Technika ultra-szybkiego western blottingu jest rozwijana poprzez poprawę kinetyki wiązania antygen-przeciwciało poprzez technologię cyklicznego drenowania i uzupełniania (CDR) w połączeniu ze środkiem wzmacniającym immunoreakcję.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ultra-High-Speed Western Blot przy użyciu technologii wzmacniającej immunoreakcję
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Western blot (znany również jako immunoblot) to kanoniczna metoda badań biomedycznych. Jest powszechnie stosowany do określania względnej wielkości i obfitości określonych białek, a także potranslacyjnych modyfikacji białek. Ta technika ma bogatą historię i pozostaje w powszechnym użyciu ze względu na swoją prostotę. Jednak procedura western blotting słynie z tego, że trwa godziny, a nawet dni, a krytycznym wąskim gardłem jest długi czas inkubacji, który ogranicza jej przepustowość. Te etapy inkubacji są wymagane ze względu na powolną dyfuzję przeciwciał z roztworu masowego do unieruchomionych antygenów na błonie: stężenie przeciwciał w pobliżu błony jest znacznie niższe niż stężenie objętościowe. W tym miejscu przedstawiamy innowację, która radykalnie skraca te interwały inkubacji poprzez poprawę wiązania antygenu poprzez cykliczne opróżnianie i uzupełnianie (CDR) roztworu przeciwciała. Wykorzystaliśmy również technologię wzmacniającą reakcję immunologiczną, aby zachować czułość testu. Połączenie metody CDR z komercyjnym środkiem wzmacniającym reakcję immunologiczną wzmocniło sygnał wyjściowy i znacznie skróciło czas inkubacji przeciwciał. Powstały w ten sposób ultraszybki western blot można uzyskać w ciągu 20 minut bez utraty czułości. Metodę tę można zastosować do western blot przy użyciu zarówno detekcji chemiluminescencyjnej, jak i fluorescencyjnej. Ten prosty protokół pozwala naukowcom lepiej zbadać analizę ekspresji białek w wielu próbkach.
Wprowadzenie
Western blot (znany również jako immunoblot) jest potężną i fundamentalną techniką w szerokim zakresie dyscyplin naukowych i klinicznych. Technika ta służy do badania obecności, względnej obfitości, względnej masy cząsteczkowej i modyfikacji potranslacyjnych białek1. W połączeniu z cyfrową analizą obrazu, metoda ta może niezawodnie analizować obfitość białek i modyfikacje białek2. Chociaż western blot jest wykonywany rutynowo, jest to metoda czasochłonna i pracochłonna. Wymagane są długie inkubacje przeciwciała z błonami. W tym miejscu opisujemy modyfikację metody inkubacji, która pokonuje to ograniczenie bez poświęcania czułości.
Podczas inkubacji błony, przeciwciała unoszą się w roztworze, podczas gdy antygeny są unieruchomione na membranie. Ze względu na ich wysokie powinowactwo szybkość wiązania przeciwciał z antygenem jest szybsza niż dyfuzja przeciwciał z roztworu masowego do błony. W ten sposób powstaje "warstwa zubożona" o niskim stężeniu (Rysunek 1). Może minąć wiele godzin, zanim bardziej odległe przeciwciała dotrą do błony poprzez dyfuzję bierną, która jest głównym czynnikiem odpowiedzialnym za długi czas inkubacji w tej technice. Efekt ten nazywa się ograniczeniem transportu masowego (MTL)3. Zaproponowano, że powtarzające się opróżnianie i uzupełnianie roztworu zawierającego przeciwciała może zakłócić warstwę zubożającą i przezwyciężyć MTL4. Tutaj opracowaliśmy unikalną technikę, która wdraża tę cykliczną koncepcję drenażu i uzupełniania (CDR) w celu zmniejszenia efektu MTL w tradycyjnym protokole western blotting i znacznego skrócenia wymaganego okresu inkubacji.
Aby utrzymać czułość wykrywania przy krótkim czasie inkubacji, użyliśmy technologii wzmacniającej immunoreakcję, która przyspiesza reakcję antygen-przeciwciało, poprawiając tym samym stosunek sygnału do szumu5. Wiele dostępnych na rynku środków wzmacniających reakcję immunologiczną (IRE) składa się z 2 składników (roztwór 1 i 2, patrz tabela materiałów). Zastrzeżony skład lub mechanizm działania IRE nie został ujawniony, ale wcześniej odkryliśmy, że IRE zmniejszył stałą dysocjacji między antygenem a przeciwciałem w testach wiązania fazy stałej, co wskazuje, że zwiększone powinowactwo jest, przynajmniej częściowo, odpowiedzialne za wzmacniający efekt IRE6. Połączenie CDR z IRE daje ultraszybki protokół western blotting, który skraca cały czas zabiegu bez poświęcania czułości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. SDS-PAGE i przenieść na membranę PVDF
- Wykonaj SDS-PAGE, aby oddzielić białka na podstawie względnej wielkości.
UWAGA: Każdy komercyjny lub domowy system żelowy jest w porządku. Prosimy o postępowanie zgodnie z protokołem producenta. - Przenieść oddzielone białka z żelu na membranę PVDF.
UWAGA: Odpowiednie są popularne metody transferu (transfer półsuchy lub mokry). Prosimy o postępowanie zgodnie z protokołem producenta.
2. Blokowanie membran PVDF
- Inkubować błony w odpowiednich blokujących przez 1 godzinę z mieszaniem w temperaturze pokojowej.
UWAGA: W zależności od przeciwciała pierwotnego i systemu detekcji należy dobrać odpowiedni bufor blokujący. Na przykład najbardziej typowymi blokerami są BSA, odtłuszczone mleko w proszku, kazeina i komercyjne polimery syntetyczne. Najczęściej używanymi są PBS i/lub TBS z 0,1% Tween20. Ten etap blokowania można wykonać przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Inkubacja z pierwotnym przeciwciałem
- Przygotować 10% roztwór czynnika wzmacniającego odczyn immunologiczny-1 (IRE-1) z wodą destylowaną. Dobrze wirować.
- Przygotować rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe z 10% IRE-1. Wymieszaj go delikatnie i dokładnie.
- W przypadku stosowania większej membrany (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) dodaj 8 ml roztworu przeciwciała do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. W przypadku stosowania mniejszej membrany (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) dodaj 3 ml roztworu przeciwciała do 14 ml okrągłodennej probówki polipropylenowej (tabela materiałów).
- Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór blokujący. Włóż membranę PVDF do tej rurki palcami w rękawiczkach i upewnij się, że cała membrana przylega do ścianki rurki. Po włożeniu membrany PVDF do probówki, skieruj ją do wewnątrz "stroną białkową" membrany, która pierwotnie stykała się z żelem. Zamknij szczelnie nakrętkę.
- Włóż probówkę o pojemności 50 ml do szklanej butelki do pieca do hybrydyzacji.
UWAGA: Gdy do tej inkubacji używane są probówki o pojemności 14 ml, włóż probówkę o pojemności 14 ml do probówki o pojemności 50 ml, używając pary plastikowych uchwytów pierścieniowych, aby utrzymać rurkę wewnętrzną w środku probówki o pojemności 50 ml. - Włącz piekarnik do hybrydyzacji.
- Inkubować błonę z obrotem 6 obr./min przez co najmniej 5 min.
UWAGA: Upewnij się, że membrana cały czas przylega do ścianki i że (wewnętrzna) rurka jest pozioma, aby równomiernie pokryć membranę roztworem przeciwciała. Skalibrować rozcieńczenie przeciwciała i czas inkubacji przed właściwym eksperymentem.
4. Mycie membrany
- Zatrzymaj obrót.
- Ostrożnie wyjmij membranę PVDF z probówki za pomocą pęsety i umieść membranę w pojemniku z 50 ml PBS-T.
- Krótko przepłukać membranę PBS-T.
- Przepłucz membranę w pojemniku wodą destylowaną, aż nie pojawią się bąbelki. Ma to na celu usunięcie większości przeciwciał.
- Przenieś membranę PVDF z pojemnika do wirówki do sałatek, która zawiera 250 ml PBS-T.
- Umieść kosz sitka w wirówce. Upewnij się, że pokrywka została dobrze założona.
- Aktywuj kołpak i uruchom go na około 20-30 s.
- Wylej roztwór i krótko przepłucz wnętrze wirówki wodą destylowaną.
- Ponownie dodaj 250 ml PBS-T do wirówki.
- Powtórz kroki 4.6 i 4.7.
5. Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
- Przygotować 10% roztwór czynnika wzmacniającego odczyn immunologiczny-2 (IRE-2) z wodą destylowaną. Dobrze wirować.
- Przygotować rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe z 10% IRE-2. Wymieszaj go delikatnie i dokładnie.
- Wybrać objętość roztworu przeciwciała i probówki, jak podano w kroku 3.3.
- Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór. Włóż membranę PVDF do rurki, jak podano w kroku 3.4.
- Włóż probówkę o pojemności 50 ml do szklanej butelki do pieca do hybrydyzacji.
- Włącz piekarnik do hybrydyzacji.
- Inkubować membranę z obrotem 6 obr./min przez co najmniej 5 minut. Upewnij się, że membrana przylega do ścianki przez cały czas i że (wewnętrzna) rurka jest pozioma, aby równomiernie pokryć membranę roztworem przeciwciała.
UWAGA: Skalibruj czas inkubacji przed właściwym eksperymentem. Gdy przeciwciało drugorzędowe jest fluorescencyjnie sprzężone, inkubację należy przeprowadzić w ciemności.
6. Mycie membrany
- Wykonaj kroki od 4.1 do 4.10.
7. Akwizycja obrazu
- Detekcja chemiluminescencyjna
- Umieść kawałek elastycznej folii do półprzeszczepu (10 cm x 15 cm) na płaskiej powierzchni.
- Wymieszaj 2 składniki substratu chemiluminescencyjnego w probówce o pojemności 5 ml.
- Natychmiast przenieś 1,5 ml zmieszanego substratu na elastyczną folię do półprzeszczepu i umieść na niej membranę PVDF. Następnie przenieś resztę roztworu substratu na membranę.
- Inkubować membranę PVDF z wymieszanym substratem na półprzezroczystej elastycznej folii przez 1 minutę.
- Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór podłoża.
- Umieść membranę między parą przezroczystych folii.
- Uzyskaj obraz w trybie chemiluminescencyjnym.
- Detekcja fluorescencyjna
- Podnieś membranę PVDF pęsetą i krótko spuść roztwór.
- Umieść membranę między parą przezroczystych folii.
- Zrób zdjęcie w trybie fluorescencyjnym.
UWAGA: Kroki 7.1 i 7.2 należy wykonywać w bliskiej odległości od urządzenia do obrazowania, aby zapewnić maksymalną czułość. - Gdy sygnał tła jest wysoki, wykonaj etap mycia w pojemniku z 80-100 ml PBS-T: 10 min płukania 3 razy dla przeciwciała pierwszorzędowego i 5 min płukania 6 razy dla przeciwciała drugorzędowego.
UWAGA: Zarówno pierwszorzędowe, jak i drugorzędowe przeciwciała rozcieńczone 10% roztworami IRE mogą być używane do 8-10 razy bez utraty czułości6. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy przykład ilustruje skuteczność metody CDR wraz z technologią wzmacniającą odpowiedź immunologiczną w technice western blot. Inkubację statyczną przeprowadzono na półprzezroczystej, elastycznej folii, na której membrany PVDF inkubowano z roztworem przeciwciał, natomiast inkubację CDR przeprowadzono w piecu do hybrydyzacji poprzez rotowanie probówek zawierających membrany i roztwór przeciwciał (Film). Rysunek 2 przedstawia ilości antygenu i przeciwciał, odpowiednio, niezbędne do dete...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Western blot jest szeroko stosowaną techniką analityczną do wykrywania określonych białek, która została opracowana ~40 lat temu 7,8. Od tego czasu technika ta nadal ewoluowała, a kolejne innowacje poprawiły czułość, szybkość i ilościowość techniki 2,9,10,11,12,13. Pr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów bezpośrednio związanych z treścią niniejszego artykułu.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Division of Intramural Research, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. był wspierany przez Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, a H.N. i K.Y. byli wspierani przez Valor and V Drug Overseas Training Scholarship.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 14 ml probówka PP o okrągłym dnie i wysokiej przejrzystości, z podziałką, z | 352059 | ||
| Apollo do drukarek laserowych | Nie | Nie dotyczy Wszystkie rodzaje folii przezroczystej do drukarek laserowych są w porządku. | |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Każdy rodzaj systemu pozyskiwania obrazów jest odpowiedni do wykrywania chemiluminescencyjnego i/lub fluorescencyjnego. |
| Może uzyskać sygnał Roztwór wzmacniający reakcję immunologiczną | TOYOBO | NKB-101 | |
| GŹDZIK Natychmiastowy beztłuszczowy suchy | goździk | N/A | |
| ECL anty-mysie IgG, peroksydaza chrzanowa związana z F (ab ')2 fragment z owiec | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anty-króliczą IgG, F (ab ') połączony z peroksydazą chrzanową2 fragment od osiołka | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Każdy piec do hybrydyzacji jest w porządku, o ile rurki są równomiernie obracane w pozycji poziomej. |
| Membrana PVDF Immobilon-P, 0,45 &mikro; m wielkość porów | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anty-mysie przeciwciało wtórne IgG | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Kozia przeciwciało anty-królicze IgG Przeciwciało wtórne | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescencyjny substrat | seracare | 5430-0049 | |
| Mysie przeciwciało anty-ß aktynowe | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer do detekcji fluorescencyjnej |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Każda wirówka do sałatek jest w porządku, o ile membrany PVDF są energicznie płukane bez rozdzierania. |
| Folia uszczelniająca Parafilm | Bemis | Parafilm M PM996 | półprzezroczysta elastyczna folia |
| Polietylenowe płaskie nakrętki do stożkowych dolnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Pierścienie do trzymania probówki 14 ml w środku probówki 50 ml | NIE DOTYCZY | Przygotowane w warsztacie mechanicznym | |
| Królik anty-6X Jego tag przeciwciało | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
Bibliografia
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852(2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
