki w stanie suchym, umieszczając ją w czystej rurce do mikrofugi.

4. Immobilizacja biotynylowanego mRNA na końcu 3′

  1. Ekstrakt komórkowy i mieszankę translacyjną należy przechowywać zamrożone na suchym lodzie do momentu tuż przed ich użyciem. Rozmrozić pozostałe zamrożone odczynniki i utrzymać je na lodzie.
  2. Umieść komorę przepływową w uchwycie na próbkę mikroskopu stroną z szkiełkiem nakrywkowym skierowaną w dół i zabezpiecz ją taśmą. Użyj taśmy, aby zakryć wloty i wyloty kanałów przepływowych, które nie są używane.
  3. Odpipetować 1,5-krotną objętość (w stosunku do objętości kanału; dotyczy również innych etapów kroku 4 i 5) 0,2 mg/ml streptawidyny do kanału przepływowego i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Aby usunąć niezwiązaną streptawidynę, należy przemyć kanał trzykrotnie, pipetując 3 razy objętość buforu płuczącego T50 (20 mM Tris HCl, pH 7,0, 50 mM NaCl, 0,2 U/μL odczynnika hamującego RNazę) na jedno płukanie.
    UWAGA: Ważne jest, aby zapobiec cofaniu się odpadów płynnych do kanału. Jeśli wylot kanału przepływowego nie jest podłączony do rurki do zbierania odpadów, umieść złożoną bibułkę w pobliżu wylotu, aby wchłonąć ciecz wypływającą z kanału.
  5. Przenieś ekstrakt translacyjny i wymieszaj z suchego lodu na lód i pozwól im się rozmrozić.
  6. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw. Umieść uchwyt na próbkę mikroskopu z komorą przepływową w stoliku mikroskopu. Zbliż obiektyw do szkiełka nakrywkowego, aż olej immersyjny na obiektywie zetknie się ze szkiełkiem nakrywkowym. Przesuń stolik na próbkę tak, aby kanał przepływu znajdował się bezpośrednio nad soczewką obiektywu.
  7. W oprogramowaniu 2 otwórz migawkę lasera i wyreguluj poziom intensywności lasera.
  8. Na ekranie dotykowym sterowania mikroskopem wybierz kartę Ostrość i kliknij przycisk Wyszukiwanie ostrości i Start. Po pomyślnym osiągnięciu płaszczyzny ostrości słychać sygnał dźwiękowy.
  9. Zobrazuj powierzchnię kanału przepływu w trybie Live w oprogramowaniu 1. Zoptymalizuj ostrość, aby uzyskać ostrzejszy obraz, dostosowując pozycję obiektywu za pomocą precyzyjnego elementu sterującego na ekranie dotykowym.
  10. W oprogramowaniu 3 przesuń stolik, aby ocenić poziom tła fluorescencyjnego w różnych obszarach powierzchni detekcji kanału przepływowego. Jeśli fluorescencja jest niska, kontynuuj eksperyment. Jeśli tło fluorescencyjne jest zbyt wysokie, rozważ odrzucenie kanału przepływu.
  11. W oprogramowaniu 2 zamknij migawkę lasera.
  12. Odpipetować bufor płuczący T50 z kanału przepływowego i natychmiast odpipetować 2x objętość biotynylowanego roztworu mRNA do kanału przepływowego. Inkubować przez 15 min.
    UWAGA: Dla każdej partii preparatu mRNA należy zbadać stężenia mRNA i czasy inkubacji w celu uzyskania gęstości powierzchniowej mRNA niezbędnej do wykrycia pojedynczej cząsteczki. Odpowiednia gęstość powierzchniowa mRNA pośredniczy w wiązaniu przeciwciał, które pokazuje plamki fluorescencyjne z nie więcej niż ~5% nakładaniem się (patrz Reprezentatywne wyniki). Jako punkt wyjścia zaleca się biotynylowane mRNA w stężeniu 2–20 nM.
  13. Przemyj kanał trzy razy, pipetując 3 razy objętość buforu kompatybilnego z translacją na pranie.

5. Składanie mieszanki translacyjnej i dostarczanie jej do kanału przepływowego w celu wykrywania pojedynczych cząsteczek

  1. Na lodzie zbierz 3x objętości translacji mix30 w probówce mikrowirówkowej zgodnie z protokołem translacji masowej z kroku 1.7, z wyjątkiem pominięcia mRNA i uzupełnienia zoptymalizowanym stężeniem przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Krótko obrócić probówkę mikrowirówkową, aby zebrać mieszaninę translacyjną na dnie probówki.
    UWAGA: Podczas ustalania testu badane są różne stężenia przeciwciał. Optymalne stężenie wskazuje na małe ilości nieswoistych przeciwciał wiążących się z powierzchnią detekcji i szybkie wiązanie przeciwciał z powstającym peptydem (patrz odpowiednio kroki 7.1 i 7.2 w celu uzyskania szczegółów kalibracji testu).
  2. Przenieś mieszaninę translacyjną do wnętrza nakrętki probówki do mikrofugi o pojemności 0,7 ml. Ustawić pompę strzykawkową w trybie wycofania. Włóż końcówkę rurki pompy do mieszanki translacyjnej. Rozpocząć pobieranie strzykawki, aby zebrać mieszaninę translacyjną do rurki pompy. Odwróć ustawienie pompy strzykawkowej do trybu dozowania i ustaw przepływ na optymalną szybkość dostarczania mieszanki tłumaczeniowej.
    UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków w mieszance translacyjnej podczas przenoszenia jej do rurki pompy. Unikaj wsuwania mieszanki translacyjnej zbyt głęboko do części rurki, która nie została zdezynfekowana i wypłukana w kroku 3.6. Podczas ustalania testu testowane są różne natężenia przepływu w celu określenia optymalnej szybkości (patrz krok 6.2, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat kalibracji testu).
  3. Jeśli między końcówką rurki a mieszaniną translacyjną jest przerwa, uruchom pompę strzykawkową i pozwól, aby mieszanina translacyjna dotarła do końca rurki, a następnie zatrzymaj pompę strzykawkową.
  4. Włóż końcówkę rurki pompy do wlotu kanału przepływowego. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do mieszanki tłumaczeniowej podczas wykonywania połączenia. Ustabilizuj połączenie, przykręcając wykonany na zamówienie metalowy wspornik do płytki uchwytu próbki mikroskopu. Oceń ostrość mikroskopu i fluorescencję obszaru obrazowania.
    UWAGA: Rurkę można zamocować do komory przepływowej za pomocą niestandardowej części, jak opisano wcześniej33. Do tego testu można również użyć innych typów systemów fluidycznych34. Pole widzenia powinno wyglądać podobnie przed i po podłączeniu rurki. Jeśli po połączeniu pojawi się więcej plam fluorescencyjnych, prawdopodobnie mieszanina translacyjna wycieka z rurki doprowadzającej. W zależności od zastosowania, kanał z wyciekłym miksem tłumaczeń może wymagać odrzucenia.
  5. Upewnij się, że parametry pozyskiwania filmu są poprawne i że została wprowadzona odpowiednia nazwa pliku i katalog do zapisania plików.
  6. Przesuń stół montażowy, aby zobrazować obszar znajdujący się na środku powierzchni wykrywania kanału przepływowego. Na ekranie dotykowym sterowania mikroskopem wybierz kartę Ciągły AF i kliknij przycisk Wyszukiwanie ostrości i Start, aby utrzymać pozycję ogniskowej podczas eksperymentu. Po pomyślnym osiągnięciu płaszczyzny ostrości słychać sygnał dźwiękowy.
  7. W oprogramowaniu 2 otwórz migawkę lasera. W oprogramowaniu 1 kliknij przycisk Take Signal (Weź sygnał), aby rozpocząć nagrywanie. Po około 5 sekundach nagrywania wprowadź polecenie Uruchom w Coolterm, aby dostarczyć miks tłumaczeniowy do kanału przepływu. Nagrywaj do 2 godzin z rozdzielczością 0,5–2 s/klatkę.
    UWAGA: Maksymalny zakres pozyskiwania danych zależy od tego, jak szybko ekstrakt translacyjny traci aktywność w czasie, co można wygodnie scharakteryzować, wykonując masową translację bez komórek za pomocą mRNA reportera lucyferazy i mierząc aktywność lucyferazy w reakcjach translacji w różnych punktach czasowych35.
  8. Po zakończeniu zbierania danych wyłącz laser, wyłącz ciągły AF na ekranie dotykowym sterowania mikroskopem i zdemontuj rurkę z komory przepływowej.
  9. Odpipetować mieszaninę translacyjną z wlotu kanału przepływowego, przenieść ją do probówki do mikrofuge i zatrzaskowo zamrozić roztwór, umieszczając probówkę w ciekłym azocie. Później przechowywać w temperaturze -80 °C.
  10. Umyj rurkę pompy strzykawkowej trzy razy wodą wolną od RNaz, a następnie trzy razy 70% etanolem. Pobrać 70% etanolu do rurki pompy strzykawkowej w celu przechowywania.
  11. Wyłącz mikroskop i wszystkie akcesoria. Posprzątaj.

6. Analiza danych

UWAGA: Analiza danych dla tego testu wymaga wspólnych metod w badaniach biofizycznych pojedynczych cząsteczek. Wszystkie kroki wymagające dużej mocy obliczeniowej można wykonać przy użyciu istniejących algorytmów i oprogramowania (poniżej znajdują się odniesienia do odpowiadających im kroków).

  1. Opcjonalnie: W razie potrzeby przekonwertuj pobrany plik serii obrazów na format zgodny z wybranym oprogramowaniem do przetwarzania obrazu lub językiem programowania.
  2. Określ punkt początkowy reakcji translacji i czas wymiany odczynnika.
    UWAGA: Ze względu na dyfuzyjne przeciwciała fluorescencyjne w mieszance translacyjnej, intensywność fluorescencji tła obrazowanego obszaru wzrośnie podczas wymiany odczynnika w kanale z bufora kompatybilnego z translacją do mieszaniny translacyjnej. Punkt początkowy reakcji translacji jest ustalany jako punkt czasowy, w którym wymiana odczynnika jest zakończona. Ten punkt zakończenia jest znajdowany poprzez pomiar intensywności fluorescencji tła podczas dostarczania mieszanki translacyjnej i zidentyfikowanie punktu czasowego, w którym wzrastająca intensywność fluorescencji utrzymuje się na stałym poziomie15, jak opisano poniżej.
    1. Oblicz całkowitą liczbę fluorescencji na klatkę obrazu i wykreśl odpowiedni profil czasowy. Zidentyfikuj nagły wzrost całkowitej fluorescencji na wykresie profilu czasowego.
      UWAGA: Całkowity wzrost fluorescencji wynika ze wzrostu stężenia przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie podczas wymiany odczynnika.
    2. Zidentyfikuj punkt końcowy fazy całkowitego wzrostu fluorescencji i ustaw ten punkt czasowy jako punkt początkowy (tj. czas 0) reakcji translacji. Zidentyfikuj zarówno punkt początkowy, jak i końcowy fazy całkowitego wzrostu fluorescencji i ustaw różnicę czasu jako czas wymiany odczynnika.
      UWAGA: Całkowity czas wymiany odczynnika zależy od wymiarów kanału przepływu i wybranego natężenia przepływu. Możliwe jest, że niektóre czynniki translacyjne mogą zacząć wiązać się z mRNA przed zakończeniem wymiany odczynnika, co może zmniejszyć rozdzielczość określonego czasu inicjacji pierwszej rundy. Dlatego zaleca się testowanie różnych natężeń przepływu podczas ustawiania testu i wybieranie natężeń przepływu, które umożliwiają zakończenie wymiany odczynnika w ciągu 3–4 s dla prędkości akwizycji danych 0,5–2 s/klatkę.
  3. Opcjonalnie: Wykonaj korekcję dryfu filmu.
    UWAGA: Pozycje związanych przeciwciał na obrazie danych mogą się zmieniać w czasie z powodu dryftu części i akcesoriów mikroskopu. Dryf, który jest wizualnie zauważalny w filmie, wymaga korekty przed przystąpieniem do dalszej analizy danych. Dostępnych jest kilka algorytmów i skryptów korekcji dryfu przestrzennego36,37,38.
    1. Na każdym obrazie znajdź lokalne maksima w liczbie pikseli, aby określić pozycje związanych przeciwciał w każdej klatce z dokładnością na poziomie pikseli. Ustaw próg liczby pikseli w taki sposób, aby wybierane były tylko te miejsca, które wyraźnie wystają poza szum tła.
    2. Oblicz zmiany poszczególnych pozycji przeciwciał w każdym kierunku między dwiema kolejnymi klatkami obrazu.
    3. Wykreśl histogram zmian położenia przeciwciał między dwiema kolejnymi ramkami i zrób to osobno dla każdego kierunku. Dopasuj Gaussa do każdego histogramu i ustaw środkową pozycję szczytów jako dryf kierunkowy między dwiema kolejnymi klatkami.
    4. Aby przeciwdziałać obserwowanemu dryfowi, przesuń każdą klatkę obrazu w przeciwnym kierunku o obliczoną wartość dryfu.
  4. Konstruowanie trajektorii pojedynczych cząsteczek.
    UWAGA: Dostępne jest oprogramowanie do wykrywania/śledzenia do identyfikacji jasnych punktów i wyodrębniania ich intensywności z danych obrazów series39,40.
    1. Zidentyfikuj pozycje przeciwciał zgodnie z opisem w kroku 6.3.1.
      UWAGA: Zaleca się kontrolę wzrokową w celu upewnienia się, że wybrany próg nie powoduje nadmiernego lub niedostatecznego wybierania cząstek. Oględziny można przeprowadzić poprzez nałożenie zidentyfikowanych pozycji środka ciężkości na każdą klatkę obrazu i wizualną ocenę ich zgodności (patrz Reprezentatywne wyniki).
    2. Połącz wybrane cząstki ze wszystkich ramek i usuń zbędne pozycje cząstek.
    3. Sprawdź wzrokowo obrazy związanych przeciwciał i wybierz kwadratowy obszar otaczający piksele z liczbami, które są wyraźnie powyżej tła i są reprezentatywne dla indywidualnie związanego przeciwciała.
      UWAGA: Funkcja rozrzutu punktowego (tj. rozmiar kwadratu dla pojedynczej cząsteczki) jest określana przez układ optyczny i rozmiar piksela detektora.
    4. Dla każdej pozycji cząstki skonstruuj trajektorię pojedynczej cząsteczki, obliczając całkowitą intensywność wszystkich pikseli w kwadratowym obszarze wokół pozycji cząstki. Trajektorie są konstruowane dla każdej pozycji, klatka po klatce i dla całego filmu z danymi.
  5. Opcjonalnie: Zastosuj nieliniowy filtr przód-tył41, aby zredukować szum tła w trajektoriach pojedynczych cząsteczek.
  6. Opcjonalnie: Digitalizacja trajektorii za pomocą istniejących algorytmów wykrywania kroków42,43,44,45.
    UWAGA: Wybór algorytmu detekcji krokowej zależy od złożoności dynamiki pojedynczej cząsteczki. W przypadku najprostszego scenariusza tylko izolowanej translacji rybosomów (tj. braku tworzenia się polisomów) i dobrego stosunku sygnału do szumu, zastosowanie progu do liczby fluorescencji jest wystarczające do określenia czasu zdarzeń wiązania i dysocjacji przeciwciał w trajektoriach pojedynczej cząsteczki. Zaleca się kontrolę wzrokową co najmniej 100 trajektorii dla każdego warunku w celu zapewnienia, że kroki trajektorii zostały odpowiednio wybrane za pomocą strategii wykrywania kroków.
  7. Określ czas pierwszego zdarzenia wiązania przeciwciał dla każdej trajektorii (tj. czas pierwszego przybycia, t1), używając trajektorii cyfrowych lub stosując próg do trajektorii niezdigitalizowanych.
    UWAGA: Wartość mediany rozkładu czasu pierwszego przyjazdu może być porównywana między różnymi warunkami translacji. Alternatywnie, rozkład czasu pierwszego przyjazdu można dopasować do przesuniętej (3-parametrowej) funkcji logarytmiczno-normalnej w celu wyznaczenia wartości średniej15 <t1>. Ponieważ rozkład czasu pierwszego przybycia jest zwykle skośny i ma długi ogon, nie należy obliczać średniej przez bezpośrednie uśrednianie obserwowanych czasów pierwszego przybycia.
  8. Opcjonalnie: Analiza czasu przebywania i obliczanie średniej szybkości syntezy peptydów.
    1. Użyj cyfrowych trajektorii, aby zidentyfikować zdarzenia translacji monosomu (pojedynczego rybosomu) w każdej trajektorii i obliczyć czasy przebywania pojedynczego zdarzenia wiązania jako różnicę czasu między odpowiadającymi im zdarzeniami wiązania i dysocjacji przeciwciał.
      UWAGA: Algorytmy detekcji krokowej do digitalizacji trajektorii są na ogół mniej niezawodne, gdy wiele zdarzeń molekularnych nakłada się na siebie w czasie. Dlatego zaleca się wykluczenie zdarzeń polisomowych z analizy czasu przebywania. W przypadku wysoce aktywnych systemów translacyjnych, które są wzbogacone o zdarzenia polisomowe i rzadko wykazują zdarzenia monosomowe, mieszaninę znakowanych i nieznakowanych przeciwciał można zastosować w celu zwiększenia szansy na zaobserwowanie izolowanych zdarzeń translacji w trajektoriach pojedynczych cząsteczek.
    2. Dopasuj rozkład do funkcji logarytmiczno-normalnej i użyj funkcji dopasowanej do obliczenia średniego czasu przebywania.
      UWAGA: Obliczanie średniej bezpośrednio przez uśrednianie obserwowanych czasów przebywania nie jest zalecane, ponieważ rozkłady czasu przebywania są zwykle skośne z długimi ogonami.
    3. Określ liczbę aminokwasów, które ulegają translacji w czasie przebywania wiązania przeciwciała, odejmując sumę długości aminokwasów epitopu i 35 (średnia długość aminokwasów powstającego peptydu w tunelu wyjściowym rybosomu) od całkowitej liczby kodonów ORF.
    4. Aby określić średnią szybkość syntezy peptydów, podziel liczbę translowanych aminokwasów przez średni czas przebywania.
  9. Opcjonalnie: Obliczanie średniego czasu inicjacji pierwszej rundy (<t1_I>).
    UWAGA: Warunki inicjacji i wydłużenia, takie jak kontekst sekwencji miejsca inicjacji i sekwencja kodująca, są na ogół celowo zachowywane do badań kinetyki inicjacji. W związku z tym średni czas pierwszego przyjazdu nie < 1> od kroku 6.7. Może być używany bezpośrednio do obliczania zmiany kinetyki inicjacji pierwszej rundy między różnymi warunkami. Poniższa korekta jest konieczna tylko do określenia rzeczywistej wartości czasu rozpoczęcia pierwszej rundy.
    1. Podziel sumę długości epitopu i 35 (średnia długość aminokwasu powstającego peptydu w tunelu wyjściowym rybosomu) przez średnią szybkość syntezy peptydów (z kroku 6.8.4.), aby obliczyć średni czas wydłużania peptydu w tym regionie N-końcowym (<t1_tag>).
    2. Ponieważ czas pierwszego przybycia jest sumą czasu inicjacji pierwszej rundy i t 1_tag, odejmij <t1_tag> od średniego czasu pierwszego przybycia <t1>, aby obliczyć średni czas inicjacji pierwszej rundy <t1_I>: <t1_I> = <t1> - <t1_tag>

7. Kalibracja testu

UWAGA: Wykonaj następujące kroki kalibracji podczas początkowego ustalania testu.

  1. Aby zbadać swoistość wiązania przeciwciała, wykonaj kroki protokołu w sekcjach 4 i 5 osobno dla nieoznakowanych i znakowanych mRNA (Rysunek 2). Poziomy wiązania przeciwciał w kanałach z tymi odpowiednimi mRNA reprezentują zakres niespecyficznego wiązania przeciwciała z powierzchnią detekcji i swoistego wiązania przeciwciała z powstającym peptydem.
    UWAGA: Zaleca się, aby stosunek wiązania swoistego do niespecyficznego wynosił >10 i może być zwiększony przy różnych strategiach pasywacji powierzchniowej, niższym stężeniu przeciwciał lub wyższej gęstości powierzchniowej mRNA.
  2. Aby zmierzyć szybkość wiązania przeciwciał, wykonaj protokół z dodatkowym krokiem między krokiem 4 a krokiem 5.
    1. Po kroku 4 inkubuj kanał z mieszaniną translacyjną, w której brakuje przeciwciał do wstępnego generowania kompleksów mRNA / rybosom / peptyd.
    2. Następnie przejdź do kroku 5 i wlej do kanału mieszaninę translacyjną uzupełnioną przeciwciałami.
    3. Określ ilościowo średnią szybkość wiązania przeciwciał z wstępnie wygenerowanym powstającym peptydem z wykładniczym dopasowaniem do histogramu czasu pierwszego przybycia.
      UWAGA: Wiązanie przeciwciała z wstępnie wygenerowanym peptydem powinno być szybkie, rzędu sekund i powinno być szybsze niż kinetyka translacji. Wyższe stężenie przeciwciał może być stosowane w celu zwiększenia szybkości wiązania przeciwciał.
  3. Fotostabilność przeciwciała znakowanego fluoroforem.
    1. Przygotuj szkiełko zgodnie z protokołem w kroku 2, ale pomiń etap PEGylacji. Zmontować komorę przepływową po etapie zasolenia. Powłoka silanowa umożliwia skuteczne wiązanie przeciwciał nieswoistych z powierzchnią detekcji.
    2. Dodaj przeciwciała znakowane fluorescencyjnie do kanału, aby uzyskać gęstość pojedynczej cząsteczki niespecyficznego przeciwciała wiążącego się z powierzchnią detekcji. Zacznij od dodania znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała, które jest silnie rozcieńczone w buforze płuczącym T50 i stopniowo zwiększaj stężenie przeciwciała, aż do uzyskania pożądanej gęstości pojedynczej cząsteczki.
    3. Zobrazuj powierzchnię detekcji do momentu, gdy większość fluorescencji przeciwciał nie będzie już wykrywalna.
    4. Wykreśl całkowitą liczbę widocznych przeciwciał w czasie, aby ocenić szybkość utraty fluorescencji przeciwciał w wyniku fotowybielania fluoroforowego.
      UWAGA: Znakowanie przeciwciałami zazwyczaj daje wiele fluoroforów na przeciwciało. Poszczególne przeciwciała pozostają wykrywalne, dopóki wszystkie sprzężone fluorofory nie ulegną fotowybielaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzeganie opisanego protokołu umożliwia obrazowanie indywidualnych interakcji przeciwciał z powstającymi N-końcowymi poligeptydami z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki podczas aktywnej, wolnej od komórek translacji 3' mRNA reporterowego na uwięzi (Rysunek 1). Przedstawiono minimalny eksperyment demonstracyjny z użyciem trzech syntetycznych mRNA: LUC (kodowanie nieoznakowanej lucyferazy), LUC FLAG (kodowanie lucyferazy znakowanej 3xFLAG) i hp-LUC<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z typowymi eksperymentami jednocząsteczkowymi TIRF in vitro, obrazowanie pojedynczych cząsteczek za pomocą opisanego tutaj testu jest dodatkowo skomplikowane ze względu na zastosowanie ekstraktu komórkowego i wysokie stężenie przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. W porównaniu z bardziej powszechną praktyką jednej rundy pegylacji powierzchniowej, druga runda PEGylacji (etap 2) znacznie zmniejsza wiązanie przeciwciał niespecyficznych z powierzchniąwykrywania 15. Wysokie stę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health [R01GM121847]; Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); oraz MSKCC Functional Genomics Initiative.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Obiektyw olejowy 100X, brak danych 1.49OlympusUAPON 100XOTIRF
Akrioamid/bis (40%, 19:1)Bio-Rad161-0144
Alkaliczny detergent w płynieDecon5332
Aminosilan (N-(2-aminoetylo)-3-aminopropylottrimetoksysilan)UCT Specialties, LLCA0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCDAndorDU-897U-CSO-#BV
Oprogramowanie Andor SolisAndorDo sterowania Andor EMCCD
Filtr pasmowo-przepustowyChroma532/640/25
Filtr pasmowo-przepustowyChromaNF03-405/488/532/635E-25
Biotyna-PEG-SVALaysan Bio IncBiotyna-PEG-SVA
Koenzym A wolny kwasProlume309-250
OprogramowanieDo sterowania pompą strzykawkową
Komputer stacjonarnyDellDo sterowania mikroskopem, kamerą, stolikiem i pompą.
Lustro dichroiczneSemrockR405/488/532/635
Mikropreparat Direct-zol RNA 50RNXFisher ScientificNC1139450
System testowy reporterowy z podwójną lucyferazyąPromegaE1910
EpoksydDevcon14250
Świetlik Lucyferyna D-Lucyferyna Wolny kwasProlume306-250
Lodowaty kwas octowyFisher ScientificBP1185500
Nadtlenek wodoruSigma-Aldrich216763-500ML
Olejek immersyjnyOlympusZ-81226Ao niskiej autofluorescencji
do transkrypcjiPromegaE1500
MEGASCRIPT T7Thermo fisherAM1334
MetanolFisher Mikroskop MMX04751
Scientific OlympusIX83
Szkiełko mikroskopoweThermo Scientific3048
Monoklonalny anty-FLAG M2-Cy3Sigma-AldrichA9594
mPEG-SVALaysan Bio IncmPEG-SVA-5000
MS(PEG)4Thermo Scientific22341
NaCl (5M)Mikroskop Thermo ScientificAM9760G
nr 1,5 Szkło osłonoweFisherband12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mMOlympus cyfrowy systemlaserowy CMR-LAS 532nm 100mW
Oprogramowanie Olympus TirfCtrlOlympusDo kontrolowania intensywności lasera i kąta padania
Stół optycznyKontrola drgań TMC63-563Z izolacją drgań
Mieszanina alkoholu izoamylowego chloroformu fenolowegoSigma-Aldrich77617-100ml
Zestaw do biotynylacji Pierce RNA 3' EndThermo Scientific20160
Granulki wodorotlenku potasuSigma-AldrichP1767-500G
Wcześniejszy zmotoryzowany etap translacji XYWcześniejszyPS3J100
Wcześniejszy Oprogramowanie PriorTestPriorDo kontrolowania wcześniejszego etapu zmotoryzowanego
Rekombinowany inhibitor RNazy RNasinPromegaN2515
Stage top InkubatorIn vivo scientific (world precision Instruments)98710-1Z niestandardową akrylową klatką
Słoik do barwieniaFisher Scientific08-817
StreptavidinThermo Scientific43-4301
Kwas siarkowyFisher ScientificA300212
SYBR zielony IIFisher ScientificS7564
StrzykawkaHamilton1725RN
Pompa strzykawkowaAparat Harvard55-3333
Tris (1M), pH = 7,0Thermo ScientificAM9850G
Kąpiel ultradźwiękowaBranson
MocznikSigma-AldrichU5378-500G
System zamykania krowiankiNew England BiolabsM2080S
Zymo ResearchC1004
Coolterm System oznaczania lucyferazy ZestawCPX1800H Zymo-Spin IC Kolumny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6(2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24(2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357(2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wi zanie przeciwcia fluorescencyjnychledzenie nowo powstaj cych polipeptyd wobrazowanie w czasie rzeczywistymtrajektorie pojedynczych cz steczekbezkom rkowy system translacjiimmobilizacja mRNAprzygotowanie kana u przep ywowego

Powiązane artykuły