Artykuł metodologiczny

Izolacja tkanek o wysokiej czystości od rozwijających się nasion jęczmienia

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61681

⸱

26 października 2020

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do ręcznej izolacji i kontroli jakości zarodków, bielma i tkanek nasiennych podczas całego rozwoju nasion jęczmienia.

Streszczenie

Zrozumienie mechanizmów regulujących rozwój nasion zbóż jest niezbędne dla hodowli roślin i zwiększenia plonów. Jednak analiza nasion zbóż jest trudna ze względu na niewielkie rozmiary, płynny charakter niektórych tkanek i ścisłe połączenia międzytkankowe. Tutaj pokazujemy szczegółowy protokół sekcji zarodka, bielma i tkanek matczynych nasion na wczesnych, środkowych i późnych etapach rozwoju nasion jęczmienia. Protokół opiera się na ręcznym wycięciu tkanek przy użyciu precyzyjnych narzędzi i mikroskopu dwuokularowego, a następnie kontroli czystości opartej na analizie ploidalnej. Nasienne tkanki matczyne i zarodki są diploidalne, podczas gdy bielmo jest tkanką triploidalną. Pozwala to na monitorowanie czystości próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Dodatkowe pomiary wykazały wysoką jakość RNA wyizolowanego z takich próbek i ich przydatność do analizy o wysokiej czułości. Podsumowując, protokół ten opisuje, jak praktycznie wypreparować czyste tkanki z rozwijających się ziaren uprawianego jęczmienia, a potencjalnie także innych zbóż.

Wprowadzenie

Nasiona są złożonymi strukturami składającymi się z kilku tkanek pochodzenia macierzystego i potomnego1. Ziarna zbóż stanowią szczególny typ nasion, w których największą część tworzy endosperm – wyspecjalizowana tkanka triploidalna, która chroni i odżywia embrion. Zboża zapewniają około 60% globalnych zasobów żywności i są najcenniejszym produktem produkcji roślinnej2. Znajomość procesów molekularnych kontrolujących rozwój nasion zbóż jest istotna ze względu na ich znaczenie gospodarcze oraz centralną rolę w reprodukcji roślin1,3.

Jęczmień zwyczajny (Hordeum vulgare subsp. vulgare; 2n = 2x = 14; 1C = 5.1 Gbp) jest czwartym pod względem znaczenia gatunkiem zbożowym na świecie. Jest wykorzystywany w produkcji pasz dla zwierząt, żywności oraz w biotechnologii4. Ponadto stanowi on coraz ważniejszy, klasyczny gatunek modelowy dla zbóż strefy umiarkowanej5. Zasoby genomiczne jęczmienia obejmują mapy genetyczne, kolekcje odmian, ras lokalnych i mutantów, wysokiej jakości asemblacje i adnotacje genomu, a także dane transkryptomiczne z głównych etapów rozwoju5,6,7. Geny jęczmienia są również wykorzystywane do genetycznego ulepszania innych zbóż. Odporność na stresy abiotyczne, takie jak susza i zasolenie, odporność na specyficzne patogeny oraz wysoka zawartość korzystnych związków (np. β-glukanu) sprawiają, że jęczmień jest cennym źródłem cech dla hodowli pszenicy8.

Rozwój nasion rozpoczyna się w wyniku zapłodnienia w dniu zapylenia (DOP). DOP jest definiowany poprzez ocenę morfologii znaku i pręcików zgodnie ze skalą Waddingtona (W10.0)9. Kłosy zawierające niezapylone kwiaty charakteryzowały się zwartym (nierozgałęzionym) znakiem i zielonymi pręcikami, natomiast kłosy zapylone zawierały rozciągnięte kłoski, rozciągnięty i szeroko rozgałęziony znak, nabrzmiałą zalążnię, otwarte pręciki oraz wolny pyłek. Kwiaty w dniu DOP reprezentowały fenotyp pośredni. Pręciki miały żółty kolor, łatwo pękały, a następnie uwalniały pyłek. Znak posiadał szeroko rozpostarte ramiona słupka (Rycina 1C).

Rozwój nasion jęczmienia obejmuje trzy częściowo nakładające się etapy1,10. Etap I (0 – 6 dni po zapyleniu; DAP) rozpoczyna się od podwójnego zapłodnienia i charakteryzuje proliferacją komórek oraz brakiem syntezy skrobi; etap II (7 – 20 DAP) obejmuje różnicowanie i znaczny przyrost biomasy, któremu towarzyszy produkcja skrobi i cząsteczek białek zapasowych; etap III (po 21 DAP) odpowiada dojrzewaniu nasion, redukcji masy poprzez desykację oraz wystąpieniu stanu uśpienia. Alternatywnie fazy te nazywa się odpowiednio wczesną, środkową i późną11.

Ziarno jęczmienia pokryte jest łuskami, na które składają się lemma, palea oraz glumy12. W większości genotypów jęczmienia łuski ciasno otaczają suche nasiona. Samo nasiono tworzą embrion, endosperm oraz macierzyste tkanki nasiona (Rycina 1A). Diploidalny embrion powstaje w wyniku zapłodnienia komórki jajowej przez jądro jednej komórki plemnika. W w pełni rozwiniętym nasionie embrion składa się z osi embrionalnej z koleoryzą otaczającą korzeń zakiełkowy, koleoptilem obejmującym merystem pędu i liście pierwotne oraz skutelum (liścieniem)1,10,13,14. Triploidalny endosperm jest wynikiem zapłodnienia diploidalnej komórki centralnej przez jądro drugiej komórki plemnika. Proliferacja endospermu rozpoczyna się od stadium syncytialnego (koenocytowego), w którym dzielące się jądra są spychane na peryferie przez wakuolę centralną. Na koniec fazy syncytialnej mikrotubule tworzą radialną sieć wokół jąder, co sygnalizuje formowanie się antyklinalnych ścian komórkowych i początek cellularyzacji endospermu. Dyferencjacje endospermu zachodzi równocześnie z cellularyzacją i prowadzi do powstania pięciu głównych tkanek: skrobiowego endospermu, komórek transferowych, warstw aleuronu i subaleuronu oraz obszaru otaczającego embrion. Macierzyste tkanki nasiona to wielowarstwowa struktura diploidalna pochodzenia macierzystego, zawierająca perykarp i łupiny nasiona10,12. Macierzyste tkanki nasiona obejmują wypustkę nucellarną na grzbietowej stronie ziarna, która pełni funkcję transportową i zostaje wbudowana w endosperm w późniejszych stadiach rozwoju nasiona15.

Schemat rozwoju kłoseczka pszenicy przedstawiający regiony SMTs, EMB i END wraz z przekrojami strzałkowymi i poprzecznymi.
Rysunek 1: Rozwijające się nasiona jęczmienia. (A) Schematyczny rysunek ziarna zboża w płaszczyźnie strzałkowej z zaznaczonymi macierzyńskimi tkankami nasiona (SMTs, zielony), endospermem (END, żółty), embrionem (EMB, pomarańczowy) i łuskami (H, szary). (B) Morfologia kłosa jęczmienia w okresie zbliżonym do antytezy. Pasek skali = 1 cm. (C) Morfologia znaku i pręcików w etapach przed, w trakcie i po zapyleniu. Wstawka przedstawia szczegół znaku z ziarnami pyłku (groty strzałek). Pasek skali = 5 mm, pasek wstawki = 200 µm. (D) Przekroje strzałkowe i poprzeczne nasion w 4, 8, 16 i 24 DAP. (NP, wypustka nucelarna) Pasek skali = 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Ostatnie postępy w genomice wysokoprzepustowej dostarczają narzędzi do badania rozwoju poszczególnych tkanek nasion. Jednak główną przeszkodą w tym celu jest zwarta struktura i silne przyleganie tkanek nasion1. Opracowaliśmy protokół wysokiej czystości dyssekcji tkanek nasion z rozwijających się nasion jęczmienia z możliwością ich późniejszego wykorzystania w bardzo czułych analizach, takich jak sekwencjonowanie RNA. Ponadto przedstawiony protokół można łatwo dostosować do innych zbóż.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Uprawa roślin

UWAGA: Biorąc pod uwagę, że pojedyncza roślina jęczmienia zwykle ma od 5 do 6 krzewów i tylko 5 do 6 środkowych kłosków każdego kłosa powinno być używane do rozcięcia, to maksymalny plon z rośliny wynosi 72 nasiona dla odmian dwurzędowych i 216 nasion dla odmian sześciorzędowych.

  1. Aby wykiełkować nasiona jęczmienia, przygotuj szalkę Petriego wyłożoną trzema warstwami bibuły celulozowej pokrytej jedną warstwą bibuły filtracyjnej. Nawilż go wodą destylowaną, aby nie było nadmiaru wody, połóż nasiona na powierzchni i zamknij szalkę Petriego. Bibuła filtracyjna pozwala uniknąć wzrostu korzeni przez tkankę celulozową. Kiełkuj nasiona przez 3 dni w temperaturze 25 °C w ciemności.
    UWAGA: Alternatywnie, kiełkuj nasiona, umieszczając je bezpośrednio w mokrej mieszance gleby (patrz krok 1.2).
  2. Kiełkujące nasiona z widocznym korzonkiem i pędem o długości około 5 cm przenieść do doniczek torfowych o wymiarach 5 cm x 5 cm z mieszanką ziemi i piasku (3:1, v/v). Podlewaj regularnie. Po 10 dniach przenieś rośliny do doniczek o wymiarach 12 cm x 12 cm wypełnionych tą samą mieszanką gleby.
  3. Uprawiaj rośliny w komorze klimatycznej w kontrolowanym reżimie długiego dnia (16 godzin w dzień 20 °C, 8 godzin w nocy 16 °C; natężenie światła 200 μmol m-2 s-1; wilgotność 60%).
    UWAGA: Jęczmień jary potrzebuje około 8-10 tygodni od siewu do początku kwitnienia, bez konieczności wernalizacji. Jęczmień ozimy potrzebuje 7-8 tygodni wernalizacji (warunki krótkodniowe, 8 godzin w dzień 4 °C, 16 godzin w nocy 4 °C; natężenie światła 200 μmol m-2 s-1; wilgotność 85%), aby wywołać kwitnienie.

2. Określenie zapylenia

UWAGA: Precyzyjne określenie zapylenia jest potrzebne do prawidłowego oszacowania postępu rozwoju. Jęczmień jest gatunkiem samopylnym. Aby zdefiniować dzień zapylenia (DOP), monitorowaliśmy dzień samozapylenia. Ta cecha jest specyficzna dla odmiany, ale rozpoczęcie wysunięcia markizy z pochwy liściowej jest dobrym wskaźnikiem zbliżającego się DOP (Rysunek 1B).

  1. Otwórz osłonę liścia zakrywającą kolec. Użyj drobno zakończonej pęsety, aby sprawdzić pylniki i jajnik wewnątrz kłosków w środkowej części kolca. Kłoski z żółtymi pylnikami i "puszystym" piętnem zapylają się w ciągu kilku godzin16 i są uważane za DOP (Rysunek 1B).
  2. Odetnij kolec w pobliżu czubka ostatniego kłoska i usuń liść flagowy oraz górną część markiz. Następnie odetnij górną 1/3 łusek w każdym kłosku. To wysusza pylniki i prowadzi do ich bardziej zsynchronizowanego otwierania i uwalniania pyłku.
  3. Przykryj kolec woreczkiem z okularami z identyfikatorem kłosa, numerem rośliny i zdefiniowaną datą DOP. Zapobiega to również zapylaniu krzyżowemu, które może zagrozić określonym eksperymentom.
  4. Zanotuj informacje w edytorze tabelarycznym. Użyj poniższego wzoru, aby obliczyć dzień po zapyleniu (DAP), w którym powinna odbyć się izolacja tkanki.
    xDAP = DOP + x
    x = oczekiwany DAP
    UWAGA: Wartości powinny mieć format "Dane".
  5. W celu rozbioru tkanek nasiennych należy zebrać kolce w DAP zgodnie z przygotowanym kalendarzem tabelarycznym.

3. Sekcja tkanek nasiennych

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonane przy użyciu mikroskopu stereoskopowego. Usuń łuski przed sekcją za pomocą pęsety. Należy pamiętać, że kadłuby stają się bardziej suche i bardziej przylegające od około 16 DAP. Aby zachować warunki fizjologiczne i uniknąć wysuszenia materiałów roślinnych podczas sekcji, próbki należy zwilżyć, umieszczając je w kropli 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4). Użyj nowego nasiona do wypreparowania każdej tkanki, aby uniknąć degradacji DNA, RNA lub białka z powodu wydłużonego czasu pobierania próbki. Do izolacji RNA z wypreparowanego materiału należy używać wyłącznie materiałów i chemikaliów wolnych od RNaz. Nie należy przekraczać całkowitego czasu rozwarstwiania wynoszącego 15 minut dla jednej próbki składającej się zazwyczaj z tkanek wypreparowanych z 5-10 nasion, aby zminimalizować degradację RNA.

  1. Usuń resztę łusek za pomocą drobno zakończonej pęsety przed sekcją tkanek. Nawilżanie 1× PBS przez 1 minutę pomaga usunąć suche pozostałości kłoska.
  2. Umieść obrane nasiona na szalce Petriego z kroplą 1× PBS i wypreparuj poszczególne części za pomocą drobno zakończonej pęsety, cienkiej igły i pipety mikrokapilarnej. Nieco inną strategię stosuje się do sekcji pojedynczych tkanek: nasienia tkanek matczynych (krok 3.3), zarodka (krok 3.4) i bielma (krok 3.5).
  3. Rozwarstwienie nasiennych tkanek matczynych
    1. Rozbior z nasion do 8 DAP
      1. Umieść nasiono po stronie grzbietowej i delikatnie pokrój nasiona wzdłuż osi podłużnej, a następnie oderwij tkanki matczyne nasion z wyjątkiem ostatniej warstwy graniczącej z bielmem od wierzchołka do części podstawnej za pomocą pęsety.
      2. Zebrać nasienne tkanki matczyne z 5 do 10 nasion do probówki o pojemności 1,5 ml z 50 μl 1× PBS, wyrzucić bufor za pomocą pipety, dwukrotnie przepłukać tkankę 100 μl PBS, usunąć nadmiar buforu przez pipetowanie i zamknąć probówkę i zamrozić w ciekłym azocie lub użyć bezpośrednio do pomiaru ploidalności cytometrycznej przepływowej. Ilość materiału jest wystarczająca zazwyczaj do jednego dalszego zastosowania (np. izolacja RNA lub pomiar ploidalności metodą cytometrii przepływowej).
    2. Rozbior z nasion po 8 DAP
      1. Umieść nasiono po stronie grzbietowej, delikatnie przeciąć na środku brzusznej strony tkanek matczynych nasion i stopniowo odklejaj tkankę wokół całego nasiona, w tym projekcję jądrową. Dla każdej dalszej aplikacji należy zebrać i umyć tkankę od 5 do 10 nasion, jak opisano w kroku 3.3.1.
  4. Rozwarstwienie zarodka
    1. Preparacja z nasion w wieku 8 DAP i młodszych
      1. Umieść nasiono po stronie grzbietowej i odetnij podstawową 1/3 nasion. Ostrożnie podziel oddzieloną część na pół i uwolnij zarodek. Dla każdego dalszego zastosowania należy zebrać i umyć zarodki od 10 do 20 nasion, jak opisano w ppkt 3.3.1.
    2. Rozbior z nasion po 8 DAP
      1. Umieść nasiona po stronie grzbietowej i usuń nasiona tkanek matczynych z podstawowej części strony brzusznej. Delikatnie narusz cienką warstwę bielma na obwodzie zarodka za pomocą cienkiej igły lub drobno zakończonej pęsety i oderwij zarodek. Dla każdego dalszego zastosowania zbiera się i myje zarodki z maksymalnie 5 nasion, jak opisano w ppkt 3.3.1.
  5. Rozwarstwienie bielma
    1. Rozwarstwienie bielma syncytialnego z 4 nasion DAP.
      1. Umieść nasiono po stronie grzbietowej i usuń nasienne tkanki matczyne, z wyjątkiem ostatniej warstwy komórek graniczących z bielmem. Delikatnie nakłuć warstwę na środku brzusznej strony cienką igłą i zassać bielmo syncytialne przez działanie kapilarne za pomocą pipety mikrokapilarnej.
      2. Dla każdej dalszej aplikacji należy zebrać płynne bielma od 10 do 15 nasion do nowej probówki o pojemności 1,5 ml z buforem odpowiednim do planowanej dalszej analizy (tj. 1x PBS, bufor do izolacji RNA, bufor do cytometrii przepływowej). Objętość bufora powinna odzwierciedlać protokół dla planowanej aplikacji podrzędnej. Zamrażać w ciekłym azocie.
    2. Rozwarstwienie celullaryzującego bielma od 5 do 8 nasion DAP
      1. Umieść nasiono po stronie grzbietowej i usuń wszystkie nasiona, tkanki matczyne i zarodek. Do każdej dalszej aplikacji należy zebrać i umyć bielmo od 10 do 15 nasion do nowej probówki o pojemności 1,5 ml z 1x PBS i zamrozić w ciekłym azocie.
    3. Rozwarstwienie celullaryzowanego bielma z nasion po 8 DAP
      1. Umieść nasiono po stronie grzbietowej, usuń wszystkie nasiona, tkanki matczyne i zarodek. Dla każdego dalszego zastosowania należy pobrać i przepłukać bielmo z pojedynczego ziarna na probówkę, jak opisano w kroku 3.3.1.
  6. Probówki z odizolowanym materiałem przechowywać w temperaturze – 80 °C do momentu użycia.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Kontrola czystości tkanek za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Czystość próbki można sprawdzić za pomocą cytometrii przepływowej przed izolacją RNA. Właściwa kalibracja przyrządu ma kluczowe znaczenie dla analizy próbki biologicznej. Optykę cytometru przepływowego/analizatora ploidalnego należy wyregulować za pomocą kulek kalibracyjnych (fluorescencyjnie barwione mikrosfery polistyrenowe wysoce jednorodne pod względem wielkości i intensywności fluorescencji) aż do uzyskania maksymalnej ostrości szczytowej, zwykle osiągającej współczynnik zmienności (CV) < 2%. Tkanki nasienne zbóż zawierają głównie populacje G1, G2 i endoreduplikowane jądra; Dlatego zaleca się stosowanie skali logarytmicznej. Zacznij od tkanki liścia, która zawiera głównie jądra G1 i służy jako podstawowa kontrola ploidalności.

  1. Należy użyć świeżo przygotowanych próbek przechowywanych na lodzie (patrz krok 3.3.1) lub zamrożonej tkanki zgodnie z opisem17.
    UWAGA: Ponieważ cała próbka < 8 DAP jest używana do cytometrii przepływowej, stanowi to tylko kontrolę pośrednią. Zalecamy badaczom wykonywanie wielu izolacji i pomiarów, aż do osiągnięcia wysokiego odsetka czystych próbek (>90%) przed przystąpieniem do izolacji RNA z < 8 próbkami DAP.
  2. Uwolnić jądra z 4 i 8 próbek zarodków DAP (inne próbki patrz krok 4.4) poprzez homogenizację tkanek przez 5 do 10 obrotów plastikowego tłuczka w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 300 μl buforu Otto I (0,1 M monohydrat kwasu cytrynowego, 0,5% (v/v) Tween 20, przefiltrowany przez filtr 0,22 μm)18.
  3. Przefiltrować surową zawiesinę przez siatkę nylonową o grubości 50 μm do probówki do analizy cytometrii przepływowej i dodać 600 μl buforu Otto II (0,4 M Na2HPO4·12H2O) zawierającego 2 μg mL-1 DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol)18 do barwienia DNA.
  4. Umieścić wszystkie inne tkanki (w tym 16 DAP lub starsze zarodki) na szalce Petriego zawierającej 500 μl buforu Otto I i homogenizować przez siekanie żyletką. Przefiltrować zawiesinę jak w kroku 4.3 i zabarwić 1 ml buforu Otto II zawierającego DAPI.
    UWAGA: Manipulacja ostrą żyletką z podwójną krawędzią wymaga szczególnej uwagi. Aby zmniejszyć ryzyko obrażeń, dostępne są żyletki z pojedynczą krawędzią lub specjalne uchwyty ostrzy.
  5. Oszacować zawartość jądrowego DNA w próbce za pomocą cytometru przepływowego. Do analizy czystości próbki wymagane jest co najmniej 2000 cząstek na próbkę.

5. Izolacja RNA i pomiar jakości

  1. Użyj zamrożonej tkanki, aby zapobiec degradacji RNA przez endogenne rybonukleazy. Z nasion, tkanek matczynych i próbek zarodków wyizoluj RNA za pomocą dostępnych na rynku zestawów lub odczynnika TRIzol19. Ze względu na wysoką zawartość skrobi w tkankach bielma, należy wyizolować całkowite RNA ze wszystkich próbek przy użyciu komercyjnych protokołów ekstrakcji RNA na kolumnie dla problematycznych tkanek (np. Zestaw Spectrum Plant Total RNA Kit) z wbudowanym w kolumnę traktowaniem DNazy I20.
  2. Pomiar stężenia i integralności RNA za pomocą dedykowanego protokołu do elektroforezy żelowej RNA lub Bioanalyzera Agilent 2100.
    UWAGA: Nienaruszone całkowite RNA ma wyraźne prążki/piki 18S i 25S rRNA o rozmiarach odpowiednio około 1,9 i 3,7 kb. Pasmo 25S rRNA powinno być około dwa razy intensywniejsze niż pasmo 18S rRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby przeprowadzić tkankowo specyficzną analizę transkryptomiczną rozwoju nasion jęczmienia, opracowaliśmy protokół wysokiej czystości izolacji tkanek. Protokół opiera się na manualnej dyssekcji zarodka, endospermy oraz maternalnych tkanek nasion z obranych (po manualnym usunięciu łuski) ziaren (Rysunek 1A). Protokół został z sukcesem zastosowany do izolacji materiałów z kilku odmian dwu- i sześciorzędnego jęczmienia jarego; kłosy zbierano w określonym DAP i bezpośrednio wykorzystywano do eks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół, który pozwala na izolację tkanek nasion jęczmienia o wysokiej czystości. Chociaż został opracowany i przetestowany dla jęczmienia, może być łatwo zaadoptowany do innych członków plemienia Triticeae, takich jak pszenica, owies, żyto czy pszenżyto27. Początkowa część protokołu, skupiająca się na sekcji tkanek nasiennych, nie wymaga żadnego niestandardowego ani drogiego sprzętu i dlatego powinna być dostępna dla wielu naukowców. Do dokładnej analizy kont...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Janowi Vránie i dr Mahmoudowi Saidowi za utrzymanie cytometrów przepływowych, Evie Jahnovej za przygotowanie, Marie Seifertovej za listę materiałów i Zdence Bursovej za pielęgnację roślin. Prace te były wspierane przede wszystkim z grantu Czeskiej Fundacji Naukowej 18-12197S. Projekt A.P. był dodatkowo wspierany przez stypendium J. E. Purkyně z Czeskiej Akademii Nauk oraz projekt EFRR "Rośliny jako narzędzie zrównoważonego rozwoju globalnego" (nr 1). CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr 0,22 umMerckSLGSV255F
1,5 ml Probówka EppendorfSarstedt72.690.001
4',6-diamidono-2-fenyloindolInvitrogenD21490
50 um siatka nylonowaSilk a Progrersuhelon 120 T
Agilent 2100 BioanalyzerZespół
Drummond Scientific Company1-000-9000
Koraliki kalibracyjneInvitrogenA16502
Bibułka
Monohydrat kwasu cytrynowegoPenta13830-31000
Komora klimatycznaWeiss Gallenkamp
DNase ISigma AldrichDNASE70
Filter papierFagron
Pęseta drobno spiczastaFine Science Tools11254-20
Cytometr przepływowySysmex-Partec
Rurka do cytometrii przepływowejSarstedt55.484
Zamrażarka
Worek
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
Ciekły azotPipeta
Fivephoton BiochemicalsMGM 1C-20-30
Minutien PinsFine Science Tools26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
Doniczki torfoweJiffy5x5 cm
szalka
Uchwyt na szpilkiFine Science Tools26016-12
Tłuczek plastikowyp-LabA199001
Doniczki12x12 cm
ŻyletkaGillette
RNAz zapInvitrogenAM9780
Nożyczki
Spektrum gleby
Roślina Całkowity zestaw RNASigma AldrichSTRN50
Olympus
P2287
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513
żarówki G2939BA celulozowaszklany mikrokapilarna Linde Petriego do piasku Narzędzia do nauki o nauce 14060-11 Mikroskop stereoskopowy Tween 20 Sigma Aldrich

Bibliografia

  1. Sreenivasulu, N., et al. Barley grain development: Toward an integrative view. International Review of Cell and Molecular Biology. 281, 49-89 (2010).
  2. FAO. Cereal supply and demand brief. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: http://www.fao.org (2019).
  3. Baik, B. K., Ullrich, S. E. Barley for food: Characteristics, improvement, and renewed interest. Journal of Cereal Science. 48 (2), 233-242 (2008).
  4. Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Stein, N., Muehlbauer, G. J. , Springer. Cham. Switzerland, AG. 1-10 (2018).
  5. Mascher, M., et al. A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome. Nature. 544 (7651), 427-433 (2017).
  6. Mascher, M. Pseudomolecules and annotation of the second version of the reference genome sequence assembly of barley cv. Morex V2. Morex. , Available from: https://edal.ipk-gatersleben.de (2019).
  7. Rapazote-Flores, P., et al. BaRTv1.0: An improved barley reference transcript dataset to determine accurate changes in the barley transcriptome using RNA-seq. BMC Genomics. 20 (1), 968(2019).
  8. Molnár-Láng, M., Linc, G., Szakács, É Wheat-barley hybridization: The last 40 years. Euphytica. 195 (3), 315-329 (2014).
  9. Waddington, S. R., Cartwright, P. M., Wall, P. C. A quantitative scale of spike initial and pistil development in barley and wheat. Annals of Botany. 51 (1), 119-130 (1983).
  10. Sabelli, P. A., Larkins, B. A. The development of endosperm in grasses. Plant Physiology. 149 (1), 14-26 (2009).
  11. Dante, R. A., Larkins, B. A., Sabelli, P. A. Cell cycle control and seed development. Frontiers in Plant Science. 5, 1-14 (2014).
  12. Rodríguez, M. V., Barrero, J. M., Corbineau, F., Gubler, F., Benech-Arnold, R. L. Dormancy in cereals (not too much, not so little): About the mechanisms behind this trait. Seed Science Research. 25 (2), 99-119 (2015).
  13. Sreenivasulu, N., et al. Gene expression patterns reveal tissue-specific signaling networks controlling programmed cell death and ABA-regulated maturation in developing barley seeds. Plant Journal. 47 (2), 310-327 (2006).
  14. Olsen, O. A. Nuclear endosperm development in cereals and Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 16, suppl_1 214-227 (2004).
  15. Thiel, J., et al. Different hormonal regulation of cellular differentiation and function in nucellar projection and endosperm transfer cells: A microdissection-based transcriptome study of young barley grains. Plant Physiology. 148 (3), 1436-1452 (2008).
  16. Weschke, W., et al. Sucrose transport into barley seeds: Molecular characterization of two transporters and implications for seed development and starch accumulation. Plant Journal. 21 (5), 455-467 (2000).
  17. Staszak, A. M., Rewers, M., Sliwinska, E., Klupczyńska, E. A., Pawłowski, T. A. DNA synthesis pattern, proteome, and ABA and GA signalling in developing seeds of Norway maple (Acer platanoides). Functional Plant Biology. 46 (2), 152-164 (2019).
  18. Otto, F. Chapter 11 DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  19. Fisher Scientific. Procedural guidelines. , (2020).
  20. Spectrum TM. Plant Total RNA Kit. , (2020).
  21. Nowicka, A., et al. Dynamics of endoreduplication in developing barley seeds. Journal of Experimental Botany. , eraa453(2020).
  22. Chen, J., et al. Dynamic transcriptome landscape of maize embryo and endosperm development. Plant Physiology. 166 (1), 252-264 (2014).
  23. Zhang, S., Laurie, A. E., Ae, W., Meng, L., Lemaux, P. G. Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize (Zea mays L.). Springer. 215 (2), 191-194 (2002).
  24. Doll, N. M., et al. Transcriptomics at maize embryo/endosperm interfaces identifies a transcriptionally distinct endosperm subdomain adjacent to the embryo scutellum. Planta. 32 (4), 833-852 (2020).
  25. Yi, F., et al. High temporal-resolution transcriptome landscape of early maize seed development. Plant Cell. 31 (5), 974-992 (2019).
  26. Gómez, E., et al. The maize transcription factor myb-related protein-1 is a key regulator of the differentiation of transfer cells. Plant Cell. 21 (7), 2022-2035 (2009).
  27. Bewley, J. D., Black, M., Halmer, P. The encyclopaedia of seeds: Science, technology and uses. CABI. , Wallingford, UK. (2006).
  28. Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
  29. Pirrello, J., et al. Transcriptome profiling of sorted endoreduplicated nuclei from tomato fruits: how the global shift in expression ascribed to DNA ploidy influences RNA-Seq data normalization and interpretation. Plant Journal. 93 (2), 387-398 (2018).
  30. Sreenivasulu, N., et al. Transcript profiles and deduced changes of metabolic pathways in maternal and filial tissues of developing barley grains. Plant Journal. 37 (4), 539-553 (2004).
  31. Bian, J., et al. Transcriptional dynamics of grain development in barley (Hordeum vulgare L). International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 962(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozw j nasion j czmieniasekcja tkanekanaliza ploidiicytometria przep ywowaizolacja embrionuizolacja endospermyizolacja tkanek macierzystychmikroskopia binokularnaanaliza jako ci RNAczysto tkanek zb
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły