Artykuł metodologiczny

Decelularyzacja ludzkiej trzustki bez użycia detergentów do produkcji rozpuszczalnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)

DOI:

10.3791/61663

⸱

4 września 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome, 5Wake Forest University College of Arts and Science, 6Wake Forest University School of Medicine, 7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w tym manuskrypcie wyjaśnia etapy wytwarzania rozpuszczalnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) z ludzkiej trzustki. Rozpuszczony proszek ECM otrzymany za pomocą tego protokołu może być stosowany do rekapitulacji mikrośrodowiska wysp trzustkowych in vitro i, potencjalnie, in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transplantacja wysp trzustkowych (ITx) ma potencjał, aby stać się standardem opieki w medycynie zastępczej komórek beta, ale jej wyniki pozostają gorsze niż te uzyskane po przeszczepieniu całej trzustki. Protokoły stosowane obecnie do izolacji ludzkich wysp trzustkowych są poddawane analizie, ponieważ opierają się na enzymatycznym trawieniu narządu, w wyniku którego trzustka zostaje zniszczona, jej połączenia z ciałem zostają utracone, a wyspy trzustkowe są nieodwracalnie uszkodzone. Uszkodzenie wysp trzustkowych charakteryzuje się krytycznymi czynnikami, takimi jak zniszczenie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), która reprezentuje szkielet 3D niszy wysp trzustkowych i której utrata jest niezgodna z eufizjologią wysp trzustkowych. Naukowcy proponują zastosowanie rusztowań opartych na ECM pochodzących z trzustki ssaków, aby rozwiązać ten problem i ostatecznie poprawić żywotność, funkcję i żywotność wysp trzustkowych. Obecnie dostępne metody pozyskiwania takich rusztowań są surowe, ponieważ są one w dużej mierze oparte na detergentach. W związku z tym proponujemy nową, wolną od detergentów metodę, która powoduje mniej uszkodzeń ECM i może zachować krytyczne elementy ECM trzustki. Wyniki pokazują, że nowo opracowany protokół decelularyzacji pozwolił na osiągnięcie całkowitego usunięcia DNA przy zachowaniu komponentów ECM. Uzyskany ECM został przetestowany pod kątem cytotoksyczności i otoczony ludzkimi wyspami trzustkowymi, które wykazywały pozytywne zachowanie komórkowe z wydzielaniem insuliny po stymulacji prowokacją glukozą. Wspólnie proponujemy nową metodę decelularyzacji ludzkiej trzustki bez użycia konwencjonalnych jonowych i niejonowych detergentów chemicznych. Protokół ten i uzyskany za jego pomocą ECM mogą być użyteczne zarówno do zastosowań in vitro, jak i in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja wysp trzustkowych jest drobiazgowym procesem przeprowadzanym poprzez enzymatyczne trawienie połączeń między wyspami trzustkowymi a ich zewnątrzkomórkową otaczającą strukturą podporową. To zniszczenie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest jednym z krytycznych czynników charakteryzujących uszkodzenia wysp trzustkowych zachodzące podczas procesów izolacji1,2,3,4. ECM okołowyspowy jest niezbędnym bezkomórkowym składnikiem endokrynnej trzustki. Składa się z białek i polisacharydów, które oddziałują i sieciują się, tworząc trójwymiarową siatkę, która strukturalnie i biochemicznie wspiera fizjologiczną homeostazę i pomaga w odtworzeniu tego mikrośrodowiska in vitro2,5,6. Utrata podstawowych procesów sygnalizacyjnych między wyspami trzustkowymi a ECM jest uznawana za jeden z czynników przyczyniających się do tego zjawiska, który ogranicza przeżywalność wysp in vitro i in vivo2,7,8,9,10.

ECM pochodzenia zwierzęcego i ludzkiego jest szeroko stosowany do rekapitulacji mikrośrodowiska wysp trzustkowych11,12,13,14,15,16,17,18,19. Ponieważ zdolność ECM do zwiększania przyczepiania, proliferacji i długoterminowego utrzymywania hodowli komórek wysp trzustkowych szczura została po raz pierwszy opisana w ref.20, wiele innych badań dostarczyło mocnych dowodów, że przywrócenie natywnej interakcji ECM z ludzkimi wyspami trzustkowymi poprawia funkcję wysp trzustkowych21,22. Na przykład ostatnie dane wykazały, że wyspy trzustkowe otoczone ECM znacznie poprawiły kontrolę glikemii u myszy z cukrzycą, zwiększając i ułatwiając dostarczanie insuliny w nowatorskiej platformie dostarczania insuliny opartej na komórkach23. Ponadto badania wykazały, że włączenie krytycznych składników ECM trzustki może znacznie poprawić funkcję hormonalną komórek β24,25,26,27.

Protokoły produkcji ECM obecne w literaturze opierają się na stosowaniu chemicznych detergentów, np. Triton X-100 lub dodecylosiarczanu sodu (SDS). Pomimo zapewnienia doskonałego klirensu DNA, substancje chemiczne stosowane w procesach decelularyzacji są cytotoksyczne, drogie, a pozostałości na tkankach pozbawionych komórek budzą obawy co do potencjalnego zastosowania klinicznego.

Na podstawie tych obserwacji, cele tego badania były trojakie: Po pierwsze, opracowanie metody decelularyzacji ludzkiej trzustki przy minimalnym użyciu jonowych lub niejonowych chemicznych detergentów; Po drugie, wyprodukowanie rozpuszczalnego rusztowania ECM do hodowli tkankowej; Po trzecie, scharakteryzowanie ECM trzustki w celu oceny jego cytotoksyczności i wpływu na funkcję komórek wysp trzustkowych. Charakterystyka jest niezbędna dla wszystkich zastosowań opartych na hodowlach komórkowych, ponieważ pokazuje, że rozpuszczony ECM trzustki może być korzystny w rekapitulacji mikrośrodowiska trzustki dla izolowanych wysp trzustkowych. Opisano w nim skuteczną, bezdetergentową metodę decelularyzacji ludzkiej trzustki, charakterystykę ECM oraz wpływ ECM na żywotność i funkcję zamkniętych, izolowanych ludzkich wysp trzustkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez komitet badawczy Wake Forest Baptist Medical Center. Ludzka trzustka została uzyskana w sposób etyczny od dawców narządów za pośrednictwem Carolina Donor Services. Dawcy narządów zostali przebadani pod kątem chorób zakaźnych istotnych dla ludzi, zgodnie z przepisami UNOS. Narządy przyjmowano w sterylnym roztworze konserwującym, gdzie przechowywano je do momentu użycia. Po dostarczeniu do laboratorium wszystkie narządy zostały sprawdzone, a próbki rodzimej trzustki zostały pobrane do celów histologicznych. Narządy zostały następnie zamrożone i przechowywane w sterylnych warunkach w temperaturze -20 °C do czasu dalszego wykorzystania.

1. Chirurgiczne przygotowanie trzustki ludzkiej

UWAGA: Zamrożone trzustki były rozmrażane przez noc w temperaturze 4 °C.

  1. Przed przystąpieniem do chirurgicznego rozwarstwienia trzustki należy przygotować 1 l roztworu do mycia, składającego się z 950 ml wody dejonizowanej (dH2O), 50 ml odczynnika na bazie jodu i 1% roztworu Pen/Strep.
  2. Podczas sekcji chirurgicznej należy nosić sterylne rękawice i fartuch laboratoryjny. Wszystkie operacje należy wykonywać pod kapturem klasy do hodowli komórkowych, aby uniknąć możliwego zanieczyszczenia.
  3. Przenieść trzustkę ze sterylnego worka transportowego do sterylnego łożyska. Upewnij się, że trzustka jest zorientowana z głową narządu po lewej stronie, a ogonem po prawej.
  4. Ostrożnie wypreparuj dwunastnicę z głowy trzustki za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy bez zębów. Uważaj, aby nie zrobić w dwunastnicy, ponieważ zwiększa to ryzyko zanieczyszczenia.
    UWAGA: Jeśli w przewodzie pokarmowym zostanie wykonana, szybko zaciśnij otwór i przystąp do sekcji.
  5. Po zakończeniu sekcji głowy trzustki wyrzuć dwunastnicę do odpowiedniego worka na zagrożenia biologiczne i postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi jej utylizacji.
  6. Wypreparuj i odrzuć całą tkankę pozatrzustkową pozostałą wokół głowy trzustki, w tym główne naczynia krwionośne i wspólny przewód żółciowy, które są zwykle oznaczone w momencie pobrania narządu niewchłanialnymi szwami. Tkankę należy usunąć zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  7. Wypreparuj i odrzuć całą tkankę tłuszczową poza trzustką i tkankę tłuszczową okołotrzustkową otaczającą ogon trzustki, odsłaniając naczynia krwionośne śledziony.
  8. Po odsłonięciu szypułki naczyniowej śledziony należy usunąć śledzionę i wypreparować naczynia krwionośne śledziony w całości, w tym te przyczepione do tylnej powierzchni trzustki (tętnicy śledziony i żyły). Pozbądź się śledziony i usuń tkankę zgodnie z wytycznymi instytucji.
  9. Odpowiednio wypreparować i usunąć wyraźnie widoczny tłuszcz pozatrzustkowy, zwłaszcza tłuszcz okołotrzustkowy.
    UWAGA: Na poziomie ogona trzustki może być widoczna zaotrzewnowa. Należy go podnieść za pomocą kleszczy bez zębów, usunąć odpowiednio za pomocą kleszczy chirurgicznych i odpowiednio zutylizować. Trzustka powinna być teraz wolna od jakiejkolwiek tkanki pozatrzustkowej.
  10. Wypreparuj trzustkę, aby uzyskać 1 cm3 kostki tkanki trzustki za pomocą nożyczek chirurgicznych, wysterylizowanych ostrzy histologicznych lub skalpeli chirurgicznych. Kostki tkanki trzustkowej uzyskane po tym rozwarstwieniu zostaną poddane procesowi decelularyzacji. Średnia liczba kostek trzustkowych, które ulegają decelularyzacji, zależy od wewnętrznych cech narządu. W prezentowanym badaniu decelularyzacji uległo średnio od 40 do 60 kostek trzustkowych.
  11. Przejdź do kroku 2.1

2. Decelularyzacja tkanki trzustki

UWAGA: Ten protokół był stosowany z trzustką o średniej wadze 100 g; dlatego nie zaleca się przekraczania tej wagi przy użyciu tej techniki decelularyzacji.

  1. Umieścić całą tkankę trzustki uprzednio wyciętą w kroku 1.10 w sterylnym plastikowym pojemniku (patrz tabela materiałów) z roztworem myjącym i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Usuń tkankę trzustki za pomocą sterylnych kleszczy i umieść ją w nowym sterylnym pojemniku, który zawiera sterylną, wolną od endotoksyn wodę dejonizowaną. Mocno zamknij nakrętkę pojemnika i umieść go na chłodzonej wytrząsarce orbitalnej o ustawionej temperaturze 4 °C i prędkości wytrząsania w zakresie 180–200 obr./min przez 24 godziny.
  3. Wyjmij pojemnik z tkanką trzustkową i odpowiednio wyczyść jego zewnętrzną stronę przed umieszczeniem go w kapturze w celu kontynuowania procesu.
  4. Usuń tkankę trzustki za pomocą kleszczy chirurgicznych i umieść ją w nowym sterylnym pojemniku wraz z 1 litrem wody dejonizowanej, 50 mg DNazy I i 0,0025% chlorku magnezu. Mocno zamknąć nakrętkę pojemnika i umieścić go w wytrząsarce orbitalnej o ustawionej temperaturze 37 °C i prędkości wytrząsania 100 obr./min przez 6 godzin.
  5. Przygotować roztwór EDTA-Trizma
    1. Zbierz nowy sterylny pojemnik o pojemności 1 l i odpowiednio go wyczyść przed włożeniem go do okapu. Aby przygotować 1 l roztworu EDTA-Trizma, dodaj następujące elementy: 985 ml sterylnej wody dejonizowanej, 7,5 ml buforu Tris-HCl i 7,5 ml roztworu EDTA. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  6. Wyjmij pojemnik otaczający tkankę trzustkową i odpowiednio wyczyść jego zewnętrzną stronę przed włożeniem go do kaptura w celu kontynuacji procesu.
  7. Usuń tkankę trzustki za pomocą kleszczy chirurgicznych i umieść ją w nowym sterylnym pojemniku z 1 litrem roztworu na bazie EDTA-Trizma. Mocno zamknąć nakrętkę pojemnika i umieścić go w wytrząsarce orbitalnej o ustawionej temperaturze 4 °C i prędkości wytrząsania w zakresie 180–200 obr./min przez 18 godzin.
  8. Wyjmij pojemnik zawierający tkankę trzustki i odpowiednio wyczyść jego zewnętrzną stronę przed włożeniem go do kaptura w celu przeprowadzenia procesu.
  9. Usuń tkankę trzustki za pomocą sterylnych kleszczy i umieść ją w nowym sterylnym pojemniku ze sterylną wodą dejonizowaną wolną od endotoksyn. Mocno zamknij nakrętkę pojemnika i umieść go na chłodzonej wytrząsarce orbitalnej o ustawionej temperaturze 4 °C i prędkości wytrząsania od 180 do 200 obr./min przez 24 h.
    UWAGA: W tym okresie przetwarzania nastąpi zauważalna zmiana koloru, w której tkanka będzie wydawać się jaśniejsza.
  10. Zebrać tkankę trzustki i przechowywać ją w sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml, osiągając maksymalną ilość 25 ml na probówkę w celu późniejszego zamrożenia i liofilizacji. Liczba probówek wirujących różni się w zależności od wielkości trzustki. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Produkcja proszku ECM trzustki – liofilizacja i kriomielenie

  1. Po co najmniej 24–40 godzinach przechowywania materiału pozbawionego komórek w temperaturze -80 °C należy przenieść ECM trzustki do liofilizatora.
  2. Przenieś zamrożony materiał do liofilizatora, zapobiegając rozmrożeniu materiału.
    UWAGA: Etap liofilizacji trwa około 3–5 dni w zależności od kilku czynników, takich jak ilość materiału w każdej probówce poddawanej procesowi oraz powierzchnia wystawiona na liofilizację. Zaleca się, aby pozbawiona komórek tkanka nie przekraczała poziomu 25 ml w każdej probówce i aby probówki były zamrożone pod kątem 45°, co pozwala na łatwe odsłonięcie większej powierzchni po rozpoczęciu liofilizacji. Zdejmij pokrywki z tubek.
  3. Po liofilizacji przenieś materiały do okapu klasy do hodowli komórkowych.
  4. Pokrój każdy kawałek wysuszonego ECM na połowę jego rozmiaru za pomocą sterylnych nożyczek. Te wysuszone kawałki ECM zostaną poddane zautomatyzowanemu procesowi mielenia w celu wytworzenia proszku ECM. Użyj kriomielonego automatycznego procesora, aby uniknąć wzrostu temperatury i późniejszej denaturacji właściwości biologicznych ECM. Upewnij się, że wyregulowałeś ustawienie kriofrezarki, aby uzyskać drobny proszek po procesie mielenia.
    UWAGA: W tym badaniu wykorzystano trzustkę od dawców o BMI < 30. Trzustka od dawców z BMI > 30 wykazywała tendencję do zawierania większej ilości tłuszczu śródmiąższowego. Proces liofilizacji nie jest uważany za optymalny i może być hamowany przez zawartość tłuszczu. Jeśli po liofilizacji tkanka jest widocznie oleista, należy ją wyrzucić, ponieważ nie będzie optymalna do produkcji proszku ECM.

4. Solubilizacja ECM trzustki

UWAGA: W tym momencie, z trzustki średniej wielkości (100 g), wydajność decelularizowanego proszku trzustkowego wynosi 1-2 g.

  1. Odważyć 1 g proszku ECM za pomocą sterylnej plastikowej szpatułki.
  2. Osiągnij solubilizację zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami: Rozpuszczaj 1 g ECM w 100 ml 0,01 M HCl i 100 mg pepsyny przez 48 godzin w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu28.
  3. Po 48 godzinach należy użyć NaOH do zneutralizowania pH (pH = 7) kwaśnego ECM, jednocześnie trzymając zlewkę zawierającą kwaśny ECM na lodzie, aby uniknąć żelowania.
    UWAGA: Kinetyka żelowania różni się w zależności od temperatury, zawartości kolagenu, pH i roztworu neutralizującego. W tym badaniu wykorzystano 0,01 M NaOH. Objętość NaOH dodanego do neutralizacji pH wynosiła około 100 ml. Rozważ wielokrotny pomiar pH podczas neutralizacji kwaśnego roztworu ECM.
  4. Przenieść neutralny roztwór ECM do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Zamknij probówki i umieść je w wirówce. Odwirować probówki zawierające rozpuszczony ECM z maksymalną prędkością (12 000 x g) przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu przenieść probówki do okapu do hodowli komórkowych.
    UWAGA: Po odwirowaniu próbki, nierozpuszczalny składnik ECM zostanie osadzony na dnie probówki, podczas gdy rozpuszczony roztwór ECM znajdzie się na górze w supernatancie.
  5. Stosując techniki sterylne, zebrać supernatant z probówki zawierającej rozpuszczony roztwór ECM i przenieść go do świeżych probówek o pojemności 50 ml, osiągając maksymalną ilość 25 ml na probówkę.
  6. Przechowywać probówki z roztworem ECM w temperaturze -80 °C.

5. Produkcja proszku ECM trzustki – liofilizacja i przechowywanie

  1. Po co najmniej 24–40 godzinach przechowywania rozpuszczalnego roztworu ECM w temperaturze -80 °C, przenieść probówki do liofilizatora.
  2. Przenieść zamrożony materiał do liofilizatora, upewniając się, że materiał nie rozmraża się.
    UWAGA: Etap liofilizacji trwa około 3–5 dni w zależności od kilku czynników, takich jak ilość materiału w każdej probówce poddawanej procesowi oraz powierzchnia wystawiona na liofilizację. Zaleca się, aby rozpuszczony roztwór ECM nie przekraczał poziomu 25 ml w każdej probówce i aby probówki były zamrożone pod kątem 45°, aby umożliwić łatwe odsłonięcie większej powierzchni po rozpoczęciu liofilizacji. Zdejmij pokrywki z rurki falcon przed liofilizacją.
  3. Po liofilizacji rozpuszczonego roztworu ECM, przenieść materiał do kaptura klasy hodowli komórkowej. Po całkowitej liofilizacji widoczny będzie drobny proszek ECM.
    UWAGA: Uzyskana wydajność to 700 mg z 1 g tkanki pozbawionej komórek.
  4. Rozpuszczony proszek ECM należy przechowywać lub stosować do hodowli komórkowych.
    UWAGA: Zaleca się przechowywanie ECM w temperaturze 4 °C do natychmiastowego użycia, w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia i w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.

6. Charakterystyka ECM trzustki z barwieniem histologicznym

  1. Zbierz kawałek rodzimej trzustki wkrótce po dostarczeniu narządu, a przed decelularyzacją. Napraw to na 24 godziny w 10% formalinie. Umyj próbki w wodzie dejonizowanej. Odwodnić go w sortowanym alkoholu przed zanurzeniem w parafinie i pokroić na 5 mm kawałki
    2. .
  2. Pod koniec procesu decelularyzacji należy pobrać próbkę materiału pozbawionego komórek i utrwalić ją na 24 godziny w 10% formalinie. Umyj próbkę w wodzie dejonizowanej. Odwodnić go w sortowanym alkoholu przed zanurzeniem w parafinie i pokroić na 5 mm kawałki
    3. .
  3. Aby zweryfikować pomyślną decelularyzację, wykonaj barwienie H&E i DAPI zarówno na natywnej trzustce, jak i na jej zdecelularyzowanym odpowiedniku.
  4. W celu charakterystyki histologicznej należy wykonać barwienia Trichrome Massona (MT) i Alcian Blue (AB), które podkreślą odpowiednio struktury kolagenowe i GAG.

7. Charakterystyka rozpuszczalnego proszku ECM

  1. Wykonaj analizę zawartości DNA i całkowitej zawartości kolagenu w natywnej tkance trzustki i rozpuszczalnym proszku ECM, jak opisano wcześniej29.
  2. Określić ilościowo siarczanowane glikozaminoglikany (sGAG) w oparciu o protokół dostarczony przez dostępny na rynku zestaw (patrz tabela materiałów). Za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami zmierzyć zawartość siarczanowanego sGAG w ECM trzustki przy długości fali 595 nm30,
    UWAGA: Zawartość DNA należy podać w ng/mg suchej tkanki, a zawartość kolagenu i GAG w μg/mg suchej tkanki.

8. Hermetyzacja ludzkich wysepek za pomocą ECM i kultury

UWAGA: Ludzkie wyspy trzustkowe zostały pozyskane komercyjnie (zobacz Tabelę Materiałów).

  1. Po przybyciu należy przeprowadzić posiew ludzkich wysp trzustkowych na płytkach poddanych działaniu hodowli nietkankowej przez 24 godziny w standardowych warunkach z przybliżoną gęstością 2 000 IEQ na każdą 10-centymetrową płytkę.
  2. Manipulować ludzkimi wysepkami w celu przetestowania wpływu ECM na funkcjonalność i żywotność wysepek z następującymi grupami eksperymentalnymi: Wyspy wolne, Wysepki zamknięte w alginacie i Wyspy trzustkowe zamknięte w alginian-ECM.
    UWAGA: Wyżej wymienione grupy wysepek hodowano in vitro w standardowych warunkach przez okres do 8 dni w celu oceny wpływu ECM na funkcjonalność i żywotność wysp trzustkowych.
  3. Zważyć alginian na wadze i zawiesić go za pomocą HBSS w probówce wirówkowej w celu uzyskania stosunku 1,5% (w/v). Umieścić probówkę wirówkową na rotatorze na noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Producent podał masę cząsteczkową między 75–200 kDA i stosunek G/M ≤ 1 dla alginianu.
  4. Odważyć 0,1 mg ECM i zawiesić go w 1 ml uprzednio przygotowanego alginianu, aby uzyskać stężenie ECM na poziomie 0,1 mg/ml.
  5. Enkapsuluj ludzkie wyspy trzustkowe w alginianach i alginianach-ECM zgodnie z wcześniej opisanym protokołem31. Procedura została opisana pokrótce poniżej.
    1. Delikatnie zebrać i wymieszać 3 000 IEQ w 1 ml alginianu i 3 000 IEQ w 1 ml alginianu-ECM przy stężeniu ECM 0,1 mg / ml przygotowanym wcześniej w kroku 8.4.
    2. Otrzymane zawiesiny przepompować przez mikroprzepływowe urządzenie do kapsułkowania ustawione odpowiednio na 0,2 ml/min i natężenie przepływu oraz ciśnienie powietrza 2,0 Pa.
    3. Po wyprodukowaniu zebrać mikrokapsułki w 100 mM kąpieli CaCl2 z 10 mM HEPES. Pozwól alginianowi usieciować się przez 10 minut.
    4. Przed hodowlą należy przemyć zamknięte wysepki HBSS w standardowych warunkach, przez 2–3 minuty w temperaturze 37 °C, z dodatkiem 5% CO2 .
    5. Dodać pożywkę hodowlaną (patrz tabela materiałów) i zmieniać dwie trzecie pożywki co drugi dzień, aż do końca eksperymentu.
      UWAGA: Powyższe kroki należy wykonać zarówno dla wysepek w alginianie, jak i wysepek w alginate-ECM.
  6. W 8 dniu, po kapsułkowaniu, wykonaj wydzielanie insuliny stymulowane glukozą (GSIS) i analizę DNA, aby ocenić odpowiednio produkcję insuliny i żywotność wysp trzustkowych.
  7. Uzyskaj obrazy jasnego pola i barwienie żywych/martwych wysepek wolnych i otorbionych, aby ocenić morfologię i żywotność komórek.
    UWAGA: Przeprowadzono ocenę jakościową obrazów w celu oceny stanu zdrowia wysp trzustkowych. Pod uwagę brane są m.in. kształt, granica, integralność i średnica wysepek, a także obecność pojedynczych komórek w hodowli.

9. Uwalnianie insuliny stymulowane glukozą (GSIS) i pomiar DNA

UWAGA: W 8 dniu, po enkapsulacji, ludzkie wyspy trzustkowe zostały zebrane i inkubowane z buforem Kreba, zawierającym niskie (2,8 mM) i wysokie (16,8 mM) stężenie glukozy, a następnie roztwór depolaryzacyjny KCl (25 mM). Prowokacja glukozy została przeprowadzona z modyfikacją wcześniej opisanego protokołu32.

  1. Wprowadzić żelową żywicę filtracyjną do kolumn polipropylenowych.
  2. Umieścić grupy traktowania (wolne wysepki lub zamknięte w kapsułkach) w środkowej części żelowej żywicy filtracyjnej w kolumnach polipropylenowych.
  3. Pipetować glukozę i roztwory depolaryzujące do kolumn polipropylenowych opisanych powyżej i inkubować przez 1 godzinę, w następującej kolejności: przeprowadzić okres wstępnej inkubacji z roztworem glukozy o niskiej molowości, następnie przystąpić do serii inkubacji z roztworem glukozy o niskim, wysokim, niskim i depolaryzującym roztworze, jak wspomniano w UWAGA na początku sekcji 9.
  4. Zebrać pożywkę z każdej fazy inkubacji i przechowywać ją w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.
  5. Po inkubacji i zebraniu roztworu depolaryzującego, inkubować ludzkie wyspy trzustkowe z 1 ml buforu do ekstrakcji DNA i przechowywać go do dalszej analizy.
  6. Zmierz zawartość insuliny z inkubacji glukozy i roztworu depolaryzującego za pomocą testu insulinowego ELISA, zgodnie z protokołem producenta.
  7. Zmierzyć zawartość DNA z buforu ekstrakcyjnego pobranego w kroku 9.5 przy użyciu zestawu do oznaczania DNA zgodnie z protokołem producenta.
  8. Normalizuj pomiary insuliny zgodnie z zawartością DNA.

10. Analiza statystyczna

UWAGA: Porównania grupowe odnoszą się do tej samej partii ludzkich wysepek z n = 3 niezależną oceną przeprowadzoną dla każdego testu opisanego w tym manuskrypcie. Wartości są wyrażone jako średnia ± SD.

  1. Użyj oprogramowania statystycznego, aby wykonać test Manna-Whitneya do oceny analizy decelularyzacji i pozostałości DNA, porównaj natywną, pozbawioną komórek trzustkę i rozpuszczoną ECM.
  2. Wykonaj niesparowany test t w celu oceny glikozaminoglikanów i kolagenu między natywną, pozbawioną komórek trzustką a rozpuszczonym ECM.
  3. Wykonaj dwukierunkową ANOVA z wielokrotnymi porównaniami post-hoc Turcji dla testu stymulacji glukozy w ocenie stymulacji wysp trzustkowych w dniu 8.
  4. Rozważ istotność statystyczną na poziomie p < 0,05 z oznaczeniem *p < 0,05, **p<0,01, ***p < 0,001 i ****p < 0,0001.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rodzime i bezkomórkowe próbki trzustki zostały przetworzone do barwienia histologicznego za pomocą H&E, MT i AB. Barwienie H&E wykazało całkowity brak materiału jądrowego i komórek, co potwierdza udaną decelularyzację. Barwienia MT i AB ukazały strukturę ECM, podkreślając odpowiednio jakościowo składniki kolagenowe i zrębowe (Rysunek 1).

Ta metoda umożliwiła konsekwentne wytwarzanie proszku ECM z ludzkiej trzustki. Testy kwantyfikacyjne DNA potwierdziły zado...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tej pracy było opracowanie łagodniejszego, wolnego od detergentów protokołu decelularyzacji w celu wytworzenia ECM trzustki. Zwrócono uwagę na zachowanie składników ECM miąższu trzustki i unikanie długotrwałej ekspozycji tkanek na konwencjonalne jonowe lub niejonowe detergenty chemiczne podczas procesu decelularyzacji.

Najbardziej innowacyjnym aspektem opracowanej metody decelularyzacji jest unikanie klasycznych jonowych i niejonowych detergentów chemicznych. Nasze wcześniejsze doświadcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma konkurencyjnych interesów finansowych, które mógłby zadeklarować którykolwiek ze współautorów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z Programu Badań i Innowacji Unii Europejskiej Horyzont 2020 na podstawie umowy o grant nr 646272. Ludzkie wyspy trzustkowe uzyskano z Prodo Laboratories, Aliso Viejo, CA 92656.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelki do przechowywania z polistyrenu Corning 1L Easy Grip z nakrętkami 45 mmThermoFisher430518Pojemnik do decelularyzacji
Młyn kriogenicznySPEX Certiprep6870-230
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcejSigma AldrichDN25
Woda destylowanaThermoFisher15230147
Falcon 50mL Stożkowy Probówki wirówkoweCorning352070
Ludzka trzustkana
insulinę-ElisaMercodia10-1113-01
Chlorek magnezu, 1M, sterylnyBio-World41320004-1
Pepsyna z błony śluzowej żołądka świniSigma AldrichP7012-5G
Łożysko bez pokrywki, sterylneDeRoyal32-881
Probówki do chromatografii polipreBio-rad731-1500Kolumny polipropylenowe
Quant-iT PicoGreen dsDNA ZestawInvitrogenP7589Zestaw DNA
SamplePrep Akcesorium do zamrażarki/młyna o dużej pojemności SPEX6801Duży zestaw fiolek do mielenia
Koraliki Sephadex G-10Cytiva17001001Żelowa żywica
filtracyjnaZestaw chirurgicznydo
UltraPur 0,5 M EDTA, pH 8,0ThermoFisher15575020
UltraPur 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7,5ThermoFisher15567027
UltraPure Woda destylowana bez DNaz/RNazThermoFisher10977023
testowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korpos, E., et al. The peri-islet basement membrane, a barrier to infiltrating leukocytes in type 1 diabetes in mouse and human. Diabetes. 62 (2), 531-542 (2013).
  2. Daoud, J., Petropavlovskaia, M., Rosenberg, L., Tabrizian, M. The effect of extracellular matrix components on the preservation of human islet function in vitro. Biomaterials. 31 (7), 1676-1682 (2010).
  3. Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S., Maysinger, D. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
  4. Paraskevas, S., Maysinger, D., Wang, R., Duguid, T. P., Rosenberg, L. Cell loss in isolated human islets occurs by apoptosis. Pancreas. 20 (3), 270-276 (2000).
  5. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  6. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  7. Kuehn, C., Vermette, P., Fulop, T. Cross talk between the extracellular matrix and the immune system in the context of endocrine pancreatic islet transplantation. A review article. Pathologie Biologie (Paris). 62 (2), 67-78 (2014).
  8. Irving-Rodgers, H. F., et al. Pancreatic islet basement membrane loss and remodeling after mouse islet isolation and transplantation: impact for allograft rejection. Cell Transplant. 23 (1), 59-72 (2014).
  9. Tomei, A. A., et al. Device design and materials optimization of conformal coating for islets of Langerhans. Proceedings of the National Academy Science U. S. A. 111 (29), 10514-10519 (2014).
  10. Miao, G., et al. Basement membrane extract preserves islet viability and activity in vitro by up-regulating alpha3 integrin and its signal. Pancreas. 42 (6), 971-976 (2013).
  11. Peloso, A., et al. The human pancreas as a source of protolerogenic extracellular matrix scaffold for a new-generation bioartificial endocrine pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
  12. Salvatori, M., et al. Extracellular Matrix Scaffold Technology for Bioartificial Pancreas Engineering: State of the Art and Future Challenges. Journal of Diabetes Science and Technology. 8 (1), 159-169 (2014).
  13. Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
  14. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2017).
  15. Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Science Reports. 8 (1), 10452(2018).
  16. Jiang, K., et al. 3-D physiomimetic extracellular matrix hydrogels provide a supportive microenvironment for rodent and human islet culture. Biomaterials. 198, 37-48 (2019).
  17. Citro, A., et al. Biofabrication of a vascularized islet organ for type 1 diabetes. Biomaterials. 199, 40-51 (2019).
  18. Hashemi, J., et al. Application of a novel bioreactor for in vivo engineering of pancreas tissue. Journal of Cell Physiology. 233 (5), 3805-3816 (2018).
  19. Guruswamy Damodaran, R., Vermette, P. Decellularized pancreas as a native extracellular matrix scaffold for pancreatic islet seeding and culture. Journal of Tissue Engineering and Regeneration Medicine. 12 (5), 1230-1237 (2018).
  20. Thivolet, C. H., Chatelain, P., Nicoloso, H., Durand, A., Bertrand, J. Morphological and functional effects of extracellular matrix on pancreatic islet cell cultures. Experimental Cell Research. 159 (2), 313-322 (1985).
  21. Llacua, L. A., Faas, M. M., de Vos, P. Extracellular matrix molecules and their potential contribution to the function of transplanted pancreatic islets. Diabetologia. 61 (6), 1261-1272 (2018).
  22. Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
  23. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2016).
  24. Hadavi, E., et al. Microwell Scaffolds Using Collagen-IV and Laminin-111 Lead to Improved Insulin Secretion of Human Islets. Tissue Engineering Part C Methods. 25 (2), 71-81 (2019).
  25. Crisostomo, J., et al. ECM-enriched alginate hydrogels for bioartificial pancreas: an ideal niche to improve insulin secretion and diabetic glucose profile. Journal of Applied Biomaterial and Functional Mater. 17 (4), 2280800019848923(2019).
  26. Davis, N. E., et al. Enhanced function of pancreatic islets co-encapsulated with ECM proteins and mesenchymal stromal cells in a silk hydrogel. Biomaterials. 33 (28), 6691-6697 (2012).
  27. Carlo, D. Pancreatic acellular matrix supports islet survival and function in a synthetic tubular device: In vitro and in vivo studies. International Journal of Molecular Medicine. 25 (2), (2009).
  28. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  29. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
  30. Afara, I. O., Prasadam, I., Arabshahi, Z., Xiao, Y., Oloyede, A. Monitoring osteoarthritis progression using near infrared (NIR) spectroscopy. Science Reports. 7 (1), 11463(2017).
  31. Tendulkar, S., et al. A scalable microfluidic device for the mass production of microencapsulated islets. Transplantation Protocol. 43 (9), 3184-3187 (2011).
  32. Fraker, C. A. The Role of Oxygen During In Vitro Culture and Immunoisolation of Islets of Langerhans. University of Miami. , PhD Thesis (2011).
  33. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  34. Edgar, L., et al. Utility of extracellular matrix powders in tissue engineering. Organogenesis. , 1-15 (2018).
  35. Katari, R., et al. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 325-347 (2017).
  36. Peloso, A., Katari, R., Tamburrini, R., Duisit, J., Orlando, G. Glycosaminoglycans as a measure of outcome of cell-on-scaffold seeding (decellularization) technology. Expert Reviews on Medical Devices. 13 (12), 1067-1068 (2016).
  37. Pineda Molina, C., Lee, Y. C., Badylak, S. F. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , 527-536 (2020).
  38. Thomas, F. T., et al. Anoikis, extracellular matrix, and apoptosis factors in isolated cell transplantation. Surgery. 126 (2), 299-304 (1999).
  39. Kenmochi, T., et al. Improved quality and yield of islets isolated from human pancreata using a two-step digestion method. Pancreas. 20 (2), 184-190 (2000).
  40. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  41. Stendahl, J. C., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Extracellular matrix in pancreatic islets: relevance to scaffold design and transplantation. Cell Transplant. 18 (1), 1-12 (2009).
  42. de Vos, P., et al. Enzymes for Pancreatic Islet Isolation Impact Chemokine-Production and Polarization of Insulin-Producing beta-Cells with Reduced Functional Survival of Immunoisolated Rat Islet-Allografts as a Consequence. PLoS One. 11 (1), 0147992(2016).
  43. Smink, A. M., de Vos, P. Therapeutic Strategies for Modulating the Extracellular Matrix to Improve Pancreatic Islet Function and Survival After Transplantation. Current Diabetes Report. 18 (7), 39(2018).
  44. Orlando, G., Soker, S., Stratta, R. J. Organ bioengineering and regeneration as the new Holy Grail for organ transplantation. Annals of Surgery. 258 (2), 221-232 (2013).
  45. Orlando, G., et al. Rethinking Regenerative Medicine From a Transplant Perspective (and Vice Versa). Transplantation. 103 (2), 237-249 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production
Posted by JoVE Editors on 12/10/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

Tagi

Decelularyzacja trzustkimetoda bezdetergentowatransplantacja wysepekizolacja wysepekrusztowanie ECMusuwanie DNAwysepki trzustkowesekrecja insulinyzast powanie kom rek beta
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły