Artykuł metodologiczny

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

DOI:

10.3791/61666

⸱

14 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Reproductive Sciences, Division of Developmental Biology, Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine, 3Division of Germ Cell Biology, National Institute for Basic Biology, National Institutes of Natural Sciences, 4Department of Basic Biology, School of Life Science, Graduate University for Advanced Studies (Sokendai), 5Department of Animal Science and Biotechnology, School of Veterinary Medicine, Azabu University, 6Faculty of Science and Technology, Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja spermatocytów mejotycznych jest niezbędna do zbadania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw mejozy i spermatogenezy. Chociaż istnieją ustalone protokoły izolacji komórek wykorzystujące barwienie Hoechst 33342 w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją, wymaga to sortowników komórek wyposażonych w laser ultrafioletowy. Tutaj opisujemy protokół izolacji komórek przy użyciu barwienia DyeCycle Violet (DCV), barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, strukturalnie podobnego do Hoechst 33342. DCV może być wzbudzany zarówno przez lasery ultrafioletowe, jak i fioletowe, co zwiększa elastyczność wyboru sprzętu, w tym sortera komórek niewyposażonego w laser ultrafioletowy. Korzystając z tego protokołu, można wyizolować trzy subpopulacje żywych komórek w profazie mejotycznej I, w tym spermatocyty leptotenowo-zygotenowe, pachytenowe i diplotenowe, a także pomejotyczne okrągłe spermatydy. Opisujemy również protokół przygotowania zawiesiny jednokomórkowej z jąder myszy. Ogólnie rzecz biorąc, procedura wymaga krótkiego czasu (4-5 godzin w zależności od liczby potrzebnych komórek), co ułatwia wiele dalszych zastosowań.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spermatogeneza to złożony proces, w którym niewielka populacja spermatogonialnych komórek macierzystych podtrzymuje ciągłą produkcję dużej liczby plemników przez całe dorosłe życie1,2. Podczas spermatogenezy dynamiczna przebudowa chromatyny ma miejsce, gdy komórki spermatogenne przechodzą mejozę w celu wytworzenia haploidalnych spermatydów3,4,5. Izolacja spermatocytów mejotycznych jest niezbędna do badań molekularnych i ustalono kilka różnych podejść do izolacji spermatocytów mejotycznych, w tym separację opartą na sedymentacji6,7 i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Metody te mają jednak ograniczenia techniczne. Podczas gdy separacja oparta na sedymentacji daje dużą liczbę komórek5,6,7, jest pracochłonna. Uznana metoda oparta na FACS wykorzystuje Hoechst 33342 (Ho342) do separacji spermatocytów mejotycznych na podstawie zawartości DNA i właściwości rozpraszania światła oraz wymaga sortowników komórek FACS wyposażonych w laser ultrafioletowy (UV) 8,9,10,11. Alternatywne metody oparte na FACS wymagają transgenicznych linii myszy, które wyrażają białka fluorescencyjne, synchronizacji spermatogenezy12 lub utrwalenia komórek i znakowania przeciwciał, które nie są kompatybilne z izolacją żywych komórek13. Chociaż istnieje inna alternatywna metoda wykorzystująca przepuszczalny dla komórek barwnik wiążący DNA, DyeCycle Green stain14,15,16,17, ta metoda jest zalecana do izolacji komórek spermatogennych z młodzieńczych jąder. Dlatego istnieje krytyczna potrzeba opracowania prostej i solidnej metody izolacji żywych spermatocytów mejotycznych, którą można zastosować do dowolnego szczepu myszy w każdym wieku i którą można przeprowadzić przy użyciu dowolnego sortera komórek FACS.

Tutaj opisujemy taki długo poszukiwany protokół izolacji komórek za pomocą barwienia DyeCycle Violet (DCV). DCV jest barwnikiem wiążącym DNA o niskiej cytotoksyczności, przepuszczalnym dla komórek, strukturalnie podobnym do Ho342, ale o spektrum wzbudzenia przesuniętym w kierunku fioletowego zakresu18. Ponadto DCV ma szersze spektrum emisji w porównaniu do DCG. Dzięki temu może być wzbudzany zarówno przez lasery UV, jak i fioletowe, co poprawia elastyczność sprzętu, umożliwiając zastosowanie sortera komórek FACS niewyposażonego w laser UV. Przedstawiony tutaj protokół DCV wykorzystuje dwuwymiarową separację z kolorem niebieskim DCV i czerwonym DCV, naśladując zaletę protokołu Ho342. Dzięki tej przewadze nasz protokół DCV pozwala nam wyizolować wysoce wzbogacone komórki rozrodcze z dorosłego jądra. Zapewniamy szczegółowy protokół bramkowania w celu wyizolowania żywych komórek plemnikotwórczych z jąder dorosłych myszy jednej myszy (z dwóch jąder). Opisujemy również skuteczny i szybki protokół przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki z jąder myszy, którą można wykorzystać do tej izolacji komórek. Zabieg wymaga krótkiego czasu wykonania (przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki - 1 godzina, barwienie barwnikiem - 30 minut, a sortowanie komórek - 2-3 godziny: łącznie - 4-5 godzin w zależności od liczby potrzebnych komórek; Rysunek 1). Po izolacji komórek można wykonać szeroki zakres dalszych zastosowań, w tym sekwencję RNA, sekwencję ATAC, sekwencję ChIP-i hodowlę komórkową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (nr protokołu. IACUC2018-0040) w Centrum Medycznym Szpitala Dziecięcego w Cincinnati.

1. Sprzęt i zestaw odczynników do przygotowania zawiesiny komórek jądra

  1. Przygotuj każdy zapas enzymu w 1x Zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) i przechowuj w temperaturze -20 °C. (Tabela 1).
    UWAGA: Przygotuj się w dowolnym momencie przed eksperymentem.
  2. Dzień przed eksperymentem: Pokryj probówki (probówki 1,5 ml) płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. W dniu eksperymentu: Ustawić łaźnię wodną na 37 °C.
  4. Wstępnie podgrzej zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco w temperaturze 37 °C i przygotuj 2 ml 1x buforu dysocjacyjnego dla każdej próbki bezpośrednio przed użyciem (Tabela 1) w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: 2 ml bufor dysocjacyjny przygotowuje się dla dwóch testów. Receptura bufora dysocjacyjnego znajduje się w Tabeli 1.

2. Sekcja zwierząt i przygotowanie zawiesiny komórek jąder

  1. Poświęć 8-tygodniowego samca myszy, pozostawiając go w komorze na dwutlenek węgla na co najmniej 10 minut.
  2. Wyjąć oba jądra i umieścić na szalce Petriego o średnicy 60 mm zawierającej 2 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Usuń osłonkę białawą z jąder. Lekko rozprowadź kanaliki nasienne, delikatnie oddzielając je kleszczami.
  4. Przenieś kanaliki nasienne na szalkę Petriego o średnicy 100 mm z nową kroplą lodowatego PBS i delikatnie rozplątaj kanaliki nasienne za pomocą kleszczy. Powtórz to pranie 3 razy, aby usunąć komórki śródmiąższowe w jak największym stopniu.
  5. Inkubować rozplątane kanaliki nasienne w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml buforu dysocjacyjnego w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  6. Delikatnie odpipetować kanaliki 20 razy za pomocą mikropipety o pojemności 1000 μl.
  7. Inkubować przez 6 minut. Powtórzyć delikatne pipetowanie 20 razy.
  8. Inkubować przez 3 minuty. Powtórzyć delikatne pipetowanie 10 razy, aż nie pozostaną żadne widoczne kawałki.
  9. Dodać 10 ml buforu FACS do zawiesiny. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
  10. Powtórz krok 2.9 dwa razy, aby usunąć plemniki i jak najwięcej zanieczyszczeń.

3. Barwienie komórek

  1. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 3 ml buforu FACS (Tabela 1) i przefiltrować zawiesinę komórek przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 70 μm do probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Oczekiwana wydajność komórek wynosi około 100 milionów komórek na dwa jądra (od 8-tygodniowej myszy B6 typu dzikiego).
  2. Policz liczbę komórek i podziel 10% komórek do nowej probówki jako niebarwionej kontroli ujemnej i pozostaw na lodzie.
  3. Dodać 6 μl barwnika DCV (pierwotne stężenie wynosi 5 mM) do pozostałej zawiesiny komórek i dobrze wymieszać. Końcowe stężenie wynosi 10 μM, a pojemność to około 100 milionów komórek.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności. Delikatnie wstrząsać zawiesiną komórek co 10 minut.
  5. Po inkubacji, bez etapu przemłukiwania, bezpośrednio dodać 5 μl DNazy I (stężenie podstawowe wynosi 10 mg/ml) do zawiesiny komórek i przefiltrować komórki do probówki FACS o pojemności 5 ml przez nasadkę z siatki nylonowej o grubości 35 μm. Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu sortowania.

4. Cytometria przepływowa i bramki eksperymentalne

  1. Przygotuj sorter komórek FACS. Upewnij się, że sortownik komórek FACS jest wyposażony w optykę wzbudzenia: laser fioletowy (405 nm); Optyka detekcyjna: kombinacja filtrów pasma przepustowego 450/50 [ten sam zestaw filtrów 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) do wykrywania DCV-niebieskiego] i pasma przepustowego 665/30 [ten sam zestaw filtrów allofikocyjaniny (APC) do wykrywania DCV-red]. Tutaj jako przykładu używamy sortera komórek Sony SH800S.
  2. Utwórz nowy eksperyment i skonfiguruj następujące wykresy robocze wyświetlające parametry, które mają zostać zoptymalizowane: Kliknij "Nowa gęstość" na pasku menu "Narzędzia arkusza roboczego", aby utworzyć wykres gęstości obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) do obszaru rozproszenia wstecznego (BSC-A) w skali liniowej. Kliknij "Nowy histogram", aby utworzyć wykres niebieskiego histogramu DCV w skali logarytmicznej.
  3. Krótko zmieszać niezabarwioną kontrolę ujemną (z kroku 3.2) i załadować próbkę.
  4. Kliknij "Start" i "Nagraj", aby rozpocząć przetwarzanie niezabarwionej próbki. Podczas pracy próbki kliknij "Ustawienia detektora i progu", aby zoptymalizować napięcia FSC i BSC, dostosowując napięcia obu fotopowielaczy (PMT) w górę lub w dół, aby umieścić niezabarwione ogniwa na skali wykresu FSC/BSC.
  5. Dostosuj napięcie PMT w górę i w dół na "FL1: DAPI", gdy próbka jest uruchomiona, aby zlokalizować pozycję populacji ujemnej DCV w pierwszej dekadzie wykresu logarytmicznego histogramu DCV-blue (Rysunek 2A). Po zakończeniu regulacji napięcia PMT kliknij "Stop", aby rozładować niezabarwioną próbkę.
  6. Krótko zawirować próbkę (od kroku 3.5) i załadować próbkę.
  7. Kliknij "Następna probówka", aby utworzyć nowy arkusz roboczy dla próbki barwionej DCV; a następnie kliknij "Start" i "Nagraj", aby pobrać próbkę zabarwioną DCV, nagrać zdarzenia ≥ 1 x 106. Dodaj następujące wykresy robocze: Kliknij "Nowa gęstość" na pasku menu "Narzędzia arkusza roboczego", aby utworzyć wykres gęstości FSC-H (wysokość) vs. FSC-W (szerokość) na skali liniowej; Kliknij "Nowa gęstość", aby utworzyć wykres gęstości DCV-niebieski i DCV-czerwony na skali liniowej. Po nagraniu zdarzeń ≥ 1 x 106 kliknij "Stop" i rozładuj próbkę.
  8. Na wykresie gęstości FSC-A vs. BSC-A kliknij "Wielokąt" na pasku menu "Narzędzia wykresu", aby narysować dużą bramkę "Komórki", aby uwzględnić większość komórek i wykluczyć małe zanieczyszczenia (Rysunek 2B). Zastosuj bramkę "Komórki" do wykresu gęstości FSC-H vs. FSC-W. Kliknij "Prostokąt", aby narysować bramkę "Pojedyncze komórki", aby wykluczyć komórki inne niż pojedyncze (Rysunek 2C).
  9. Zastosuj bramkę "Pojedyncze komórki" do wykresu gęstości DCV-niebieski i DCV-czerwony i dostosuj skalę, aby uchwycić rozszerzony profil, jak pokazano na Rysunek 2D. Kliknij "Wielokąt" na pasku menu "Narzędzia wykresu", aby narysować bramkę "DCV", aby wykluczyć niebarwione komórki i populację boczną (Rysunek 2D).
  10. Zastosuj bramkę "DCV" do wykresu histogramu DCV-blue na skali liniowej. Trzy główne piki odnoszą się do różnej zawartości DNA: 1C, 2C i 4C (Rysunek 2E).
  11. Kliknij "Nowa gęstość", aby utworzyć wykres gęstości DCV-niebieski i DCV-czerwony na skali liniowej i zastosuj bramkę "DCV", aby wykonać bramkowanie wsteczne od Rysunek 2E, aby zlokalizować populacje 1C i 4C ( Rysunek 2F). Kliknij "Elipsa", aby narysować bramkę na populacji 1C, która znajduje się w zagęszczonym obszarze (bramka 1C). Kliknij "Wielokąt", aby narysować bramę na populacji 4C, która jest ciągłą krzywą (brama 4C).
  12. Kliknij "Nowa gęstość", aby utworzyć wykres gęstości DCV-niebieski i DCV-czerwony na skali liniowej i zastosuj bramkę "4C"; dostosuj skalę, aby powiększyć, a następnie kliknij "Wielokąt", aby narysować bramkę "4C_1" w celu dokładniejszego wyboru (Rysunek 2G).
  13. Kliknij "Nowa gęstość", aby utworzyć nowy wykres gęstości FSC-A vs. BSC-A na skali liniowej i zastosuj bramkę "4C_1"; będą trzy wzbogacone populacje oddzielone wielkością odpowiadającą spermatocytom leptotenu (L) / zygotenu (Z), pachytenu (P) i diplotenu (D). Kliknij "Wielokąt" lub "Elipsa", aby narysować 3 bramki: "L/Z", "P" i "D" w oparciu o rosnący rozmiar (Rysunek 2H).
  14. Kliknij "Nowy wykres punktowy", aby utworzyć wykres punktowy DCV-niebieski i DCV-czerwony na skali liniowej, aby zastosować bramkę i upewnić się, że trzy populacje są w ciągłej kolejności w bramce "4C_1" (Rysunek 2I).
  15. Podobnie, dla populacji 1C, kliknij "Nowa gęstość", aby utworzyć nowy wykres gęstości FSC-A vs. BSC-A na skali liniowej i zastosuj bramkę "1C", wybierz ujednolicony rozmiar komórek jako czystą okrągłą populację spermatydów i kliknij "Elipsa", aby narysować bramkę "RS" (Rysunek 2J).

5. Sortuj subpopulacje męskich komórek rozrodczych

  1. Przygotuj probówki o pojemności 1,5 ml zawierające 500 μl 50% FBS do pobierania komórek i załaduj probówkę do kolektora i kliknij "Załaduj kolekcję".
  2. Kliknij "Następna rura", "Start", "Nagrywanie" i "Początek sortowania". Aby skorzystać z systemu dwukierunkowego, który umożliwia jednoczesne sortowanie dwóch interesujących populacji do urządzenia do pobierania, należy postępować zgodnie z kombinacjami par: spermatocyty leptotenu (L) / zygotenu (Z) i pachytenu (P) oparte na tylnych bramkach L / Z i P; Okrągłe spermatydy (RS) i spermatocyty diplotenowe (D) oparte na tylnych bramach RS i D.
  3. Podczas pracy próbki dostosuj natężenie przepływu do ~3000 zdarzeń/s, aby uzyskać najbardziej efektywne sortowanie.

6. Analiza czystości posortowanych komórek

  1. Zbierz ≥ 10 000 komórek/każdą populację. Wykonaj barwienie immunologiczne komórek, aby potwierdzić podetap.
  2. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie wyrzucić supernatant, pozostawiając około 110 μl cieczy na dnie probówki.
  3. Weź 10 μl kropli zawiesiny komórek, aby obserwować pod mikroskopem i ocenić przegląd morfologii i liczby komórek.
  4. Nałożyć 100 μl zawiesiny komórek na każde z szkiełek komory próbki (patrz Tabela materiałów) i załadować komory do Cytospinu.
  5. Wirować próbki o masie 30 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Narysuj okrąg wokół komórki za pomocą hydrofobowego pisaka. Suszyć szkiełka na stole laboratoryjnym przez kilka minut w temperaturze pokojowej.
  6. Wrzuć 50 μl PBS w okrąg szkiełka i stuknij.
  7. Dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe 5% surowicą osła w PBS z 0,02% polisorbatem 20) w okręgu szkiełka i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Aby ocenić podstopień spermatocytów mejotycznych, wykryto SYCP3, który jest markerem osi chromosomów mejotycznych oraz γH2AX, który jest markerem odpowiedzi na uszkodzenie DNA. (Aby uzyskać informacje na temat stężenia roboczego przeciwciała, zapoznaj się z tabelą materiałów).
  8. Stuknij główny roztwór przeciwciała ze szkiełek.
  9. Wrzuć 50 μl PBS do okręgu szkiełka i stuknij. Powtórz raz.
  10. Dodać roztwór przeciwciał drugorzędowych (rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w PBS z 0,02% polisorbatem 20) w okręgu szkiełka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.
  11. Wrzuć 50 μl PBS do okręgu szkiełka i stuknij. Powtórz raz.
  12. Dodaj 50 μl barwnika DAPI (stężenie wyjściowe wynosi 0,1 μg/ml) przez 5 minut i strzepuj.
  13. Dodaj 1-2 krople nośnika montażowego na szkiełka. Ostrożnie przykryj nośnik montażowy szkłem nakrywkowym i delikatnie dociśnij szkło nakrywkowe, aby usunąć dodatkowe nośniki montażowe i pęcherzyki powietrza. Preparaty są gotowe do oceny mikroskopowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywny wynik tego protokołu sortowania jest pokazany w Rysunek 3. Całkowity czas sortowania dwóch jąder (jednej myszy) wynosi zwykle około 3 godzin, co zależy od stężenia zawiesiny komórkowej i prędkości sortowania. Po sortowaniu czystość spermatocytów potwierdza się poprzez barwienie immunologiczne SYCP3 i γH2AX (Figura 3A). Reprezentatywna czystość posortowanych frakcji spermatocytów L/Z, P, D wynosi odpowiednio około 80,4%, 90,6% i 87,6% (R...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy praktyczny i prosty protokół izolowania subpopulacji spermatocytów i spermatydów od jednego dorosłego samca myszy. Aby zapewnić odtwarzalność tego protokołu, istnieje kilka krytycznych kroków, które wymagają uwagi. Przed trawieniem enzymatycznym etap płukania ma na celu usunięcie komórek śródmiąższowych; Po strawieniu ten krok pomaga usunąć plemniki i zanieczyszczenia. Ważne jest mycie/odwirowywanie 3 razy. W naszej recepturze bufora dysocjacyjnego połączenie kilku różnych enzymów ułatwia dysocjację j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratoriów Namekawa, Yoshida i Maezawa za pomoc; Katie Gerhardt za redakcję rękopisu; Mary Ann Handel za udostępnienie przeciwciała H1T, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core za udostępnienie sprzętu FACS wspieranego przez NIH S10OD023410; Dotacja na badania naukowe (KAKENHI; 17K07424) dla T.N.; Stypendium podoktorskie Fundacji Lalor dla A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) do Południowego Jorku; grant na projekt badawczy przyznany przez Wydział Usług Badawczych Uniwersytetu Azabu, program wspierany przez Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) na projekt marki badawczej prywatnej uczelni (2016–2019), grant na rozpoczęcie działalności badawczej (19K21196), Fundację Naukową Takeda (2019) oraz grant motywacyjny na badania Fundacji Pamięci Uehara (2018) dla S.M.; Narodowy Instytut Zdrowia R01 GM122776 do S.H.N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 1,5 mlWatson131-7155C
100 mm szalka PetriegoCorning, Falcon351029
15 ml Probówka wirówkowaWatson1332-015S
ml probówka polistyrenowa z zatrzaskiem sitko do komórek (35 &mikro; m siatka nylonowa)Corning, Falcon352235
50 mL Probówka wirówkowaWatson1342-050S
60 mm szalka PetriegoCorning, Falcon351007
70 µ m siatka nylonowaCorning, Falcon352350
Sorter komórekSonySH800S
Wirówka
Kolagenaza, rekombinowana, bez pochodzenia zwierzęcegoFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation036-23141
Kolagenaza, Typ 1WorthingtonLS004196
Szkło nakrywkoweFisher12-544-G
Cytospin 3Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol, Dichlorowodorek)FisherD1306stężenie robocze: 0,1 μ g/mL
Dnase ISigmaD5025-150KU
Serum osłaSigmaS30-M
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Gibco14190144
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)Gibco11885076
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco16000044
Histone H1tprzeciwciało podarowane przez Mary Ann Handel1/2000 rozcieńczony
Hank' s zbilansowany roztwór soli (HBSS)Gibco14175095
Hialuronidaza z jąder bydlęcychSigmaH3506-1G
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP5493-4L
Pipety
ProLong Gold Antifade MountantFisherP36930
rH2AXprzeciwciało Millipore05-635stężenie robocze: 2 i mu; g/ml
Przeciwciało przeciwko białku zapłodnienia plemników 56 (Sp56)QED Bioscience55101stężenie robocze: 0,5 μ g / ml
Sterylizowane kleszcze i nożyczki
Szkiełka mikroskopowe Superfrost / Plus Fisher12-550-15
Przeciwciało SYCP3Abcamab205846stężenie robocze: 5 μ g/mL
TWEEN 20 (Polisorbat 20)SigmaP9416
Vybrant DyeCycle Fioletowa Bejca (DCV)InvitrogenV35003
Łaźnia
5 wodna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
  2. Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186(2020).
  3. Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
  4. Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125(2018).
  5. Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
  6. Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
  7. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648(2013).
  8. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
  9. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
  10. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602(2011).
  11. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
  12. Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
  13. Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821(2019).
  14. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
  15. da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294(2016).
  16. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  17. Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
  18. Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
  19. Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
  20. Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
  21. Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
  22. Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81(2016).
  23. Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40(2013).
  24. Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
  25. Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
  26. Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233(2018).
  27. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rek spermatogennychbramkowanie w cytometrii przep ywowejbarwienie DyeCycle Violettrawienie tkanki j drazawiesina pojedynczych kom rekanaliza zawarto ci DNAprotok sortowania kom reksubpopulacje spermatocyt wwzbudzenie laserem fioletowymanaliza rozproszenia wiat a przedniego

Powiązane artykuły