Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61655

⸱

29 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Department of Health, Animal Science and Food Safety and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, 2Department of Veterinary Medicine, University of Sassari, 3Department of Agricultural and Environmental Sciences - Production, Landscape, Agroenergy and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Streszczenie

Fenotyp komórki może być odwrócony lub zmodyfikowany różnymi metodami, z zaletami i ograniczeniami, które są specyficzne dla każdej techniki. W tym artykule opisujemy nową strategię, która łączy wykorzystanie chemicznego wymazywania epigenetycznego ze wskazówkami związanymi z mechanosensoryzacją, w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków. Wymagane są dwa główne kroki. W pierwszym etapie dorosłe dojrzałe (nieuleczalnie zróżnicowane) komórki są poddawane działaniu epigenetycznej gumki 5-aza-cytydyny, aby wprowadzić je w stan pluripotencjalny. Ta część protokołu została opracowana w oparciu o rosnące zrozumienie mechanizmów epigenetycznych kontrolujących los i różnicowanie komórek, i obejmuje wykorzystanie modyfikatora epigenetycznego do usunięcia stanu różnicowania komórek, a następnie przejścia w przejściowe okno wysokiej plastyczności.

W drugim kroku, wymazane komórki są zamykane w mikro-bioreaktorach z politetrafluoroetylenu (PTFE), znanych również jako Płynne Kulki, aby promować przegrupowanie komórek 3D w celu rozszerzenia i stabilnego utrzymania uzyskanej wysokiej plastyczności. PTFE jest niereaktywnym hydrofobowym związkiem syntetycznym, a jego zastosowanie pozwala na stworzenie mikrośrodowiska komórkowego, czego nie można osiągnąć w tradycyjnych systemach hodowli 2D. System ten zachęca i wzmacnia utrzymanie pluripotencji poprzez sygnały związane z biomechanosensoryzacją.

Procedury techniczne opisane tutaj to proste strategie pozwalające na indukcję i utrzymanie stanu wysokiej plastyczności w dorosłych komórkach somatycznych. Protokół pozwolił na wyprowadzenie komórek o wysokiej plastyczności u wszystkich badanych gatunków ssaków. Ponieważ nie wiąże się z wykorzystaniem transfekcji genów i jest wolna od wektorów wirusowych, może stanowić znaczący postęp technologiczny w zastosowaniach medycyny translacyjnej. Co więcej, system mikrobioreaktorów stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych dzięki odtworzeniu in vitro specyficznego mikrośrodowiska, które pozwala na długoterminową hodowlę komórek o wysokiej plastyczności, a mianowicie jako ESC, iPSC, komórek wymazanych epigenetycznie i MSC.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dziesięcioleci powszechnie akceptowana koncepcja jednokierunkowego postępu w kierunku zaangażowania i różnicowania komórek została całkowicie zmieniona. Wykazano, że specyfikacja komórki może zostać odwrócona, a kończalnie zróżnicowana komórka może zostać popchnięta w kierunku mniej zaangażowanego i bardziej permisywnego stanu, przy użyciu różnych metod.

Wśród kilku proponowanych metod, jedna z najbardziej obiecujących metod polega na użyciu związków chemicznych do indukowania komórek w tak zwanej chemicznie indukowanej pluripotencji. Małe cząsteczki stosowane w tym podejściu są w stanie oddziaływać i modyfikować sygnaturę epigenetyczną dorosłej dojrzałej komórki, unikając potrzeby stosowania jakiegokolwiek wektora transgenicznego i/lub wirusowego1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Liczne badania wykazały ostatnio, że możliwe jest przełączanie komórek z jednego fenotypu na drugi poprzez dostarczanie określonych bodźców biochemicznych i biologicznych, które indukują reaktywację hipermetylowanych genów11,12,13,14,15. Te zdarzenia demetylacji pozwalają na przekształcenie kończnie zróżnicowanych komórek w prymitywnego przodka, komórkę multipotencjalną lub o wysokiej plastyczności/pluripotencjalną1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Równolegle, wiele badań skupia się ostatnio na zrozumieniu sygnałów związanych z mechanosensoringiem, a dokładniej na możliwości wykorzystania sił mechanicznych do bezpośredniego wpływania na plastyczność i/lub różnicowanie komórek16,17,18,19. Rzeczywiście, wyraźnie wykazano, że macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w kontroli losu komórki. W szczególności sygnały biomechaniczne i biofizyczne wytwarzane przez ECM bezpośrednio regulują mechanizmy molekularne i szlaki sygnałowe, wpływając na zachowanie i funkcje komórek20,21. Najnowsze dane utorowały drogę do opracowania nowatorskich systemów hodowli 3D, które lepiej naśladują mikrośrodowisko komórkowe in vivo, replikując bodźce mechaniczne i fizyczne wpływające na zachowanie komórek.

Opisujemy tutaj dwuetapowy protokół, który łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoringiem, w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków. W pierwszym etapie komórki są inkubowane z cząsteczką demetylującą 5-aza-cytydynę (5-aza-CR). Czynnik ten jest w stanie wywołać znaczącą globalną demetylację DNA poprzez połączony efekt bezpośredniego działania za pośrednictwem translokacji 10-jedenaście 2 (TET2)8,10 oraz pośrednie hamowanie metylotransferaz DNA (DNMT)22,23. Ten krok indukuje usunięcie blokad epigenetycznych, a następnie reaktywację ekspresji genów związanych z pluripotencją, a tym samym generowanie komórek o wysokiej plastyczności1,2,3,8,10, zwane dalej "komórkami wymazanymi epigenetycznie". W drugim etapie komórki są zamykane w systemie hodowli 3D. W tym celu jako mikrobioreaktor zastosowano niereaktywny hydrofobowy związek syntetyczny politetrafluoroetylen (PTFE; o wielkości cząstek 1 μm), który pozwala na stworzenie mikrośrodowiska komórkowego nieosiągalnego przy użyciu tradycyjnych systemów hodowli 2D10. Cząsteczki proszku PTFE przylegają do powierzchni kropli cieczy, w której komórki są ponownie zawieszane i izolują ciekły rdzeń od powierzchni nośnej, umożliwiając jednocześnie wymianę gazową między wewnętrzną cieczą a otaczającym środowiskiem24. Uzyskany w ten sposób "mikrobioreaktor PTFE", znany również jako "płynny marmur", zachęca komórki do swobodnej interakcji ze sobą, promując rearanżację komórek 3D25,26,27, oraz rozszerza i stabilnie utrzymuje nabyty stan wysokiej plastyczności dzięki sygnałom związanym z biomechanosensoringiem10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania zostały przejrzane i zatwierdzone przez Komisję Etyczną Uniwersytetu w Mediolanie. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, opublikowanymi przez Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH) w USA. Izolacja ludzkich komórek od zdrowych dorosłych osób została zatwierdzona przez Komisję Etyczną Ospedale Maggiore Policlinico w Mediolanie. Wszystkie metody zastosowane w naszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.

1. Izolacja fibroblastów skóry

UWAGA: Wszystkie opisane poniżej procedury można zastosować do fibroblastów wyizolowanych z różnych gatunków ssaków, w tym myszy, świni i ludzi. Komórki mysie wyizolowano od 7-tygodniowych samców myszy, a tkankę skóry świńskiej pobrano w lokalnej rzeźni. Komórki ludzkie wyizolowano od pacjentów dorosłych po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody.

  1. Przygotować 0,1% roztwór żelatyny wieprzowej.
    1. Odważyć 0,1 g żelatyny wieprzowej i rozpuścić ją w 100 mL wody. Przed użyciem roztwór żelatyny wysterylizować w autoklawie.
    2. Szalkę Petriego o średnicy 35 mm pokryć 0,1% żelatyną wieprzową, dodając 1,5 mL przygotowanego roztworu. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej.
  2. Wyciąć biopsje skóry ssaków (mysiej, wieprzowej i ludzkiej) o długości około 2-5 cm i umieścić je w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (PBS) zawierającym 2% roztwór antybiotyku i antymykotyku. Przechowywać w temperaturze + 4 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Pobieranie biopsji musi być przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i po uzyskaniu zgody Komisji Etycznej.
  3. Zebrane biopsje dokładnie przemyć trzykrotnie w świeżym, sterylnym PBS zawierającym 2% roztwór antybiotyku i antymykotyku.
  4. Biopsje z ostatniego płukania zebrać i umieścić w sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Za pomocą sterylnego skalpela pociąć je na fragmenty o wielkości około 2 mm3.
  5. Po 2 h inkubacji usunąć nadmiar roztworu żelatyny z szalki Petriego o średnicy 35 mm (opisanej w kroku 1.1.2) i za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej natychmiast umieścić 5-6 fragmentów skóry w każdej uprzednio pokrytej szalce hodowlanej.
  6. Nawilżyć fragmenty, dodając po 100 µL kropli pożywki do izolacji fibroblastów (Tabela 1) na każdy z nich. Hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.
    UWAGA: Aby zapobiec odparowaniu pożywki, szalkę Petriego o średnicy 35 mm umieścić w szalce Petriego o średnicy 100 mm lub większej, zawierającej sterylną wodę. Należy pamiętać o zamknięciu obu szalek.
  7. Po 24 h hodowli sprawdzić ilość pożywki w hodowlanej szalce Petriego o średnicy 35 mm. W razie potrzeby dodać 500 µL pożywki do izolacji fibroblastów, aby utrzymać nawilżenie fragmentów.
  8. Ostrożnie usunąć pożywkę i odświeżać ją za pomocą pipety co najmniej co 2 dni hodowli.
  9. Gdy fibroblasty zaczną wyrastać z fragmentów skóry umieszczonych w szalce Petriego o średnicy 35 mm (opisanej w kroku 1.5.) i zaczną tworzyć monowarstwę komórkową (zwykle po 6 dniach), usunąć fragmenty skóry za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej i hodować w 2 mL pożywki do izolacji fibroblastów.
  10. Kontynuować hodowlę monowarstwy komórkowej w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 aż do osiągnięcia 80% konfluencji, odświeżając pożywkę co drugi dzień.

2. Hodowla pierwotnej linii komórkowej fibroblastów

  1. Gdy fibroblasty osiągną 80% konfluencji, ostrożnie usunąć pożywkę do izolacji fibroblastów i przemyć komórki trzykrotnie 3 mL PBS zawierającego 1% roztwór antybiotyków i przeciwgrzybików.
  2. W celu odklejenia komórek dodać do naczynia hodowlanego 600 µL 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 min.
  3. Gdy komórki zaczną odklejać się od naczynia hodowlanego, dodać 5,4 mL pożywki do hodowli fibroblastów, aby zneutralizować trypsynę (Tabela 1).
  4. Odczepić komórki poprzez wielokrotne i delikatne pipetowanie. Przesiać komórki do nowych naczyń hodowlanych (bez żelatyny), zachowując stosunek pasażowania od 1:2 do 1:4 (w zależności od szybkości wzrostu).
    UWAGA: Wirowanie nie jest konieczne.
  5. Utrzymywać komórki w kulturze i wymieniać pożywkę co 2 dni, aż osiągną 80% konfluencji, a następnie przeprowadzić pasaż.
    UWAGA: Pasażować fibroblasty dwa razy w tygodniu, aby utrzymać intensywny wzrost.

3. Ekspozycja fibroblastów na 5-aza-CR

  1. Przygotuj świeży roztwór zapasowy 5-aza-CR o stężeniu 1 mM.
    1. Odważ 2,44 mg 5-aza-CR i rozpuść w 10 ml DMEM z wysoką zawartością glukozy. Resuspenduj proszek za pomocą wstrząsarki vortex. Sterylizuj roztwór za pomocą 0.22 µm filtr
      UWAGA: Roztwór zapasowy 5-aza-CR należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
    2. Przygotować roztwór roboczy 5-aza-CR poprzez rozcieńczenie 1 µL roztworu zapasu 5-aza-CR (3.1.1.) w 1 ml pożywki do hodowli fibroblastów.
      UWAGA: Stężenie roztworu roboczego 5-aza-CR wynosi 1 μM1,2,3,8,9.
  2. Poddać komórki trypsynizacji zgodnie z wcześniejszym opisem (2.1.–2.3.) i odseparować je poprzez wielokrotne, delikatne pipetowanie.
  3. Zebrać zawiesinę komórkową i przenieść ją do probówki stożkowej.
  4. Policz komórki za pomocą komory licznej pod mikroskopem optycznym w temperaturze pokojowej. Oblicz objętość pożywki niezbędną do ponownego zawieszenia komórek w celu uzyskania stężenia 4 x 104 komórki w 30 μL pożywki do hodowli fibroblastów uzupełnionej o 1 μM 5-aza-CR (patrz krok 3.1.2.).
    UWAGA: Wzór, którego należy użyć, zależy od konkretnego rodzaju komory.
    Wzór na liczenie komórek: Komórki/µL = średnia liczba komórek na siatce × współczynnik komory × rozcieńczenie; metoda obliczeń.
  5. Wirować zawiesinę komórkową przy 150 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i resuspendować osad w pożywce do hodowli fibroblastów uzupełnionej o 1 μM 5-aza-CR (patrz krok 3.1.2.). Objętość pożywki do hodowli fibroblastów, której należy użyć, podano w kroku 3.4.
    UWAGA: Jako kontrolę negatywną należy resuspendować komórki w tym samym stężeniu w pożywce do hodowli fibroblastów bez dodatku 5-aza-CR, a następnie przystąpić do enkapsulacji komórek w proszku PTFE (kroki 4.1.–4.13.).

4. Enkapsulacja fibroblastów w mikrobioreaktorach PTFE

  1. Wypełnij 35 mm szalkę Petri proszkiem politetrafluoroetylenowym (PTFE), aby utworzyć złoże (Rysunek 1A).
    UWAGA: Należy używać 35 mm szalek Petri do bakteriologii, aby uniknąć przylegania ciekłych kulek (liquid marbles). W celu uzyskania cienkiej, hydrofobowej i porowatej otoczki należy zastosować proszek PTFE o średnicy cząstek 1 μm, wytworzony przy maksymalnym stopniu rozdrobnienia 2,0 NPIRI. Pozwala to na stworzenie przepuszczalnych dla gazów ciekłych kulek. Ponadto półprzezroczysta powłoka ułatwia obserwację procesów agregacji komórek w czasie rzeczywistym. Większa średnica cząstek prowadzi do wysokiej polidyspersyjności, co może powodować zwiększone parowanie, deformację i utratę kształtu sferycznego oraz przedwczesny rozpad mikrobioreaktorów.
  2. Nanieś pojedynczą kroplę o objętości 30 μL zawierającą 4 x 104 komórek (patrz kroki 3.4.- 3.5.) na złoże proszku (Rysunek 1B).
  3. Delikatnie obracaj 35 mm szalkę Petri ruchem okrężnym, aby upewnić się, że proszek PTFE całkowicie pokrył powierzchnię kropli cieczy, tworząc mikrobioreaktor w formie ciekłej kulki (Rysunek 1C).
  4. Pobierz mikrobioreaktor w formie ciekłej kulki za pomocą końcówki pipety 1 000 μL, ściętej na krawędzi, aby dopasować ją do średnicy kulki (Rysunek 1D,E). Umieść mikrobioreaktor na czystej szalce Petri do bakteriologii w celu jego stabilizacji (Rysunek 1F).
    UWAGA: Aby stworzyć tarcie umożliwiające uchwycenie kulki wewnątrz końcówki, należy przyciąć końcówki pipety tak, aby ich średnica była nieco mniejsza niż średnica ciekłej kulki.
  5. Przenieś mikrobioreaktor w formie ciekłej kulki z szalki Petri do płytki 96-dołkowej (jedna kulka na dołek) (Rysunek 1G).
  6. Powoli dodaj 100 μL pożywki przy krawędzi dołka. Mikrobioreaktor zacznie pływać na powierzchni pożywki (Rysunek 1H).
    UWAGA: Mikrobioreaktor rozpada się przy bezpośrednim kontakcie z cieczą ze względu na zaburzenie hydrofobowości PTFE. Jako alternatywną metodę można umieścić mikrobioreaktory w formie ciekłych kulek pojedynczo w 35 mm szalce do hodowli bakteriologicznych. W takim przypadku, aby zapobiec parowaniu ciekłych kulek, 35 mm szalkę Petri zawierającą mikrobioreaktor należy włożyć do 100 mm szalki Petri, do której wcześniej nalano sterylną wodę.
  7. Inkubuj mikrobioreaktory w formie ciekłych kulek przez 18 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO21,2,3,8,9.
    UWAGA: Rozmiar cząstek PTFE wynoszący 1 μm zapewnia optymalną wymianę gazową między cieczą wewnątrz a otoczeniem.
  8. Po 18 h inkubacji z 5-aza-CR pobierz mikrobioreaktory w formie ciekłych kulek za pomocą końcówki pipety 1 000 μL ściętej na krawędzi (patrz krok 4.5).
  9. Umieść mikrobioreaktory w nowej 35 mm szalce Petri do bakteriologii (Rysunek 1D-F).
  10. Użyj igły, aby przebić i rozbić ciekłą kulkę.
  11. Odzyskaj powstałe sferoidy za pomocą końcówki pipety 200 μL ściętej na krawędzi, pracując pod stereomikroskopem (Rysunek 1I,J).
    UWAGA: Komórki z usuniętymi epigenetycznie znacznikami zamknięte w PTFE tworzą sferyczną strukturę 3D (jeden agregat w każdej ciekłej kulce).
  12. Aby ocenić nabycie stanu pluripotencji w odpowiedzi na 5-aza-CR, sprawdź początek ekspresji genów związanych z pluripotencją: OCT4, NANOG, REX1 oraz SOX2 za pomocą jakościowej PCR (Tabela 2).
  13. Przejdź do drugiego etapu protokołu zgodnie z poniższym opisem.

5. Hodowla komórek z usuniętymi znacznikami epigenetycznymi w mikro-bioreaktorach z PTFE

  1. Przygotować świeżą pożywkę do hodowli ESC (Tabela 1).
  2. Przenieść organoidy do szalki Petriego zawierającej pożywkę ESC w celu wypłukania pozostałości 5-aza-CR (patrz kroki 5.1.-5.2.).
  3. Przygotować nową 35-milimetrową bakteriologiczną szalkę Petriego zawierającą łoże z proszku PTFE (patrz również krok 4.1.).
  4. Nanieść pojedynczy organoid w kropli 30 μL pożywki do hodowli ESC na łoże proszkowe, używając końcówki pipety 200 μL ściętej na krawędzi (patrz kroki 4.9.; 5.3.).
  5. Delikatnie obracać 35-milimetrową szalkę Petriego kolistym ruchem, aby uformować nowy mikrobioreaktor w postaci ciekłej kulki (liquid marble), pobrać go końcówką pipety 1,000 μL ściętą na krawędzi i umieścić nowo powstały mikrobioreaktor w studzience płytki 96-dołkowej (jedna kulka na studzienkę) (patrz kroki 4.3.-4.6.).
  6. Aby mikrobioreaktory unosiły się na powierzchni, dodać 100 μL pożywki przy krawędzi studzienki, aby powoli obmyć kulkę (patrz uwaga 4.7.).
  7. Hodować mikrobioreaktory w postaci ciekłych kulek w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez wymagany czas. Wymieniać pożywkę co drugi dzień, postępując zgodnie z procedurą opisaną w punktach 5.3.-5.7.
    UWAGA: W niniejszej pracy przedstawiono wyniki uzyskane przy hodowli organoidów przez 28 dni. Jeśli jednak jest to konieczne, można zastosować dłuższy okres hodowli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje wszystkie kroki niezbędne do wygenerowania i stabilnego utrzymania pluripotencjalnych komórek ssaków z dorosłych komórek somatycznych. Metoda ta okazała się skuteczna w przypadku fibroblastów izolowanych od różnych gatunków ssaków, mianowicie myszy, świni i człowieka. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki uzyskano dla wszystkich linii komórkowych, niezależnie od gatunku pochodzenia.

Analizy morfologiczne wykazały, że po 18 h inkubacji z czynnikiem demetylującym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ciągu ostatnich dziesięcioleci kilka badań koncentrowało się na opracowaniu strategii przywracania terminalnie zróżnicowanej komórki w kierunku mniej zaangażowanego i bardziej permisywnego stanu. Opisany tutaj protokół pozwala na wytwarzanie i długoterminowe utrzymywanie komórek pluripotencjalnych, począwszy od dojrzałych, terminalnie zróżnicowanych komórek dorosłych. Metoda łączy w sobie dwa niezależne etapy, które polegają na indukcji stanu wysokiego permisywnego, który osiąga się poprzez chemiczne wymazywanie epigen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Carraresi i MiND FoodS Hub ID: 1176436. Wszyscy autorzy są członkami COST Action CA16119 In vitro 3-D Total Cell guidance and Fitness (CellFit).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM7522Składnik pożywki ESC
5-AzacytydynaSigma-AldrichA23855-aza-CR, do epigenetycznego usuwania fibroblastów
AdenozynaSigma-AldrichA4036Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC
Antybiotyk Roztwór przeciwgrzybiczy (100& razy;)Sigma-AldrichA5955Składnik pożywki fibroblastów i ESC
CFX96 Real-Time PCRBio-Rad LaboratoriesNATermocykler do ilościowego PCR
CytydynaSigma-AldrichC4654Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC
DMEM, wysoka glukoza, pirogronianThermo Fisher Scientific41966052Do izolacji fibroblastów i pożywki
hodowlanejDMEM, niska glukoza, pirogronianThermo Fisher Scientific31885023Dla ESC medium
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichD5652PBS; do biopsji i przemywania komórek oraz do przygotowania roztworu
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021Estraction mRNA
ESGRO Rekombinowane mysie białko LIFSigma-AldrichESG1106Składnik pożywki ESC
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznieThermo Fisher Scientific10500064Składnik pożywki dla fibroblastów i ESC
FGF-Basic (AA10-155) Rekombinowane białko ludzkieThermo Fisher ScientificPHG0024Składnik pożywki ESC
Żelatyna ze skóry świniSigma-AldrichG1890Do powlekania naczyń
GeneAmp PCR System 2700Applied BiosystemsNATermocykler do jakościowego PCR
Globalna metylacja DNA ELISA ZestawCELL BIOLABSSTA-380Badanie metylacji
GoTaq G2 Flexi DNA PolimerazaPromegaM7801Jakościowy PCR
GuanozynaSigma-AldrichG6264Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC
Mieszanka odżywcza Ham's F-10Thermo Fisher Scientific31550031Do podłoża ESC
Zamiennik serum do nokautowaniaThermo Fisher Naukowe10828028Składnik podłoża ESC
KOVA Glasstic Slide 10 z siatkamiHycor Biomedical87144Do liczenia komórek
Mikroskop stereoskopowy Leica MZ APOLeicaNADo obserwacji organoidów
Roztwór L-glutaminySigma-AldrichG7513Składnik pożywek fibroblastów i ESC
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Thermo Fisher Scientific11140035Składnik podłoża ESC
Millex-GS 0,22 µ m filtry poroweMilliporeSLGS033SBDo sterylizacji roztworem
M-MLV Odwrotna transkryptaza, RNaza H Minus, Point MutantPromegaM3681Odwrotna transkrypcja mRNA Multiskan
FC Microplate FotometrThermo Fisher Scientific51119000Do odczytu płytki ELISA
Nikon Eclipse TE300 Mikroskop kontrastowy z odwróconą faząNikonNADo komórki obserwacja
Perkin Elmer Thermal Cycler 480Perkin ElmerNATermocykler do odwrotnej transkrypcji
Poli(tetrafluoroetylen) 1 μ m Wielkość cząstekSigma-Aldrich430935Do generowania mikrobioreaktora
PureLink Genomic DNA Mini KitThermo Fisher ScientificK182001Ekstrakcja genomicznego DNA
Zestaw TaqMan Gene Expression Cells-to-CT ThermoFisher ScientificAM1728Ilościowy PCR
TymidynaSigma-AldrichT1895Składnik mieszanki nukleozydów do pożywki ESC
Naczynie do hodowli tkankowych 100X20 mm, standardowe833902 SarstedtDo izolacji fibroblastów
Naczynie do hodowli tkankowych 35X10 mm, StandardSarstedt833900Do izolacji fibroblastów
Naczynie do hodowli tkankowych 35X10 mm, zawiesinaSarstedt833900500Bakteriologia szalka Petriego do hodowli płynnego marmuru
Płytka do hodowli tkanek 96 Well, Standard, FSarstedt833924005Do hodowli płynnego marmuru
Roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT3924Do dysocjacji fibroblastów
Probówka 15ml, 120x17mm, PSSarstedt62553041Do wirowania zawiesiny komórkowej
UrydynaSigma-AldrichU3003Składnik mieszanki nukleozydów do podłoża ESC

Bibliografia

  1. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  2. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
  3. Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
  4. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
  5. Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333(2015).
  6. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
  7. Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
  8. Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017(2016).
  9. Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
  10. Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
  11. Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
  12. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  13. Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
  14. Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
  15. Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
  16. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).
  17. Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
  18. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).
  19. Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
  20. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
  21. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  22. Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
  23. Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
  24. Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  25. Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083(2015).
  26. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).
  27. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).
  28. Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
  29. Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
  30. Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

5 aza cytydynamikrobioreaktory PTFEmarmury ciek ereorganizacja kom rekutrzymanie pluripotencjianaliza metylacji DNAanaliza morfologiczna
Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.