Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Izolacja spermatocytów mejotycznych jest niezbędna do zbadania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw mejozy i spermatogenezy. Chociaż istnieją ustalone protokoły izolacji komórek wykorzystujące barwienie Hoechst 33342 w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją, wymaga to sortowników komórek wyposażonych w laser ultrafioletowy. Tutaj opisujemy protokół izolacji komórek przy użyciu barwienia DyeCycle Violet (DCV), barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, strukturalnie podobnego do Hoechst 33342. DCV może być wzbudzany zarówno przez lasery ultrafioletowe, jak i fioletowe, co zwiększa elastyczność wyboru sprzętu, w tym sortera komórek niewyposażonego w laser ultrafioletowy. Korzystając z tego protokołu, można wyizolować trzy subpopulacje żywych komórek w profazie mejotycznej I, w tym spermatocyty leptotenowo-zygotenowe, pachytenowe i diplotenowe, a także pomejotyczne okrągłe spermatydy. Opisujemy również protokół przygotowania zawiesiny jednokomórkowej z jąder myszy. Ogólnie rzecz biorąc, procedura wymaga krótkiego czasu (4-5 godzin w zależności od liczby potrzebnych komórek), co ułatwia wiele dalszych zastosowań.
Wprowadzenie
Spermatogeneza to złożony proces, w którym niewielka populacja spermatogonialnych komórek macierzystych podtrzymuje ciągłą produkcję dużej liczby plemników przez całe dorosłe życie1,2. Podczas spermatogenezy dynamiczna przebudowa chromatyny ma miejsce, gdy komórki spermatogenne przechodzą mejozę w celu wytworzenia haploidalnych spermatydów3,4,5. Izolacja spermatocytów mejotycznych jest niezbędna do badań molekularnych i ustalono kilka różnych podejść do izolacji spermatocytów mejotycznych, w tym separację opartą na se....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (nr protokołu. IACUC2018-0040) w Centrum Medycznym Szpitala Dziecięcego w Cincinnati.
1. Sprzęt i zestaw odczynników do przygotowania zawiesiny komórek jądra
- Przygotuj każdy zapas enzymu w 1x Zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) i przechowuj w temperaturze -20 °C. (Tabela 1).
UWAGA: Przygotuj się w dowolnym momencie przed eksperymentem. - Dzień przed eksperymentem: Pokryj probówki (probówki 1,5 ml) płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 4 °C przez noc.
- W dniu eksperymentu: Ustawi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywny wynik tego protokołu sortowania przedstawiono na Rysunku 3. Całkowity czas sortowania dwóch jąder (jednej myszy) wynosi zazwyczaj około 3 godzin, co zależy od stężenia zawiesiny komórkowej i prędkości sortowania. Po sortowaniu czystość spermatocytów potwierdza się za pomocą immunobarwienia SYCP3 i γH2AX (Rysunek 3A). Reprezentatywna czystość posortowanych frakcji spermatocytów L/Z, P oraz D wynosi odpowiednio około 80,4%, 90,6% i 87,6% (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj przedstawiamy praktyczny i prosty protokół izolowania subpopulacji spermatocytów i spermatydów od jednego dorosłego samca myszy. Aby zapewnić odtwarzalność tego protokołu, istnieje kilka krytycznych kroków, które wymagają uwagi. Przed trawieniem enzymatycznym etap płukania ma na celu usunięcie komórek śródmiąższowych; Po strawieniu ten krok pomaga usunąć plemniki i zanieczyszczenia. Ważne jest mycie/odwirowywanie 3 razy. W naszej recepturze bufora dysocjacyjnego połączenie kilku różnych enzymów ułatwia dysocjację j.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy członkom laboratoriów Namekawa, Yoshida i Maezawa za pomoc; Katie Gerhardt za redakcję rękopisu; Mary Ann Handel za udostępnienie przeciwciała H1T, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core za udostępnienie sprzętu FACS wspieranego przez NIH S10OD023410; Dotacja na badania naukowe (KAKENHI; 17K07424) dla T.N.; Stypendium podoktorskie Fundacji Lalor dla A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) do Południowego Jorku; grant na projekt badawczy przyznany przez Wydział Usług Badawczych Uniwersytetu Azabu, program wspierany przez Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) na projekt marki badawczej pry....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka 1,5 ml | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm szalka Petriego | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 ml Probówka wirówkowa | Watson | 1332-015S | |
| ml probówka polistyrenowa z zatrzaskiem sitko do komórek (35 &mikro; m siatka nylonowa) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Probówka wirówkowa | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm szalka Petriego | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µ m siatka nylonowa | Corning, Falcon | 352350 | |
| Sorter komórek | Sony | SH800S | |
| Wirówka | |||
| Kolagenaza, rekombinowana, bez pochodzenia zwierzęcego | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Kolagenaza, Typ 1 | Worthington | LS004196 | |
| Szkło nakrywkowe | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol, Dichlorowodorek) | Fisher | D1306 | stężenie robocze: 0,1 μ g/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Serum osła | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t | przeciwciało podarowane przez Mary Ann Handel | 1/2000 rozcieńczony | |
| Hank' s zbilansowany roztwór soli (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hialuronidaza z jąder bydlęcych | Sigma | H3506-1G | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipety | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX | przeciwciało Millipore | 05-635 | stężenie robocze: 2 i mu; g/ml |
| Przeciwciało przeciwko białku zapłodnienia plemników 56 (Sp56) | QED Bioscience | 55101 | stężenie robocze: 0,5 μ g / ml |
| Sterylizowane kleszcze i nożyczki | |||
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost / Plus Fisher | 12-550-15 | ||
| Przeciwciało SYCP3 | Abcam | ab205846 | stężenie robocze: 5 μ g/mL |
| TWEEN 20 (Polisorbat 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Fioletowa Bejca (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Łaźnia |
Bibliografia
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
