Dwuwymiarowa wizualizacja i kwantyfikacja labilnych, nieorganicznych składników odżywczych roślin i zanieczyszczeń w glebie

Stefan Wagner; Christoph Hoefer; Thomas Prohaska; Jakob Santner

doi:10.3791/61661

Method Article

Dwuwymiarowa wizualizacja i kwantyfikacja labilnych, nieorganicznych składników odżywczych roślin i zanieczyszczeń w glebie

DOI:

10.3791/61661

⸱

September 1st, 2020

Stefan Wagner¹ , Christoph Hoefer² , Thomas Prohaska¹ , Jakob Santner¹^,³

¹Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, ²Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, ³Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia przepływ pracy dla sub-mm wizualizacji 2D wielu labilnych nieorganicznych składników odżywczych i zanieczyszczeń rozpuszczonych za pomocą gradientów dyfuzyjnych w cienkich warstwach (DGT) w połączeniu z obrazowaniem spektrometrii mas. Pobieranie próbek substancji rozpuszczonych i analiza chemiczna o wysokiej rozdzielczości są szczegółowo opisane w celu ilościowego mapowania substancji rozpuszczonych w ryzosferze roślin lądowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę dwuwymiarowej (2D) wizualizacji i kwantyfikacji rozkładu labilnych (tj. odwracalnie zaadsorbowanych) nieorganicznych składników odżywczych (np. P, Fe, Mn) i zanieczyszczeń (np. As, Cd, Pb) w glebie przylegającej do korzeni roślin ("ryzosfera") w submilimetrowej (~100 μm) rozdzielczości przestrzennej. Metoda ta łączy pobieranie próbek substancji rozpuszczonej na bazie zlewu techniką gradientów dyfuzyjnych w cienkich warstwach (DGT) z przestrzennie rozdzielczą analizą chemiczną za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z ablacją laserową (LA-ICP-MS). Technika DGT opiera się na cienkich hydrożelach z jednorodnie rozmieszczonymi fazami wiązania selektywnymi analitowo. Różnorodność dostępnych faz wiązania pozwala na przygotowanie różnych rodzajów żelu DGT po zastosowaniu prostych procedur wytwarzania żelu. W celu zastosowania żelu DGT w ryzosferze, rośliny są uprawiane w płaskich, przezroczystych pojemnikach wzrostowych (ryzotronach), które umożliwiają minimalny inwazyjny dostęp do systemu korzeniowego uprawianego w glebie. Po okresie wstępnego wzrostu, żele DGT są nakładane na wybrane obszary zainteresowania w celu pobrania próbek substancji rozpuszczonej in situ w ryzosferze. Następnie żele DGT są pobierane i przygotowywane do dalszej analizy chemicznej związanych substancji rozpuszczonych za pomocą obrazowania liniowego LA-ICP-MS. Zastosowanie normalizacji wewnętrznej przy użyciu ¹³C oraz zewnętrznej kalibracji przy użyciu wzorców żelowych dopasowanych do matrycy dodatkowo pozwala na ilościowe określenie strumieni substancji rozpuszczonej 2D. Metoda ta jest wyjątkowa ze względu na swoją zdolność do generowania ilościowych obrazów 2D w skali submilimetrowej wielopierwiastkowych strumieni substancji rozpuszczonych w środowisku glebowo-roślinnym, znacznie przewyższając osiągalną rozdzielczość przestrzenną innych metod pomiaru gradientów substancji rozpuszczonej w ryzosferze. Przedstawiono zastosowanie i ocenę metody obrazowania wielu kationowych i anionowych gatunków substancji rozpuszczonych w ryzosferze roślin lądowych oraz podkreślono możliwość połączenia tej metody z uzupełniającymi technikami obrazowania substancji rozpuszczonych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozyskiwanie składników odżywczych przez rośliny uprawne jest kluczowym czynnikiem decydującym o wydajności upraw. Procesy rządzące efektywnym pobieraniem składników odżywczych przez rośliny uprawne były intensywnie badane, zwłaszcza mechanizmy kontrolujące dostępność składników odżywczych i internalizację składników odżywczych przez korzenie roślin na granicy gleby i korzeni, czyli ryzosfery, są uznawane za ich rolę w pozyskiwaniu składników odżywczych przez rośliny. Do ważnych procesów pobierania składników odżywczych przez rośliny należą: transport składników odżywczych w kierunku korzenia; dynamiczne równowagi sorpcyjne między gatunkami rozpuszczonymi w wodzie porowej gleby a gatunkami związanymi ze stałymi powierzchniami gleby; konkurencja mikrobiologiczna o składniki odżywcze; mineralizacja mikrobiologiczna składników odżywczych zawartych w materii organicznej gleby; i internalizacja składników odżywczych do syplazmy korzeniowej. Absorpcja nieorganicznych zanieczyszczeń metalami śladowymi (oidami) jest w dużej mierze kontrolowana przez te same mechanizmy.

W zależności od dostępności składników odżywczych i zanieczyszczeń, zapotrzebowania roślin i dyfuzyjności w glebie, można zaobserwować zróżnicowane wzorce składników odżywczych w ryzosferze. W przypadku silnie sorpujących się pierwiastków o stosunkowo wysokich wskaźnikach internalizacji (np. P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb) stwierdza się zubożenie labilnej (tj. odwracalnie zaadsorbowanej) frakcji pierwiastków w porównaniu z glebą luzem, przy czym szerokość strefy zubożenia często wynosi ≤1 mm, podczas gdy w przypadku bardziej ruchliwych składników odżywczych, takich jak NO₃^-, strefy zubożenia mogą rozciągać się do kilku centymetrów¹. Co więcej, zaobserwowano akumulację pierwiastków, takich jak Al i Cd, gdy ich dostępność przekracza wskaźniki pobierania przez rośliny²^,³.

Biorąc pod uwagę znaczenie procesów ryzosfery w obiegu składników odżywczych i zanieczyszczeń, opracowano kilka technik pomiaru frakcji pierwiastków dostępnych dla roślin w wysokiej rozdzielczości przestrzennej⁴^,⁵. Jednak pomiar niestabilnego rozkładu substancji rozpuszczonej na małą skalę okazał się trudny z kilku powodów. Główną trudnością jest pobieranie próbek bardzo małych (niski zakres μl) objętości gleby i/lub wody porowej w określonych miejscach przylegających do korzeni żywych roślin, aby rozwiązać strome gradienty składników odżywczych w ryzosferze. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest użycie mikroprzyssawek do ekstrakcji próbek wody porowej⁶. Za pomocą tej metody A. Göttlein, A. Heim i E. Matzner⁷ zmierzyli stężenia składników pokarmowych w wodzie porowej w glebie w pobliżu korzeni Quercus robur L. z rozdzielczością przestrzenną ~1 cm. Trudność w analizie objętości μl gleby lub roztworu glebowego polega na tym, że te małe objętości próbek, w połączeniu z niskimi stężeniami wszystkich oprócz głównych składników odżywczych, wymagają bardzo czułych technik analizy chemicznej.

Alternatywnym systemem, zdolnym do rozwiązywania gradientów składników odżywczych z rozdzielczością do ~0,5 mm, jest wyhodowanie maty korzeniowej na powierzchni bloku gleby, z cienką hydrofilową warstwą membrany oddzielającą glebę od korzeni8^,⁹. W tej konfiguracji substancje rozpuszczone mogą przechodzić przez błonę, a korzenie mogą pobierać składniki odżywcze i zanieczyszczenia z gleby, podczas gdy wysięki korzeniowe mogą dyfundować do gleby. Po utworzeniu gęstej warstwy korzeniowej można pobrać próbki z bloku gleby i pokroić go w plastry w celu uzyskania próbek gleby w celu późniejszej ekstrakcji frakcji pierwiastków. W ten sposób można analizować jednowymiarowe gradienty składników odżywczych i zanieczyszczeń, uśrednione na stosunkowo dużym obszarze (~100 cm²).

Kolejnym wyzwaniem jest uzyskanie próbek labilnej, dostępnej dla roślin frakcji pierwiastków, ponieważ większość technik chemicznego wydobywania gleby działa zupełnie inaczej niż mechanizmy, za pomocą których rośliny pobierają składniki odżywcze i zanieczyszczenia. W wielu protokołach ekstrakcji gleby gleba jest mieszana z roztworem ekstrahentu w celu ustalenia (pseudo)równowagi między rozpuszczoną a zasorbowaną frakcją pierwiastków. Jednak rośliny stale internalizują składniki odżywcze i dlatego często stopniowo zubażają glebę ryzosfery. Chociaż protokoły ekstrakcji równowagowej są szeroko stosowane jako testy gleby, ponieważ są łatwe do wdrożenia, wyekstrahowana frakcja składników odżywczych często nie reprezentuje dobrze frakcji składników odżywczych dostępnej dla roślin¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³. Metody zlewu, które w sposób ciągły zubażają glebę w składniki odżywcze, zostały zaproponowane jako korzystne metody i mogą lepiej przypominać podstawowy mechanizm pobierania składników odżywczych, naśladując procesy pobierania przez korzenie¹⁰^,¹¹^,¹⁴^,¹⁵.

