Artykuł metodologiczny

Ultra-High-Speed Western Blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję

DOI:

10.3791/61657

⸱

26 września 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2United Graduate School of Drug Discovery and Medical Information Sciences, Gifu University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika ultra-szybkiego western blottingu jest rozwijana poprzez poprawę kinetyki wiązania antygen-przeciwciało poprzez technologię cyklicznego drenowania i uzupełniania (CDR) w połączeniu ze środkiem wzmacniającym immunoreakcję.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot (znany również jako immunoblot) to kanoniczna metoda badań biomedycznych. Jest powszechnie stosowany do określania względnej wielkości i obfitości określonych białek, a także potranslacyjnych modyfikacji białek. Ta technika ma bogatą historię i pozostaje w powszechnym użyciu ze względu na swoją prostotę. Jednak procedura western blotting słynie z tego, że trwa godziny, a nawet dni, a krytycznym wąskim gardłem jest długi czas inkubacji, który ogranicza jej przepustowość. Te etapy inkubacji są wymagane ze względu na powolną dyfuzję przeciwciał z roztworu masowego do unieruchomionych antygenów na błonie: stężenie przeciwciał w pobliżu błony jest znacznie niższe niż stężenie objętościowe. W tym miejscu przedstawiamy innowację, która radykalnie skraca te interwały inkubacji poprzez poprawę wiązania antygenu poprzez cykliczne opróżnianie i uzupełnianie (CDR) roztworu przeciwciała. Wykorzystaliśmy również technologię wzmacniającą reakcję immunologiczną, aby zachować czułość testu. Połączenie metody CDR z komercyjnym środkiem wzmacniającym reakcję immunologiczną wzmocniło sygnał wyjściowy i znacznie skróciło czas inkubacji przeciwciał. Powstały w ten sposób ultraszybki western blot można uzyskać w ciągu 20 minut bez utraty czułości. Metodę tę można zastosować do western blot przy użyciu zarówno detekcji chemiluminescencyjnej, jak i fluorescencyjnej. Ten prosty protokół pozwala naukowcom lepiej zbadać analizę ekspresji białek w wielu próbkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot (znany również jako immunoblot) jest potężną i fundamentalną techniką w szerokim zakresie dyscyplin naukowych i klinicznych. Technika ta służy do badania obecności, względnej obfitości, względnej masy cząsteczkowej i modyfikacji potranslacyjnych białek1. W połączeniu z cyfrową analizą obrazu, metoda ta może niezawodnie analizować obfitość białek i modyfikacje białek2. Chociaż western blot jest wykonywany rutynowo, jest to metoda czasochłonna i pracochłonna. Wymagane są długie inkubacje przeciwciała z błonami. W tym miejscu opisujemy modyfikację metody inkubacji, która pokonuje to ograniczenie bez poświęcania czułości.

Podczas inkubacji błony, przeciwciała unoszą się w roztworze, podczas gdy antygeny są unieruchomione na membranie. Ze względu na ich wysokie powinowactwo szybkość wiązania przeciwciał z antygenem jest szybsza niż dyfuzja przeciwciał z roztworu masowego do błony. W ten sposób powstaje "warstwa zubożona" o niskim stężeniu (Rysunek 1). Może minąć wiele godzin, zanim bardziej odległe przeciwciała dotrą do błony poprzez dyfuzję bierną, która jest głównym czynnikiem odpowiedzialnym za długi czas inkubacji w tej technice. Efekt ten nazywa się ograniczeniem transportu masowego (MTL)3. Zaproponowano, że powtarzające się opróżnianie i uzupełnianie roztworu zawierającego przeciwciała może zakłócić warstwę zubożającą i przezwyciężyć MTL4. Tutaj opracowaliśmy unikalną technikę, która wdraża tę cykliczną koncepcję drenażu i uzupełniania (CDR) w celu zmniejszenia efektu MTL w tradycyjnym protokole western blotting i znacznego skrócenia wymaganego okresu inkubacji.

Aby utrzymać czułość wykrywania przy krótkim czasie inkubacji, użyliśmy technologii wzmacniającej immunoreakcję, która przyspiesza reakcję antygen-przeciwciało, poprawiając tym samym stosunek sygnału do szumu5. Wiele dostępnych na rynku środków wzmacniających reakcję immunologiczną (IRE) składa się z 2 składników (roztwór 1 i 2, patrz tabela materiałów). Zastrzeżony skład lub mechanizm działania IRE nie został ujawniony, ale wcześniej odkryliśmy, że IRE zmniejszył stałą dysocjacji między antygenem a przeciwciałem w testach wiązania fazy stałej, co wskazuje, że zwiększone powinowactwo jest, przynajmniej częściowo, odpowiedzialne za wzmacniający efekt IRE6. Połączenie CDR z IRE daje ultraszybki protokół western blotting, który skraca cały czas zabiegu bez poświęcania czułości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SDS-PAGE i przenieść na membranę PVDF

  1. Wykonaj SDS-PAGE, aby oddzielić białka na podstawie względnej wielkości.
    UWAGA: Każdy komercyjny lub domowy system żelowy jest w porządku. Prosimy o postępowanie zgodnie z protokołem producenta.
  2. Przenieść oddzielone białka z żelu na membranę PVDF.
    UWAGA: Odpowiednie są popularne metody transferu (transfer półsuchy lub mokry). Prosimy o postępowanie zgodnie z protokołem producenta.

2. Blokowanie membran PVDF

  1. Inkubować błony w odpowiednich blokujących przez 1 godzinę z mieszaniem w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W zależności od przeciwciała pierwotnego i systemu detekcji należy dobrać odpowiedni bufor blokujący. Na przykład najbardziej typowymi blokerami są BSA, odtłuszczone mleko w proszku, kazeina i komercyjne polimery syntetyczne. Najczęściej używanymi są PBS i/lub TBS z 0,1% Tween20. Ten etap blokowania można wykonać przez noc w temperaturze 4 °C.

3. Inkubacja z pierwotnym przeciwciałem

  1. Przygotować 10% roztwór czynnika wzmacniającego odczyn immunologiczny-1 (IRE-1) z wodą destylowaną. Dobrze wirować.
  2. Przygotować rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe z 10% IRE-1. Wymieszaj go delikatnie i dokładnie.
  3. W przypadku stosowania większej membrany (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) dodaj 8 ml roztworu przeciwciała do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. W przypadku stosowania mniejszej membrany (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) dodaj 3 ml roztworu przeciwciała do 14 ml okrągłodennej probówki polipropylenowej (tabela materiałów).
  4. Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór blokujący. Włóż membranę PVDF do tej rurki palcami w rękawiczkach i upewnij się, że cała membrana przylega do ścianki rurki. Po włożeniu membrany PVDF do probówki, skieruj ją do wewnątrz "stroną białkową" membrany, która pierwotnie stykała się z żelem. Zamknij szczelnie nakrętkę.
  5. Włóż probówkę o pojemności 50 ml do szklanej butelki do pieca do hybrydyzacji.
    UWAGA: Gdy do tej inkubacji używane są probówki o pojemności 14 ml, włóż probówkę o pojemności 14 ml do probówki o pojemności 50 ml, używając pary plastikowych uchwytów pierścieniowych, aby utrzymać rurkę wewnętrzną w środku probówki o pojemności 50 ml.
  6. Włącz piekarnik do hybrydyzacji.
  7. Inkubować błonę z obrotem 6 obr./min przez co najmniej 5 min.
    UWAGA: Upewnij się, że membrana cały czas przylega do ścianki i że (wewnętrzna) rurka jest pozioma, aby równomiernie pokryć membranę roztworem przeciwciała. Skalibrować rozcieńczenie przeciwciała i czas inkubacji przed właściwym eksperymentem.

4. Mycie membrany

  1. Zatrzymaj obrót.
  2. Ostrożnie wyjmij membranę PVDF z probówki za pomocą pęsety i umieść membranę w pojemniku z 50 ml PBS-T.
  3. Krótko przepłukać membranę PBS-T.
  4. Przepłucz membranę w pojemniku wodą destylowaną, aż nie pojawią się bąbelki. Ma to na celu usunięcie większości przeciwciał.
  5. Przenieś membranę PVDF z pojemnika do wirówki do sałatek, która zawiera 250 ml PBS-T.
  6. Umieść kosz sitka w wirówce. Upewnij się, że pokrywka została dobrze założona.
  7. Aktywuj kołpak i uruchom go na około 20-30 s.
  8. Wylej roztwór i krótko przepłucz wnętrze wirówki wodą destylowaną.
  9. Ponownie dodaj 250 ml PBS-T do wirówki.
  10. Powtórz kroki 4.6 i 4.7.

5. Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym

  1. Przygotować 10% roztwór czynnika wzmacniającego odczyn immunologiczny-2 (IRE-2) z wodą destylowaną. Dobrze wirować.
  2. Przygotować rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe z 10% IRE-2. Wymieszaj go delikatnie i dokładnie.
  3. Wybrać objętość roztworu przeciwciała i probówki, jak podano w kroku 3.3.
  4. Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór. Włóż membranę PVDF do rurki, jak podano w kroku 3.4.
  5. Włóż probówkę o pojemności 50 ml do szklanej butelki do pieca do hybrydyzacji.
  6. Włącz piekarnik do hybrydyzacji.
  7. Inkubować membranę z obrotem 6 obr./min przez co najmniej 5 minut. Upewnij się, że membrana przylega do ścianki przez cały czas i że (wewnętrzna) rurka jest pozioma, aby równomiernie pokryć membranę roztworem przeciwciała.
    UWAGA: Skalibruj czas inkubacji przed właściwym eksperymentem. Gdy przeciwciało drugorzędowe jest fluorescencyjnie sprzężone, inkubację należy przeprowadzić w ciemności.

6. Mycie membrany

  1. Wykonaj kroki od 4.1 do 4.10.

7. Akwizycja obrazu

  1. Detekcja chemiluminescencyjna
    1. Umieść kawałek elastycznej folii do półprzeszczepu (10 cm x 15 cm) na płaskiej powierzchni.
    2. Wymieszaj 2 składniki substratu chemiluminescencyjnego w probówce o pojemności 5 ml.
    3. Natychmiast przenieś 1,5 ml zmieszanego substratu na elastyczną folię do półprzeszczepu i umieść na niej membranę PVDF. Następnie przenieś resztę roztworu substratu na membranę.
    4. Inkubować membranę PVDF z wymieszanym substratem na półprzezroczystej elastycznej folii przez 1 minutę.
    5. Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór podłoża.
    6. Umieść membranę między parą przezroczystych folii.
    7. Uzyskaj obraz w trybie chemiluminescencyjnym.
  2. Detekcja fluorescencyjna
    1. Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór.
    2. Umieść membranę między parą przezroczystych folii.
    3. Zrób zdjęcie w trybie fluorescencyjnym.
      UWAGA: Kroki 7.1 i 7.2 należy wykonywać w bliskiej odległości od urządzenia do obrazowania, aby zapewnić maksymalną czułość.
    4. Gdy sygnał tła jest wysoki, wykonaj etap mycia w pojemniku z 80-100 ml PBS-T: 10 min płukania 3 razy dla przeciwciała pierwszorzędowego i 5 min płukania 6 razy dla przeciwciała drugorzędowego.
      UWAGA: Zarówno pierwszorzędowe, jak i drugorzędowe przeciwciała rozcieńczone 10% roztworami IRE mogą być używane do 8-10 razy bez utraty czułości6. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten przykład ilustruje skuteczność metody CDR wraz z technologią wzmacniającą odporność na western blot. Inkubację statyczną przeprowadzono na półprzezroczystej elastycznej folii, w której membrany PVDF inkubowano z roztworem przeciwciała, podczas gdy inkubacja CDR odbywała się w piecu hybrydyzacyjnym poprzez obracanie rurek zawierających błony i roztwór przeciwciała (Movie). Rysunek 2 pokazał ilości odpowiednio antygenu i przeciwciała, niezbędne do chemiluminescencyjnego wykrywania na zacho...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot jest szeroko stosowaną techniką analityczną do wykrywania określonych białek, która została opracowana ~40 lat temu 7,8. Od tego czasu technika ta nadal ewoluowała, a kolejne innowacje poprawiły czułość, szybkość i ilościowość techniki 2,9,10,11,12,13. Pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów bezpośrednio związanych z treścią niniejszego artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Division of Intramural Research, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. był wspierany przez Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, a H.N. i K.Y. byli wspierani przez Valor and V Drug Overseas Training Scholarship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
14 ml probówka PP o okrągłym dnie i wysokiej przejrzystości, z podziałką, z352059
Apollo do drukarek laserowychNieNie dotyczy Wszystkie rodzaje folii przezroczystej do drukarek laserowych są w porządku.
Azure Imaging System 600Azure BiosystemsAzure 600Każdy rodzaj systemu pozyskiwania obrazów jest odpowiedni do wykrywania chemiluminescencyjnego i/lub fluorescencyjnego.
Może uzyskać sygnał Roztwór wzmacniający reakcję immunologicznąTOYOBONKB-101
GŹDZIK Natychmiastowy beztłuszczowy suchygoździkN/A
ECL anty-mysie IgG, peroksydaza chrzanowa związana z F (ab ')2 fragment z owiecGE HealthcareNA9310V
ECL anty-króliczą IgG, F (ab ') połączony z peroksydazą chrzanową2 fragment od osiołkaGE HealthcareNA9340V
HYBAID Micro-4N/AN/AKażdy piec do hybrydyzacji jest w porządku, o ile rurki są równomiernie obracane w pozycji poziomej.
Membrana PVDF Immobilon-P, 0,45 &mikro; m wielkość porówMillipore SigmaIPVH304F0
IRDye 680RD Goat anty-mysie przeciwciało wtórne IgGLICOR926-68070
IRDye 800CW Kozia przeciwciało anty-królicze IgG Przeciwciało wtórneLICOR926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescencyjny substratseracare5430-0049
Mysie przeciwciało anty-ß aktynoweMillipore SigmaA5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)LICOR927-40100Blocking Buffer do detekcji fluorescencyjnej
OXO Salad SpinnerOXO32480V2BKażda wirówka do sałatek jest w porządku, o ile membrany PVDF są energicznie płukane bez rozdzierania.
Folia uszczelniająca ParafilmBemisParafilm M PM996półprzezroczysta elastyczna folia
Polietylenowe płaskie nakrętki do stożkowych dolnych probówek wirówkowych o pojemności 50 mlFalcon352070
Pierścienie do trzymania probówki 14 ml w środku probówki 50 mlNIE DOTYCZYPrzygotowane w warsztacie mechanicznym
Królik anty-6X Jego tag przeciwciałoAbcamab9108
Tween20Millipore SigmaP2287
folią przezroczystą Snap Cap Falcon dotyczy mleka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
  2. Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
  3. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
  4. Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
  5. Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
  6. Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  8. Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
  9. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  10. Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
  11. Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852(2016).
  12. Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
  13. Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
  14. Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

cykliczne opr nianie i uzupe nianiedetekcja bia ekinkubacja z przeciwcia amidetekcja chemiluminescencyjnadetekcja fluorescencyjnamembrana PVDFbufor blokuj cywir wka do sa atek

Powiązane artykuły