Analiza klonalna serca noworodka myszy przy użyciu modelowania najbliższego sąsiada

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół do korzystania z wielokolorowego śledzenia linii i modelowania najbliższego sąsiedztwa do identyfikacji kardiomiocytów pochodzenia klonalnego podczas wzrostu i regeneracji u myszy. Takie podejście jest obiektywne, działa w różnych warunkach etykietowania i można je dostosować do różnych potoków analizy obrazu.

Streszczenie

Zastępując utracony lub dysfunkcyjny mięsień sercowy, regeneracja tkanek jest obiecującym podejściem do leczenia niewydolności serca. Jednak wyzwanie, jakim jest wykrycie regeneracji serca w dobrej wierze, ogranicza walidację potencjalnych czynników regeneracyjnych. Jedną z metod wykrywania nowych kardiomiocytów jest wielokolorowe śledzenie linii z analizą klonalną. Eksperymenty z analizą klonalną mogą być trudne do przeprowadzenia, ponieważ warunki znakowania, które są zbyt rzadkie, nie są czułe na rzadkie zdarzenia, takie jak proliferacja kardiomiocytów, a znakowanie rozproszone ogranicza zdolność do rozpoznawania klonów. Przedstawiono tutaj protokół przeprowadzenia analizy klonalnej serca noworodka myszy przy użyciu modelowania statystycznego rozkładów najbliższych sąsiadów w celu rozpoznania klonów kardiomiocytów. Podejście to umożliwia rozdzielczość klonów w różnych warunkach znakowania i zapewnia solidne podejście analityczne do ilościowego określania proliferacji i regeneracji kardiomiocytów. Protokół ten można dostosować do innych tkanek i może być szeroko stosowany do badania regeneracji tkanek.

Wprowadzenie

Histologiczną cechą charakterystyczną niewydolności serca jest utrata kardiomiocytów (CM), czy to w wyniku urazu, starzenia się, czy apoptozy¹. Uzupełnienie utraconego lub dysfunkcyjnego mięśnia sercowego poprzez regenerację tkanek stanowi potencjalną strategię terapeutyczną leczenia pacjentów z niewydolnością serca. W ciągu ostatnich kilku dekad przełomowe postępy w biologii rozwojowej i regeneracyjnej ujawniły ograniczoną zdolność serca ssaków do uzupełniania utraconych CMs^2,3,4,5. Ta ekscytująca praca zwiększyła możliwość, że wrodzone mechanizmy wzrostu mogą być wykorzystane do regeneracji. Ponieważ wrodzone reakcje regeneracyjne są funkcjonalnie nieobecne w sercu dorosłego ssaka, do realizacji terapeutycznej regeneracji serca potrzebne są metody poprawy odporności endogennej naprawy.

Mechanizmy wrodzonej regeneracji serca wydają się być zachowane u różnych gatunków. Po urazie, istniejące wcześniej CM rozmnażają się, aby wygenerować nowe CM w danio pręgowanym^6,7, newts^8,9, mice^4,10, rats¹¹ i pigs^12,13. W związku z tym wiele grup stara się zidentyfikować mitogeny zdolne do promowania kardiomiogenezy. Jednak taka praca jest wyzwaniem. Nie tylko zadanie nakłonienia CM dorosłych ssaków do rozmnażania się jest zniechęcające, ale także jest w stanie zidentyfikować rzadkie zdarzenia proliferacyjne^1,14. Wyzwanie związane z identyfikacją rzadkich cyklicznych CM jest spotęgowane przez tendencję CM dorosłych ssaków do preferencyjnego poddawania się endomitozie. Na przykład po urazie serca myszy prawie 25% CM w strefie granicznej ponownie wchodzi w cykl komórkowy, ale tylko 3,2% CM divide⁴. Ponieważ większość cyklicznych CM duplikuje swój genom, ale nie ulega cytokinezie, samo oznaczanie wzrostu liczby cyklicznych CM jest niejednoznaczne z kardiomiogenezą w dobrej wierze. W związku z tym testy na inkorporację nukleozydów przez CM lub na obecność markerów proliferacyjnych na CM mogą nie wskazywać całkowicie na regenerację. W miarę pojawiania się coraz większej liczby czynników kandydujących do regeneracji serca potrzebne są testy w celu lepszej identyfikacji przerostu CM.

Analiza klonalna za pomocą śledzenia linii jest cennym podejściem do oznaczania kardiomiogenezy, ponieważ pozwala na bezpośrednią wizualizację komórek i ich potomstwa. Tradycyjne podejścia do analizy klonalnej polegają na rzadkim znakowaniu pojedynczych komórek za pomocą genu reporterowego. Jednak jednokolorowe śledzenie linii rzadkich komórek może mieć ograniczoną wartość w przypadku rzadkich zdarzeń, takich jak proliferacja CM, ponieważ szanse na oznaczenie proliferującego CM są niskie¹⁵. Alternatywnie, wielokolorowe śledzenie pochodzenia może zwiększyć czułość analizy klonalnej¹⁶. Krótko mówiąc, poszczególne komórki są losowo znakowane genetycznie jednym z kilku białek fluorescencyjnych, tak że proliferujące komórki będą generować jednorodnie zabarwione klastry komórek, które można rozdzielić z sąsiednich komórek fluorescencyjnych. Metoda ta została wykorzystana do śledzenia wzrostu w różnych narządach, a ostatnio została zastosowana do badań nad regeneracją serca ssaków^17,18. Podczas gdy wielokolorowe śledzenie linii może wykryć klonalną ekspansję CM w stadiach embrionalnych i noworodkowych, wrodzone reakcje regeneracyjne nie są łatwe do wykrycia w sercu dorosłej myszy po urazie serca^17,19. Jednym z podejść mających na celu zwiększenie czułości wielokolorowego śledzenia linii rodowodu byłoby zwiększenie poziomu etykietowania i zwiększenie prawdopodobieństwa wizualizacji rzadkich zdarzeń. Jednak szersze znakowanie odbywa się kosztem niemożności odróżnienia podobnie oznakowanych komórek jako pochodzących od wspólnego przodka w porównaniu z komórkami, które zostały niezależnie znakowane tym samym fluoroforem. Przedstawiono tutaj protokół, który wykorzystuje modelowanie najbliższego sąsiada do identyfikacji klonalnie spokrewnionych CM w sercu noworodka myszy. Ta metoda jest bezstronna, ilościowa i działa w różnych warunkach etykietowania.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące obchodzenia się z myszami, przeprowadzania operacji przetrwania i pobierania serc wymagają zatwierdzenia przez lokalny instytucjonalny komitet ds. użytkowania zwierząt.

1. Myszy do analizy klonalnej CM

Skrzyżowanie Myh6-MerCreMer mice20 z Gt(ROSA)26Sor tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw mice21, aby wygenerować Myh6-MerCreMer;
1. Myszy bitransgeniczne R26R-Rainbow.
   1. Utrzymuj zapasy myszy homozygotycznych pod względem allelu R26R-Rainbow i krzyżuj je z myszami heterozygotycznymi pod względem allelu Myh6-MerCreMer, tak aby wszystkie eksperymenty były przeprowadzane na myszach heterozygotycznych pod względem allelu R26R-Rainbow. Alternatywnie, użyj myszy homozygotycznych pod względem allelu R26R-Rainbow, aby zwiększyć różnorodność kolorów, ale będzie to wymagało systemu obrazowania, który może wiernie rozróżniać fluorofory EGFP, mCerulean, mOrange i mCherry.
2. Wykonaj genotypowanie w momencie pobrania serca.
   UWAGA: Myszy Myh6-MerCreMer wyrażają indukowaną tamoksyfenem rekombinazę Cre w CM i mogą być genotypowane przy użyciu starterów PCR CGTACTGACGGTGGGAGAAT (Cre-F) i GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) w celu wytworzenia produktu o wartości 200 par zasad (bp). Myszy R26R-Rainbow konstytutywnie wyrażają EGFP, ale po rekombinacji za pośrednictwem Cre będą wyrażać stochastycznie mCerulean, mOrange lub mCherry. R26R-Rainbow może być genotypowany za pomocą starterów PCR CTCTGCTGCCTCCTCTCTCTCTCTT (R26-F), CGAGGCGGATCACAAGCAAGCAATA (R26-R) i TCAATGGGCGGGGGGGTGTT (Rainbow-R). Allel typu dzikiego daje produkt 350 pz, a allel tęczowy daje produkt 250 pz.

2. Kriouraz i znakowanie kardiomiocytów

1. Wykonaj krioobrażenia zgodnie z wcześniejszym opisem z niewielkimi modyfikacjami^22,23. Ostrożnie umieść jednodniowe myszy (P1) na łóżku z pokruszonego lodu na 3 minuty, aby wywołać zatrzymanie akcji serca. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, wykonując szczypanie palca u nogi bez odruchowego wycofywania.
   UWAGA: Czas znieczulenia ma kluczowe znaczenie. Przeżywalność może być zagrożona, jeśli myszy są chłodzone zbyt długo. Dodatkowo wiek myszy ma kluczowe znaczenie. Zdolność regeneracyjna gwałtownie spada w pierwszym tygodniu życia¹⁰.
2. Umieść znieczulone szczenię na zimnym opakowaniu i pod obiektywem chirurgicznego mikroskopu preparacyjnego. Użyj mikronożyczek 6 mm, aby wykonać torakotomię między 4. a 5. żebrem, aby odsłonić przednią powierzchnię serca.
3. Za pomocą kriosondy schłodzonej ciekłym azotem umieść sondę na lewej komorze na 1-2 s. W przypadku pozorowanych urazów należy wykonać torakotomię bez kriourazu.
   UWAGA: Czas trwania kriouszkodzenia decyduje o zakresie urazu. Długotrwałe urazy zmniejszają wskaźniki przeżycia.
4. Zamknij nacięcie szwem polipropylenowym 6-0 przymocowanym do igły o średnicy 0,15 mm.
5. Szybko rozgrzej szczeniaka i ręcznie stymuluj, aby wznowić przepływ krwi. Gdy szczeniak zacznie się spontanicznie poruszać, umieść go na poduszce grzewczej.
6. Ozdrowieńcom należy wstrzyknąć dootrzewnowo 20 μg tamoksyfenu. W tym momencie należy wstrzyknąć leki przeciwbólowe, takie jak 0,25% bupiwakainy wzdłuż linii szwów, jeśli jest to wymagane. Zwróć szczenięta do matki.
   UWAGA: Młode z jednego miotu są odzyskiwane razem i razem wracają do matki. Taki przebieg pracy poprawia przeżywalność i ponowne przyjęcie miotu przez matkę.

3. Pobieranie i przetwarzanie serc do analizy histologicznej

1. Zbieraj serca po 20 dniach od urazu (dpi) lub po urodzeniu (P21), ponieważ reakcje regeneracyjne można zaobserwować w tym punkcie czasowym¹⁰. Najpierw poddaj myszy eutanazji w komorze wziewnej CO₂ , a następnie przenieś do mikroskopu chirurgicznego.
   UWAGA: Eutanazja powinna być przeprowadzana zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt.
2. Po potwierdzeniu wystarczającego znieczulenia wykonaj podwójną torakotomię za pomocą mikronożyczek chirurgicznych, aby odsłonić serce. Następnie przeprowadź perfuzję serca za pomocą 1 ml 1 M KCl, 1 ml 4% paraformaldehydu i 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   UWAGA: Konieczne jest odpowiednie mycie, aby ograniczyć wewnątrzkomorowe zakrzepy krwi, które mogą powodować autofluorescencję podczas akwizycji obrazu.
3. Po perfuzji należy wyciąć serce i umieścić w probówce zawierającej co najmniej 1 ml PBS.
4. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby przyciąć serca, aby zoptymalizować osadzanie. Poziomy wycinek poniżej atrium zapewnia dobrą powierzchnię do osadzenia serc dla sekcji o krótkiej osi.
   UWAGA: Alternatywnie można poprzecznie przeciąć serce, jeśli pożądane są długie sekcje osi.
5. Umieścić przycięte serca w 1 ml 30% (wag./obj.) sacharozy w temperaturze 4 °C na 12–18 godzin. Usunąć próbki z roztworu sacharozy. Osadź przyciętą tkankę w blokach za pomocą pożywki do zamrażania tkanek.
6. Osadzoną tkankę należy szybko zamrozić na suchym lodzie i przechowywać bloki w temperaturze -80 °C.
7. Podziel zamrożone bloki całego serca na sekcje 10 μm za pomocą kriostatu, zamontuj na naładowanych szkiełkach i przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C. Szeregowo pokrój serca na 10 szkiełkach. Odbywa się to poprzez zamontowanie sekcji na każdym z 10 slajdów przed powrotem do pierwszego slajdu w celu dodania kolejnej sekcji. Taka strategia ogranicza szansę na uchwycenie tych samych CM w wielu sekcjach na danym slajdzie.
   UWAGA: Należy uważać, aby ograniczyć ekspozycję na światło, aby zapobiec utracie fluorescencji.
8. Gdy będziesz gotowy do obrazowania, rozmrozić szkiełka i ponownie nawodnić w PBS. Dodaj środek montażowy zapobiegający blaknięciu przed nałożeniem szklanego szkiełka nakrywkowego #1.5. Szkiełka nakryte przechowywać w zakrytym pojemniku w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Aby uzyskać oczekiwane wyniki dla kriourazów, czytelnik jest kierowany do wcześniejszych prac na ten temat²³. Odcinki serca mają wysoki poziom autofluorescencji. Stosowanie środków hartujących, takich jak Sudan Black, przed nałożeniem szkiełka nakrywkowego może pomóc w złagodzeniu autofluorescencji. Należy jednak zachować ostrożność, aby uniknąć wygaszania interesujących nas fluoroforów.

4. Obrazowanie

UWAGA: Poniższe kroki dotyczą korzystania z komercyjnego mikroskopu (zobacz Tabelę Materiałów), który posiada pionowy system fluorescencji szerokopolowej z kostkami filtrującymi wyposażonymi w rozróżnianie fluoroforów mCerulean, EGFP, mOrange i mCherry, oraz oprogramowanie związane z tym zestawem (zobacz Tabela materiałów). Dodatkowe kroki będą się różnić w zależności od używanego systemu obrazowania.

1. Zobrazuj cały slajd w 5-krotnym powiększeniu, używając tylko filtra GFP, aby utworzyć mapę slajdów.
2. Wybierz poszczególne sekcje na mapie slajdów, które są nienaruszone i mają ograniczoną autofluorescencję do obrazowania. Ze względu na seryjne cięcie w zestawach po 10 szkiełek, sąsiednie sekcje będą oddalone od siebie o co najmniej 100 μm, co uniemożliwi obrazowanie tych samych CM.
3. Wykonaj obrazowanie skanowania kafelków dla poszczególnych sekcji za pomocą obiektywu 20x z filtrami mCerulean, mOrange, mCherry i EGFP. Reprezentatywne obrazy są pokazane w Rysunek 1.
4. Zapisuj obrazy w formacie, który pozwala na pobranie informacji o poszczególnych kanałach. Uważaj, aby nazwać pliki w formacie, który pozwoli na identyfikację serca, fluoroforu i położenia sekcji w sercu. Dla poniższych kroków obliczeniowych wymagane jest systematyczne podejście do nazewnictwa.

5. Analiza obrazów w celu identyfikacji oznaczonych CM

1. Wybierz zobrazowane sekcje, które są nienaruszone z każdego zestawu i rozprowadź losowo do wszystkich przesiewaczy. Upewnij się, że skanery przestrzegają poniższych kroków dla każdego obrazu.
2. Dla każdego kanału (mCerulean, mOrange i mCherry) użyj narzędzia 'Balans kolorów' w ImageJ²⁴, aby dostosować jasność i kontrast obrazu, aby pomóc użytkownikowi zidentyfikować oznaczone komórki.
   UWAGA: ImageJ to bezpłatne narzędzie do analizy obrazu, które można pobrać ze strony https://imagej.net. Ten protokół używał wersji 2.0.0-rc-69/1.52i.
3. W ImageJ wybierz opcję "Ustaw pomiary" z menu rozwijanego "Analizuj". W oknie, które się otworzy, wybierz "Obszar | Środek ciężkości | Prostokąt ograniczający | Ogranicz do progu'.
   UWAGA: Moduł odejmowania obrazu może być czasami używany do poprawy sygnału fluoroforu w stosunku do autofluorescencji tła. Jeśli jednak odejmowanie jest wykonywane, powinno być wykonywane systematycznie dla wszystkich obrazów w zbiorze danych.
4. Po otwarciu interesującego Cię obrazu wybierz "Narzędzia", a następnie wybierz "Menedżer ROI" z menu rozwijanego "Analizuj". Otworzy się okno "Menedżer ROI".
5. Wybierz narzędzie "Zaznaczanie odręczne" z paska narzędzi ImageJ i prześledź interesującą Cię komórkę (Rysunek 2A). Po prześledzeniu naciśnij "t" lub użyj przycisku "Dodaj [t]" w oknie "Menedżer ROI" (Rysunek 2B). Powtórz te czynności dla wszystkich komórek pojedynczego kanału.
   UWAGA: Segmentacja i ROI powinny być wykonywane osobno dla każdego kanału.
6. Po wybraniu wszystkich komórek dla danego kanału zapisz ROI jako plik .zip. Zrób to, najpierw wybierając "Odznacz" w oknie "Menedżer ROI", aby upewnić się, że żaden pojedynczy ROI nie jest podświetlony. Następnie kliknij zakładkę "Więcej" w oknie "Menedżer ROI" i wybierz opcję "Zapisz". Spowoduje to otwarcie nawigatora na pulpicie, w którym ROI są zapisywane jako plik .zip.
7. Wyeksportuj pomiary dla każdego z ROI jako plik .csv. Aby to zrobić, upewnij się, że żaden pojedynczy zwrot z inwestycji nie jest podświetlony, ponownie wybierając opcję "Odznacz", a następnie wybierz opcję "Mierz" w oknie "Menedżer ROI". Spowoduje to otwarcie nowego okna "Wyniki" ze wszystkimi wybranymi wcześniej pomiarami.
8. W oknie "Wyniki" wybierz "Plik", a następnie wybierz "Zapisz jako" z menu rozwijanego (Rysunek 2C). Spowoduje to ponowne otwarcie nawigatora na pulpicie, dzięki czemu plik można zapisać w formacie .csv.
   UWAGA: Pamiętaj, aby zapisać ROI i pomiary przed przejściem do segmentacji następnego kanału.
9. Uważaj, aby nazwać pliki w formacie, który pozwoli zidentyfikować serce, kanał i położenie sekcji w sercu. Na przykład "HeartType#_Set#_Section#_Channel" (np. "CI-1_Set4_S3_mOrange.zip" dla ROI i "CI-1_Set4_S3_mOrange.csv" dla odpowiednich pomiarów).
   UWAGA: Poniższy kod zakłada powyższą konwencję nazewnictwa. Inna konwencja nazewnictwa będzie wymagała modyfikacji kodu.

6. Analiza statystyczna

UWAGA: Komórki noszące ten sam fluorofor są mieszanką komórek pochodzących klonalnie (kin) i niepowiązanych komórek, które przeszły losową rekombinację w celu ekspresji tego samego fluoroforu (niespokrewnionego). Na podstawie wcześniejszych danych¹⁷, zakłada się, że komórki krewniacze mają bliższą fizyczną bliskość niż komórki niespokrewnione wykazujące ekspresję tego samego fluoroforu. W ten sposób komórki krewniacze i niespokrewnione mogą być różnicowane na podstawie progu odległości. Jednak w celu określenia progu należy zdekonwolować rozkłady najbliższych sąsiadów dla komórek krewniaczych i niespokrewnionych. Na szczęście rozkłady najbliższych sąsiadów dla komórek niespokrewnionych można oszacować, oceniając wartości najbliższego sąsiada z każdej komórki do najbliższej komórki zawierającej inny fluorofor. W tym miejscu przedstawiono metodologię statystycznego wyznaczania odległości progowej w celu zdefiniowania klonalności oraz przypisania prawdopodobieństwa pokrewieństwa między komórkami.

1. Korzystając z plików .csv uzyskanych z sekcji 5, oblicz odległości najbliższego sąsiada dla każdej komórki w wycinku serca. Skompiluj te wyniki w odległości wewnątrzkanałowe (mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange i mCherry-mCherry) i międzykanałowe (mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry i mCherry-mCerulean). Zapisz wyniki w dwóch plikach .csv: jednym dla odległości wewnątrzkanałowych i jednym dla odległości międzykanałowych.
   1. Zainstaluj kod Python²⁵, który wymaga bibliotek numpy i pandas.
      > install numpy; install pandas
   2. Obliczaj odległości i eksportuj pliki .csv dla odległości wewnątrzkanałowych i odległości między kanałami za pomocą snippet_6_1.py Pythona.
2. Odczytaj odległości wewnątrzkanałowe i międzykanałowe do ramki danych R²⁶, przekształcając identyfikatory serca w zmienną jakościową. Zastosuj próg wybrany ad hoc, patrząc na histogramy najbliższego sąsiada (Rysunek 3A,C), aby zminimalizować wartości odstające. Pamiętaj, aby wybrać próg, który obejmuje ponad 90% odległości między kanałami i wewnątrz kanału, wykluczając jednocześnie długi ogon, aby uniknąć nadmiernego dopasowania do hałasu w dużych odległościach najbliższego sąsiada. Protokół ten wykorzystuje próg 400 μm (Rysunek 3). Użyj Rscript snippet_6_2.R, aby wykonać ten krok.
   UWAGA: Alternatywnie można modelować wiele wycinków jako pojedyncze zmienne. Protokół ten ogranicza złożoność modelu do poziomu serca, co ułatwia modelowanie i szacowanie.
3. Uzyskaj logarytmy naturalne dla odległości wewnątrzkanałowych i międzykanałowych. Ponieważ komórki zajmują przestrzeń, nie są jednostkami punktowymi, minimalny rozkład odległości najbliższego sąsiada jest wyśrodkowany wokół wartości niezerowej i ma asymetryczne ogony, ponieważ maksymalna odległość między parami komórek może być znacznie wyższa niż wartości mediany (Rysunek 3A,C). Do modelowania takich rozkładów należy użyć rozkładu logarytmiczno-normalnego (Rysunek 3B,D). Zrób to za pomocą Rscript snippet_6_3.R.
4. Poniższy model bayesowski służy do oszacowania średnich i wariancji rozkładów najbliższego sąsiada dla krewnych (α₂, σ²₂) i niespokrewnionych (α₁, σ²₁) oraz prawdopodobieństwa odległości wewnątrzkanałowych wynikających z rozkładu krewnego (π=e^β/(1+e^β)):
   bw.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi wi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ_{2 2}| l.limi σ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ>₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α>₁ ~ Unif(2,6)
   α₂ ~ Unif(1,5)
   β ~ Unif(-5,0)
   gdzie Unif(a,b) jest rozkładem jednostajnym na przedziale [a,b], N(μ,σ²|l2 ograniczoną do przedziału (l,u), T₁(0,1|x>0) jest standardowym rozkładem Cauchy'ego (T o 1 stopniu swobody) ograniczonym do dodatniej półlinii, bw.dist_i to^i-ta zarejestrowana odległość między parami kanałów, a wi.dist_i to^i-ta zarejestrowana odległość pary w kanale. Należy zauważyć, że zarejestrowane odległości wewnątrz kanału mają dwuskładnikowy rozkład mieszaniny odzwierciedlający domieszkanie par komórek spokrewnionych i niespokrewnionych.
   1. Jeśli to możliwe, podaj modelowi informacyjne a priori. Na przykład ten protokół oczekuje, że komórki krewniacze będą bliżej siebie niż komórki niespokrewnione, więc jest to podawane jako a priori średnia rozkładu odległości. Następnie użyj pakietów runjags²⁷ i coda²⁸ R oraz programu JAGS²⁹ do szacowania parametrów (Rscript snippet_6_4.R).
5. Wykonaj model JAGS z liczbą łańcuchów odpowiadającą liczbie dostępnych procesorów. Użyj Rscript snippet_6_5.R, aby wykonać ten krok. Pozwól oprogramowaniu działać aż do konwergencji.
6. Użyj metryk, aby przetestować zbieżność algorytmu, takie jak efektywna wielkość próby (dostępna z runjags), diagnostyka zbieżności Gelmana-Rubina (dostępna z runjags) i jej autokorelacja (autocorr/autocorr.diag dostępna w coda). Sprawdź poprawność dopasowania oszacowanego modelu do najbliższych odległości sąsiada, sprawdzając wykres Q-Q, który przedstawia porównanie rzeczywistych i szacowanych wartości na poziomie kwantyla dla najbliższych odległości sąsiadów przy użyciu Rscript snippet_6_6.R (Rysunek 4C,F). Ten skrypt wymaga od użytkownika edycji wartości w wierszach 25-29 snippet_6_6.R na podstawie danych wyjściowych z polecenia 6.
   UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby efektywna wielkość próby (SSeff) była większa niż 10 000 dla każdego z parametrów³⁰. Jednak SSeff większy niż 2,500 może być odpowiedni dla niektórych złożonych modeli. Diagnostyka Gelmana Rubina wynosi 1,00 dla doskonałej zbieżności i musi być mniejsza niż 1,05 dla zadowalającej zbieżności. Wysoka autokorelacja wskazuje na powolne mieszanie w łańcuchach i jest wskaźnikiem powolnej konwergencji. Wykres autokorelacji musi podążać za rozkładem wykładniczym w przypadku dobrego modelu. Wykres Q-Q rzeczywistych i modelowanych rozkładów najbliższego sąsiada (Rysunek 4C,F) powinien jak najściślej podążać za przekątną.
7. Po zweryfikowaniu dokładności modeli uzyskaj prawdopodobieństwo, że para komórek jest spokrewniona, w funkcji ich odległości. Aby określić odległość progową do określenia, czy komórki wewnątrzkanałowe mogą być spokrewnione, określ odległość, przy której prawdopodobieństwo bycia krewnym spada poniżej 0,5. Można to zrobić za pomocą Rscript snippet_6_7.R.
   UWAGA: Alternatywne progi można wybrać na podstawie celów eksperymentalnych. W przypadku niektórych zastosowań progi mogą nie być istotne, a prawdopodobieństwo bycia parą krewniaczą może być bezpośrednio wykorzystane do ważenia par komórek.

Wyniki

Przestrzeganie protokołu dla kriouszkodzeń noworodków powinno dać serca P21 z uszkodzeniem i bez niego. Serca kriouszkodzone mają dobrze opisany uraz, podczas gdy powierzchnia serc pozorowanych jest gładka i jednorodna. W przypadku kriourazów serca obszar urazu powinien być spójny od serca do serca. Po mikroskopii należy uzyskać obrazy podobne do Rysunek 1. Należy pamiętać, że rozdzielczość obrazu pozwala na identyfikację poszczególnych CM, a warunki obrazowania pozwalają na rozpoznanie każdego fluoro...

Dyskusja

Wielokolorowe śledzenie linii to potężne podejście do identyfikacji wzorców wzrostu narządów z rozdzielczością pojedynczej komórki. Jednak głównym ograniczeniem wielokolorowego śledzenia linii jest potrzeba rzadkiego znakowania komórek, co może zmniejszyć czułość identyfikacji rzadkich zdarzeń. W przypadku narządów takich jak serce, o notorycznie niskim poziomie obrotu komórek miąższowych, może to prowadzić do niedoszacowania reakcji wzrostu. Przedstawiono tutaj protokół krok po kroku do przeprowadzenia analizy klonalnej...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#1.5 szkiełko nakrywkowe	FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Medium montażowe zapobiegające blaknięciu	FisherScientific	00-4958-02
			inhalacyjna CO2
Zimny pakiet
Kriomoldy	VWR	15160-215
Świat Cryoprobe	Precision Instruments	501313
Kostki filtracyjne
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw myszy
Oprogramowanie			https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050
Nożyczki z ciekłym azotem
, 6mm	World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2	Uchwyt
	World Precision Instruments	14109
Paraformaldehyd 4%	FisherScientific
Sól fizjologiczna
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Wytrząsarka
Stereoskop
Sacharoza 30% (wag./obj.)	FisherScientific	BP220
Nożyczki chirurgiczne do preparacji	World Precision Instruments	14393
Strzykawka do tamoksyfenu	VWR	BD328438
Tamoksyfen, 20 μ g	Sigma	T5648
Media do zamrażania tkanek	VWR	15148-031
Białe szkiełka Frosted/Plus	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 pionowy szerokokątny system
Zen 2.5 Blue