Oprócz metod opisanych powyżej, dla określonych pierwiastków i parametrów (bio)chemicznych gleby, opracowano prawdziwe aplikacje do obrazowania, zdolne do pomiaru ciągłych map parametrów z rozdzielczością ≤100 μm w polach widzenia kilku^cm2⁵. Autoradiografia może być wykorzystana do zobrazowania rozkładu pierwiastków w ryzosferze, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie izotopy promieniotwórcze¹⁶. Optody planarne umożliwiają wizualizację ważnych parametrów chemicznych gleby, takich jak pH i pO₂¹⁷^,¹⁸^,¹⁹, a aktywność enzymu lub całkowite rozmieszczenie białek można odwzorować za pomocą technik obrazowania fluorescencyjnego, takich jak zymography gleby²⁰^,²¹^,²²^,²³ i/lub metody blottingu korzeniowego24. Podczas gdy zymografia i autoradiografia ograniczają się do pomiaru pojedynczego parametru na raz, obrazowanie pH i pO₂ za pomocą optod planarnych można wykonywać jednocześnie. Bardziej tradycyjne techniki mat korzeniowych dostarczają tylko informacji 1D, podczas gdy mikroprzyssawki dostarczają pomiarów punktowych lub informacji 2D o niskiej rozdzielczości, jednak oba podejścia pozwalają na analizę wieloelementową. Niedawno P. D. Ilhardt, et al.²⁵ przedstawili nowatorskie podejście wykorzystujące spektroskopię rozpadu indukowanego laserem (LIBS) do mapowania całkowitych rozkładów wielopierwiastkowych 2D z rozdzielczością ~100 μm w próbkach rdzenia glebowego, w których naturalny rozkład pierwiastków został zachowany przez staranne przygotowanie próbki.

Jedyną techniką zdolną do ukierunkowanego pobierania próbek 2D wielu substancji rozpuszczonych składników odżywczych i zanieczyszczeń w wysokiej rozdzielczości przestrzennej jest technika dyfuzyjnych gradientów w cienkich warstwach (DGT), metoda próbkowania oparta na zlewach, która unieruchamia labilne gatunki metali śladowych (loid) in situ na materiale wiążącym osadzonym w warstwie hydrożelu²⁶^,²⁷. DGT została wprowadzona jako technika specjacji chemicznej do pomiaru labilnych substancji rozpuszczonych w osadach i wodach, a wkrótce została zaadoptowana do użytku w glebach²⁸. Umożliwia obrazowanie wielopierwiastkowych substancji rozpuszczonych w skali poniżej milimetra, co początkowo zademonstrowano w osadzie rzecznym²⁹, a następnie zostało rozwinięte pod kątem zastosowania w ryzosferach roślinnych³⁰^,³¹^,³²^,³³.

Do pobierania próbek DGT, na pojedynczy korzeń rośliny, który rośnie w warstwie powierzchniowej bloku gleby, nakłada się arkusz żelu o wymiarach około 3 cm x 5 cm, z hydrofilową membraną oddzielającą żel od gleby. W czasie kontaktu labilne składniki odżywcze i/lub zanieczyszczenia dyfundują w kierunku żelu i są natychmiast wiązane przez materiał wiążący zawarty w żelu. W ten sposób ustala się gradient stężenia, a tym samym ciągły strumień netto w kierunku żelu, który przeważa w czasie pobierania próbek. Po pobraniu próbek hydrożel może zostać usunięty i przeanalizowany przy użyciu analitycznej techniki chemicznej pozwalającej na analizę przestrzenną. Wysoce wyspecjalizowaną i często stosowaną techniką w tym celu jest spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (LA-ICP-MS) z ablacją laserową. W niektórych wczesnych badaniach stosowano również emisję promieniowania rentgenowskiego indukowaną mikrocząstkami (PIXE)²⁹. Pobieranie próbek DGT w połączeniu z analizą LA-ICP-MS pozwala na obrazowanie wielopierwiastkowe w rozdzielczości przestrzennej ~100 μm. W przypadku zastosowania bardzo czułych technik ICP-MS (np. ICP-MS w polu sektorowym) można osiągnąć wyjątkowo niskie granice wykrywalności. W badaniu nad wpływem wapnowania na pobieranie Zn i Cd przez kukurydzę¹⁵, byliśmy w stanie zmapować labilne Cd w ryzosferze kukurydzy w niezanieczyszczonej glebie z granicą wykrywalności wynoszącą 38 pg ^cm-2 Cd na powierzchnię żelu. DGT, optody planarne i zymografia opierają się na dyfuzji pierwiastka docelowego z gleby do warstwy żelu, która może być wykorzystana do łącznego zastosowania tych metod w celu jednoczesnego lub sekwencyjnego obrazowania dużej liczby parametrów istotnych dla pobierania składników odżywczych i zanieczyszczeń przez rośliny. Szczegółowe informacje na temat analityczno-chemicznych aspektów obrazowania DGT, na temat potencjału łączenia DGT z innymi metodami obrazowania oraz na temat jego zastosowań są kompleksowo omówione w ref.³⁴^,³⁵.

W tym artykule opisujemy, jak przeprowadzić eksperyment z obrazowaniem substancji rozpuszczonych za pomocą techniki DGT na korzeniach roślin lądowych w nienasyconym środowisku glebowym, włączając w to uprawę roślin, wytwarzanie żelu, aplikację żelu, analizę żelu i generowanie obrazu. Wszystkie kroki są szczegółowo opracowane, w tym uwagi dotyczące krytycznych kroków i eksperymentalnych alternatyw.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja żeli DGT

UWAGA: Dostępnych jest kilka typów żeli DGT do obrazowania 2D labilnych gatunków substancji rozpuszczonej w wysokiej (poniżej mm) rozdzielczości przestrzennej³⁵. W tym miejscu pokrótce podsumowano wytwarzanie trzech dobrze scharakteryzowanych żeli wiążących o wysokiej rozdzielczości (HR)-DGT stosowanych w zastosowaniach obrazowania substancji rozpuszczonych. Procedury laboratoryjne do analizy pierwiastków śladowych, a także szczegółowe procedury wytwarzania wszystkich prezentowanych żeli HR-DGT są opisane w sekcjach S1 i S2 Informacje Uzupełniające (SI).

Mieszany anion i kationowy żel wiążący na bazie poliuretanu (HR-MBG; SI S2.1)³¹
1. Przygotować zawiesinę żelu poliuretanowego z jednorodnie zdyspergowanymi fazami wodorotlenku cyrkonu (IV) i iminodioctanu (IDA).
2. Zawiesinę żelu należy pokryć cienką warstwą na szklanej płytce i zainicjować tworzenie żelu przez odparowanie rozpuszczalnika, aby uzyskać cienką warstwę 0,1 mm, odporną na rozdarcie mieszaninę żelu wiążącego aniony i kationy (HR-MBG).
Żel wiążący anion poliakrylamidowo-cyrkonowy (HR-ABG; SI S2.2)³⁶
1. Wytwarzaj usieciowany żel poliakrylamidowy (APA) o grubości 0,4 mm zgodnie z ustalonymi procedurami odlewania żelu³⁷ (patrz SI S2.4, aby uzyskać szczegółowy protokół wytwarzania APA).
2. Wytrącić fazy wodorotlenku cyrkonu (IV) w prefabrykowanym żelu APA, aby uzyskać żel wiążący aniony o grubości 0,4 mm (HR-ABG).
Żel wiążący kationy poliakrylamidowo-iminodioctanu (HR-CBG; SI S2.3)³⁸
1. Przygotować zawiesinę żelu poliakryloamidowego z jednorodnie zdyspergowanymi fazami IDA.
2. Odlać żel między dwie szklane płytki i zainicjować reakcję polimeryzacji, aby uzyskać żel wiążący kationy o grubości 0,4 mm (HR-CBG), w którym fazy IDA są osadzone po jednej stronie żelu.

2. Uprawa roślin

UWAGA: System eksperymentalny używa rhizotrons⁴ (Rysunek 1) do uprawy roślin w nienasyconej glebie do obrazowania substancji rozpuszczonych. Najpierw opisano napełnianie i podlewanie gleby ryzotronowej, a następnie podano szczegółowe informacje na temat eksperymentalnego wzrostu roślin. Szczegółowe informacje na temat konstrukcji ryzotronu i przygotowania podłoża glebowego przed wypełnieniem do ryzotronu przedstawiono w sekcji SI S3.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Konstrukcja ryzotronu (nie w skali). (A) Widok rozstrzelony pojemnika na wzrost ryzotronu. (B) Złożony ryzotron podczas wzrostu rośliny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wypełnienie gleby ryzotronowej
1. Przed napełnieniem ryzotronu wstępnie zwilżoną glebą (grawimetryczna zawartość wody, , jest znane; patrz SI S3.2), należy zamknąć otwory wodne z tyłu ryzotronu za pomocą taśmy klejącej i zdjąć płytę czołową oraz jej szyny mocujące i.
2. Zważyć pusty ryzotron (z wyłączeniem płyty czołowej, szyn i), osiem płytek akrylowych o wymiarach 5 cm x 11 cm i 16 zacisków (tabela materiałów) i zapisać sumę mas.
3. Przymocuj jedną małą akrylową płytkę na dole ryzotronu za pomocą dwóch zacisków z każdej strony, przy nacisku zacisków skierowanym na ramę ryzotronu, tak aby płyta nie zginała się do wewnątrz, a objętość była stała.
4. Nachyl lekko ryzotron w kierunku małej plastikowej płytki i wypełnij ją wstępnie zwilżoną glebą do wysokości ~4 cm (Rysunek 2A). Rozprowadź glebę wewnątrz ryzotronu, lekko mieszając ryzotron i delikatnie ściskaj glebę o kilka mm (w zależności od konkretnych cech gleby) za pomocą narzędzia do zagęszczania (Rysunek 2B).
5. Powtarzaj 2.1.3 - 2.1.4, aż ryzotron wypełni się glebą (Rysunek 2C). Pozostaw odstęp ~ 3 cm u góry na późniejsze sadzenie sadzonek w ryzotronie.
6. Zważyć wypełniony glebą ryzotron (w tym 8 małych szalek i 16 zacisków) i zapisać wagę. Od tego odejmij masę pustego ryzotronu otrzymaną w ppkt 2.1.2 i zapisz różnicę masy, tj. masę wilgotnej gleby, (g), w ryzotronie.
7. Oblicz masę suchej gleby w ryzotronie, (g), zgodnie z równaniem 1, a następnie oblicz gęstość objętościową suchej gleby, (g ^cm-3), w ryzotronie zgodnie z równaniem 2,
  
  Tutaj (cm³) to całkowita wewnętrzna objętość ryzotronu.
  UWAGA: Typowe wartości w ryzotronie mieszczą się w przedziale 1,0-1,4 g ^cm-3. Nie przekraczaj 1,5 g ^cm-3, ponieważ wzrost korzeni może być utrudniony powyżej tej wartości.
8. Umieść wypełniony glebą ryzotron na skrzynce nośnej i usuń wszystkie zaciski i małe płytki z ryzotronu (Rysunek 2D). Ostrożnie wyczyść ramę ryzotronową (tj. krawędzie) za pomocą bibuły, ponieważ pozostałe cząstki gleby na ramie mogą powodować nieszczelności.
  UWAGA: Odsłonięta powierzchnia gleby musi być jednorodna i wyrównana ramą ryzotronową bez żadnych pęknięć i szczelin. Jeśli nie, opróżnić ryzotron i powtórzyć czynności 2.1.2 - 2.1.8.
9. Wytnij dwa kawałki folii politetrafluoroetylenowej (PTFE) (tabela materiałów) na wymiary 22 cm x 13 cm każdy. Dodatkowo przytnij kawałek folii plastikowej o wymiarach 46 cm x 15 cm. Zapisz sumę wag PTFE i folii plastikowej. Umieść pierwszy kawałek folii PTFE na górnej połowie odsłoniętej powierzchni gleby w ryzotronie, rozciągając się ~ 1 cm ponad poziom gleby w górnej części ryzotronu.
10. Ostrożnie przymocuj folię PTFE do ramy ryzotronu za pomocą taśmy klejącej ( Rysunek 2E). Zacznij od zamocowania najpierw jednego rogu na szczycie ryzotronu, następnie jego przeciwległego rogu, a na końcu dwóch rogów dalej w dół ryzotronu. Zastosuj napięcie podczas mocowania narożników 2-4, aby zapewnić płaską powierzchnię folii. Jeśli pojawią się fałdy, otwórz i ponownie przymocuj taśmę w poszczególnych rogach (nie wszystkie naraz), aż wszystkie fałdy zostaną usunięte, a folia PTFE będzie płaska i przylegająca do powierzchni gleby.
11. Umieść drugi kawałek folii PTFE na dolnym końcu ryzotronu, zachodząc na górny kawałek folii PTFE na ~1 cm. Powtórz 2.1.10 dla przymocowania drugiej folii PTFE do ryzotronu.
12. Umieść folię plastikową (46 cm x 15 cm) na foliach PTFE. Utrwalić folię z tworzywa sztucznego, stosując procedurę utrwalania opisaną w ppkt 2.1.10.
13. Umieść przednią płytę na wypełnionym ziemią i pokrytym folią ryzotronie. Umieść po jednej szynie z każdej strony ryzotronu i dokręć ręcznie, aby przymocować szyny, a tym samym płytę czołową do ryzotronu. są umieszczone w kierunku zamkniętej strony ryzotronu, tj. strony z otworami do podlewania (Rysunek 1A).

figure-protocol-10
Rysunek 2: Montaż i wypełnienie ryzotronu w celu wyhodowania roślin w glebie w celu obrazowania substancji rozpuszczonej w ryzosferze. (A) Wypełnienie gleby w ryzotronie. (B) Zagęszczenie wypełnionej gleby za pomocą narzędzia do zagęszczania. (C) Wypełniony glebą ryzotron z małymi akrylowymi płytkami i zaciskami. (D) Wypełniony glebą ryzotron z odsłoniętą powierzchnią gleby. (E) Wypełniony glebą ryzotron częściowo pokryty ochronną folią PTFE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-11
Rycina 3: Obchodzenie się z ryzotronem i aplikacja żelu DGT. (A) Podlewanie gleby za pomocą końcówek pipet o pojemności 10 ml w otworach do podlewania w tylnej części ryzotronu. (B) Sadzenie siewek (oznaczonych jako zielone plamki) w wypełnionym glebą i zamkniętym ryzotronie. (C) Rhizotron obsadzony sadzonkami Salix smithiana i usunięty przedni talerz oraz plastikową osłonę foliową. (D) Ostrożnie zdejmij osłonę z folii PTFE przed nałożeniem żelu DGT. (E) Zdjęcie w wysokiej rozdzielczości ROI na granicy faz gleba-korzeń. (F) Nałożenie płyty czołowej wyposażonej w żel DGT na ryzotron. (G) Zdjęcie zwrotu z inwestycji w żel DGT nałożony podczas pobierania próbek substancji rozpuszczonej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podlewanie gleby
1. Określ zdolność zatrzymywania wody (WHC) gleby doświadczalnej w ryzotronie. W tym celu należy wyprodukować dwa ryzotrony z otwartym dnem i wypełnić je glebą, jak określono w sekcji 2.1. Całkowicie nasycić te otwarte, wypełnione glebą ryzotrony, zanurzając je w zbiorniku wodnym na 16 godzin i osuszając ryzotrony przez 8 godzin.
2. Pobrać złożoną próbkę gleby o masie ~50 g z losowych miejsc w ryzotronach o otwartym dnie i wysuszyć próbkę w temperaturze 105 °C, aby określić zgodnie z równaniem S1. Wyznaczone odpowiada WHC gleby i dlatego jest wyrażone jako (g ^g-1).
3. Zdefiniuj cel w eksperymentalnym ryzotronie. Podczas fazy wzrostu ustaw na poziomie 60 % WHC (tj. współczynnika WHC, ), aby zapewnić roślinom odpowiednią ilość wody, unikając jednocześnie warunków beztlenowych w ryzotronie.
4. Oblicz całkowitą masę wody, która ma zostać dodana, (g), aby nawodnić glebę w ryzotronie w miejscu docelowym zgodnie z równaniem 3. Weź pod uwagę masę wody obecnej w glebie w ryzotronie, (g).
5. Podziel przez liczbę ryzotronowych otworów wodnych (tutaj 14), aby otrzymać masę wody, która ma być dodana do każdego wodopoju. Dodaj wodę, wciskając końcówki pipet o pojemności 10 ml do otworów do podlewania i pozwalając wodzie spływać do gleby grawitacyjnie (Rysunek 3A).
Wzrost roślin
1. Nasiona rośliny doświadczalnej należy wstępnie wykiełkować (np. na mokrej bibule filtracyjnej) zgodnie ze szczególnymi wymaganiami dotyczącymi kiełkowania nasion, aż do pojawienia się korzonka (do 1 cm długości).
2. Posadź do dwóch sadzonek w ryzotronie, jak wskazano w Rysunek 3B. Podczas sadzenia dodaj ~5 ml wody bezpośrednio do sadzonek, aby wspomóc ich wzrost. Przykryj górny otwór ryzotronu przez pierwsze ~ dwa dni po posadzeniu przezroczystą, zatrzymującą wilgoć folią (Tabela materiałów). Owiń ryzotron folią aluminiową, aby zapobiec rozwojowi mikrofitów.
  UWAGA: Oprócz sadzonek sadzonki roślin można również uprawiać w ryzotronach.
3. Przenieś posadzony ryzotron do pomieszczenia wzrostowego, w którym warunki środowiskowe (tj. temperatura, wilgotność, natężenie światła) są dostosowane do konkretnych wymagań rośliny. Nachyl ryzotron pod kątem 25°-35°, aby zapewnić rozwój korzeni wzdłuż płytki czołowej poprzez grawitropizm.
4. Podczas wzrostu roślin należy grawimetrycznie utrzymywać docelową zawartość wody w ryzotronie poprzez okresowe podlewanie co 2-4 dni za pomocą wodopojów ryzotronowych, jak opisano w ppkt 2.2.5. Utrzymuj powierzchnię gleby w górnym otworze wilgotną poprzez regularne dodawanie ~5 ml wody.
  UWAGA: Jeżeli rośliny są uprawiane przez dłuższy czas i oczekuje się, że biomasa roślinna znacznie zmniejszy ilość wody dodawanej do ryzotronu proponowaną metodą, należy uwzględnić masę biomasy roślinnej poprzez hodowlę roślin w oddzielnych kontrpróbach ryzotronów oraz zbiór i ważenie tkanek roślinnych w określonych odstępach czasu.
5. Gdy korzenie osiągną odpowiednie miejsce wzdłuż płytki czołowej, najlepiej w środku ryzotronu, należy zastosować żele DGT do pobierania próbek rozkładu substancji rozpuszczonej w ryzosferze.

3. Pobieranie próbek rozkładu substancji rozpuszczonej

Aplikacja żelu
1. Zwiększ w ryzotronie z 60 % do 80 % 24 godziny przed nałożeniem żelu, jak opisano w 2.2.4.-2.2.5. Zapewnia to dobry kontakt gleba-żel i umożliwia dyfuzję substancji rozpuszczonej do żelu, jednocześnie unikając beztlenowych warunków glebowych podczas pobierania próbek substancji rozpuszczonej.
2. Weź nową, oczyszczoną kwasem płytkę czołową, wyrównaj ją z ryzotronem używanym do pobierania próbek i zaznacz obszary zainteresowania (ROI) na płytce. Przenieś płytkę na ławkę z przepływem laminarnym lub w inne środowisko wolne od kurzu i metalu, nieoznaczoną stroną do góry.
3. Przyciąć żel wiążący DGT na akrylowym podłożu do wymaganego prostokątnego rozmiaru odpowiadającego ROI, zwykle około 3 cm × 5 cm, za pomocą żyletek pokrytych PTFE. Pokrój żel, naciskając, a nie przesuwając żyletkę, aby zapewnić wyraźne cięcie. Umieść prostokątną cząstkę żelu po nieoznaczonej stronie płytki w zaznaczonym miejscu ROI.
  UWAGA: W przypadku stosowania HR-MBG pod żelem można dodać folię dystansową o grubości 100 μm, aby zapewnić dobry kontakt żelu z systemem korzeniowym gleby.
4. Wytnij membranę poliwęglanową o grubości 10 μm (wielkość porów 0,2 μm; Tabela materiałów) do rozmiaru, który zwiększa rozmiar żelu o ≥1 cm z każdej strony i umieść membranę na żelu. Nałóż trochę wody, aby usunąć pęcherzyki powietrza ze stosu.
5. Przymocuj membranę wzdłuż wszystkich czterech krawędzi za pomocą winylowej taśmy izolacyjnej (tabela materiałów). W tym procesie ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza uwięzione między żelem a membraną za pomocą plastikowej pęsety. Taśma może stykać się tylko z membraną, a nie z żelem.
  UWAGA: Jeśli taśma wejdzie w kontakt z żelem, pęcherzyki powietrza zostaną uwięzione między żelem a membraną lub końcowa powierzchnia membrany wykazuje fałdy, stos żel/membrana musi zostać ponownie złożony, ponieważ strumień dyfuzyjny substancji rozpuszczonych do żelu może być osłabiony³⁵ (powtórz 3.1.3 - 3.1.5).
6. Umieść ryzotron na stojaku, zdejmij szyny i ostrożnie zdejmij płytę czołową (Rysunek 3C). Usuń folię plastikową, odetnij folię PTFE na krawędziach ryzotronu i powoli odklej folię PTFE, aby uniknąć zakłócenia systemu glebowo-korzeniowego (Rysunek 3D).
7. Wykonaj ortogonalne zdjęcie zwrotu z inwestycji za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej (DSLR) (tabela materiałów), aby ułatwić interpretację i prezentację rozkładu substancji rozpuszczonej w oparciu o strukturę gleby i morfologię korzeni (Rysunek 3E). Użyj stojaka na aparat i, jeśli jest dostępny, obiektywu makro. Ustaw aparat tak, aby środek zdjęcia odpowiadał środkowi ROI, a płaszczyzna ostrości aparatu była równoległa do powierzchni gleby. Dołącz podziałkę liniową (np. linijkę) do zdjęcia.
8. Przymocuj płytkę wyposażoną w stos żelowo-membranowy do otwartego ryzotronu (Rysunek 3F). Dlatego wyrównaj jedną krawędź płytki z krawędzią ryzotronu i delikatnie "zegnij" płytkę w kierunku gleby. Ten sposób aplikacji pomaga uniknąć pęcherzyków powietrza między stosem żelu/membrany a systemem glebowo-korzeniowym. Zamocuj płytę czołową za pomocą szyn i.
  UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie i należy go wykonać ostrożnie. Płytki nie można przesunąć po nawiązaniu kontaktu między stosem żelu/membrany a systemem glebowo-korzeniowym bez przemieszczenia gleby i korzeni.
9. Zapisz dokładny czas rozpoczęcia rozmieszczania żelu i zrób zdjęcie wdrożonego żelu przy ROI, jak podano w 3.1.7 (Rysunek 3G). Owinąć ryzotron w folię aluminiową i przenieść do pomieszczenia do uprawy do końca okresu pobierania próbek substancji rozpuszczonej (często 24 godziny).
Pobieranie żelu
1. Umieść ryzotron na pojemniku podtrzymującym, ostrożnie zdejmij płytę czołową i spłucz stos żelu/membrany na płycie wodą, aby zmyć przylegające cząstki (Rysunek 4A). Zapisz dokładny czas zakończenia podawania żelu. Pobrać próbkę gleby z ROI, aby określić rzeczywistą glebę w ryzotronie zgodnie z równaniem S1.
2. Przenieś płytę czołową do ławki z przepływem laminarnym, stos żelu/membrany skierowany do góry. Wyjmij żel z płyty czołowej, ostrożnie usuwając najpierw taśmę wzdłuż wszystkich czterech krawędzi, a następnie membranę poliwęglanową pokrywającą żel (Rysunek 4B). Nanieś wodę, aby żel swobodnie unosił się na cienkiej warstwie wody na płytce stroną stykającą się z glebą skierowaną do góry.
  UWAGA: Bardzo ważne jest, aby śledzić orientację żelu. Strona żelowa wystawiona na działanie gleby i korzeni musi być zawsze skierowana do góry (w stronę użytkownika).
Suszenie żelu
1. Wytnij prostokątny kawałek bibuły żelowej (tabela materiałów) i umieść nieco mniejszy kawałek membrany polieterosulfonowej (wielkość porów 0,45 μm; Tabela materiałów) na górze.
2. Przenieś żel z płytki na bibułę żelową/stos membrany za pomocą plastikowej pęsety, stroną stykającą się z glebą do góry. Żel musi być rozluźniony (tj. nie rozciągnięty) i całkowicie płaski, bez pęcherzyków powietrza między żelem a membraną. Nałóż trochę wody na stos bibuły/membrany żelowej, aby ułatwić przenoszenie i pozycjonowanie żelu.
3. Przykryj całkowicie stos bibuły/membrany/żelu kawałkiem folii z tworzywa sztucznego i oznacz próbkę żelu i jej orientację na folii plastikowej (Rysunek 4C). Umieść stos bibuły/membrany/żelu/folii plastikowej w suszarce próżniowej do żelu (tabela materiałów) i wysusz, aż stos zostanie całkowicie wysuszony (zwykle 48-72 godziny). W przypadku HR-MBG ustaw temperaturę na 50-55 °C, w przypadku HR-ABG i HR-CBG najlepiej suszyć w temperaturze pokojowej.
4. Wyjmij bibułę żelową z wysuszonego stosu i przenieś żel, który jest teraz nierozerwalnie połączony z membraną polieterosulfonową, do torebki strunowanej. Osłona z folii z tworzywa sztucznego pozostaje na żelu na krótko przed analizą LA-ICP-MS.
5. Dołącz kawałek żelu z oryginalnego arkusza żelu jako półfabrykat metody, który nie jest narażony na zabrudzenia. Metodę ślepej próby żelowej należy przetworzyć identycznie z żelem do próbki zgodnie z ppkt 3.3.2-3.3.4.

figure-protocol-26
Rysunek 4: Pobieranie żelu DGT i przygotowanie do suszenia po pobraniu próbki substancji rozpuszczonej. (A) Płytka z żelem DGT i ryzotronem bezpośrednio po pobraniu próbki substancji rozpuszczonej. (B) Pobieranie żelu DGT z płytki w ławie z przepływem laminarnym. (C) Stos bibuły żelowej / membrany polieterosulfonowej / żelu DGT / folii z tworzywa sztucznego do suszenia żelu. Należy pamiętać, że żel jest lekko zabarwiony po umieszczeniu na glebie ryzosferycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Analiza chemiczna żelu wiążącego DGT

UWAGA: W tym protokole analiza rozkładu substancji rozpuszczonej na żelu wiążącym DGT jest wykonywana przez LA-ICP-MS przy użyciu nanosekundowego systemu LA ekscymerowego ArF 193 nm, wyposażonego w dwuobjętościową komórkę ablacyjną sprzężoną z kwadrupolowym ICP-MS (Rysunek 5). Wszystkie instrumenty są wymienione w Tabeli Materiałów. Alternatywnie można zastosować nanosekundowe półprzewodnikowe systemy LA 213 nm lub 266 nm³⁶^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³. Jeśli wymagana jest zwiększona czułość lub rozdzielczość masy, pole sektorowe ICP-MS jest alternatywą dla kwadrupolowego ICP-MS¹⁵^,⁴⁴. Szczegóły dotyczące przygotowania wzorców żelowych DGT do zewnętrznej kalibracji i sprzężenia układu LA z kwadrupolem ICP-MS przedstawiono w sekcjach SI S4 i S5.

figure-protocol-27
Rysunek 5: Konfiguracja LA-ICP-MS do analizy żelu DGT. (A) Nanosekundowy układ LA ekscymerowy ArF 193 nm i kwadrupolowy ICP-MS. (B) Suszone żele umieszczone na szklanych płytkach i utrwalone na stoliku na próbkę LA, gotowe do wprowadzenia do komory ablacyjnej. (C) Gaz nebulizatora (Ar) z ICP-MS i gaz nośny aerozolu (He lub Ar) z komory ablacyjnej połączonej z ICP za pomocą dwukierunkowego rozdzielacza Y i łącznika palnika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przygotowanie próbki do LA-ICP-MS
1. Przenieść wysuszone próbki żelu, wzorce i półfabrykaty metody (które są połączone ze wspornikiem membrany polieterosulfonowej) na pojedyncze kawałki dwustronnej taśmy klejącej (Tabela materiałów), stroną żelową skierowaną do góry. Przytnij nadmiar części taśmy, aby zaoszczędzić miejsce w komorze ablacyjnej.
2. Zamontuj wysuszone żele na szklanych płytkach. Dla każdej próbki żelu, serii standardowej lub ślepej próby metody należy stosować indywidualne płytki szklane, aby umożliwić elastyczne rozmieszczenie na stoliku na próbkę LA (typowy rozmiar 10 cm × 10 cm). Użyj noża do szkła, aby dostosować rozmiar szklanej płyty w razie potrzeby. Przymocuj szklane płytki za pomocą żeli na stoliku próbki LA (Rysunek 5B) za pomocą plasteliny (Tabela materiałów). Wypoziomuj powierzchnię żelu, regulując podłogę stolika i zablokuj stolik na próbkę w komorze ablacyjnej.
Analiza skanowania liniowego LA-ICP-MS
1. Sprzęgnij system LA z ICP-MS zgodnie z opisem w sekcji S5 układu SI. W oprogramowaniu LA (Tabela materiałów) ustaw ustawienia światła kamery (tj. "Pierścień", "Koncentryczny" i "Transmitowane"), aby oświetlić powierzchnię żelu w komorze ablacyjnej i skupić się na powierzchni żelu, regulując odległość osi z. Przejdź do losowych miejsc w komórce, aby upewnić się, że wszystkie powierzchnie żelu są ostre.
2. Ustaw parametry LA w oknie "Laser Setup" w oprogramowaniu LA. Typowe ustawienia używane w analizie liniowej LA-ICP-MS żeli DGT to: tryb ciągły; wydajność energetyczna 20-30%; częstotliwość powtarzania 10-20 Hz; średnica plamki 100-200 μm; Szybkość skanowania 150-250 μm ^S-1.
  UWAGA: Parametry muszą być zoptymalizowane pod kątem rodzaju użytego żelu i mogą się różnić. Parametry mogą być również ulepszane w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu, rozdzielczości przestrzennej lub skrócenia czasu akwizycji w zależności od konfiguracji eksperymentalnej i instrumentalnej. Użyj stosunkowo niskiej mocy wyjściowej (≤40 %) i częstotliwości powtarzania (≤25 Hz), aby uniknąć przenikania przez żele do materiałów podkładowych³⁹. Upewnij się, że prędkość skanowania laserowego jest ≤ średnicy plamki podzielonej przez całkowity czas trwania cyklu skanowania ICP-MS (patrz 4.2.6), aby uniknąć kompresji punktów danych, a tym samym utraty rozdzielczości w kierunku skanowania⁴⁵. Na przykład, przy ustawianiu średnicy plamki 200 μm i całkowitego czasu trwania cyklu skanowania ICP-MS wynoszącego 0,25 s, prędkość skanowania powinna wynosić ≤800 μm ^s-1.
3. Wybierz narzędzie do tworzenia linii i narysuj pojedynczy wzór linii o długości ~1 mm w poprzek wzorca żelu. Kliknij prawym przyciskiem myszy wzór linii w oknie 'Scan Patterns' (Wzorce skanowania) i sprawdź, czy parametry LA są ustawione w 4.2.3. zostały przyjęte. Użyj narzędzia "Duplikuj skany", aby zduplikować tę linię cztery razy, przy czym odległość między liniami (odległość między środkami) jest większa niż średnica plamki (Rysunek 6). Takie podejście oferuje w sumie pięć równoległych linii na standard żelu (n = 5). Powtórz ten krok dla każdego wzorca żelu, ślepej próby kalibracyjnej i ślepej próby metody.
4. Przejdź do próbki żelu i narysuj pojedynczą linię wzdłuż górnej krawędzi prostokątnego obszaru, który ma być analizowany. Zduplikować linię, aby utworzyć równoległe linie dla całego obszaru próbki, jak określono w ppkt 4.2.3. Użyj odległości międzyliniowej 300-400 μm. Upewnij się, że ostrość (odległość osi z) jest ustawiona prawidłowo dla każdego punktu początkowego i końcowego każdej linii.
  UWAGA: Rozdzielczość przestrzenna analizy jest wyższa wzdłuż kierunku skanowania w porównaniu z odległością międzyliniową. W związku z tym punkt początkowy i końcowy linii mogą najlepiej podążać za kierunkiem gradientów analitu. W przypadku gradientów ryzosfery jest to zwykle prostopadłe do osi głównej (Rysunek 6).
5. W oprogramowaniu ICP-MS (Tabela materiałów) ustaw metodę "Tylko dane" z rozdzielczością czasową na ekranie "Metoda", wybierz jeden lub więcej odpowiednich izotopów dla każdego analitu i dołącz ¹³C jako wewnętrzny standard normalizacji³¹^,³⁶^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴². Sprawdź, czy zakłócenia nie zakłócają wykrywania izotopów⁴⁶.
6. Ustaw całkowity czas trwania cyklu skanowania metody ICP-MS ("Szacowany czas odczytu") na ≤0,5 s z odpowiednimi czasami przebywania na izotop (zwykle w zakresie 10-50 ms). Ustaw "Odczyty" ICP-MS na 1 i zmień wartość "Odczyty/Powtórzenie", aby ustawić całkowity czas pomiaru na próbkę ("Szacowany czas pobierania próbek"), tj. na pojedynczą linię ablacji. Zależy to od konkretnych parametrów LA i odległości linii ustawionych w 4.2.2 - 4.2.4.
7. Do raportowania danych należy użyć trybu zbierania danych intensywności w funkcji czasu i ustawić opcję "Opcja zapisu pliku" na "Nowy na próbkę", aby utworzyć indywidualny plik danych (tutaj .xl) dla każdej linii ablacji.
8. Ustawić sekwencję próbki "Partia" na ekranie "Próbka" ICP-MS, przy czym każdy wpis próbki odpowiada indywidualnej linii ablacyjnej ustawionej w ppkt 4.2.3 - 4.2.4.
9. Kliknij "Analizuj wsad", aby zainicjować sekwencję próbki na ICP-MS, która będzie czekać z akwizycją danych, aż zostanie wyzwolona przez pierwszy impuls laserowy (patrz SI S5, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konfiguracji wyzwalania).
10. W oprogramowaniu LA wybrać wszystkie linie, które mają być analizowane, i sprawdzić, czy metoda ICP-MS ("szacowany czas pobierania próbek", patrz 4.2.6.) odpowiada czasowi trwania ablacji poszczególnych linii, który jest zazwyczaj różny dla próbek żelu, wzorców i ślepych prób metody. Powtórzyć czynności 4.2.6. , aby w razie potrzeby dostosować metodę ICP-MS.
11. Kliknij "Emisja" w oknie "Energia lasera", aby naładować głowicę lasera, a następnie kliknij "Uruchom", aby otworzyć okno "Uruchom eksperyment". Tutaj wybierz "Tylko wybrane wzory", ustaw "Opóźnienie wymywania" na 20-30 s, zaznacz pole "Włącz laser podczas skanowania" i ustaw "Czas nagrzewania lasera" na 10 s.
12. Kliknij "Uruchom" w oknie "Uruchom eksperyment", aby rozpocząć analizę skanowania liniowego i monitorować intensywność sygnału surowego w liczbach na sekundę (cps) dla każdego izotopu na ICP-MS w czasie rzeczywistym. Każda linia powinna zaczynać się ("Czas nagrzewania lasera", 10 s) i kończyć ("Opóźnienie wymywania", 20-30 s) ślepą próbą gazową.
13. Monitoruj fluencję lasera (J ^cm-2) podczas analizy, aby ocenić stabilność lasera. Jeśli fluencja różni się znacznie, przerwij analizę i sprawdź, czy źródło lasera i/lub jego system lustrzany są w pełni funkcjonalne.
14. Po analizie zatrzymaj plazmę ICP-MS i ustaw natężenie przepływu gazu nośnego w systemie LA na 0 ml ^min-1. Wyjmij żele z komory ablacyjnej i przechowuj w torebkach strunowych do dalszego wykorzystania.

figure-protocol-28
Rysunek 6: Schemat projektu eksperymentalnego DGT LA-ICP-MS (bez skali). Ilustracja przedstawia pobieranie próbek substancji rozpuszczonej in situ w ryzosferze w oparciu o DGT oraz mapowanie rozkładu substancji rozpuszczonej na powierzchni żelu za pomocą LA-ICP-MS, w tym zbliżenie pokazujące przykładowe wymiary i parametry skanowania liniowego. Należy pamiętać, że żel DGT jest odwracany poziomo po przeniesieniu z gleby ryzosfery na szklaną płytkę, jak wskazuje położenie prostokąta w dolnym rogu żelu DGT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przetwarzanie i kalibracja danych
1. Zaimportuj plik nieprzetworzonych danych (.xl) dla każdej ablowanej linii w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego (Tabela materiałów). Tabela danych surowych przedstawia odczyty ICP-MS (punkty danych) dla każdego izotopu w cps i odpowiadające im punkty czasowe w s. Wymień wszystkie wiersze obok siebie w różnych kolumnach.
2. Oceń dane skanowania liniowego pod kątem stabilności sygnału wewnętrznego wzorca (¹³C) i odpowiednich czasów wymywania.
3. Obliczyć średnią ślepą próbę gazową dla każdego izotopu ze wszystkich wartości ślepej próby gazowej zarejestrowanych przed ablacją liniową (tj. w czasie nagrzewania lasera) i odjąć średnią ślepą próbę gazową od odpowiednich intensywności surowej próby dla każdego izotopu w celu skorygowania sygnału tła.
4. Zastosuj normalizację wewnętrzną, dzieląc intensywność sygnału każdego izotopu (cps) przez intensywność sygnału wzorca wewnętrznego (cps) dla każdego punktu danych, aby skorygować zmiany w ilości materiału poddanego ablacji i dryf instrumentalny.
5. Przytnij dane przed rozpoczęciem i po zakończeniu każdej ablowanej linii, aby usunąć sygnał tła. Transponuj tabelę danych, aby uzyskać macierz siatki, w której każdy wiersz odpowiada linii ablowanej, a każda kolumna znormalizowanej wartości intensywności izotopu. Rozdziel macierze dla każdego izotopu na osobne arkusze.
6. Obliczyć średni znormalizowany stosunek intensywności sygnału na izotop dla wzorców kalibracyjnych i ślepej próby kalibracyjnej, a następnie obliczyć funkcję kalibracji (y = ax + b) przy użyciu modelu regresji liniowej z ładunkami analitu wzorcowego żelu (μg ^cm-2; patrz SI S4) jako wartości x. Oceń funkcję kalibracji każdego izotopu pod kątem liniowości⁴⁷.
7. Zastosuj funkcję kalibracji do przykładowej macierzy danych. Przelicz znormalizowane współczynniki intensywności sygnału, , na ładunki analitu żelowego, (μg ^cm-2), a następnie na uśrednione w czasie strumienie substancji rozpuszczonej, (pg ^cm-2 ^s-1), dla każdego izotopu i punktu danych zgodnie z Równaniem 4 i Równaniem 5:
  
