Artykuł metodologiczny

Dwuwymiarowa wizualizacja i kwantyfikacja labilnych, nieorganicznych składników odżywczych roślin i zanieczyszczeń w glebie

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61661

⸱

1 września 2020

 ,  ,  , 
1Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, 2Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia przepływ pracy dla sub-mm wizualizacji 2D wielu labilnych nieorganicznych składników odżywczych i zanieczyszczeń rozpuszczonych za pomocą gradientów dyfuzyjnych w cienkich warstwach (DGT) w połączeniu z obrazowaniem spektrometrii mas. Pobieranie próbek substancji rozpuszczonych i analiza chemiczna o wysokiej rozdzielczości są szczegółowo opisane w celu ilościowego mapowania substancji rozpuszczonych w ryzosferze roślin lądowych.

Streszczenie

Opisujemy metodę dwuwymiarowej (2D) wizualizacji i kwantyfikacji rozkładu labilnych (tj. odwracalnie zaadsorbowanych) nieorganicznych składników odżywczych (np. P, Fe, Mn) i zanieczyszczeń (np. As, Cd, Pb) w glebie przylegającej do korzeni roślin ("ryzosfera") w submilimetrowej (~100 μm) rozdzielczości przestrzennej. Metoda ta łączy pobieranie próbek substancji rozpuszczonej na bazie zlewu techniką gradientów dyfuzyjnych w cienkich warstwach (DGT) z przestrzennie rozdzielczą analizą chemiczną za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z ablacją laserową (LA-ICP-MS). Technika DGT opiera się na cienkich hydrożelach z jednorodnie rozmieszczonymi fazami wiązania selektywnymi analitowo. Różnorodność dostępnych faz wiązania pozwala na przygotowanie różnych rodzajów żelu DGT po zastosowaniu prostych procedur wytwarzania żelu. W celu zastosowania żelu DGT w ryzosferze, rośliny są uprawiane w płaskich, przezroczystych pojemnikach wzrostowych (ryzotronach), które umożliwiają minimalny inwazyjny dostęp do systemu korzeniowego uprawianego w glebie. Po okresie wstępnego wzrostu, żele DGT są nakładane na wybrane obszary zainteresowania w celu pobrania próbek substancji rozpuszczonej in situ w ryzosferze. Następnie żele DGT są pobierane i przygotowywane do dalszej analizy chemicznej związanych substancji rozpuszczonych za pomocą obrazowania liniowego LA-ICP-MS. Zastosowanie normalizacji wewnętrznej przy użyciu 13C oraz zewnętrznej kalibracji przy użyciu wzorców żelowych dopasowanych do matrycy dodatkowo pozwala na ilościowe określenie strumieni substancji rozpuszczonej 2D. Metoda ta jest wyjątkowa ze względu na swoją zdolność do generowania ilościowych obrazów 2D w skali submilimetrowej wielopierwiastkowych strumieni substancji rozpuszczonych w środowisku glebowo-roślinnym, znacznie przewyższając osiągalną rozdzielczość przestrzenną innych metod pomiaru gradientów substancji rozpuszczonej w ryzosferze. Przedstawiono zastosowanie i ocenę metody obrazowania wielu kationowych i anionowych gatunków substancji rozpuszczonych w ryzosferze roślin lądowych oraz podkreślono możliwość połączenia tej metody z uzupełniającymi technikami obrazowania substancji rozpuszczonych.

Wprowadzenie

Pozyskiwanie składników odżywczych przez rośliny uprawne jest kluczowym czynnikiem decydującym o wydajności upraw. Procesy rządzące efektywnym pobieraniem składników odżywczych przez rośliny uprawne były intensywnie badane, zwłaszcza mechanizmy kontrolujące dostępność składników odżywczych i internalizację składników odżywczych przez korzenie roślin na granicy gleby i korzeni, czyli ryzosfery, są uznawane za ich rolę w pozyskiwaniu składników odżywczych przez rośliny. Do ważnych procesów pobierania składników odżywczych przez rośliny należą: transport składników odżywczych w kierunku korzenia; dynamiczne równowagi sorpcyjne między gatunkami rozpuszczonymi w wodzie porowej gleby a gatunkami związanymi ze stałymi powierzchniami gleby; konkurencja mikrobiologiczna o składniki odżywcze; mineralizacja mikrobiologiczna składników odżywczych zawartych w materii organicznej gleby; i internalizacja składników odżywczych do syplazmy korzeniowej. Absorpcja nieorganicznych zanieczyszczeń metalami śladowymi (oidami) jest w dużej mierze kontrolowana przez te same mechanizmy.

W zależności od dostępności składników odżywczych i zanieczyszczeń, zapotrzebowania roślin i dyfuzyjności w glebie, można zaobserwować zróżnicowane wzorce składników odżywczych w ryzosferze. W przypadku silnie sorpujących się pierwiastków o stosunkowo wysokich wskaźnikach internalizacji (np. P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb) stwierdza się zubożenie labilnej (tj. odwracalnie zaadsorbowanej) frakcji pierwiastków w porównaniu z glebą luzem, przy czym szerokość strefy zubożenia często wynosi ≤1 mm, podczas gdy w przypadku bardziej ruchliwych składników odżywczych, takich jak NO3-, strefy zubożenia mogą rozciągać się do kilku centymetrów1. Co więcej, zaobserwowano akumulację pierwiastków, takich jak Al i Cd, gdy ich dostępność przekracza wskaźniki pobierania przez rośliny2,3.

Biorąc pod uwagę znaczenie procesów ryzosfery w obiegu składników odżywczych i zanieczyszczeń, opracowano kilka technik pomiaru frakcji pierwiastków dostępnych dla roślin w wysokiej rozdzielczości przestrzennej4,5. Jednak pomiar niestabilnego rozkładu substancji rozpuszczonej na małą skalę okazał się trudny z kilku powodów. Główną trudnością jest pobieranie próbek bardzo małych (niski zakres μl) objętości gleby i/lub wody porowej w określonych miejscach przylegających do korzeni żywych roślin, aby rozwiązać strome gradienty składników odżywczych w ryzosferze. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest użycie mikroprzyssawek do ekstrakcji próbek wody porowej6. Za pomocą tej metody A. Göttlein, A. Heim i E. Matzner7 zmierzyli stężenia składników pokarmowych w wodzie porowej w glebie w pobliżu korzeni Quercus robur L. z rozdzielczością przestrzenną ~1 cm. Trudność w analizie objętości μl gleby lub roztworu glebowego polega na tym, że te małe objętości próbek, w połączeniu z niskimi stężeniami wszystkich oprócz głównych składników odżywczych, wymagają bardzo czułych technik analizy chemicznej.

Alternatywnym systemem, zdolnym do rozwiązywania gradientów składników odżywczych z rozdzielczością do ~0,5 mm, jest wyhodowanie maty korzeniowej na powierzchni bloku gleby, z cienką hydrofilową warstwą membrany oddzielającą glebę od korzeni8,9. W tej konfiguracji substancje rozpuszczone mogą przechodzić przez błonę, a korzenie mogą pobierać składniki odżywcze i zanieczyszczenia z gleby, podczas gdy wysięki korzeniowe mogą dyfundować do gleby. Po utworzeniu gęstej warstwy korzeniowej można pobrać próbki z bloku gleby i pokroić go w plastry w celu uzyskania próbek gleby w celu późniejszej ekstrakcji frakcji pierwiastków. W ten sposób można analizować jednowymiarowe gradienty składników odżywczych i zanieczyszczeń, uśrednione na stosunkowo dużym obszarze (~100 cm2).

Kolejnym wyzwaniem jest uzyskanie próbek labilnej, dostępnej dla roślin frakcji pierwiastków, ponieważ większość technik chemicznego wydobywania gleby działa zupełnie inaczej niż mechanizmy, za pomocą których rośliny pobierają składniki odżywcze i zanieczyszczenia. W wielu protokołach ekstrakcji gleby gleba jest mieszana z roztworem ekstrahentu w celu ustalenia (pseudo)równowagi między rozpuszczoną a zasorbowaną frakcją pierwiastków. Jednak rośliny stale internalizują składniki odżywcze i dlatego często stopniowo zubażają glebę ryzosfery. Chociaż protokoły ekstrakcji równowagowej są szeroko stosowane jako testy gleby, ponieważ są łatwe do wdrożenia, wyekstrahowana frakcja składników odżywczych często nie reprezentuje dobrze frakcji składników odżywczych dostępnej dla roślin10,11,12,13. Metody zlewu, które w sposób ciągły zubażają glebę w składniki odżywcze, zostały zaproponowane jako korzystne metody i mogą lepiej przypominać podstawowy mechanizm pobierania składników odżywczych, naśladując procesy pobierania przez korzenie10,11,14,15.

Oprócz metod opisanych powyżej, dla określonych pierwiastków i parametrów (bio)chemicznych gleby, opracowano prawdziwe aplikacje do obrazowania, zdolne do pomiaru ciągłych map parametrów z rozdzielczością ≤100 μm w polach widzenia kilkucm25. Autoradiografia może być wykorzystana do zobrazowania rozkładu pierwiastków w ryzosferze, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie izotopy promieniotwórcze16. Optody planarne umożliwiają wizualizację ważnych parametrów chemicznych gleby, takich jak pH i pO217,18,19, a aktywność enzymu lub całkowite rozmieszczenie białek można odwzorować za pomocą technik obrazowania fluorescencyjnego, takich jak zymography gleby20,21,22,23 i/lub metody blottingu korzeniowego24. Podczas gdy zymografia i autoradiografia ograniczają się do pomiaru pojedynczego parametru na raz, obrazowanie pH i pO2 za pomocą optod planarnych można wykonywać jednocześnie. Bardziej tradycyjne techniki mat korzeniowych dostarczają tylko informacji 1D, podczas gdy mikroprzyssawki dostarczają pomiarów punktowych lub informacji 2D o niskiej rozdzielczości, jednak oba podejścia pozwalają na analizę wieloelementową. Niedawno P. D. Ilhardt, et al.25 przedstawili nowatorskie podejście wykorzystujące spektroskopię rozpadu indukowanego laserem (LIBS) do mapowania całkowitych rozkładów wielopierwiastkowych 2D z rozdzielczością ~100 μm w próbkach rdzenia glebowego, w których naturalny rozkład pierwiastków został zachowany przez staranne przygotowanie próbki.

Jedyną techniką zdolną do ukierunkowanego pobierania próbek 2D wielu substancji rozpuszczonych składników odżywczych i zanieczyszczeń w wysokiej rozdzielczości przestrzennej jest technika dyfuzyjnych gradientów w cienkich warstwach (DGT), metoda próbkowania oparta na zlewach, która unieruchamia labilne gatunki metali śladowych (loid) in situ na materiale wiążącym osadzonym w warstwie hydrożelu26,27. DGT została wprowadzona jako technika specjacji chemicznej do pomiaru labilnych substancji rozpuszczonych w osadach i wodach, a wkrótce została zaadoptowana do użytku w glebach28. Umożliwia obrazowanie wielopierwiastkowych substancji rozpuszczonych w skali poniżej milimetra, co początkowo zademonstrowano w osadzie rzecznym29, a następnie zostało rozwinięte pod kątem zastosowania w ryzosferach roślinnych30,31,32,33.

Do pobierania próbek DGT, na pojedynczy korzeń rośliny, który rośnie w warstwie powierzchniowej bloku gleby, nakłada się arkusz żelu o wymiarach około 3 cm x 5 cm, z hydrofilową membraną oddzielającą żel od gleby. W czasie kontaktu labilne składniki odżywcze i/lub zanieczyszczenia dyfundują w kierunku żelu i są natychmiast wiązane przez materiał wiążący zawarty w żelu. W ten sposób ustala się gradient stężenia, a tym samym ciągły strumień netto w kierunku żelu, który przeważa w czasie pobierania próbek. Po pobraniu próbek hydrożel może zostać usunięty i przeanalizowany przy użyciu analitycznej techniki chemicznej pozwalającej na analizę przestrzenną. Wysoce wyspecjalizowaną i często stosowaną techniką w tym celu jest spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (LA-ICP-MS) z ablacją laserową. W niektórych wczesnych badaniach stosowano również emisję promieniowania rentgenowskiego indukowaną mikrocząstkami (PIXE)29. Pobieranie próbek DGT w połączeniu z analizą LA-ICP-MS pozwala na obrazowanie wielopierwiastkowe w rozdzielczości przestrzennej ~100 μm. W przypadku zastosowania bardzo czułych technik ICP-MS (np. ICP-MS w polu sektorowym) można osiągnąć wyjątkowo niskie granice wykrywalności. W badaniu nad wpływem wapnowania na pobieranie Zn i Cd przez kukurydzę15, byliśmy w stanie zmapować labilne Cd w ryzosferze kukurydzy w niezanieczyszczonej glebie z granicą wykrywalności wynoszącą 38 pg cm-2 Cd na powierzchnię żelu. DGT, optody planarne i zymografia opierają się na dyfuzji pierwiastka docelowego z gleby do warstwy żelu, która może być wykorzystana do łącznego zastosowania tych metod w celu jednoczesnego lub sekwencyjnego obrazowania dużej liczby parametrów istotnych dla pobierania składników odżywczych i zanieczyszczeń przez rośliny. Szczegółowe informacje na temat analityczno-chemicznych aspektów obrazowania DGT, na temat potencjału łączenia DGT z innymi metodami obrazowania oraz na temat jego zastosowań są kompleksowo omówione w ref.34,35.

W tym artykule opisujemy, jak przeprowadzić eksperyment z obrazowaniem substancji rozpuszczonych za pomocą techniki DGT na korzeniach roślin lądowych w nienasyconym środowisku glebowym, włączając w to uprawę roślin, wytwarzanie żelu, aplikację żelu, analizę żelu i generowanie obrazu. Wszystkie kroki są szczegółowo opracowane, w tym uwagi dotyczące krytycznych kroków i eksperymentalnych alternatyw.

Protokół

1. Wykonanie żeli DGT

UWAGA: Do obrazowania 2D labilnych form rozpuszczonych substancji z wysoką rozdzielczością przestrzenną (poniżej 1 mm) dostępnych jest kilka rodzajów żeli DGT35. Poniżej krótko podsumowano proces przygotowania trzech dobrze scharakteryzowanych żeli wiążących HR-DGT o wysokiej rozdzielczości, stosowanych w aplikacjach obrazowania substancji rozpuszczonych. Procedury laboratoryjne dotyczące analizy pierwiastków śladowych, a także szczegółowe procedury przygotowania wszystkich przedstawionych żeli HR-DGT opisano w sekcjach S1 i S2 Informacji Uzupełniających (SI).

  1. Żel wiążący mieszane aniony i kationy na bazie poliuretanu (HR-MBG; SI S2.1)31
    1. Przygotować zawiesinę żelu poliuretanowego z homogenicznie rozproszonymi fazami wodorotlenku cyrkonu (IV) i iminodioctanu (IDA).
    2. Nanieść zawiesinę żelu cienką warstwą na płytkę szklaną i zainicjować tworzenie żelu poprzez odparowanie rozpuszczalnika, aby uzyskać odporny na rozdarcia żel wiążący mieszane aniony i kationy (HR-MBG) o grubości 0,1 mm.
  2. Żel wiążący aniony z poliakryloamidu i cyrkonii (HR-ABG; SI S2.2)36
    1. Wykonać żel poliakryloamidowy sieciowany agarozą (APA) o grubości 0,4 mm zgodnie z ustalonymi procedurami odlewania żeli37 (patrz SI S2.4 w celu uzyskania szczegółowego protokołu sporządzania APA).
    2. Wytrącić fazy wodorotlenku cyrkonu (IV) wewnątrz wcześniej odlanego żelu APA, aby uzyskać żel wiążący aniony (HR-ABG) o grubości 0,4 mm.
  3. Żel wiążący kationy z poliakryloamidu i iminodioctanu (HR-CBG; SI S2.3)38
    1. Przygotować zawiesinę żelu poliakryloamidowego z homogenicznie rozproszonymi fazami IDA.
    2. Odlać żel pomiędzy dwiema płytkami szklanymi i zainicjować reakcję polimeryzacji, aby uzyskać żel wiążący kationy (HR-CBG) o grubości 0,4 mm, w którym fazy IDA osadzone są po jednej stronie żelu.

2. Uprawa roślin

UWAGA: System eksperymentalny wykorzystuje ryzotrony4 (Rysunek 1) do hodowli roślin w nienasyconej glebie w celu obrazowania substancji rozpuszczonych. Najpierw opisano napełnianie ryzotronu glebą oraz podlewanie, a następnie podano szczegóły dotyczące wzrostu roślin eksperymentalnych. Szczegółowe informacje na temat konstrukcji ryzotronu i przygotowania podłoża glebowego przed napełnieniem ryzotronu przedstawiono w sekcji S3 materiałów uzupełniających (SI).

Schemat montażu ryzotronu oraz wynik przedstawiający system uprawy roślin do obserwacji korzeni.
Rycina 1: Konstrukcja ryzotronu (nie w skali). (A) Widok rozstrzelony pojemnika wzrostowego ryzotronu. (B) Zmontowany ryzotron podczas wzrostu rośliny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Wypełnianie ryzotronu glebą
    1. Przed wypełnieniem ryzotronu uprzednio nawilżoną glebą (grawimetryczna zawartość wody, Równanie równowagi statycznej; symbol ciężaru gruntu; wzór naukowy; koncepcja edukacyjna., jest znany; patrz SI S3.2), zamknąć otwory nawadniające z tyłu rizotronu za pomocą taśmy klejącej, a następnie zdjąć przednią płytę wraz z szynami mocującymi i śrubami.
    2. Zważ pusty ryzotron (z wyłączeniem przedniej płyty, szyn i śrub), osiem akrylowych płytek o wymiarach 5 cm x 11 cm oraz 16 zacisków (Tabela materiałów) i zapisać sumę mas.
    3. Przymocuj jedną małą płytkę akrylową do dna ryzotronu za pomocą dwóch zacisków z każdej strony, kierując nacisk zacisków na ramę ryzotronu, tak aby płytka nie wyginała się do wewnątrz, a objętość pozostała stała.
    4. Przechylić ryzotron lekko w stronę małej plastikowej płytki i wypełnić uprzednio nawilżoną glebą do wysokości ok. 4 cm (Rycina 2A). Rozmieść glebę wewnątrz ryzotronu, lekko nim potrząsając, a następnie delikatnie ugnieć glebę o kilka mm (w zależności od konkretnych właściwości gleby) za pomocą narzędzia do zagęszczania (Rycina 2B).
    5. Powtarzać kroki 2.1.3 – 2.1.4, aż ryzotron zostanie wypełniony glebą (Rycina 2C). Pozostaw przerwę o szerokości ok. 3 cm u góry, aby umożliwić późniejsze sadzenie sadzonek w ryzotronie.
    6. Zważ wypełniony glebą ryzotron (łącznie z 8 małymi płytkami i 16 zaciskami) i zapisz masę. Od uzyskanego wyniku odejmij masę pustego ryzotronu wyznaczoną w punkcie 2.1.2 i zapisz różnicę mas, czyli masę wilgotnej gleby, Wzór na transport masy, symbol m<sub>m,soil</sub>rt. (g), w ryzotronie.
    7. Oblicz masę suchej gleby w ryzotronie, Równanie równowagi statycznej symbol \( m_{d,soil\,rt} \). (g), zgodnie z równaniem 1, a następnie obliczyć gęstość objętościową suchej gleby, Symbol gęstości ρ_d w formule stanu równowagi statycznej, równanie do celów badań edukacyjnych. (g cm-3), w ryzotronie zgodnie z równaniem 2.
      Równowaga statyczna, równanie masy gleby (Równ. 1), wzór na obliczanie masy suchej, metoda badawcza.
      Wzór na gęstość gleby ρ_d, schemat ilustrujący metodę obliczania suchej gęstości objętościowej.
      Tutaj, Równowaga statyczna, ΣFx=0, MA=0, schemat, równowaga sił, w tym symbol V_rt, równania. (cm3) to całkowita objętość wewnętrzna rizotronu.
      UWAGA: Typowe Symbol gęstości ρ_d w formule równowagi statycznej, równanie do celów badań edukacyjnych. wartości w ryzotronie wynoszą od 1,0 do 1,4 g cm-3Nie przekraczać 1,5 g cm-3 ponieważ powyżej tej wartości wzrost korzeni może zostać zahamowany.
    8. Umieść wypełniony glebą ryzotron na skrzynce wsporczej i zdejmij z niego wszystkie zaciski oraz małe płytki (Rysunek 2D). Należy starannie oczyścić ramkę ryzotronu (tj. krawędzie) za pomocą chusteczek, ponieważ pozostałe na ramce cząsteczki gleby mogą powodować nieszczelności.
      UWAGA: Odsłonięta powierzchnia gleby musi być jednorodna i wyrównana z ramą ryzotronu, bez żadnych pęknięć ani szczelin. W przeciwnym razie należy opróżnić ryzotron i powtórzyć kroki 2.1.2 – 2.1.8.
    9. Wytnij dwa kawałki politetrafluoroetylenu (PTFE) (Tabela materiałówfolię do rozmiaru 22 cm x 13 cm każdą. Dodatkowo wyciąć kawałek folii plastikowej o wymiarach 46 cm x 15 cm. Zapisać sumę masy folii PTFE i folii plastikowej. Umieścić pierwszy kawałek folii PTFE na górnej połowie odsłoniętej powierzchni gleby w ryzotronie, tak aby wystawała ok. 1 cm ponad poziom gleby w górnej części ryzotronu.
    10. Starannie przymocuj folię PTFE do ramy ryzotronu za pomocą taśmy klejącej (Rysunek 2E). Zacznij od przymocowania jednego narożnika u góry ryzotronu, następnie narożnika przeciwległego, a na koniec dwóch narożników znajdujących się niżej w ryzotronie. Podczas mocowania narożników 2–4 należy zastosować naciąg, aby zapewnić płaską powierzchnię folii. Jeśli pojawią się zagięcia, odklej i ponownie przymocuj taśmę w poszczególnych narożnikach (nie we wszystkich jednocześnie), aż do usunięcia wszystkich zagięć i uzyskania płaskiej powierzchni folii PTFE, przylegającej do powierzchni gleby.
    11. Umieść drugi kawałek folii PTFE na dolnym końcu rhizotronu, tak aby nachodził na górny kawałek folii PTFE o około 1 cm. Powtórz krok 2.1.10 w celu przymocowania drugiej folii PTFE do rhizotronu.
    12. Umieść folię plastikową (46 cm x 15 cm) na foliach PTFE. Przymocuj folię plastikową, stosując procedurę mocowania opisaną szczegółowo w punkcie 2.1.10.
    13. Na wypełnionym glebą i przykrytym folią ryzotronie umieść płytę przednią. Po obu stronach ryzotronu zamocuj po jednej szynie i ręcznie dokręć śruby, aby ustabilizować szyny, a tym samym płytę przednią na ryzotronie. Śruby są skierowane w stronę zamkniętej części ryzotronu, tj. strony z otworami do podlewania (Rycina 1A).

Proces konstrukcji ryzotronu, ilustrujący zagęszczanie gleby i montaż z użyciem płyt akrylowych z zaciskami.
Rysunek 2: Montaż i napełnianie ryzotronu w celu uprawy roślin w glebie do obrazowania substancji rozpuszczonych w ryzosferze. (A) Napełnianie ryzotronu glebą. (B) Zagęszczanie wsypanej gleby za pomocą narzędzia do zagęszczania. (C) Napełniony glebą ryzotron z małymi płytami akrylowymi i zaciskami. (D) Napełniony glebą ryzotron z odsłoniętą powierzchnią gleby. (E) Napełniony glebą ryzotron częściowo przykryty ochronną folią PTFE. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Eksperyment dotyczący oddziaływania korzeń-gleba z wykorzystaniem folii PTFE i żelu DGT; schemat układu wzrostu.
Rycina 3: Obsługa rizotronu i aplikacja żelu DGT. (A) Podlewanie gleby za pomocą końcówek do pipet 10 mL w otworach nawadniających z tyłu rizotronu. (B) Sadzenie siewek (oznaczonych zielonymi kropkami) do wypełnionego glebą i zamkniętego rizotronu. (C) Rizotron obsadzony sadzonkami Salix smithiana z usuniętą przednią płytą i plastikową folią ochronną. (D) Ostrożne odklejanie folii PTFE przed aplikacją żelu DGT. (E) Zdjęcie o wysokiej rozdzielczości obszaru zainteresowania (ROI) na styku gleba-korzeń. (F) Nałożenie przedniej płyty wyposażonej w żel DGT na rizotron. (G) Zdjęcie ROI z naniesionym żelem DGT podczas pobierania próbek substancji rozpuszczonych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Podlewanie gleby
    1. Należy określić pojemność wodną (WHC) gleby eksperymentalnej w ryzotronie. W tym celu należy wykonać dwa ryzotrony z otwartym dnem i wypełnić je glebą zgodnie z opisem w sekcji 2.1. Te otwarte, wypełnione glebą ryzotrony należy w pełni nasycić poprzez zanurzenie w pojemniku z wodą na 16 h, a następnie odstawić ryzotrony do odcieknięcia na 8 h.
    2. Pobrać zbiorczą próbkę gleby o masie ok. 50 g z losowych miejsc w ryzotronach z otwartym dnem i wysuszyć próbkę w 105 °C aby określić Równanie równowagi statycznej; symbol ciężaru gruntu; wzór naukowy; koncepcja edukacyjna. zgodnie z równaniem S1. Wyznaczono Równanie równowagi statycznej; symbol ciężaru gruntu; wzór naukowy; koncepcja edukacyjna. odpowiada pojemności wodnej (WHC) gleby i jest zatem wyrażona jako Równanie równowagi statycznej przedstawiające ΣFx=0; edukacyjny wzór z fizyki. (g g-1).
    3. Zdefiniuj cel Równanie równowagi statycznej; symbol ciężaru gruntu; wzór naukowy; pojęcie edukacyjne. w eksperymentalnym rizotronie. W fazie wzrostu ustaw Równanie równowagi statycznej; symbol ciężaru gruntu; formuła naukowa; koncepcja edukacyjna. 60% WHC (tj. współczynnika WHC, Równanie równowagi statycznej, fₜᵥᵉₕc = 0,6, analiza wzoru, schemat, badanie naukowe.) w celu zapewnienia roślinom odpowiedniej ilości wody przy jednoczesnym uniknięciu warunków anoksycznych w ryzotronie.
    4. Oblicz całkowitą masę wody do dodania, Równowaga statyczna, równanie ΣFx=0, schemat, koncepcja fizyczna, ilustracja równowagi sił. (g), aby nawodnić glebę w ryzotronie w wyznaczonym Równanie równowagi statycznej; symbol ciężaru gruntu; wzór naukowy; koncepcja edukacyjna. zgodnie z równaniem 3. Uwzględniając masę wody znajdującej się w glebie w ryzotronie, Równanie do obliczania wilgotności gleby, wzór: m_w, masa gleby. (g).
      równanie równowagi statycznej; m_wadd=f_WH×W_WH×m_d,soil rt–m_w,soil rt; wzór dotyczący fizyki
    5. Podzielić Równowaga statyczna, równanie ΣFx=0, diagram, pojęcie fizyczne, ilustracja równowagi sił. przez liczbę otworów nawadniających ryzotronu (w tym przypadku 14), aby uzyskać masę wody, którą należy dodać do każdego otworu. Należy dodać wodę, wkładając końcówki pipet o pojemności 10 ml do otworów nawadniających i pozwalając wodzie spłynąć do gleby pod wpływem grawitacji (Rycina 3A).
  2. Wzrost roślin
    1. Przeprowadź wstępne kiełkowanie nasion rośliny badanej (np. na wilgotnym papierze filtracyjnym) zgodnie z konkretnymi wymaganiami dotyczącymi kiełkowania nasion, aż do momentu wyłonienia się korzenia zakiełkowego (do długości 1 cm).
    2. Przesadź do ryzotronu do dwóch siewek, zgodnie ze wskazówkami w Rycina 3BPodczas sadzenia należy dodać ok. 5 ml wody bezpośrednio do siewek, aby wspomóc ich wzrost. Górny otwór ryzotronu należy przykryć przez pierwsze ok. dwa dni po sadzeniu przezroczystą folią zapobiegającą utracie wilgoci (Tabela materiałów). Owiń ryzotron folią aluminiową, aby zapobiec wzrostowi mikrofitów.
      UWAGA: W ryzotronach, poza siewkami, można hodować również sadzonki roślin.
    3. Przenieść obsadzony ryzotron do pomieszczenia roślinnego, w którym warunki środowiskowe (tj. temperatura, wilgotność, natężenie światła) są dostosowane do specyficznych wymagań rośliny. Ustawić ryzotron pod kątem 25°-35° aby zapewnić rozwój korzeni wzdłuż przedniej płytki poprzez grawitropizm.
    4. Podczas wzrostu roślin należy grawimetrycznie utrzymywać docelową zawartość wody w ryzotronie, podlewając go okresowo co 2–4 dni przez otwory nawadniające ryzotronu, zgodnie ze szczegółowym opisem w punkcie 2.2.5. Powierzchnię gleby w górnym otworze należy utrzymywać w stanie wilgotnym poprzez regularne dodawanie ok. 5 ml wody.
      UWAGA: Jeśli rośliny są hodowane przez dłuższy czas i oczekuje się, że biomasa roślinna w znacznym stopniu zmniejszy ilość wody dostarczanej do ryzotronu metodą opisaną w procedurze, należy uwzględnić masę biomasy roślinnej poprzez hodowlę roślin w oddzielnych powtórzeniach ryzotronowych oraz zbieranie i ważenie tkanek roślinnych w określonych odstępach czasu.
    5. Gdy korzenie dotrą do odpowiedniego miejsca wzdłuż przedniej płyty, najlepiej w centrum ryzotronu, należy zastosować żele DGT w celu pobrania próbek rozkładu substancji rozpuszczonych w ryzosferze.

3. Pobieranie próbek rozkładu substancji rozpuszczonej

  1. Nakładanie żelu
    1. Zwiększyć Równanie równowagi statycznej; symbol ciężaru gruntu; formuła naukowa; koncepcja edukacyjna. w ryzotronie z 60% Równanie równowagi statycznej przedstawiające ΣFx=0; edukacyjny wzór z fizyki. do 80% Równanie równowagi statycznej przedstawiające ΣFx=0; edukacyjny wzór z fizyki. 24 h przed aplikacją żelu, zgodnie z opisem w sekcjach 2.2.4.-2.2.5. Zapewnia to dobry kontakt gleby z żelem i umożliwia dyfuzję substancji rozpuszczonych do żelu, zapobiegając jednocześnie powstawaniu warunków anoksycznych w glebie podczas pobierania próbek substancji rozpuszczonych.
    2. Należy wziąć nową, oczyszczoną kwasem płytkę przednią, dopasować ją do ryzotronu używanego do pobierania próbek i zaznaczyć na płytce obszary zainteresowania (ROI). Następnie należy przenieść płytkę do komory z laminarnym przepływem powietrza lub innego środowiska wolnego od kurzu i metali, stroną nieoznaczoną do góry.
    3. Wytnij żel wiążący DGT na podłożu akrylowym do wymaganego prostokątnego rozmiaru odpowiadającego obszarowi zainteresowania (ROI), zazwyczaj około 3 cm × 5 cm, używając żyletki z powłoką PTFE. Żel należy wycinać poprzez naciskanie, a nie przesuwanie żyletki, aby zapewnić czyste cięcie. Umieść prostokątny fragment żelu na nieoznaczonej stronie płytki w wyznaczonym miejscu ROI.
      UWAGA: W przypadku zastosowania HR-MBG, a 100 µm-pod żel można włożyć cienką folię dystansową, aby zapewnić dobry kontakt żelu z systemem gleba-korzeń.
    4. Odetnij 10 µm-cienka membrana poliwęglanowa (0.2 µm wielkość porów; Tabela materiałów) do rozmiaru, który zwiększa wymiar żelu o ≥1 cm z każdej strony, a następnie nałóż membranę na żel. Dodaj niewielką ilość wody, aby usunąć pęcherzyki powietrza z układu.
    5. Przymocuj membranę wzdłuż wszystkich czterech krawędzi za pomocą winylowej taśmy izolacyjnej (Tabela materiałów). W trakcie tego procesu należy ostrożnie usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione między żelem a membraną, używając plastikowej pęsety. Taśma musi stykać się wyłącznie z membraną, a nie z żelem.
      UWAGA: Jeśli taśma zetknie się z żelem, między żelem a membraną uwięzione zostaną pęcherzyki powietrza lub na końcowej powierzchni membrany pojawią się fałdy, należy ponownie złożyć stos żel/membrana, ponieważ strumień dyfuzyjny substancji rozpuszczonych do żelu może zostać zaburzony35 (powtórzyć kroki 3.1.3 – 3.1.5).
    6. Umieść ryzotron na stojaku, zdejmij szyny i ostrożnie podnieś przednią płytę (Rysunek 3C). Usuń folię plastikową, odetnij folię PTFE przy krawędziach ryzotronu i powoli odklej folię PTFE, aby uniknąć naruszenia systemu gleba-korzeń (Rysunek 3D).
    7. Wykonaj ortogonalną fotografię ROI za pomocą cyfrowej lustrzanki (DSLR) (Tabela materiałów) w celu ułatwienia interpretacji i prezentacji rozkładu substancji rozpuszczonej w zależności od struktury gleby i morfologii korzeni (Rycina 3E). Należy użyć statywu do aparatu oraz, jeśli jest dostępny, obiektywu makro. Aparat należy ustawić tak, aby środek zdjęcia odpowiadał środkowi ROI, a płaszczyzna ostrości aparatu była równoległa do powierzchni gleby. Na zdjęciu należy umieścić skalę (np. linijkę).
    8. Przymocuj płytkę z zestawem żel/membrana do otwartego ryzotronu (Rysunek 3F). Należy zatem dopasować jedną krawędź płytki do krawędzi rhizotronu i delikatnie „przygiąć” płytkę w stronę gleby. Taki sposób aplikacji pomaga uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza między stosem żel-membrana a systemem gleba-korzeń. Płytkę przednią należy zamocować za pomocą prowadnic i śrub.
      UWAGA: Ten etap jest krytyczny i musi zostać przeprowadzony z należytą starannością. Po ustanowieniu kontaktu między stosem żel/membrana a systemem korzeniowym gleby nie wolno przesuwać płytki, aby nie doprowadzić do przesunięcia gleby i korzeni.
    9. Zapisz dokładny czas rozpoczęcia rozmieszczenia żelu i wykonaj zdjęcie rozmieszczonego żelu w obszarze ROI, zgodnie z opisem w punkcie 3.1.7 (Rycina 3G). Rizotron należy owinąć folią aluminiową i przenieść do pomieszczenia wzrostowego do końca okresu pobierania próbek roztworu (zazwyczaj 24 h).
  2. Odzyskiwanie żelu
    1. Umieść ryzotron na pudełku wsporczym, ostrożnie zdejmij przednią płytkę i przepłucz wodą stos żel/membrana znajdujący się na płytce, aby usunąć przylegające cząsteczki (Rysunek 4A). Zapisz dokładny czas zakończenia rozmieszczenia żelu. Pobierz próbkę gleby z ROI w celu określenia rzeczywistej Wgleba w ryzotronie zgodnie z równaniem S1.
    2. Przenieś płytkę przednią do komory z laminarnym przepływem powietrza, stroną ze stosu żel/membrana skierowaną do góry. Wyjmij żel z płytki przedniej, ostrożnie usuwając najpierw taśmę wzdłuż wszystkich czterech krawędzi, a następnie membranę poliwęglanową pokrywającą żel (Rysunek 4B). Nanieść wodę, aby żel mógł swobodnie unosić się na cienkiej warstwie wody na płytce, stroną mającą kontakt z glebą skierowaną do góry.
      UWAGA: Kluczowe jest kontrolowanie orientacji żelu. Strona żelu wystawiona na działanie gleby i korzeni musi być zawsze skierowana do góry (w stronę użytkownika).
  3. Suszenie żelu
    1. Wytnij prostokątny kawałek papieru do transferu żelowego (Tabela materiałów) i umieścić nieco mniejszy fragment membrany z polietersulfonu (0.45 µm wielkość porów; Tabela materiałów) na górze.
    2. Przenieś żel z płytki na stos papieru do transferu/membrany za pomocą plastikowej pęsety, stroną styku z próbką do góry. Żel musi być rozluźniony (tj. nienapięty) i całkowicie płaski, bez pęcherzyków powietrza między żelem a membraną. Nanieś niewielką ilość wody na stos papieru do transferu/membrany, aby ułatwić przeniesienie i ułożenie żelu.
    3. Całkowicie przykryj papier do transferu/membranę/stos żelowy kawałkiem folii plastikowej, a następnie opisz próbkę żelu i jej orientację na folii (Rycina 4C). Umieść stos złożony z papieru do transferu, membrany, żelu i folii plastikowej w próżniowej suszarce do żeli (Tabela materiałów) i suszyć do czasu całkowitego wysuszenia stosu (zazwyczaj 48–72 h). W przypadku HR-MBG ustawić temperaturę na 50-55 °Cw przypadku HR-ABG i HR-CBG najlepiej suszyć w temperaturze pokojowej.
    4. Usuń papier do transferu z wysuszonego stosu i przenieś żel, który jest teraz nierozerwalnie złączony z membraną z polietersulfonu, do woreczka strunowego. Plastikowa folia ochronna pozostaje na żelu do momentu tuż przed analizą LA-ICP-MS.
    5. Należy wyciąć fragment oryginalnego arkusza żelowego i wykorzystać go jako ślepą próbę metodyczną, która nie będzie miała kontaktu z glebą. Ślepą próbę metodyczną należy przetworzyć w sposób identyczny z żelem z próbką, zgodnie z punktami 3.3.2 - 3.3.4.

Układ do analizy korzeni: żele DGT w otwartym ryzotronie, montaż z papierem filtracyjnym, membrana do pomiaru jonów.
Rysunek 4: Odzyskiwanie żelu DGT i przygotowanie do suszenia po pobraniu próbek substancji rozpuszczonych. (A) Płytka z żelem DGT i ryzotronem bezpośrednio po pobraniu próbek substancji rozpuszczonych. (B) Odzyskiwanie żelu DGT z płytki w komorze z laminarnym przepływem powietrza. (C) Stos składający się z papieru filtracyjnego/membrany polietersulfonowej/żelu DGT/folii plastikowej do suszenia żelu. Należy zauważyć, że żel jest lekko zabarwiony po umieszczeniu w glebie ryzosferycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Analiza chemiczna żelu wiążącego DGT

UWAGA: W niniejszym protokole analiza rozkładu substancji rozpuszczonych w żelu wiążącym DGT jest przeprowadzana za pomocą LA-ICP-MS przy użyciu nanosekundowego systemu LA z ekscymerem ArF o długości fali 193 nm, wyposażonego w dwuobjętościową komorę ablacyjną sprzężoną z kwadrupolowym ICP-MS (Rycina 5). Wszystkie instrumenty są wymienione w Tabeli materiałów. Alternatywnie można zastosować nanosekundowe układy LA w stanie stałym o długości fali 213 nm lub 266 nm36,39,40,41,42,43. Jeśli wymagana jest zwiększona czułość lub rozdzielczość masowa, alternatywą dla kwadrupolowego ICP-MS jest sektorowy ICP-MS15,44. Szczegółowe informacje na temat przygotowania standardów żelu DGT do kalibracji zewnętrznej oraz sprzęgania systemu LA z kwadrupolowym ICP-MS przedstawiono w sekcjach SI S4 i S5.

Układ ablacji laserowej z ICP-MS do analizy próbek żelowych; obejmuje komorę ablacyjną, oprogramowanie LA oraz stół.
Rycina 5: Układ LA-ICP-MS do analizy żeli DGT. (A) Nanosekundowy system LA ArF o długości fali 193 nm oraz kwadrupolowy ICP-MS. (B) Wysuszone żele zamocowane na szklanych płytkach i utrwalone na stole do próbek LA, gotowe do wprowadzenia do komory ablacyjnej. (C) Gaz nebulizatora (Ar) z ICP-MS oraz gaz nośny aerozolu (He lub Ar) z komory ablacyjnej połączone z ICP za pomocą dwudrożnego rozdzielacza Y i adaptera palnika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przygotowanie próbek do LA-ICP-MS
    1. Przenieść wysuszone próbki żelu, wzorce i ślepe metody (które są złączone z podłożem z membrany polietersulfonowej) na pojedyncze kawałki dwustronnej taśmy klejącej (Tabela materiałów), stroną żelową do góry. Odciąć nadmiar taśmy, aby zaoszczędzić miejsce w komorze ablacji.
    2. Zamocować wysuszone żele na szklanych płytkach. Użyć osobnych szklanych płytek dla każdej próbki żelu, serii wzorców lub ślepej metody, aby umożliwić elastyczne rozmieszczenie na stole próbek LA (typowy rozmiar 10 cm × 10 cm). Użyć przecinaka do szkła, aby dostosować rozmiar płytki szklanej w razie potrzeby. Przymocować płytki szklane z żelami na stole próbek LA (Rycina 5B) za pomocą plasteliny (Tabela materiałów). Wypoziomować powierzchnię żelu, regulując dno stołu, a następnie zablokować stół próbek w komorze ablacji.
  2. Analiza skanowania liniowego LA-ICP-MS
    1. Połączyć system LA z ICP-MS zgodnie z opisem w sekcji SI S5. W oprogramowaniu LA (Tabela materiałów) ustawić parametry oświetlenia kamery (tj. „Ring”, „Coax” i „Transmitted”), aby oświetlić powierzchnię żelu w komorze ablacji, i ustawić ostrość na powierzchni żelu poprzez regulację odległości w osi z. Przenieść się w losowe miejsca w komorze, aby upewnić się, że wszystkie powierzchnie żelu są w ostrości.
    2. Ustawić parametry LA w oknie „Laser Setup” oprogramowania LA. Typowe ustawienia stosowane w analizie skanowania liniowego LA-ICP-MS żeli DGT to: tryb continuous; moc wyjściowa 20-30%; częstotliwość powtarzania 10-20 Hz; średnica plamki 100-200 µm; prędkość skanowania 150-250 µm s-1.
      UWAGA: Parametry muszą zostać zoptymalizowane dla zastosowanego rodzaju żelu i mogą się różnić. Parametry mogą zostać również udoskonalone w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu, rozdzielczości przestrzennej lub skrócenia czasu akwizycji, w zależności od konfiguracji eksperymentalnej i instrumentalnej. Stosować stosunkowo niską moc wyjściową (≤40 %) i częstotliwość powtarzania (≤25 Hz), aby uniknąć przebicia się przez żele do materiałów podkładowych39. Należy upewnić się, że prędkość skanowania laserowego jest ≤ średnicy plamki podzielonej przez całkowity czas cyklu skanowania ICP-MS (patrz 4.2.6), aby uniknąć kompresji punktów danych, a tym samym utraty rozdzielczości w kierunku skanowania45. Na przykład, przy ustawieniu średnicy plamki 200 µm i całkowitym czasie cyklu skanowania ICP-MS 0,25 s, prędkość skanowania powinna wynosić ≤800 µm s-1.
    3. Wybrać narzędzie linii i narysować pojedynczy wzór linii o długości ~1 mm na wzorcu żelowym. Kliknąć prawym przyciskiem myszy wzór linii w oknie „Scan Patterns” i zweryfikować, czy przyjęto parametry LA ustawione w punkcie 4.2.3. Użyć narzędzia „Duplicate Scans”, aby powielić tę linię cztery razy, z odległością między liniami (odległością między centrami linii) większą niż średnica plamki (Rycina 6). Takie podejście zapewnia łącznie pięć równoległych linii na każdy wzorzec żelowy (n = 5). Powtórzyć ten krok dla każdego wzorca żelowego, ślepej kalibracji i ślepej metody.
    4. Przejść do próbki żelu i narysować pojedynczą linię wzdłuż górnej krawędzi prostokątnego obszaru do analizy. Powielić linię, aby utworzyć linie równoległe dla całego obszaru próbki, zgodnie z opisem w 4.2.3. Stosować odległość między liniami 300-400 µm. Upewnić się, że ostrość (odległość w osi z) jest ustawiona prawidłowo dla każdego punktu początkowego i końcowego każdej linii.
      UWAGA: Rozdzielczość przestrzenna analizy jest wyższa wzdłuż kierunku skanowania w porównaniu do odległości między liniami. Dlatego punkty początkowe i końcowe linii powinny najlepiej podążać za kierunkiem gradientów analitycznych. W przypadku gradientów ryzosfery jest to zazwyczaj kierunek prostopadły do osi korzenia (Rycina 6).
    5. W oprogramowaniu ICP-MS (Tabela materiałów), skonfigurować metodę rozdzielczą w czasie „Data Only” w oknie „Method”, wybrać jeden lub więcej odpowiednich izotopów dla każdego analityka i uwzględnić 13C jako wewnętrzny standard normalizacji31,36,40,41,42. Zweryfikować, czy detekcja izotopów nie jest zakłócona przez interferencje46.
    6. Ustawić całkowity czas cyklu skanowania metody ICP-MS („Est. Reading Time”) na ≤0,5 s z odpowiednimi czasami przebywania (dwell times) na izotop (zazwyczaj od 10 do 50 ms). Ustawić liczbę odczytów ICP-MS „Readings” na 1 i zmienić wartość „Readings/Replicate”, aby ustawić całkowity czas pomiaru na próbkę („Est. Sampling Time”), t.j. na pojedynczą linię ablacji. Zależy to od konkretnych parametrów LA i odległości linii ustawionych w punktach 4.2.2 - 4.2.4.
    7. Do raportowania danych użyć trybu zbierania danych intensywność względem czasu i ustawić opcję zapisu pliku „File Write Option” na „New Per Sample”, aby utworzyć oddzielny plik danych (tutaj .xl) dla każdej linii ablacji.
    8. Skonfigurować sekwencję próbek „Batch” w oknie „Sample” ICP-MS, gdzie każdy wpis próbki odpowiada pojedynczej linii ablacji ustawionej w punktach 4.2.3 - 4.2.4.
    9. Kliknąć „Analyze Batch”, aby uruchomić sekwencję próbek w ICP-MS, który będzie oczekiwał z akwizycją danych do czasu wyzwolenia przez pierwszy impuls lasera (szczegóły konfiguracji wyzwalania patrz w SI S5).
    10. W oprogramowaniu LA wybrać wszystkie linie do analizy i zweryfikować, czy metoda ICP-MS („Est. Sampling Time”, patrz 4.2.6.) odpowiada czasowi trwania pojedynczych ablacji liniowych, który jest zazwyczaj różny dla próbek żelu, wzorców i ślepych metod. W razie potrzeby powtórzyć krok 4.2.6, aby dostosować metodę ICP-MS.
    11. Kliknąć „Emission” w oknie „Laser Energy”, aby naładować głowicę lasera, a następnie kliknąć „Run”, aby otworzyć okno „Run Experiment”. Tutaj wybrać „Selected Patterns Only”, ustawić „Washout Delay” na 20-30 s, zaznaczyć pole „Enable Laser During Scans” i ustawić „Laser Warmup Time” na 10 s.
    12. Kliknąć „Run” w oknie „Run experiment”, aby rozpocząć analizę skanowania liniowego i monitorować w czasie rzeczywistym surową intensywność sygnału w zliczeniach na sekundę (cps) dla każdego izotopu w ICP-MS. Każda linia powinna zaczynać się („Laser Warmup Time”, 10 s) i kończyć („Washout Delay”, 20-30 s) ślepą próbą gazową.
    13. Monitorować fluencję lasera (J cm-2) podczas analizy, aby ocenić stabilność lasera. Jeśli fluencja znacznie się zmienia, przerwać analizę i zweryfikować, czy źródło lasera i/lub jego system luster są w pełni sprawne.
    14. Po analizie wyłączyć plazmę ICP-MS i ustawić natężenie przepływu gazu nośnego w systemie LA na 0 mL min-1. Wyjąć żele z komory ablacji i przechowywać w woreczkach strunowych do dalszego użytku.

Schemat pobierania substancji rozpuszczonych in situ do mapowania LA-ICP-MS; konfiguracja żelu DGT; prędkość skanowania; analiza laserowa.
Rycina 6: Schemat projektu eksperymentalnego DGT LA-ICP-MS (nie w skali).Ilustracja przedstawia pobieranie substancji rozpuszczonych in situ w ryzosferze z wykorzystaniem techniki DGT oraz mapowanie rozkładu tych substancji na powierzchni żelu za pomocą LA-ICP-MS, w tym powiększenie pokazujące przykładowe wymiary i parametry skanowania liniowego. Należy zauważyć, że żel DGT zostaje obrócony poziomo podczas przenoszenia z gleby ryzosferycznej na płytkę szklaną, co jest zaznaczone położeniem prostokąta w dolnym rogu żelu DGT. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Przetwarzanie danych i kalibracja
    1. Zaimportuj surowy plik danych (.xl) dla każdej ablacyjnej linii do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego (Table of Materials). Tabela surowych danych przedstawia odczyty ICP-MS (punkty danych) dla każdego izotopu w cps oraz odpowiadające im punkty czasowe w s. Wymień wszystkie linie obok siebie w różnych kolumnach.
    2. Oceń dane ze skanowania linii pod kątem stabilności sygnału wzorca wewnętrznego (13C) oraz odpowiedniego czasu wypłukiwania.
    3. Oblicz średnią wartość tła gazowego dla każdego izotopu ze wszystkich wartości tła gazowego zarejestrowanych przed ablacją linii (tj. podczas czasu rozgrzewania lasera) i odejmij średnie tło gazowe od odpowiadających im surowych intensywności dla każdego izotopu, aby skorygować sygnał tła.
    4. Zastosuj normalizację wewnętrzną, dzieląc intensywność sygnału każdego izotopu (cps) przez intensywność sygnału wzorca wewnętrznego (cps) dla każdego punktu danych, aby skorygować różnice w ilości ablacyjnej substancji oraz dryft instrumentalny.
    5. Przytnij dane przed rozpoczęciem i po zakończeniu każdej ablacyjnej linii, aby usunąć sygnał tła. Transponuj tabelę danych, aby uzyskać macierz siatki, w której każdy wiersz odpowiada ablacyjnej linii, a każda kolumna znormalizowanej wartości intensywności izotopu. Rozdziel macierze dla każdego izotopu na oddzielne arkusze.
    6. Oblicz średnią znormalizowaną intensywność stosunku sygnału na izotop dla wzorców kalibracyjnych i ślepej próby kalibracyjnej, a następnie wyznacz funkcję kalibracyjną (y = ax + b) przy użyciu modelu regresji liniowej, gdzie wartościami x są zawartości analitycznego wzorca żelowego (µg cm-2; patrz SI S4). Oceń liniowość funkcji kalibracyjnej dla każdego izotopu47.
    7. Zastosuj funkcję kalibracyjną do macierzy danych próbki. Przelicz znormalizowane stosunki intensywności sygnału, równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, ΣM=0, diagram, edukacyjny koncept fizyczny, na zawartości analityczne w żelu, notacja tensorowa DGT; symbole naukowe; stosowane w równaniach fizycznych, analizie wektorowej. (µg cm-2), a następnie na uśrednione w czasie strumienie rozpuszczonych substancji, Równowaga statyczna, równania ΣFx=0, ΣFy=0; diagram sił mechanicznych; edukacja fizyczna. (pg cm-2 s-1), dla każdego izotopu i punktu danych zgodnie z równaniem 4 i równaniem 5:
      Równanie równowagi statycznej, Γ<sub>DGT</sub>= (I<sub>norm</sub>−b)/a, formuła matematyczna.
      Równanie równowagi statycznej, fDGT=ΓDGT/t×10^6, w kontekście analizy chemicznej.
      Gdzie a to nachylenie linii kalibracyjnej, b to punkt przecięcia linii kalibracyjnej z osią rzędnych, a t (s) to czas ekspozycji żelu podczas pobierania rozpuszczonych substancji.
    8. Zapisz skalibrowaną macierz danych próbki dla każdego analitycznego związku jako plik txt.
  2. Generowanie obrazów
    UWAGA: Należy unikać jakichkolwiek operacji interpolacji pikseli podczas wszystkich etapów generowania obrazów, ponieważ może to prowadzić do sztucznego wygładzenia gradientów strumienia rozpuszczonych substancji na wynikowych obrazach.
    1. Zaimportuj skalibrowaną macierz danych próbki (.txt) jako obraz tekstowy do oprogramowania do analizy obrazu (Table of Materials).
    2. Oblicz odległość na piksel w kierunku x (tj. rozdzielczość boczną), mnożąc prędkość skanowania lasera przez całkowity czas cyklu skanowania ICP-MS (np. przy założeniu prędkości skanowania 200 µm s-1 i całkowitego czasu cyklu skanowania 0,25 s, rozdzielczość boczna wynosi 50 µm). Odległość na piksel w kierunku y odpowiada odległości między liniami (Rysunek 6).
    3. Oblicz współczynnik korekcji proporcji obrazu. W tym celu podziel odległość na piksel w kierunku y (np. 300 µm) przez odległość na piksel w kierunku x (np. 50 µm). Zastosuj otrzymany współczynnik korekcji y/x (w tym przykładzie 6) w sekcji ‘Scale’. Ustaw odległość na piksel (w µm lub mm) w kierunku x jako skalowanie w sekcji ‘Set scale’.
    4. Zastosuj ‘Look Up Table’ (tabelę wyszukiwania), czyli skalę pseudokolorów, aby lepiej zwizualizować gradienty chemiczne na obrazie rozpuszczonych substancji i dostosuj ‘balans kolorów’ obrazu, aby kontrolować dolne/górne granice zakresu wyświetlania. Dodaj ‘Calibration bar’ (pasek kalibracyjny) i zapisz obraz rozpuszczonych substancji jako plik tiff.
    5. Skopiuj obraz rozpuszczonych substancji za pomocą polecenia ‘Copy to System’ w oprogramowaniu do analizy obrazu i wklej go do oprogramowania do składu tekstu i grafiki (Table of Materials). Dopasuj skalę, wyrównaj i zestaw obraz rozpuszczonych substancji ze zdjęciem ROI uzyskanym w punkcie 3.1.7.
      UWAGA: Przed kopiowaniem zmień rozmiar obrazu rozpuszczonych substancji, np. dziesięciokrotnie, stosując ‘X Scale’ wynoszący 10 oraz ‘Y Scale’ wynoszący 10 w sekcji ‘Set scale’, aby zapewnić wystarczającą liczbę pikseli do publikacji w wysokiej rozdzielczości.
Wytwarzanie żelu DGTUprawa roślinPobieranie próbek substancji rozpuszczonych in situMapowanie strumienia substancji rozpuszczonej za pomocą LA-ICP-MS
HR-MBG
1 tydzień		Przygotowanie gleby
1 tydzień		Nakładanie żelu
1 godzina na żel		Przygotowanie próbek
1 godzina na żel
HR-ABG
3 dni		Montaż ryzotronu
2 godziny na powtórzenie		Okres pobierania próbek substancji rozpuszczonej
zmienna, zazwyczaj 24 godziny		Analiza LA-ICP-MS
1 dzień na żel
HR-CBG
3 dni		Wzrost roślin
zależne od badania		Odzyskiwanie żelu
1 godzina na żel		Przetwarzanie danych
4 godziny na żel
Suszenie żelu
2–3 dni		Generowanie obrazów
10 min na obraz

Tabela 1: Przybliżony czas trwania ogólnych etapów techniki DGT LA-ICP-MS.

Wyniki

Aby zaprezentować możliwości i szczegółowość danych metody obrazowania DGT, opracowano dwuwymiarowy rozkład strumienia w skali submilimetrowej dla wielu labilnych gatunków nutrientów i zanieczyszczeń rozpuszczonych w glebie przylegającej do korzeni Fagopyrum esculentum oraz Salix smithiana (Rysunek 7). Przybliżone czasy trwania ogólnych etapów procedury protokołu przedstawiono w Tabeli 1.

Obrazy substancji rozpuszczonych na Ryc. 7 zostały wygenerowane w trzech różnych badaniach przy użyciu żeli wiążących HR-MBG lub HR-CBG. Obrazy chemiczne przedstawiają dwuwymiarowy rozkład strumienia substancji rozpuszczonych przy rozdzielczości przestrzennej 82-120 µm wzdłuż osi x oraz 300-400 µm wzdłuż osi y, w zależności od zastosowanych parametrów LA-ICP-MS. Ponieważ podczas kalibracji i zmiany rozmiaru obrazów nie zastosowano interpolacji, pojedyncze piksele reprezentują zmierzone punkty danych. Zestawienie obrazów substancji rozpuszczonych z fotograficznym obrazem ROI wykazuje, że submilimetrowy, dwuwymiarowy rozkład strumienia różnych pierwiastków jest bardzo zmienny w zależności od struktury gleby i morfologii korzeni. Można to przypisać zróżnicowanemu zachowaniu biogeochemicznemu pierwiastków w systemie gleba-ryzosfera-roślina oraz ich oddziaływaniu z matrycą glebową i korzeniami roślin.

Na Rysunku 7A zwizualizowano strumienie rozpuszczonych, labilnych nieorganicznych form Mg, Al, P, Mn i Fe wokół młodej korzenia F. esculentum wyhodowanego w glebie bezwęglanowej nawożonej NH4NO3. Rozkład rozpuszczonych substancji w skali poniżej milimetra wykazał strefy zmniejszonego strumienia Al, P i Fe wzdłuż starszych odcinków korzenia w wyniku poboru przez korzeń oraz znacznie zwiększone strumienie Mg, Al, P, Mn i Fe w wierzchołku korzenia w związku z lokalnymi procesami mobilizacji P przez korzeń F. esculentum. Należy zauważyć, że czubek korzenia znajduje się nieco za powierzchnią gleby i jestTherefore niemal niewidoczny na zdjęciu fotograficznym. Rysunek 7B przedstawia rozkład labilnych metali śladowych, w tym Mn, Fe, Zn, Cd i Pb, wokół korzenia metalotolerancyjnej S. smithiana wyhodowanej w glebie umiarkowanie zanieczyszczonej Zn, Cd i Pb. Obrazy rozpuszczonych substancji ukazały wyraźne wyczerpanie, szczególnie Zn, Cd i Pb, w bezpośrednim sąsiedztwie korzenia, co wskazuje, że korzenie S. smithiana działają jako lokalny absorber labilnych metali śladowych w zanieczyszczonej glebie. Ponadto można zaobserwować lokalne wzrosty strumieni Zn, Cd i Pb, co wskazuje na akumulację tych metali śladowych na bezpośredniej granicy gleba-korzeń.

Oprócz obrazowania wieloelementowego substancji rozpuszczonych, przedstawiona metoda może być również łączona z komplementarnymi technikami obrazowania opartymi na dyfuzji, takimi jak optody planarne34. Zostało to zademonstrowane na Rysunku 7C, gdzie rozkład labilnych metali śladowych w ryzosferze S. smithiana został skorelowany z rozkładem pH przy użyciu połączonej, jednowarstwowej układu optody planarnej i żelu wiążącego kationy DGT33. Podłoże glebowe nawożono (NH4)2SO4, co doprowadziło do spadku pH wzdłuż osi korzeni o ~1 jednostkę w porównaniu z glebą niezakorzenioną. Spadki pH współwystępowały ze zwiększonymi strumieniami rozpuszczonych jonów Mn, Fe, Co, Ni, Cu i Pb, co sugeruje indukowaną pH solubilizację metali.

Ponadto powyższe przykładowe wyniki obrazują niektóre z potencjalnych artefaktów obrazowania, które mogą wystąpić. Na przykład strukturalne niejednorodności gleby, np. widoczne jako pozioma linia w dolnej jednej trzeciej obrazu ROI na Rysunku 7A, mogą powodować przerwy w kontakcie gleba-żel, co skutkuje ograniczoną dyfuzją do żelu wiążącego w tym miejscu. Z drugiej strony, nadmierne ubicie gleby w rizotronie może prowadzić do niskiej porowatości, co skutkuje sztucznym przesunięciem statusu redoks gleby w stronę anoksji. Zilustrowano to na Rysunku 7B, gdzie rozległe obszary znacznie podwyższonych strumieni Mn i Fe na obrazach substancji rozpuszczonych wizualnie pokrywały się z gęstą warstwą gleby na obrazie ROI. Sugeruje to obniżony potencjał redoks gleby z powodu wysokiego stopnia ubicia, co prowadzi do redukcyjnego rozpuszczania i solubilizacji pierwiastków o wysokiej wrażliwości na procesy redoks. Dlatego zaleca się staranne wypełnianie rizotronu oraz kontrolę wizualną powierzchni gleby bezpośrednio po wypełnieniu.

Mapy rozkładu pierwiastków; analiza metali, zmienność pH; wyniki spektroskopii.
Rycina 7: Submilimetrowy rozkład 2D labilnych gatunków rozpuszczonych składników odżywczych i zanieczyszczeń w różnych interfejsach gleba-korzeń. (A) Rozkład anionowych form P oraz kationowych form Mg, Al, Mn i Fe wokół młodego korzenia F. esculentum. Współlokalizacyjne pobieranie próbek anionowych i kationowych substancji rozpuszczonych osiągnięto za pomocą HR-MBG przez 24 h przy nasyceniu wodą gleby na poziomie ~75% WHC. Obrazy Al, P i Mn są przedstawione jako skalibrowane wartości fDGT (pg cm-2 s-1), natomiast obrazy Mg i Fe pokazują intensywności znormalizowane względem 13C. Pasek skali odpowiada 1 cm. Rycina została zaadaptowana z ref.48. (B) Rozkład Mn, Fe, Zn, Cd i Pb wokół korzenia S. smithiana wyhodowanego w glebie umiarkowanie zanieczyszczonej Zn, Cd i Pb. Kationowe śladowe ilości metali rozpuszczonych pobierano za pomocą HR-CBG przez 20 h przy nasyceniu wodą gleby na poziomie ~80 % WHC. Wszystkie obrazy są przedstawione jako skalibrowane wartości fDGT (pg cm-2 s-1). Pasek skali odpowiada 0,5 cm. Rycina została zaadaptowana z ref.3. (C) Rozkład pH oraz wielu kationowych substancji rozpuszczonych wokół korzeni S. smithiana wyhodowanych w glebie wzbogaconej o Cd. Współlokalizację dynamiki pH i substancji rozpuszczonych osiągnięto za pomocą modyfikacji protokołu HR-MBG, co umożliwiło jednoczesne pobieranie próbek substancji rozpuszczonych i obrazowanie planarne optodami33. Obrazy Mn, Cu, Zn i Cd są przedstawione jako skalibrowane wartości fDGT (pg cm-2 s-1), natomiast obrazy Fe, Co, Ni i Pb pokazują intensywności znormalizowane względem 13C. Pasek skali odpowiada 1 cm. Rycina została zaadaptowana z ref.33. Przedstawione ryciny zostały powielone z cytowanych artykułów3,33,48 na licencji CC BY. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół obrazowania substancji rozpuszczonych jest wszechstronną metodą wizualizacji i ilościowego określania strumieni składników odżywczych i zanieczyszczeń 2D w środowisku glebowo-roślinnym. Jego wyjątkowość polega na zdolności do generowania wieloelementowych obrazów labilnych gatunków substancji rozpuszczonych w skali poniżej milimetra na granicy gleba-korzeń, znacznie przekraczając osiągalną rozdzielczość przestrzenną alternatywnych metod pomiaru gradientów substancji rozpuszczonej w ryzosferze4. Ukierunkowane podejście DGT do pobierania próbek in situ, w połączeniu z bardzo czułą metodą analizy chemicznej, taką jak LA-ICP-MS, ułatwia szczegółowe badanie dynamiki strumienia substancji rozpuszczonej wokół poszczególnych korzeni roślin uprawianych w glebie lub podobnych podłożach. Ze względu na proces pobierania próbek oparty na zlewie, uzyskane obrazy odzwierciedlają labilność wizualizowanych substancji rozpuszczonych, a zatem stanowią oszacowanie ich dostępności w roślinie10. Chociaż pomiar strumieni substancji rozpuszczonych oparty na metodzie ma znaczne zalety, takie jak możliwość interpretacji jako frakcji składników odżywczych dostępnych dla roślin, pomiary strumienia są znacznie mniej proste do zrozumienia niż pomiary stężenia w wodzie porowej. Standardowa geometria pobierania próbek DGT w zastosowaniach glebowych masowych (w szczególności żele dyfuzyjne o grubości 0,8 mm stosowane w tej konfiguracji) pozwala na porównanie rzeczywistego stężenia wody porowej, c soln, i uśrednionego w czasie oszacowania stężenia wody porowej za pomocą masowego pomiaru DGT, cDGT, oraz na interpretację tych parametrów w odniesieniu do dynamiki uzupełniania gatunków substancji rozpuszczonych. Nie można jednak przeprowadzić takiego porównania w oparciu o obrazowanie DGT z bardzo cienkimi warstwami dyfuzyjnymi, ponieważ otrzymane wartości cDGT są nierealistycznie małe34. Wyniki obrazowania DGT nie zawsze są zatem proste i szybkie w interpretacji, a często nie są bezpośrednio porównywalne z bardziej konwencjonalnymi pomiarami stężenia wody porowej.

Podczas stosowania tej metody należy dokładnie rozważyć kilka krytycznych kroków, związanych głównie z napełnianiem i podlewaniem pojemników do wzrostu ryzotronów. Podczas napełniania gleby do ryzotronu bardzo ważne jest, aby unikać zbyt dużego zagęszczenia gleby, ponieważ korzenie roślin nie mogą wniknąć w silnie zagęszczoną glebę, a wzrost korzeni zostanie zahamowany. Zaobserwowaliśmy, że korzenie unikają silnie zagęszczonej gleby i rosną wzdłuż wewnętrznych krawędzi pojemnika do wzrostu ryzotronu, gdzie gleba jest zwykle mniej zagęszczona. W takim przypadku pojedyncze korzenie znajdujące się w środku ryzotronów, gdzie można wygodnie nakładać żele DGT, mogą w ogóle się nie rozwijać, skutecznie hamując udaną aplikację żelu. W naszym laboratorium doświadczenie wykazało, że gęstość nasypowa suchej gleby wynosząca 1,0-1,4 g cm-3 pozwala na niezakłócony rozwój korzeni. Co więcej, nadmierne zagęszczenie gleby jest również potencjalnym źródłem artefaktów dotyczących rozpuszczalności pierwiastków wrażliwych na redoks i gatunków biogeochemicznie związanych. Ponieważ całkowita objętość porów jest zmniejszona, a rozkład średnicy porów jest przesunięty w kierunku niższych średnic w silnie zagęszczonej glebie, dostępna jest mniejsza objętość porów o większej średnicy wypełniona powietrzem, co może prowadzić do lokalnych warunków redukcyjnych. W związku z tym tlenki MnIII/IV- i FeIII mogą ulec redukcji, co prowadzi do zwiększenia strumieni Mn2+ i Fe2+ . Rozpuszczanie tlenków żelaza, które są ważnymi miejscami sorpcji, np. dla fosforanów i mikroelementów, może uwolnić sorbowane i/lub współwytrącone gatunki, a tym samym spowodować sztucznie zawyżone strumienie biogeochemicznie powiązanych gatunków. Podobny problem może wystąpić, jeśli pojemniki do wzrostu są zbyt mocno podlewane. Parowanie przez małą powierzchnię gleby w górnej części pojemnika wzrostowego jest niewielkie, a gleba może pozostać nasycona wodą nawet przez kilka tygodni po posadzeniu, co może również powodować artefakty redoks.

Kolejną ważną kwestią jest funkcjonalność chemiczna wytworzonego żelu wiążącego HR-DGT. Postępując zgodnie z protokołem, uzyskuje się cienkie żele o jednorodnym rozkładzie faz wiążących. Jeśli żele mają obszary o niejednorodnym rozmieszczeniu materiału (np. w żelu lub agregaty faz wiążących), obszary te muszą zostać usunięte lub, jeśli są zbyt rozległe, należy powtórzyć protokół wytwarzania żelu. Prawidłowo przygotowany żel musi być w stanie natychmiast i ilościowo związać docelowe formy substancji rozpuszczonej, które dyfundują do żelu27, co zależy od zdolności wiązania żelu specyficznej dla analitu. O ile przekroczenie pojemności żelu jest mniej problematyczne w glebach niezanieczyszczonych, o tyle należy je rozważyć w glebach zanieczyszczonych metalami i glebach zasolonych. Nasycenie faz wiążących żel nie tylko pogorszy ilościowe pobieranie próbek substancji rozpuszczonej, ale także spowoduje boczną dyfuzję substancji rozpuszczonych między fazami wiązania w żelu, prowadząc do nieokreślonej lokalizacji cech strumienia substancji rozpuszczonej na małą skalę. W związku z tym, jeżeli w docelowym środowisku glebowym spodziewane są bardzo duże ilości labilnych składników pokarmowych/zanieczyszczeń, należy przeprowadzić wstępne badania. W celu oszacowania oczekiwanych obciążeń DGT można zastosować masowe pobieranie próbek tłoka DGT z gleby, a następnie elucję żelu i mokrą analizę chemiczną15,49. W razie potrzeby czasy rozmieszczenia DGT można dostosować w celu skrócenia czasu kontaktu żelu, a tym samym uniknięcia nasycenia żelu powyżej progów wydajności. I odwrotnie, wstępne testy mogą być również pomocne w określeniu wymaganych czasów kontaktu żelu i/lub wrażliwości LA-ICP-MS, jeśli spodziewane są bardzo niskie ładunki substancji rozpuszczonej, co może być ważne dla mapowania substancji rozpuszczonych pierwiastków śladowych na naturalnych poziomach tła glebowego15. Poza tym prawidłowe działanie żelu DGT powinno być sprawdzone przed jego eksperymentalnym zastosowaniem poprzez kontrolowane ładowanie żeli podczas przygotowywania wzorców kalibracyjnych DGT LA-ICP-MS. Wzorzec żelu zapewnia dopasowane do matrycy referencyjne obciążenie analitem żelu, które można wykorzystać do oceny, czy obciążenie próbki żelem określone przez LA-ICP-MS mieści się w oczekiwanym zakresie. Jeżeli nie jest w stanie uzyskać sygnału, który różni się od szumu tła ślepej próby gazu i metody, operator musi zapewnić, że wdrożono procedury laboratoryjne do analizy pierwiastków śladowych i wykonano wszystkie kroki protokołu. Czasami żel DGT jest przypadkowo odwracany po pobraniu próbki substancji rozpuszczonej, gdy obciążona strona wystawiona na działanie gleby jest skierowana w stronę szklanej płytki, a nie wiązki laserowej, co skutkuje niską intensywnością sygnału i błędnie odwróconymi cechami na końcowych obrazach strumienia substancji rozpuszczonej.

Podczas analizy LA-ICP-MS generowana jest duża ilość danych, których ocena zajmuje dużo czasu. W naszym laboratorium korzystamy z wewnętrznych skryptów oceny danych dostosowanych do naszego docelowego formatu wyjściowego danych przy użyciu standardowego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Po półautomatycznym sortowaniu i kalibracji, drukowanie obrazu odbywa się przy użyciu narzędzi do analizy obrazów o otwartym dostępie (ImageJ, Fiji50). Takie podejście pozwala na pełną kontrolę nad sortowaniem, oceną i prezentacją danych, co jest o tyle istotne, że zebrane dane odpowiadają pikselom prostokątnym, a nie kwadratowym, które muszą być odpowiednio wyświetlane na generowanych mapach substancji rozpuszczonych. Ponadto podczas przetwarzania danych należy starannie unikać interpolacji pikseli. Interpolacja pikseli prowadzi do wygładzonych gradientów w obrazach chemicznych, co skutkuje zmiękczonymi, często okrągłymi cechami rozkładu pierwiastków, a zatem jest niepożądaną zmianą oryginalnych danych. Interpolacja pikseli jest standardową procedurą w operacjach ponownego skalowania i formatowania w wielu programach do przetwarzania obrazu, ale zwykle można ją odznaczyć.

Podsumowując, opisana metoda stanowi znaczący postęp w zrozumieniu dynamiki składników odżywczych i zanieczyszczeń w naturalnych systemach gleba-ryzosfera-roślina. Oprócz zastosowań wyłącznie DGT, metoda może być łączona z innymi technikami obrazowania opartymi na dyfuzji, takimi jak optody planarne 3,33,42,43,48,51 i zymografia 20,21,22,23,24, i może być dalej rozwijana w celu uwzględnienia dodatkowych elementów i parametrów gleby.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było współfinansowane przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) i Austriacki Fundusz Naukowy (FWF) oraz Kraj Związkowy Dolnej Austrii: P27571-BBL (Jakob Santner).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(NH4)2S2O8 (nadsiarczan amonu; APS)VWR21300.260≥ 98,0%, odczynnik analityczny
Kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy (MES)Sigma-AldrichM8250-100G≥ 99,5%
roztwór akrylamiduSigma-AldrichA4058-100ML40%, do elektroforezy
Sole analitunie dotyczynie dotyczyStosować rozpuszczalne w wodzie sole analitu klasy analitycznej lub wyższej
Lejek BuechneraVWR511-0065Średnica płytki 13 cm
Oprogramowanie do modelowania równowagi chemicznejKTH Szwecjan/aWizualny zacisk MINTEQ
Magazyn lokalnynie dotyczy
Oprogramowanie do składu komputerowegoAdobe Inc.nie dotyczyInDesign CS6
DGT sieciownikDGT Research Ltdnie dotyczy2%, próbnik tłokowy DGT pochodna agarozy
DGT Research Ltddotyczyokna naświetlania o średnicy 2 cm
Cyfrowa lustrzanka jednoobiektywowa (DSLR)Canon Inc.nie dotyczyCanon EOS 1000D
Urządzenie dyspersyjneIKA3737000Ultra-Turrax T10 Basic
Dwustronna taśma klejącaTesa56171
EtanolSigma-Aldrich34923Puriss. p.a., absolut, ≥ 99.8%
Bibuła żelowaBibułki Whatman10426981, gatunek GB005, 20 &krot; 20 cm, grubość 1.5 mm
Suszarka do żeluUniEquipn/aUNIGELDRYER 3545
Wysokociśnieniowy system mikrofalowyAnton Paarn/aMultiwave 3000
HNO3VWR1.00456.2500P65%, ISO do analizy
Poziomo WytrząsarkaGFL305
HydroMed D4AdvanSource Biomaterials Corp.n/aHydrofilowe
oprogramowanie ICP-MSPerkin Elmern/aSyngistix
Institutes of Health (NIH)n/aImageJ Fiji, dostępne bezpłatnie pod adresem https://fiji.sc/
Urządzenie do powlekania nożemBYK5561Single Bar 6″, 0,5 mils
Oprogramowanie LAElemental Scientific Lasersn/aSystem ActiveView
LAElemental Scientific Lasersn/aNWR193
Ławka z przepływem laminarnymTelstar Laboratory Equipment B.V.nie dotyczySzafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II
Mieszadło magnetyczneIKA0003582400C-MAG MS 7
Folia zatrzymująca wilgoćBemis Company, Inc.PM999Parafilm M, 4" x 250'N,N,N
',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Sigma-AldrichT9281-50MLBioReagent, odpowiedni do elektroforezy, ~ 99%
NaNO3Sigma-Aldrich229938-10G99,995% na bazie metali śladowych
NaOHSigma-Aldrich1064980500Granulki do analizy
Wytrząsarka górnaGFL3040
Fiolki perfluoroalkoksyalkowe (PFA)Savillex200-015-2015 ml Fiolka standardowa, zaokrąglony
pH-metrThermo Scientific13-644-928Orion 3-gwiazdkowy pH-metr laboratoryjny
Sonda pHThermo Scientific8157BNUMDOrion ROSS Ultra pH/ATC Triode
Obcinak do tworzyw sztucznychDGT Research Ltdn/aUżyj pustych fiolek do sieciowania firmy DGT research Ltd
Pęseta plastikowaSemadeni602
Plastelina Lokalnysklep stacjonarnynie dotyczynieschnącej plastikowej masy modelarskiej na bazie parafiny, wosku i środków wypełniających
Krążki z membrany poliwęglanowejWhatman110606Nuclepore Hydrofilowa membrana, średnica 25 mm, 0,2 i mikro; m wielkość porów, 10 i mikro; m grubości
Arkusz membrany poliwęglanowejHydrofilowa membrana Whatman113506Nuclepore, 8 &; 10 cali, 0,2 i mikro; m wielkość porów, 10 i mikro; m grubość
Krążki membranowe z polieterosulfonuPall Corporation60172Filtry membranowe Supor 450, średnica 25 mm, 0,45 i mikro; m wielkość porów, grubość 0,14 mm
Arkusz membrany polieterosulfonowejPall Corporation60179Filtry membranowe Supor 450, średnica 293 mm, 0,45 i mikro; m wielkość porów, grubość 0,14 mm
folia PTFEHaberkornn/a50 µ m grubość
Przekładka PTFEHaberkornn/aDostępne różne grubości
Żyletki powlekane PTFEPersonna GEM62-0178Ostrza jednoostrzowe ze stali nierdzewnej (powlekane)
Rurka Tygon powlekana PTFES-prep GmbHSP81800,32 cm średnica wewnętrzna
Quadrupole ICP-MSPerkin ElmerN8150044NexION 2000B
Bibuła filtracyjna ilościowa, 454VWR516-0854Zatrzymywanie cząstek 12-15 &mikro; m
Arkusz kalkulacyjnyMicrosoft Corporationn/aMicrosoft Excel 2016 (v16.0)
Nóż ze stali nierdzewnejLokalne zakłady ślusarskien/do średnicy 2,5 cm
Odczynnik zawieszonych cząstek stałych-iminodiacetan (SPR-IDA)Teledyne CETAC Technologiesn/a10 µ Średnica m kulki polistyrenowe, 10 % (w/v) zawieszenie koralików
tranzystorowo-tranzystorowo-logiczny (TTL)nieSkonsultuj się z technikiem ICP-MS w celu określenia odpowiedniego TTL dla konkretnego instrumentu
Dwuobjętościowa komórkaElemental Scientific Lasersn/aDwuobjętościowa komórka 1
Winylowa taśma izolacyjna3Mn/AScotch Super 33+
System oczyszczania wodyTermo Electron LED GmbHn/aTKA-GenPure
ZrOCl2 × 8H2OAlfa Aesar86108.3099.9 %, na bazie metali
nie na bazie eteru Oprogramowanie do analizy obrazu National wewnętrzny dotyczy

Bibliografia

  1. Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
  2. Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
  3. Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
  4. Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
  5. Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
  6. Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
  7. Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
  8. Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
  9. Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
  10. Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
  11. Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
  12. Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
  13. Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
  14. Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
  15. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738(2020).
  16. Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
  17. Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
  18. Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
  19. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  20. Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
  21. Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
  22. Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
  23. Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
  24. Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820(2020).
  25. Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
  26. Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
  27. Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
  28. Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
  29. Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
  30. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  31. Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
  32. Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
  33. Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
  34. Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
  35. Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
  36. Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
  37. Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
  38. Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
  39. Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
  40. Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
  41. Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
  42. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  43. Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369(2017).
  44. Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
  45. Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
  46. May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
  47. Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
  48. Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
  49. Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
  50. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  51. Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika DGTobrazowanie LA ICP MSwizualizacja rizosferymapowanie sk adnik w od ywczych w glebiewytwarzanie elumonta rizotronuanaliza ablacji laserowejnormalizacja wewn trznailo ciowe oznaczenie wielu pierwiastk wrozdzielczo poni ej milimetra
Dwuwymiarowa wizualizacja i kwantyfikacja labilnych, nieorganicznych składników odżywczych roślin i zanieczyszczeń w glebie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.