Method Article

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

DOI:

10.3791/61655

⸱

August 29th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Department of Health, Animal Science and Food Safety and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, 2Department of Veterinary Medicine, University of Sassari, 3Department of Agricultural and Environmental Sciences - Production, Landscape, Agroenergy and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenotyp komórki może być odwrócony lub zmodyfikowany różnymi metodami, z zaletami i ograniczeniami, które są specyficzne dla każdej techniki. W tym artykule opisujemy nową strategię, która łączy wykorzystanie chemicznego wymazywania epigenetycznego ze wskazówkami związanymi z mechanosensoryzacją, w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków. Wymagane są dwa główne kroki. W pierwszym etapie dorosłe dojrzałe (nieuleczalnie zróżnicowane) komórki są poddawane działaniu epigenetycznej gumki 5-aza-cytydyny, aby wprowadzić je w stan pluripotencjalny. Ta część protokołu została opracowana w oparciu o rosnące zrozumienie mechanizmów epigenetycznych kontrolujących los i różnicowanie komórek, i obejmuje wykorzystanie modyfikatora epigenetycznego do usunięcia stanu różnicowania komórek, a następnie przejścia w przejściowe okno wysokiej plastyczności.

W drugim kroku, wymazane komórki są zamykane w mikro-bioreaktorach z politetrafluoroetylenu (PTFE), znanych również jako Płynne Kulki, aby promować przegrupowanie komórek 3D w celu rozszerzenia i stabilnego utrzymania uzyskanej wysokiej plastyczności. PTFE jest niereaktywnym hydrofobowym związkiem syntetycznym, a jego zastosowanie pozwala na stworzenie mikrośrodowiska komórkowego, czego nie można osiągnąć w tradycyjnych systemach hodowli 2D. System ten zachęca i wzmacnia utrzymanie pluripotencji poprzez sygnały związane z biomechanosensoryzacją.

Procedury techniczne opisane tutaj to proste strategie pozwalające na indukcję i utrzymanie stanu wysokiej plastyczności w dorosłych komórkach somatycznych. Protokół pozwolił na wyprowadzenie komórek o wysokiej plastyczności u wszystkich badanych gatunków ssaków. Ponieważ nie wiąże się z wykorzystaniem transfekcji genów i jest wolna od wektorów wirusowych, może stanowić znaczący postęp technologiczny w zastosowaniach medycyny translacyjnej. Co więcej, system mikrobioreaktorów stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych dzięki odtworzeniu in vitro specyficznego mikrośrodowiska, które pozwala na długoterminową hodowlę komórek o wysokiej plastyczności, a mianowicie jako ESC, iPSC, komórek wymazanych epigenetycznie i MSC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dziesięcioleci powszechnie akceptowana koncepcja jednokierunkowego postępu w kierunku zaangażowania i różnicowania komórek została całkowicie zmieniona. Wykazano, że specyfikacja komórki może zostać odwrócona, a kończalnie zróżnicowana komórka może zostać popchnięta w kierunku mniej zaangażowanego i bardziej permisywnego stanu, przy użyciu różnych metod.

Wśród kilku proponowanych metod, jedna z najbardziej obiecujących metod polega na użyciu związków chemicznych do indukowania komórek w tak zwanej chemicznie indukowanej pluripotencji. Małe cząsteczki stosowane w tym podejściu są w stanie oddziaływać i modyfikować sygnaturę epigenetyczną dorosłej dojrzałej komórki, unikając potrzeby stosowania jakiegokolwiek wektora transgenicznego i/lub wirusowego1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Liczne badania wykazały ostatnio, że możliwe jest przełączanie komórek z jednego fenotypu na drugi poprzez dostarczanie określonych bodźców biochemicznych i biologicznych, które indukują reaktywację hipermetylowanych genów11,12,13,14,15. Te zdarzenia demetylacji pozwalają na przekształcenie kończnie zróżnicowanych komórek w prymitywnego przodka, komórkę multipotencjalną lub o wysokiej plastyczności/pluripotencjalną1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Równolegle, wiele badań skupia się ostatnio na zrozumieniu sygnałów związanych z mechanosensoringiem, a dokładniej na możliwości wykorzystania sił mechanicznych do bezpośredniego wpływania na plastyczność i/lub różnicowanie komórek16,17,18,19. Rzeczywiście, wyraźnie wykazano, że macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w kontroli losu komórki. W szczególności sygnały biomechaniczne i biofizyczne wytwarzane przez ECM bezpośrednio regulują mechanizmy molekularne i szlaki sygnałowe, wpływając na zachowanie i funkcje komórek20,21. Najnowsze dane utorowały drogę do opracowania nowatorskich systemów hodowli 3D, które lepiej naśladują mikrośrodowisko komórkowe in vivo, replikując bodźce mechaniczne i fizyczne wpływające na zachowanie komórek.

Opisujemy tutaj dwuetapowy protokół, który łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoringiem, w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków. W pierwszym etapie komórki są inkubowane z cząsteczką demetylującą 5-aza-cytydynę (5-aza-CR). Czynnik ten jest w stanie wywołać znaczącą globalną demetylację DNA poprzez połączony efekt bezpośredniego działania za pośrednictwem translokacji 10-jedenaście 2 (TET2)8,10 oraz pośrednie hamowanie metylotransferaz DNA (DNMT)22,23. Ten krok indukuje usunięcie blokad epigenetycznych, a następnie reaktywację ekspresji genów związanych z pluripotencją, a tym samym generowanie komórek o wysokiej plastyczności1,2,3,8,10, zwane dalej "komórkami wymazanymi epigenetycznie". W drugim etapie komórki są zamykane w systemie hodowli 3D. W tym celu jako mikrobioreaktor zastosowano niereaktywny hydrofobowy związek syntetyczny politetrafluoroetylen (PTFE; o wielkości cząstek 1 μm), który pozwala na stworzenie mikrośrodowiska komórkowego nieosiągalnego przy użyciu tradycyjnych systemów hodowli 2D10. Cząsteczki proszku PTFE przylegają do powierzchni kropli cieczy, w której komórki są ponownie zawieszane i izolują ciekły rdzeń od powierzchni nośnej, umożliwiając jednocześnie wymianę gazową między wewnętrzną cieczą a otaczającym środowiskiem24. Uzyskany w ten sposób "mikrobioreaktor PTFE", znany również jako "płynny marmur", zachęca komórki do swobodnej interakcji ze sobą, promując rearanżację komórek 3D25,26,27, oraz rozszerza i stabilnie utrzymuje nabyty stan wysokiej plastyczności dzięki sygnałom związanym z biomechanosensoringiem10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Uniwersytetu w Mediolanie. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, opublikowanym przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH). Izolacja komórek ludzkich od zdrowych dorosłych osób została zatwierdzona przez Komisję Etyczną Ospedale Maggiore Policlinico w Mediolanie. Wszystkie metody w naszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.

1. Izolacja fibroblastów skóry

UWAGA: Wszystkie opisane poniżej procedury mogą być stosowane do fibroblastów wyizolowanych od różnych gatunków ssaków, w tym myszy, świń i ludzi. Komórki mysie wyizolowano od 7-tygodniowych samców myszy, a tkankę skórną świń pobrano w lokalnej rzeźni. Komórki ludzkie izolowano od dorosłych pacjentów, po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody.

  1. Przygotować 0,1% roztwór żelatyny wieprzowej.
    1. Odważyć 0,1 g żelatyny wieprzowej i rozpuścić ją w 100 ml wody. Przed użyciem wysterylizuj roztwór żelatyny przez autoklawowanie.
    2. Pokryć szalkę Petriego o średnicy 35 mm 0,1% żelatyną wieprzową, dodając 1,5 ml przygotowanego roztworu. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  2. Wytnij biopsje skóry ssaków (myszy, świń i ludzi) o długości około 2-5 cm i umieść je w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) firmy Dulbecco zawierającym 2% antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy. Przechowywać w temperaturze + 4 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Pobieranie biopsji musi być przeprowadzone w porozumieniu i po zatwierdzeniu przez Komisję Etyczną, zgodnie z ustalonymi wytycznymi.
  3. Pobrane biopsje należy dokładnie umyć trzykrotnie w świeżym, sterylnym PBS zawierającym 2% antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy.
  4. Pobrać biopsje z ostatniego płukania i umieścić je na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Za pomocą sterylnego skalpela pokrój je na kawałki o wielkości około 2mm3.
  5. Pod koniec 2-godzinnej inkubacji usunąć nadmiar roztworu żelatyny z płytki Petriego o średnicy 35 mm (opisanej w kroku 1.1.2) i za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej natychmiast umieścić 5-6 fragmentów skóry w każdej wstępnie pokrytej szalce hodowlanej.
  6. Zwilż fragmenty, dodając 100 μl kropelek pożywki izolacyjnej fibroblastów (Tabela 1) na każdy z nich. Hodowla w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
    UWAGA: Aby zapobiec parowaniu pożywki, umieść szalkę Petriego o średnicy 35 mm w szalce Petriego o średnicy 100 mm lub większej zawierającej sterylną wodę. Upewnij się, że obie szalki Petriego zostały zakryte.
  7. Po 24 godzinach hodowli sprawdzić ilość pożywki na szalce Petriego o średnicy 35 mm. W razie potrzeby dodaj 500 μl pożywki izolacyjnej fibroblastów, aby fragmenty były mokre.
  8. Ostrożnie wyjmij pożywkę i odświeżaj ją co najmniej co 2 dni hodowli za pomocą pipety.
  9. Kiedy fibroblasty zaczynają wyrastać z fragmentów skóry umieszczonych na szalce Petriego o średnicy 35 mm (opisanej w kroku 1.5) i zaczynają tworzyć monowarstwę komórkową (zwykle 6 dni). Usuń kawałki skóry za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej i posiewu w 2 ml pożywki do izolacji fibroblastów.
  10. Kontynuować hodowlę monowarstwy komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 aż do 80% zbiegu i odświeżać pożywkę co drugi dzień.

2. Hodowla pierwotnej linii komórkowej fibroblastów

  1. Gdy fibroblasty osiągną 80% konfluencji, ostrożnie usuń pożywkę izolacyjną fibroblastów i trzykrotnie przemyj komórki 3 ml PBS zawierającego 1% antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy.
  2. W celu odłączenia komórek dodać 600 μl 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do naczynia hodowlanego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
  3. Dodaj 5,4 ml pożywki do hodowli fibroblastów, aby zneutralizować trypsynę, gdy komórki zaczną odłączać się od szalki hodowlanej (Tabela 1).
  4. Usunąć komórki przez wielokrotne i delikatne pipetowanie. Płytki w nowych szalkach hodowlanych (bez żelatyny), utrzymując stosunek pasażu między 1:2 a 1:4 (w zależności od szybkości wzrostu).
    UWAGA: Wirowanie nie jest konieczne.
  5. Utrzymuj komórki w hodowli i zmieniaj pożywkę co 2 dni, aż osiągną 80% zbiegu i przejdą je.
    UWAGA: Rozmnażaj fibroblasty dwa razy w tygodniu, aby utrzymać energiczny wzrost.

3. Narażenie fibroblastów na 5-aza-CR

  1. Przygotować świeży 1 mM roztwór podstawowy 5-aza-CR.
    1. Odważ 2,44 mg 5-aza-CR i rozpuść go w 10 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Ponownie zawiesić proszek przez wirowanie. Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra 0,22 μm.
      UWAGA: Roztwór podstawowy 5-aza-CR należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
    2. Przygotować roztwór roboczy 5-aza-CR, rozcieńczając 1 μl roztworu podstawowego 5-aza-CR (3.1.1.) w 1 ml pożywki do hodowli fibroblastów.
      UWAGA: Stężenie roztworu roboczego 5-aza-CR wynosi 1 μM1,2,3,8,9.
  2. Trypsynizować komórki zgodnie z wcześniejszym opisem (2.1.-2.3.) i usuwać komórki poprzez wielokrotne i delikatne pipetowanie.
  3. Zebrać zawiesinę komórkową i przenieść ją do stożkowej probówki.
  4. Policz komórki za pomocą komory liczącej pod mikroskopem optycznym w temperaturze pokojowej. Obliczyć objętość pożywki potrzebną do ponownego zawieszenia komórek w celu uzyskania 4 x 104 komórek w 30 μl pożywki do hodowli fibroblastów uzupełnionej 1 μM 5-aza-CR (patrz krok 3.1.2.).
    UWAGA: Formuła, którą należy zastosować, zależy od konkretnego typu komory.
    figure-protocol-1
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 150 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą pożywki do hodowli fibroblastów uzupełnionej 1 μM 5-aza-CR (patrz krok 3.1.2.). Objętość pożywki do hodowli fibroblastów, która ma być użyta, patrz krok 3.4.
    UWAGA: Jako kontrolę ujemną, ponownie zawiesić komórki w tym samym stężeniu w pożywce hodowlanej fibroblastów bez 5-aza-CR i kontynuować enkapsulację komórek w proszku PTFE (krok 4.1.-4.13.).

4. Hermetyzacja fibroblastów w mikrobioreaktorach PTFE

  1. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 35 mm proszkiem politetrafluoroetylenu (PTFE), aby uzyskać łoże (Rysunek 1A).
    UWAGA: Używaj bakteriologicznych szalek Petriego o średnicy 35 mm, aby uniknąć przywierania płynnego marmuru. Aby uzyskać cienką hydrofobową i porowatą powłokę, należy użyć proszku PTFE o średniej wielkości cząstek 1 μm i wytwarzanego z maksymalnym zmieleniem 2,0 NPIRI. Pozwala to na tworzenie płynnych kulek przepuszczających gaz. Ponadto półprzezroczysta powłoka ułatwia obserwację procesów agregacji komórek w czasie rzeczywistym Większy rozmiar cząstek prowadzi do wysokiej polidyspersyjności, która może powodować zwiększone parowanie, deformację i utratę kulistego kształtu oraz przedwczesne rozpuszczanie mikrobioreaktorów.
  2. Dozować 30 μl pojedynczą kroplę zawierającą 4 x 104 komórek (patrz kroki 3.4.- 3.5.) na łoże proszku (Rysunek 1B).
  3. Delikatnie obracaj szalkę Petriego o średnicy 35 mm ruchem okrężnym, aby upewnić się, że proszek PFTE całkowicie pokrywa powierzchnię kropli cieczy, tworząc mikrobioreaktor z ciekłego marmuru (Rysunek 1C).
  4. Pobrać mikrobioreaktor z płynnego marmuru za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, naciętej na krawędzi, aby dostosować ją do średnicy marmuru (Rysunek 1D,E). Umieść mikrobioreaktor z płynnego marmuru na czystej bakteriologicznej szalce Petriego, aby go ustabilizować (Rysunek 1F).
    UWAGA: Aby wytworzyć tarcie w celu uchwycenia kulki wewnątrz końcówki, odetnij końcówki pipet o średnicy około nieco mniejszej niż średnica płynnej kulki.
  5. Przenieś mikrobioreaktor z ciekłym marmurem z szalki Petriego na płytkę 96-dołkową (jedna kulka/studzienka) (Rysunek 1G).
  6. Powoli dodawać 100 μl pożywki z brzegu studzienki. Mikrobioreaktor zaczyna unosić się na powierzchni pożywki (Rysunek 1H).
    UWAGA: Mikrobioreaktor pęka w bezpośrednim kontakcie z cieczą z powodu zakłócenia hydrofobowości PTFE. Alternatywnym podejściem jest umieszczenie mikrobioreaktorów z płynnego marmuru w naczyniu bakteriologicznym o średnicy 35 mm. W takim przypadku, aby zapobiec parowaniu ciekłego marmuru, płytka Petriego o średnicy 35 mm zawierająca mikrobioreaktor musi zostać umieszczona na płytce Petriego o średnicy 100 mm, uprzednio podzielonej na porcje sterylnej wody
  7. Inkubuj mikrobioreaktor z płynnego marmuru przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 1,2,3,8,9.
    UWAGA: Wielkość cząstek PTFE wynosząca 1 μm może zapewnić optymalną wymianę gazową między cieczą wewnętrzną a otaczającym środowiskiem.
  8. Po inkubacji 5-aza-CR przez 18 godzin, zebrać mikrobioreaktor z płynnego marmuru za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl naciętej na krawędzi (patrz krok 4.5).
  9. Umieść mikrobioreaktor na nowej bakteriologicznej szalce Petriego o średnicy 35 mm (Rysunek 1D-F).
  10. Użyj igły, aby przebić płynny marmur i rozbić go.
  11. Odzyskaj uformowane sferoidy za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl, naciętej na krawędzi, pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 1I,J).
    UWAGA: Epigenetycznie wymazane komórki zamknięte w PTFE tworzą sferyczną strukturę 3D (po jednym kruszywie w każdym płynnym marmurze).
  12. Aby ocenić nabycie stanu pluripotencjalnego w odpowiedzi na 5-aza-CR, sprawdź początek ekspresji genów związanych z pluripotencją, OCT4, NANOG, REX1 i SOX2, za pomocą jakościowego PCR (Tabela 2).
  13. Postępuj zgodnie z drugim krokiem protokołu, jak opisano poniżej.

5. Hodowla w mikrobioreaktorach PTFE komórek wymazanych epigenetycznie

  1. Przygotować świeżą pożywkę hodowlaną ESC (tabela 1).
  2. Przenieść organoidy na płytkę Petriego zawierającą pożywkę ESC do przemywania pozostałości 5-aza-CR (patrz kroki 5.1.-5.2.).
  3. Przygotować nową bakteriologiczną szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą łoże proszku PTFE (patrz również krok 4.1.).
  4. Dozować pojedynczy organoid w postaci kropli 30 μl pożywki hodowlanej ESC na łoże proszku za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl, przeciętej na krawędzi (patrz kroki 4.9.; pkt 5.3.).
  5. Delikatnie obrócić szalkę Petriego o średnicy 35 mm ruchem okrężnym, aby utworzyć nowy mikrobioreaktor z ciekłego marmuru, podnieść go za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, przeciąć krawędź i umieścić nowo utworzony mikrobioreaktor w studzience z 96-dołkową płytką (jedna kulka/studzienka) (patrz kroki 4.3.-4.6.).
  6. Aby unosić mikrobioreaktory na wodzie, należy dodać 100 μl pożywki z brzegu studzienki, aby powoli kąpać marmur (zob. uwaga 4.7).
  7. Hodować mikrobioreaktory z płynnego marmuru w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 tak długo, jak jest to wymagane. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, postępując zgodnie z procedurą opisaną w 5.3.-5.7.
    UWAGA: W niniejszym manuskrypcie przedstawiono wyniki uzyskane z hodowlą organoidów przez 28 dni. Jednak w razie potrzeby można przeprowadzić dłuższy okres hodowli.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje wszystkie kroki, które należy wykonać, aby wygenerować i stabilnie utrzymać komórki pluripotencjalne ssaków z dorosłych komórek somatycznych. Metoda ta okazała się skuteczna w przypadku fibroblastów wyizolowanych od różnych gatunków ssaków, a mianowicie myszy, świń i ludzi. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki uzyskano ze wszystkich linii komórkowych, niezależnie od gatunku pochodzenia.

Analizy morfologiczne pokazują, że po 18 godzinach inkubacji ze środkiem demet...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dziesięcioleci kilka badań koncentrowało się na opracowaniu strategii przywracania terminalnie zróżnicowanej komórki w kierunku mniej zaangażowanego i bardziej permisywnego stanu. Opisany tutaj protokół pozwala na wytwarzanie i długoterminowe utrzymywanie komórek pluripotencjalnych, począwszy od dojrzałych, terminalnie zróżnicowanych komórek dorosłych. Metoda łączy w sobie dwa niezależne etapy, które polegają na indukcji stanu wysokiego permisywnego, który osiąga się poprzez chemiczne wymazywanie epigen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Carraresi i MiND FoodS Hub ID: 1176436. Wszyscy autorzy są członkami COST Action CA16119 In vitro 3-D Total Cell guidance and Fitness (CellFit).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM7522Składnik pożywki ESC
5-AzacytydynaSigma-AldrichA23855-aza-CR, do epigenetycznego usuwania fibroblastów
AdenozynaSigma-AldrichA4036Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC
Antybiotyk Roztwór przeciwgrzybiczy (100& razy;)Sigma-AldrichA5955Składnik pożywki fibroblastów i ESC
CFX96 Real-Time PCRBio-Rad LaboratoriesNATermocykler do ilościowego PCR
CytydynaSigma-AldrichC4654Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC
DMEM, wysoka glukoza, pirogronianThermo Fisher Scientific41966052Do izolacji fibroblastów i pożywki
hodowlanejDMEM, niska glukoza, pirogronianThermo Fisher Scientific31885023Dla ESC medium
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichD5652PBS; do biopsji i przemywania komórek oraz do przygotowania roztworu
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021Estraction mRNA
ESGRO Rekombinowane mysie białko LIFSigma-AldrichESG1106Składnik pożywki ESC
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznieThermo Fisher Scientific10500064Składnik pożywki dla fibroblastów i ESC
FGF-Basic (AA10-155) Rekombinowane białko ludzkieThermo Fisher ScientificPHG0024Składnik pożywki ESC
Żelatyna ze skóry świniSigma-AldrichG1890Do powlekania naczyń
GeneAmp PCR System 2700Applied BiosystemsNATermocykler do jakościowego PCR
Globalna metylacja DNA ELISA ZestawCELL BIOLABSSTA-380Badanie metylacji
GoTaq G2 Flexi DNA PolimerazaPromegaM7801Jakościowy PCR
GuanozynaSigma-AldrichG6264Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC
Mieszanka odżywcza Ham's F-10Thermo Fisher Scientific31550031Do podłoża ESC
Zamiennik serum do nokautowaniaThermo Fisher Naukowe10828028Składnik podłoża ESC
KOVA Glasstic Slide 10 z siatkamiHycor Biomedical87144Do liczenia komórek
Mikroskop stereoskopowy Leica MZ APOLeicaNADo obserwacji organoidów
Roztwór L-glutaminySigma-AldrichG7513Składnik pożywek fibroblastów i ESC
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Thermo Fisher Scientific11140035Składnik podłoża ESC
Millex-GS 0,22 µ m filtry poroweMilliporeSLGS033SBDo sterylizacji roztworem
M-MLV Odwrotna transkryptaza, RNaza H Minus, Point MutantPromegaM3681Odwrotna transkrypcja mRNA Multiskan
FC Microplate FotometrThermo Fisher Scientific51119000Do odczytu płytki ELISA
Nikon Eclipse TE300 Mikroskop kontrastowy z odwróconą faząNikonNADo komórki obserwacja
Perkin Elmer Thermal Cycler 480Perkin ElmerNATermocykler do odwrotnej transkrypcji
Poli(tetrafluoroetylen) 1 μ m Wielkość cząstekSigma-Aldrich430935Do generowania mikrobioreaktora
PureLink Genomic DNA Mini KitThermo Fisher ScientificK182001Ekstrakcja genomicznego DNA
Zestaw TaqMan Gene Expression Cells-to-CT ThermoFisher ScientificAM1728Ilościowy PCR
TymidynaSigma-AldrichT1895Składnik mieszanki nukleozydów do pożywki ESC
Naczynie do hodowli tkankowych 100X20 mm, standardowe833902 SarstedtDo izolacji fibroblastów
Naczynie do hodowli tkankowych 35X10 mm, StandardSarstedt833900Do izolacji fibroblastów
Naczynie do hodowli tkankowych 35X10 mm, zawiesinaSarstedt833900500Bakteriologia szalka Petriego do hodowli płynnego marmuru
Płytka do hodowli tkanek 96 Well, Standard, FSarstedt833924005Do hodowli płynnego marmuru
Roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT3924Do dysocjacji fibroblastów
Probówka 15ml, 120x17mm, PSSarstedt62553041Do wirowania zawiesiny komórkowej
UrydynaSigma-AldrichU3003Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  2. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
  3. Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
  4. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
  5. Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333(2015).
  6. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
  7. Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
  8. Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017(2016).
  9. Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
  10. Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
  11. Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
  12. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  13. Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
  14. Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
  15. Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
  16. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).
  17. Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
  18. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).
  19. Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
  20. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
  21. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  22. Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
  23. Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
  24. Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  25. Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083(2015).
  26. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).
  27. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).
  28. Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
  29. Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
  30. Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epigenetic ModificationBiomechanical CuesPluripotent Cells5 Aza CytidinePTFE Micro BioreactorsLiquid MarblesCell RearrangementPluripotency MaintenanceDNA Methylation AnalysisMorphological Analysis

Related Articles