  Tutaj a jest nachyleniem linii kalibracyjnej, b jest przecięciem linii kalibracyjnej, a t (s) jest czasem rozmieszczania żelu podczas pobierania próbki substancji rozpuszczonej.
8. Zapisz skalibrowaną macierz danych próbki dla każdego analitu jako plik txt.
Generowanie obrazu
UWAGA: Upewnij się, że unikasz wszelkich operacji interpolacji pikseli na wszystkich etapach generowania obrazu, ponieważ może to prowadzić do sztucznie wygładzonych gradientów strumienia substancji rozpuszczonej na wynikowych obrazach.
1. Zaimportuj skalibrowaną macierz danych próbki (.txt) jako obraz tekstowy w oprogramowaniu do analizy obrazu (Tabela materiałów).
2. Oblicz odległość na piksel w kierunku x (tj. rozdzielczość poprzeczną), mnożąc prędkość skanowania laserowego przez całkowity czas trwania cyklu skanowania ICP-MS (np. zakładając prędkość skanowania 200 μm ^s-1 i całkowity czas trwania cyklu skanowania 0,25 s, rozdzielczość boczna wynosi 50 μm). Odległość na piksel w kierunku y jest równa odległości między liniami (Rysunek 6).
3. Oblicz współczynnik korekcji współczynnika proporcji obrazu. Dlatego podziel odległość na piksel w kierunku y (np. 300 μm) przez odległość na piksel w kierunku x (np. 50 μm). Zastosuj uzyskany współczynnik korygujący y/x (w tym przykładzie 6) w polu "Skala". Zastosuj odległość na piksel (w μm lub mm) w kierunku x jako skalowanie w sekcji "Ustaw skalę".
4. Zastosuj "Tablicę przeglądową", tj. pseudo-skalę kolorów, aby uzyskać lepszą wizualizację gradientów chemicznych na obrazie substancji rozpuszczonej i dostosuj "balans kolorów" obrazu, aby kontrolować dolne/górne granice zakresu wyświetlania. Dodaj "Pasek kalibracji" i zapisz obraz substancji rozpuszczonej jako plik tiff.
5. Skopiuj obraz substancji rozpuszczonej za pomocą polecenia "Kopiuj do systemu" w oprogramowaniu do analizy obrazu i wklej go do oprogramowania do składu komputerowego (tabela materiałów). Dopasuj skalę, wyrównaj i skomponuj obraz substancji rozpuszczonej ze zdjęciem zwrotu z inwestycji uzyskanym w 3.1.7.
  UWAGA: Przed skopiowaniem zmień rozmiar obrazu rozpuszczonego, np. o współczynnik 10, stosując "Skalę X" 10 i "Skalę Y" 10 w sekcji "Ustaw skalę", aby zapewnić wystarczającą liczbę pikseli do publikacji w wysokiej rozdzielczości.

Produkcja żelu DGT	Uprawa roślin	Pobieranie próbek substancji rozpuszczonych in situ	Mapowanie strumienia rozruchowego LA-ICP-MS
HR-MBG 1 tydzień	Przygotowanie gleby 1 tydzień	Aplikacja żelu 1 godzina na żel	Przygotowanie próbki 1 godzina na żel
HR-ABG 3 dni	Montaż ryzotronu 2 godziny na replikę	Okres pobierania próbek substancji rozpuszczonej zmienna, zwykle 24 godziny	Analiza LA-ICP-MS 1 dzień na żel
HR-CBG 3 dni	Wzrost roślin w zależności od badania	Pobieranie żelu 1 godzina na żel	Przetwarzanie danych 4 godziny na żel
		Suszenie żelu 2-3 dni	Generowanie obrazów 10 minut na obraz

Tabela 1: Przybliżone czasy dla ogólnych etapów techniki DGT LA-ICP-MS.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować możliwości i szczegóły danych metody obrazowania DGT, skompilowaliśmy sub-mm, rozkład strumienia 2D wielu labilnych składników odżywczych i zanieczyszczeń rozpuszczonych w glebie przylegającej do korzeni Fagopyrum esculentum i Salix smithiana (Rysunek 7). Przybliżony czas na przeprowadzenie ogólnych etapów proceduralnych w ramach protokołu przedstawiono w tabeli 1.

Obrazy substancji rozpuszczonej w Rysunek 7 został wygenerowany w trzech różnych badaniach przy użyciu żeli wiążących HR-MBG lub HR-CBG. Obrazy chemiczne pokazują rozkład strumienia substancji rozpuszczonej 2D w rozdzielczości przestrzennej 82-120 μm wzdłuż osi x i 300-400 μm wzdłuż osi y, w zależności od zastosowanych parametrów LA-ICP-MS. Ponieważ podczas kalibracji i zmiany rozmiaru obrazu nie zastosowano interpolacji, pojedyncze piksele reprezentują zmierzone punkty danych. Wyrównanie obrazów substancji rozpuszczonej z fotograficznym obrazem ROI ujawnia, że rozkład strumienia substancji rozpuszczonej sub-mm, 2D różnych pierwiastków jest bardzo zmienny w zależności od struktury gleby i morfologii korzeni. Można to przypisać zróżnicowanemu zachowaniu biogeochemicznemu pierwiastków w układzie gleba-ryzosfera-roślina oraz ich interakcji z matrycą glebową i korzeniami roślin.

W Rysunek 7A Uwidoczniono labilne nieorganiczne strumienie substancji rozpuszczonej Mg, Al, P, Mn i Fe wokół młodego korzenia F. esculentum rosnącego w glebie bezwęglanowej nawożonej NH₄NO₃. Rozkład substancji rozpuszczonej poniżej mm wykazał strefy zmniejszonych strumieni Al, P i Fe wzdłuż starszych odcinków korzeni z powodu wychwytu przez korzenie oraz znacznie zwiększone strumienie Mg, Al, P, Mn i Fe na wierzchołku korzenia z powodu zlokalizowanych procesów mobilizacji P korzenia F. esculentum. Należy pamiętać, że wierzchołek korzenia znajduje się nieco za powierzchnią gleby i dlatego jest prawie niewidoczny na zdjęciu fotograficznym. Rysunek 7B pokazuje rozkład labilnych metali śladowych, w tym Mn, Fe, Zn, Cd i Pb, wokół korzenia tolerującego metale S. smithiana uprawianego w glebie umiarkowanie zanieczyszczonej Zn, Cd i Pb. Obrazy substancji rozpuszczonej uwidoczniły wyraźne zubożenie, szczególnie Zn, Cd i Pb w bezpośrednim położeniu korzeniowym, pokazując, że korzenie S. smithiana działają jak miejscowy zlew dla labilnych metali śladowych w zanieczyszczonej glebie. Poza tym można zaobserwować miejscowe wzrosty strumienia Zn, Cd i Pb, co wskazuje na akumulację tych metali śladowych na bezpośrednim styku gleba-korzeń.

Oprócz wieloelementowego obrazowania substancji rozpuszczonych, prezentowana metoda może być również połączona z uzupełniającymi technikami obrazowania opartymi na dyfuzji, takimi jak płaskie optody³⁴. Zostało to pokazane w Rysunek 7C, gdzie rozkład labilnych metali śladowych w ryzosferze S. smithiana został zlokalizowany równolegle z rozkładem pH za pomocą połączonego, jednowarstwowego płaskiego żelu wiążącego kationy optode-DGT³³. Podłoże glebowe nawożono (NH₄)₂_SO4, co doprowadziło do spadku pH wzdłuż osi korzeniowych o ~1 jednostkę w porównaniu z glebą objętościową. Spadki pH były zlokalizowane równolegle ze zwiększonymi strumieniami substancji rozpuszczonych Mn, Fe, Co, Ni, Cu i Pb, co sugeruje rozpuszczalność metali wywołaną pH.

Ponadto, te przykładowe wyniki pokazują niektóre z potencjalnych artefaktów obrazowania, które można uzyskać. Na przykład strukturalne niejednorodności gleby, np. obserwowane jako pozioma linia w dolnej jednej trzeciej obrazu ROI Rysunek 7A, mogą powodować nieciągłości kontaktu gleba-żel, skutkujące ograniczoną dyfuzją w tym miejscu do żelu wiążącego. I odwrotnie, nadmierne zagęszczenie gleby w ryzotronie może prowadzić do słabej porowatości, co skutkuje sztucznym przesunięciem stanu redoks gleby w kierunku anoksji. Jest to zilustrowane na Rysunek 7B, gdzie rozległe obszary o bardzo podwyższonych strumieniach Mn i Fe na obrazach substancji rozpuszczonych wizualnie pasowały do gęstej warstwy gleby na obrazie ROI. Sugeruje to zmniejszony potencjał redoks gleby ze względu na duże zagęszczenie gleby, co skutkuje redukcyjnym rozpuszczaniem i solubilizacją pierwiastków wysoce wrażliwych na redoks. Dlatego zaleca się staranne wypełnienie ryzotronem i oględziny powierzchni gleby bezpośrednio po wypełnieniu.

figure-results-1
Rysunek 7: Rozkład sub-mm 2D labilnych składników odżywczych i zanieczyszczeń rozpuszczonych w różnych granicach gleba-korzeń. (A) Dystrybucja anionowych substancji rozpuszczonych P i kationowych Mg, Al, Mn i Fe wokół młodego korzenia F. esculentum. Jednoczesne pobieranie próbek substancji rozpuszczonych anionowych i kationowych uzyskano przy użyciu HR-MBG przez 24 godziny przy nasyceniu gleby wodą ~75% WHC. Obrazy Al, P i Mn są wyświetlane jako skalibrowane wartości f_DGT (pg ^cm-2 ^s-1), podczas gdy obrazy Mg i Fe pokazują ¹³intensywności znormalizowane C. Podziałka odpowiada 1 cm. Ten rysunek został zaadaptowany z ref.⁴⁸. (B) Rozmieszczenie Mn, Fe, Zn, Cd i Pb wokół korzenia S. smithiana uprawianego w glebie umiarkowanie zanieczyszczonej Zn, Cd i Pb. Próbki kationowych substancji rozpuszczonych metali śladowych pobierano przy użyciu HR-CBG przez 20 godzin przy nasyceniu gleby wodą ~80 % WHC. Wszystkie obrazy są wyświetlane jako skalibrowane wartości DGT (pg, ^cm-2, ^s-1). Podziałka skali reprezentuje 0,5 cm. Ten rysunek jest zaadaptowany z ref.³. (C) Rozkład pH i wielu kationowych substancji rozpuszczonych wokół korzeni S. smithiana rosnących w glebie wzbogaconej Cd. Kolokalizację pH i dynamiki substancji rozpuszczonej osiągnięto przy użyciu modyfikacji protokołu HR-MBG, pozwalającej na jednoczesne pobieranie próbek substancji rozpuszczonej i obrazowanie planarne optodowe³³. Obrazy Mn, Cu, Zn i Cd są wyświetlane jako skalibrowane wartości f_DGT (pg ^cm-2 ^s-1), podczas gdy obrazy Fe, Co, Ni i Pb pokazują ¹³C-znormalizowane intensywności. Podziałka odpowiada 1 cm. Ten rysunek jest zaadaptowany z ref.³³. Przedstawione rysunki są reprodukowane z cytowanych artykułów³^,³³^,⁴⁸ na licencji CC BY. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół obrazowania substancji rozpuszczonych jest wszechstronną metodą wizualizacji i ilościowego określania strumieni składników odżywczych i zanieczyszczeń 2D w środowisku glebowo-roślinnym. Jego wyjątkowość polega na zdolności do generowania wieloelementowych obrazów labilnych gatunków substancji rozpuszczonych w skali poniżej milimetra na granicy gleba-korzeń, znacznie przekraczając osiągalną rozdzielczość przestrzenną alternatywnych metod pomiaru gradientów substancji rozpuszczonej w ryzosferze⁴. Ukierunkowane podejście DGT do pobierania próbek in situ, w połączeniu z bardzo czułą metodą analizy chemicznej, taką jak LA-ICP-MS, ułatwia szczegółowe badanie dynamiki strumienia substancji rozpuszczonej wokół poszczególnych korzeni roślin uprawianych w glebie lub podobnych podłożach. Ze względu na proces pobierania próbek oparty na zlewie, uzyskane obrazy odzwierciedlają labilność wizualizowanych substancji rozpuszczonych, a zatem stanowią oszacowanie ich dostępności w roślinie¹⁰. Chociaż pomiar strumieni substancji rozpuszczonych oparty na metodzie ma znaczne zalety, takie jak możliwość interpretacji jako frakcji składników odżywczych dostępnych dla roślin, pomiary strumienia są znacznie mniej proste do zrozumienia niż pomiary stężenia w wodzie porowej. Standardowa geometria pobierania próbek DGT w zastosowaniach glebowych masowych (w szczególności żele dyfuzyjne o grubości 0,8 mm stosowane w tej konfiguracji) pozwala na porównanie rzeczywistego stężenia wody porowej, _{c soln}, i uśrednionego w czasie oszacowania stężenia wody porowej za pomocą masowego pomiaru DGT, c_DGT, oraz na interpretację tych parametrów w odniesieniu do dynamiki uzupełniania gatunków substancji rozpuszczonych. Nie można jednak przeprowadzić takiego porównania w oparciu o obrazowanie DGT z bardzo cienkimi warstwami dyfuzyjnymi, ponieważ otrzymane wartości c_DGT są nierealistycznie małe³⁴. Wyniki obrazowania DGT nie zawsze są zatem proste i szybkie w interpretacji, a często nie są bezpośrednio porównywalne z bardziej konwencjonalnymi pomiarami stężenia wody porowej.

Podczas stosowania tej metody należy dokładnie rozważyć kilka krytycznych kroków, związanych głównie z napełnianiem i podlewaniem pojemników do wzrostu ryzotronów. Podczas napełniania gleby do ryzotronu bardzo ważne jest, aby unikać zbyt dużego zagęszczenia gleby, ponieważ korzenie roślin nie mogą wniknąć w silnie zagęszczoną glebę, a wzrost korzeni zostanie zahamowany. Zaobserwowaliśmy, że korzenie unikają silnie zagęszczonej gleby i rosną wzdłuż wewnętrznych krawędzi pojemnika do wzrostu ryzotronu, gdzie gleba jest zwykle mniej zagęszczona. W takim przypadku pojedyncze korzenie znajdujące się w środku ryzotronów, gdzie można wygodnie nakładać żele DGT, mogą w ogóle się nie rozwijać, skutecznie hamując udaną aplikację żelu. W naszym laboratorium doświadczenie wykazało, że gęstość nasypowa suchej gleby wynosząca 1,0-1,4 g ^cm-3 pozwala na niezakłócony rozwój korzeni. Co więcej, nadmierne zagęszczenie gleby jest również potencjalnym źródłem artefaktów dotyczących rozpuszczalności pierwiastków wrażliwych na redoks i gatunków biogeochemicznie związanych. Ponieważ całkowita objętość porów jest zmniejszona, a rozkład średnicy porów jest przesunięty w kierunku niższych średnic w silnie zagęszczonej glebie, dostępna jest mniejsza objętość porów o większej średnicy wypełniona powietrzem, co może prowadzić do lokalnych warunków redukcyjnych. W związku z tym tlenki Mn^III/IV- i Fe^III mogą ulec redukcji, co prowadzi do zwiększenia strumieni Mn²⁺ i Fe²⁺ . Rozpuszczanie tlenków żelaza, które są ważnymi miejscami sorpcji, np. dla fosforanów i mikroelementów, może uwolnić sorbowane i/lub współwytrącone gatunki, a tym samym spowodować sztucznie zawyżone strumienie biogeochemicznie powiązanych gatunków. Podobny problem może wystąpić, jeśli pojemniki do wzrostu są zbyt mocno podlewane. Parowanie przez małą powierzchnię gleby w górnej części pojemnika wzrostowego jest niewielkie, a gleba może pozostać nasycona wodą nawet przez kilka tygodni po posadzeniu, co może również powodować artefakty redoks.

Kolejną ważną kwestią jest funkcjonalność chemiczna wytworzonego żelu wiążącego HR-DGT. Postępując zgodnie z protokołem, uzyskuje się cienkie żele o jednorodnym rozkładzie faz wiążących. Jeśli żele mają obszary o niejednorodnym rozmieszczeniu materiału (np. w żelu lub agregaty faz wiążących), obszary te muszą zostać usunięte lub, jeśli są zbyt rozległe, należy powtórzyć protokół wytwarzania żelu. Prawidłowo przygotowany żel musi być w stanie natychmiast i ilościowo związać docelowe formy substancji rozpuszczonej, które dyfundują do żelu²⁷, co zależy od zdolności wiązania żelu specyficznej dla analitu. O ile przekroczenie pojemności żelu jest mniej problematyczne w glebach niezanieczyszczonych, o tyle należy je rozważyć w glebach zanieczyszczonych metalami i glebach zasolonych. Nasycenie faz wiążących żel nie tylko pogorszy ilościowe pobieranie próbek substancji rozpuszczonej, ale także spowoduje boczną dyfuzję substancji rozpuszczonych między fazami wiązania w żelu, prowadząc do nieokreślonej lokalizacji cech strumienia substancji rozpuszczonej na małą skalę. W związku z tym, jeżeli w docelowym środowisku glebowym spodziewane są bardzo duże ilości labilnych składników pokarmowych/zanieczyszczeń, należy przeprowadzić wstępne badania. W celu oszacowania oczekiwanych obciążeń DGT można zastosować masowe pobieranie próbek tłoka DGT z gleby, a następnie elucję żelu i mokrą analizę chemiczną^15,49. W razie potrzeby czasy rozmieszczenia DGT można dostosować w celu skrócenia czasu kontaktu żelu, a tym samym uniknięcia nasycenia żelu powyżej progów wydajności. I odwrotnie, wstępne testy mogą być również pomocne w określeniu wymaganych czasów kontaktu żelu i/lub wrażliwości LA-ICP-MS, jeśli spodziewane są bardzo niskie ładunki substancji rozpuszczonej, co może być ważne dla mapowania substancji rozpuszczonych pierwiastków śladowych na naturalnych poziomach tła glebowego¹⁵. Poza tym prawidłowe działanie żelu DGT powinno być sprawdzone przed jego eksperymentalnym zastosowaniem poprzez kontrolowane ładowanie żeli podczas przygotowywania wzorców kalibracyjnych DGT LA-ICP-MS. Wzorzec żelu zapewnia dopasowane do matrycy referencyjne obciążenie analitem żelu, które można wykorzystać do oceny, czy obciążenie próbki żelem określone przez LA-ICP-MS mieści się w oczekiwanym zakresie. Jeżeli nie jest w stanie uzyskać sygnału, który różni się od szumu tła ślepej próby gazu i metody, operator musi zapewnić, że wdrożono procedury laboratoryjne do analizy pierwiastków śladowych i wykonano wszystkie kroki protokołu. Czasami żel DGT jest przypadkowo odwracany po pobraniu próbki substancji rozpuszczonej, gdy obciążona strona wystawiona na działanie gleby jest skierowana w stronę szklanej płytki, a nie wiązki laserowej, co skutkuje niską intensywnością sygnału i błędnie odwróconymi cechami na końcowych obrazach strumienia substancji rozpuszczonej.

Podczas analizy LA-ICP-MS generowana jest duża ilość danych, których ocena zajmuje dużo czasu. W naszym laboratorium korzystamy z wewnętrznych skryptów oceny danych dostosowanych do naszego docelowego formatu wyjściowego danych przy użyciu standardowego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Po półautomatycznym sortowaniu i kalibracji, drukowanie obrazu odbywa się przy użyciu narzędzi do analizy obrazów o otwartym dostępie (ImageJ, Fiji⁵⁰). Takie podejście pozwala na pełną kontrolę nad sortowaniem, oceną i prezentacją danych, co jest o tyle istotne, że zebrane dane odpowiadają pikselom prostokątnym, a nie kwadratowym, które muszą być odpowiednio wyświetlane na generowanych mapach substancji rozpuszczonych. Ponadto podczas przetwarzania danych należy starannie unikać interpolacji pikseli. Interpolacja pikseli prowadzi do wygładzonych gradientów w obrazach chemicznych, co skutkuje zmiękczonymi, często okrągłymi cechami rozkładu pierwiastków, a zatem jest niepożądaną zmianą oryginalnych danych. Interpolacja pikseli jest standardową procedurą w operacjach ponownego skalowania i formatowania w wielu programach do przetwarzania obrazu, ale zwykle można ją odznaczyć.

Podsumowując, opisana metoda stanowi znaczący postęp w zrozumieniu dynamiki składników odżywczych i zanieczyszczeń w naturalnych systemach gleba-ryzosfera-roślina. Oprócz zastosowań wyłącznie DGT, metoda może być łączona z innymi technikami obrazowania opartymi na dyfuzji, takimi jak optody planarne 3,33,42,43,48,51 i zymografia 20,21,22,23,24, i może być dalej rozwijana w celu uwzględnienia dodatkowych elementów i parametrów gleby.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było współfinansowane przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) i Austriacki Fundusz Naukowy (FWF) oraz Kraj Związkowy Dolnej Austrii: P27571-BBL (Jakob Santner).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH₄)₂S₂O₈ (nadsiarczan amonu; APS)	VWR	21300.260	≥ 98,0%, odczynnik analityczny
Kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy (MES)	Sigma-Aldrich	M8250-100G	≥ 99,5%
roztwór akrylamidu	Sigma-Aldrich	A4058-100ML	40%, do elektroforezy
Sole analitu	nie dotyczy	nie dotyczy	Stosować rozpuszczalne w wodzie sole analitu klasy analitycznej lub wyższej
Lejek Buechnera	VWR	511-0065	Średnica płytki 13 cm
Oprogramowanie do modelowania równowagi chemicznej	KTH Szwecja	n/a	Wizualny zacisk MINTEQ
	Magazyn lokalny	nie dotyczy
Oprogramowanie do składu komputerowego	Adobe Inc.	nie dotyczy	InDesign CS6
DGT sieciownik	DGT Research Ltd	nie dotyczy	2%, próbnik tłokowy DGT pochodna agarozy
	DGT Research Ltd	dotyczy	okna naświetlania o średnicy 2 cm
Cyfrowa lustrzanka jednoobiektywowa (DSLR)	Canon Inc.	nie dotyczy	Canon EOS 1000D
Urządzenie dyspersyjne	IKA	3737000	Ultra-Turrax T10 Basic
Dwustronna taśma klejąca	Tesa	56171
Etanol	Sigma-Aldrich	34923	Puriss. p.a., absolut, ≥ 99.8%
Bibuła żelowa	Bibułki Whatman	10426981	, gatunek GB005, 20 &krot; 20 cm, grubość 1.5 mm
Suszarka do żelu	UniEquip	n/a	UNIGELDRYER 3545
Wysokociśnieniowy system mikrofalowy	Anton Paar	n/a	Multiwave 3000
HNO₃	VWR	1.00456.2500P	65%, ISO do analizy
Poziomo Wytrząsarka	GFL	305
HydroMed D4	AdvanSource Biomaterials Corp.	n/a	Hydrofilowe
oprogramowanie ICP-MS	Perkin Elmer	n/a	Syngistix
	Institutes of Health (NIH	)n/a	ImageJ Fiji, dostępne bezpłatnie pod adresem https://fiji.sc/
Urządzenie do powlekania nożem	BYK	5561	Single Bar 6″, 0,5 mils
Oprogramowanie LA	Elemental Scientific Lasers	n/a	System ActiveView
LA	Elemental Scientific Lasers	n/a	NWR193
Ławka z przepływem laminarnym	Telstar Laboratory Equipment B.V.	nie dotyczy	Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II
Mieszadło magnetyczne	IKA	0003582400	C-MAG MS 7
Folia zatrzymująca wilgoć	Bemis Company, Inc.	PM999	Parafilm M, 4" x 250'N,N,N
',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281-50ML	BioReagent, odpowiedni do elektroforezy, ~ 99%
NaNO₃	Sigma-Aldrich	229938-10G	99,995% na bazie metali śladowych
NaOH	Sigma-Aldrich	1064980500	Granulki do analizy
Wytrząsarka górna	GFL	3040
Fiolki perfluoroalkoksyalkowe (PFA)	Savillex	200-015-20	15 ml Fiolka standardowa, zaokrąglony
pH-metr	Thermo Scientific	13-644-928	Orion 3-gwiazdkowy pH-metr laboratoryjny
Sonda pH	Thermo Scientific	8157BNUMD	Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode
Obcinak do tworzyw sztucznych	DGT Research Ltd	n/a	Użyj pustych fiolek do sieciowania firmy DGT research Ltd
Pęseta plastikowa	Semadeni	602
Plastelina Lokalny	sklep stacjonarny	nie dotyczy	nieschnącej plastikowej masy modelarskiej na bazie parafiny, wosku i środków wypełniających
Krążki z membrany poliwęglanowej	Whatman	110606	Nuclepore Hydrofilowa membrana, średnica 25 mm, 0,2 i mikro; m wielkość porów, 10 i mikro; m grubości
Arkusz membrany poliwęglanowej	Hydrofilowa membrana Whatman	113506	Nuclepore, 8 &; 10 cali, 0,2 i mikro; m wielkość porów, 10 i mikro; m grubość
Krążki membranowe z polieterosulfonu	Pall Corporation	60172	Filtry membranowe Supor 450, średnica 25 mm, 0,45 i mikro; m wielkość porów, grubość 0,14 mm
Arkusz membrany polieterosulfonowej	Pall Corporation	60179	Filtry membranowe Supor 450, średnica 293 mm, 0,45 i mikro; m wielkość porów, grubość 0,14 mm
folia PTFE	Haberkorn	n/a	50 µ m grubość
Przekładka PTFE	Haberkorn	n/a	Dostępne różne grubości
Żyletki powlekane PTFE	Personna GEM	62-0178	Ostrza jednoostrzowe ze stali nierdzewnej (powlekane)
Rurka Tygon powlekana PTFE	S-prep GmbH	SP8180	0,32 cm średnica wewnętrzna
Quadrupole ICP-MS	Perkin Elmer	N8150044	NexION 2000B
Bibuła filtracyjna ilościowa, 454	VWR	516-0854	Zatrzymywanie cząstek 12-15 &mikro; m
Arkusz kalkulacyjny	Microsoft Corporation	n/a	Microsoft Excel 2016 (v16.0)
Nóż ze stali nierdzewnej	Lokalne zakłady ślusarskie	n/d	o średnicy 2,5 cm
Odczynnik zawieszonych cząstek stałych-iminodiacetan (SPR-IDA)	Teledyne CETAC Technologies	n/a	10 µ Średnica m kulki polistyrenowe, 10 % (w/v) zawieszenie koralików
tranzystorowo-tranzystorowo-logiczny (TTL)	nie		Skonsultuj się z technikiem ICP-MS w celu określenia odpowiedniego TTL dla konkretnego instrumentu
Dwuobjętościowa komórka	Elemental Scientific Lasers	n/a	Dwuobjętościowa komórka 1
Winylowa taśma izolacyjna	3M	n/A	Scotch Super 33+
System oczyszczania wody	Termo Electron LED GmbH	n/a	TKA-GenPure
ZrOCl₂ × 8H₂O	Alfa Aesar	86108.30	99.9 %, na bazie metali

nie na bazie eteru Oprogramowanie do analizy obrazu National wewnętrzny dotyczy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).">Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).">Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).">Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).">Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).">Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).">Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).">Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).">Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).">Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).">Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).">Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).">Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).">Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).">Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738(2020).">Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738(2020).
Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).">Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).">Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).">Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).">Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).">Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).">Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).">Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).">Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820(2020).">Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820(2020).
High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).">Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).">Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).">Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).">Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).">Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).">Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).">Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).">Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).">Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).">Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).">Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).">Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).">Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).">Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).">Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).">Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).">Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).">Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369(2017).">Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369(2017).
Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).">Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).">Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).">May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).">Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).">Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).">Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122(2020).">Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Dwuwymiarowa wizualizacja i kwantyfikacja labilnych, nieorganicznych składników odżywczych roślin i zanieczyszczeń w glebie

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles