Artykuł metodologiczny

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

DOI:

10.3791/61683

⸱

5 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby zwyrodnieniowe siatkówki (RD) związane z utratą fotoreceptorów, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) i wrodzona ślepota Lebera (LCA) powodują postępującą i wyniszczającą utratę wzroku. Istnieje niezaspokojone zapotrzebowanie na terapie, które mogą przywrócić wzrok po utracie fotoreceptorów. Przeszczepienie ludzkiej tkanki siatkówki pochodzącej z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) (organoidów) do przestrzeni podsiatkówkowej oka z zaawansowanym RD przynosi arkusze tkanki siatkówki z tysiącami zdrowych, wolnych od mutacji fotoreceptorów i ma potencjał do leczenia większości/wszystkich chorób powodujących ślepotę związanych ze zwyrodnieniem fotoreceptorów za pomocą jednego zatwierdzonego protokołu. Przeszczep tkanki siatkówki płodu do przestrzeni podsiatkówkowej modeli zwierzęcych i osób z zaawansowaną RD został pomyślnie opracowany, ale nie może być stosowany jako rutynowa terapia ze względu na obawy etyczne i ograniczoną podaż tkanek. Modele zwierzęce z dziedzicznym zwyrodnieniem siatkówki (IRD) dużego oka są cenne dla opracowywania terapii przywracających wzrok wykorzystujących zaawansowane podejścia chirurgiczne do przeszczepiania komórek/tkanek siatkówki do przestrzeni podsiatkówkowej. Podobieństwa w rozmiarach kuli i rozmieszczeniu fotoreceptorów (np. obecność obszaru centralnego obszaru plamki żółtej) oraz dostępność modeli IRD ściśle rekapitulujących ludzkie IRD ułatwiłyby szybkie przełożenie obiecującej terapii na praktykę kliniczną. Przedstawiono tu chirurgiczną technikę przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z hPSC do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego, co pozwala na ocenę tego obiecującego podejścia w modelach zwierzęcych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miliony ludzi na całym świecie cierpią na zwyrodnienie siatkówki (RD) z wynikającym z tego upośledzeniem wzroku lub ślepotą związaną z utratą fotoreceptorów wyczuwających światło (PR). Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest główną przyczyną ślepoty wynikającej z połączenia genetycznych czynników ryzyka i czynników środowiskowych/stylu życia. Ponadto stwierdzono, że ponad 200 genów i loci powoduje dziedziczne RD (IRD)1. Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP), najczęstsze IRD, jest genetycznie heterogenne z ponad 3,000 mutacjami genetycznymi w około 70 genach, które są zgłaszane2,3,4. Wrodzona ślepota Lebera (LCA), która powoduje ślepotę w dzieciństwie, jest również genetycznie heterogeniczna5,6. Terapia wzmacniająca geny została opracowana i jest w fazie badań klinicznych w leczeniu niewielkiej liczby IRD3,7. Należy jednak opracować oddzielną terapię do leczenia każdej odrębnej postaci genetycznej IRD, a tym samym leczyć tylko niewielką podgrupę pacjentów. Co więcej, augmentacja genów opiera się na obecności populacji możliwych do uratowania fotoreceptorów i dlatego nie ma zastosowania w przypadku zaawansowanego zwyrodnienia.

Istnieje zatem pilna i jeszcze niezaspokojona kliniczna potrzeba opracowania terapii adresujących i leczących zaawansowane RD oraz głęboką lub terminalną ślepotę. W ciągu ostatnich 2 dekad implanty neuroprotetyczne zostały opracowane i przetestowane na dużych modelach zwierzęcych, takich jak koty, przed użyciem u ludzi8,9,10,11,12,13,14. Podobnie, w ciągu ostatnich 20 lat opracowano terapie wymiany siatkówki z wykorzystaniem arkuszy embrionalnej lub nawet dojrzałej siatkówki ssaków przeszczepionych podsiatkówkowo15,16,17,18,19,20,21,22 i nawet przetestowane pomyślnie u pacjentów z RD23,24,25. Oba podejścia wykorzystują ideę wprowadzenia nowych czujników (fotowoltaiczne fotodiody krzemowe w przypadku urządzeń neuroprotetycznych 26,27, oraz zdrowych, wolnych od mutacji fotoreceptorów zorganizowanych w arkusze, w przypadku implantacji arkusza siatkówki) do siatkówki ze zdegenerowanymi PR. Ostatnie badania dotyczyły zastosowania podejść opartych na komórkach macierzystych, takich jak przeszczepianie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z komórek macierzystych siatkówki pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC)28,29, hPSC-photoreceptors30 i hPSC-organoidy siatkówkowe31,32,33. Organoidy siatkówki umożliwiają tworzenie tkanki siatkówki w naczyniu i wyprowadzanie arkuszy fotoreceptorów z tysiącami wolnych od mutacji PR, które przypominają warstwę fotoreceptorów w rozwijającej się siatkówce płodu ludzkiego34,35,36,37,38,39,40. Przeszczepianie tkanki siatkówki pochodzącej z hPSC (organoidów) do przestrzeni podsiatkówkowej pacjentów z chorobami RD jest jednym z nowych i obiecujących eksperymentalnych podejść terapii komórkowej, nad którym pracuje wiele zespołów31,32,41,42. W porównaniu z przeszczepem zawiesiny komórkowej (młodych fotoreceptorów lub komórek progenitorowych siatkówki), wykazano, że przeszczepione arkusze fotoreceptorów płodowych skutkują poprawą widzenia w badaniach klinicznych23,24.

Protokół przedstawiony tutaj szczegółowo opisuje procedurę transplantacji w celu dostarczenia podsiatkówkowego całych organoidów siatkówki (zamiast obrzeży organoidów33,41) jako potencjalnie lepszy sposób na wprowadzenie nienaruszonych arkuszy siatkówki z PR, w celu zwiększenia przeżywalności przeszczepu i poprawy zachowania arkusza. Chociaż opracowano procedury wprowadzania płaskiego fragmentu ludzkiej siatkówki, a także plastrów RPE43,44,45, przeszczepy większych przeszczepów 3D nie zostały zbadane. Organoidy siatkówki pochodzące z komórek macierzystych stanowią niewyczerpane źródło arkuszy fotoreceptorów do opracowywania technologii przywracania wzroku, są wolne od ograniczeń etycznych i są uważane za doskonałe źródło ludzkiej tkanki siatkówki w terapiach skoncentrowanych na leczeniu zaawansowanego RD i śmiertelnej ślepoty46. Opracowanie metod chirurgicznych do precyzyjnej implantacji organoidów podsiatkówkowych przy minimalnym uszkodzeniu niszy siatkówki gospodarza (siatkówka nerwowa, nabłonek barwnikowy siatkówki oraz unaczynienie siatkówki i naczyniówki) jest jednym z kluczowych kroków w kierunku rozwoju takiej terapii w kierunku zastosowań klinicznych31,32. Duże modele zwierzęce, takie jak koty, psy, świnie i małpy, okazały się dobrymi modelami do badania metod chirurgicznego podawania, a także do demonstrowania bezpieczeństwa wszczepionych arkuszy tkanki (komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE)) i badania zastosowania organoidów41,44,45,47,48,49,50. Duże oko zwierzęcia ma podobny rozmiar kuli do ludzkiej, a także podobną anatomię, w tym obecność obszaru o dużej gęstości fotoreceptorów, w tym czopków (obszar centralny), przypominających ludzką plamkę żółtą6,51,52.

W tym manuskrypcie opisana jest technika implantacji tkanki siatkówki pochodzącej z hPSC (organoidów) do przestrzeni podsiatkówkowej dużych modeli zwierzęcych kotów (zarówno kotów typu dzikiego, jak i CrxRdy/+), która wraz z obiecującymi wynikami skuteczności32,53 buduje podstawę do dalszego rozwoju takiej eksperymentalnej terapii w kierunku zastosowań klinicznych w leczeniu schorzeń RD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Zostały one również zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Michigan. W badaniu wykorzystano koty typu dzikiego i CrxRdy/+ z kolonii kotów utrzymywanych na Uniwersytecie Stanowym Michigan. Zwierzęta trzymano w cyklach 12 godzin : 12 godzin światła i ciemności i karmiono je komercyjną dietą pełnoporcjową dla kotów.

1. Procedury przedimplantacyjne i przygotowanie chirurgiczne

  1. Wybierz koty typu dzikiego lub CrxRdy/+ w zależności od projektu badania. Wykonaj przedoperacyjne badanie okulistyczne, w tym biomikroskopię w lampie szczelinowej i oftalmoskopię pośrednią. Należy wykluczyć wszystkie zwierzęta z nieprawidłowościami dna oka niezwiązanymi z ich genotypami.
  2. Na tydzień przed implantacją należy rozpocząć stosowanie u zwierząt protokołu immunosupresyjnego polegającego na doustnym podawaniu cyklosporyny w dawce 2 mg/kg mc. i prednizolonu w dawce 1 mg/kg mc., aby zapobiec odrzuceniu przeszczepu.
  3. Zwierzęta powyżej 4 miesiąca życia należy pościć przez noc (co najmniej 8 godzin). Zwierzętom poniżej 4 miesiąca życia należy podać ograniczoną ilość mokrej karmy na noc, a następnie pościć je przez 2 godziny przed zabiegiem.
  4. Wykonaj ogólne badanie fizykalne, w tym osłuchiwanie klatki piersiowej (za pomocą stetoskopu). Zapisz częstość akcji serca i oddechu, temperaturę, kolor błony śluzowej i czas napełniania naczyń włosowatych.
  5. Zwierzęta w wieku poniżej 4 miesięcy należy poddać premedykacji buprenorfiną (0,02 mg/kg), a zwierzętom w wieku powyżej 4 miesięcy buprenorfinę (0,02 mg/kg) w połączeniu z acepromazyną (0,02 mg/kg) podskórnie lub domięśniowo 30–45 minut przed indukcją znieczulenia ogólnego.
  6. Nakładaj miejscowo 1% roztwór okulistyczny tropikamidu i 10% roztwór okulistyczny fenylefryny na powierzchnię oka co najmniej dwa razy, aby rozszerzyć źrenice. Powtórz tę czynność, jeśli źrenice nie są dobrze rozszerzone.
  7. Umieścić cewnik dożylny 22 G w żyle głowowej u wszystkich zwierząt: najpierw przyciąć włosy z obszaru 2 x 3 cm nad żyłą głowową; przygotować skórę, najpierw szorując ją 70% etanolem, a następnie peelingiem z chlorheksydyną; umieścić cewnik i zabezpieczyć taśmą medyczną i spłukać heparynizowaną solą fizjologiczną. U zwierząt w wieku poniżej 4 miesięcy można to zrobić po indukcji znieczulenia.
  8. Znieczulenie ogólne należy wprowadzić 30–45 minut po premedykacji: zwierzęta poniżej 4 miesiąca życia indukuje się izofluranem podawanym przez maskę, a zwierzęta powyżej 4 miesiąca życia indukuje się za pomocą dożylnego propofolu (4–6 mg/kg).
  9. Zaintubować rurką dotchawiczą o odpowiednim rozmiarze. Uwidocznij krtań za pomocą lampy do badania lub laryngoskopu. Rozpyl 0,1 ml lidokainy 2% na krtań, odczekaj kilka sekund, a następnie zaintubuj.
  10. Utrzymuj znieczulenie izofluranem (między 2%-3,5%) w tlenie (300-600 ml/kg/min) za pomocą systemu Baina.
  11. Umieść zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej na poduszce pozycjonującej, na której umieszczony jest podgrzewany koc wodny przykryty ręcznikami. Załóż monitor pacjenta i monitoruj tętno i elektrokardiogram (EKG), częstość oddechów, ciśnienie krwi, nasycenie tlenem i dwutlenek węgla w końcówce oddechu. Regularnie monitoruj temperaturę ciała podczas zabiegu. Za utrzymanie i monitorowanie znieczulenia odpowiedzialna jest odpowiednio przeszkolona osoba.
  12. Ustaw zwierzę za pomocą poduszki pozycjonującej w taki sposób, aby powierzchnia rogówki była pozioma, gdy oko jest obrócone do podstawowej pozycji spojrzenia. Zabezpiecz głowę na miejscu za pomocą taśmy medycznej.
  13. Przykryj zwierzę kocami, aby pomóc utrzymać temperaturę ciała.
  14. Przepłukać cewnik dożylny heparynizowaną solą fizjologiczną i rozpocząć dożylną infuzję mleczanu Ringera podawaną w dawce 2–5 ml/kg/h na czas trwania zabiegu.
  15. Przygotuj powierzchnię oka, worek spojówkowy i powieki do operacji aseptycznej za pomocą 0,2% jodu powidonu, sterylnych aplikatorów do wacików i wacików.
  16. Ustawić mikroskop operacyjny z odpowiednio wyregulowanymi okularami. Umieść sterownik nożny mikroskopu (ostrość, zoom i sterowanie osią XY) i witrektomii w taki sposób, aby chirurg mógł je obsługiwać.
  17. Przygotuj się do operacji aseptycznej: cały personel musi nosić fartuch chirurgiczny, czepek chirurgiczny i maskę. Upewnij się, że chirurg i asystent (asystenci) szorują, fartuch i rękawice jak w przypadku rutynowej operacji aseptycznej. Cały personel powinien być zaznajomiony z technikami aseptycznymi.
  18. Gdy personel zostanie wyszorowany, ubrany w fartuch i rękawiczki, otwórz pakiety chirurgiczne i rozłóż narzędzia. Umieść sterylne pokrętła manipulacyjne na pokrętłach regulacyjnych mikroskopu, aby umożliwić chirurgowi lub asystentowi regulację bez przerywania aseptyki. Ułóż zwierzę w rutynowy sposób do operacji oka.
  19. Przygotuj maszynę do witrektomii zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi witrektomii z dwoma portami.
    1. Umieść soczewkę kontaktową do witrektomii i dwa porty witrektomii 23 G na stole asystenta. Założyć kauteryzację na mokre pole. Zamocować i zalać rurkę infuzyjną oraz końcówkę witrektomii 23 G.
    2. Umieść narzędzia do witrektomii i przewody płynowe na sterylnej serwety i utrzymuj je na miejscu za pomocą zacisków do ręczników. Ustaw maszynę do witrektomii w trybie próżni proporcjonalnej między 1,500 a 2,500 cięć na minutę (cpm) i maksymalną próżnią 500 mmHg. Odbywa się to poprzez naciśnięcie przycisków strzałek (w górę lub w dół) znajdujących się na przednim panelu urządzenia do witrektomii.

2. Przygotowanie organoidów do implantacji podsiatkówkowej (Rysunek 1)

  1. Proszę uzyskać organoidy siatkówki zgodnie z wcześniejszymi opisami31 i, jeśli to konieczne, wysłać na noc w temperaturze 37 °C, jak wcześniej podano54.
  2. Przetrzeć powierzchnie w pomieszczeniu do hodowli tkankowej w laboratorium przyjmującym środkiem dezynfekującym i zachować ten sam wysoki poziom techniki aseptycznej, jak w sali operacyjnej do operacji oka, aby uniknąć skażenia bakteryjnego lub grzybiczego, a następnie przenieść na salę operacyjną, aby uniknąć zakażenia miejsca operowanego.
  3. Noś ochraniacze na buty chirurgiczne, jednorazowe fartuchy laboratoryjne, czepki, maski chirurgiczne, rękawy i fartuchy chirurgiczne w pomieszczeniu do hodowli tkanek przeznaczonym do przygotowania organoidów do operacji oczu.
  4. Wstępnie zrównoważyć pożywkę nerwową z 20 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 20 ng/ml neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ). Umieść organoidy w pożywkach na płytkach o bardzo niskiej przyczepności, używając około jednej czwartej objętości kondycjonowanej pożywki (z wysyłki nocnej) i trzech czwartych objętości świeżej pożywki31,54. Przechowywać przez 24–48 godzin.
  5. Przygotować i zrównoważyć kilka świeżych płytek o średnicy 60 mm z pożywką neuronową (jak przygotowano w kroku 2.4) przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2) przed znieczuleniem pierwszego zwierzęcia. Należy zauważyć, że płytki te są używane do przenoszenia organoidów dla każdej pojedynczej operacji, przy założeniu, że warunki pH i nasycenie CO2 będą utrzymywane w pożywce przez co najmniej 20 minut, co wystarczy do przeniesienia płytki na salę operacyjną i załadowania organoidów do kaniuli.
  6. W każdym przypadku przeszczepu należy użyć świeżej płytki o średnicy 60 mm ze wstępnie nasyconymi pożywkami nerwowymi, pozostawiając pozostałe płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.
  7. Przenieś 6–9 organoidów do jednej naczyń o średnicy 60 mm (z ponownie nasyconymi pożywkami), pipetując je ręczną pipetą jednokanałową (20–200 μl) ze sterylną końcówką filtrującą o pojemności 200 μl z szerokim (~0,7 mm) otworem. Końcówki te można przygotować przed zabiegiem lub w jego trakcie, odcinając ~3-4 mm końcówki sterylnymi nożyczkami (wykonane w kapturze do hodowli tkankowych, aby uniknąć zanieczyszczenia). Umieść naczynie o średnicy 60 mm w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm (aby uniknąć zanieczyszczenia podczas transportu z pomieszczenia do pokoju) i szybko przetransportuj na salę operacyjną.
  8. Umieścić płytkę z organoidami na elektrycznej poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C, przykrytej sterylnym obłożeniem.
  9. Zmień na nową parę sterylnych rękawiczek przed przygotowaniem organoidów.
  10. Opłucz organoidy w sterylnym zrównoważonym roztworze soli (BSS) (opcjonalnie), a następnie załaduj do wtryskiwacza, który składa się z cienkościennej kaniuli ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna, średnica zewnętrzna 1,52 mm; średnica wewnętrzna, średnica wewnętrzna 1,12 mm) z polerowanym końcem przymocowanym sterylną plastikową rurką do sterylnej strzykawki Hamilton o pojemności 500 μl wstępnie wypełnionej sterylnym BSS.
  11. Przekaż kaniulę zespołowi chirurgicznemu w sterylny sposób, gdy będzie on gotowy do wstrzyknięcia organoidów.
  12. Utrzymuj długość całej procedury (od usunięcia organoidów z pożywki do pożywki do naładowania kaniuli) na poziomie 20 minut lub krótszym.
  13. W przypadku opóźnienia w implantacji organoidów należy umieścić je z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych, aby uniknąć zmian w nasyceniu pH/CO2 wewnątrz naczynia.
  14. Niewykorzystane organoidy należy przechowywać przez 1 tydzień w tym samym inkubatorze do hodowli tkankowych i monitorować pod kątem jakichkolwiek oznak zanieczyszczenia.

3. Implantacja organoidów podsiatkówkowych

  1. Wykonaj kantotomię boczną 0,5–1 cm za pomocą nożyczek do tenotomii Stevensa. Umieść wziernik powiek Barraquer o odpowiedniej wielkości, aby powieki były otwarte. Upewnij się, że asystent chirurgiczny regularnie iryguje rogówkę za pomocą BSS przez cały czas trwania zabiegu.
  2. Umieść 2 szwy podporowe szwu jedwabnego 6-0 w spojówce bezpośrednio przylegającej do rąbka w pozycjach godziny 4 i 8, aby utrzymać oko w pierwotnym spojrzeniu i schować trzecią powiekę. Użyj kleszczy do wiązania rogówki Castroviejo o grubości 0,5 cala i małego hemostatu komara, aby delikatnie chwycić spojówkę opuszkową obok rąbka. Pozostaw szwy długie i zaciśnij końce małymi hemostatami komarów, aby pomóc w ich manipulacji.
    UWAGA: Umieszczenie szwu pod trzecią powieką jest trudniejsze; Pamiętaj, aby umieścić go bezpośrednio obok rąbka.
  3. Umieść kolejny szew w pozycji godziny 12 na rąbku, częściowo przez grubość rąbka, uważając, aby nie przebić oka. Zawiąż luźno ten szew i krótko odetnij końce. Zapewnia to solidny szew kotwiczący, który jest używany podczas operacji jako "uchwyt" do obracania oka, aby umożliwić chirurgowi dostęp do różnych części gałki ziemskiej na różnych etapach zabiegu.
    UWAGA: Kroki 3.2 i 3.3 można odwrócić. Kolejność zakładania szwów podtrzymujących zależy od preferencji chirurga.
  4. Odbić spojówkę opuszkową między godziną 10–2 (obwód). Za pomocą nożyczek do tenotomii naciąć spojówkę w odległości 2–3 mm od rąbka. Podkop go i oczyść torebkę czopa, aby odsłonić twardówkę w miejscach portów witrektomii na godzinie 2 i 10, które zostaną umieszczone około 3–5 mm od rąbka w zależności od wieku zwierzęcia. Użyj chirurgicznych włóczni celulozowych do hemostazy i do usunięcia krwi.
  5. Zidentyfikuj miejsca do sklerotomii po odbiciu spojówki i torebki czopa za pomocą suwmiarki. Wybierz miejsca sklerotomii (na godzinie 2 i 10, mając na celu przejście przez pars plana), aby uniknąć głównych naczyń twardówkowych, które mogą być widoczne u kota. Zastosuj kauteryzację w polu mokrym na twardówce w planowanych miejscach sklerotomii, aby zmniejszyć krwawienie z twardówki, planując obszar ~3 mm w porcie narzędzia (port na godzinie 10 dla praworęcznego chirurga), ponieważ zostanie on powiększony po witrektomii, aby umożliwić wprowadzenie kaniuli implantacyjnej.
  6. Wstępnie załóż szwy krzyżowe (szew poliglaktynowy 6-0 lub 7-0) bez wiązania węzła w miejscu proponowanej sklerotomii przed umieszczeniem portów witrektomii.
    UWAGA: Ułatwia to szybkie zamknięcie sklerotomii pod koniec zabiegu. Szew do planowanego portu instrumentu musi mieć dłuższy kęs twardówki, ponieważ będzie to długie nacięcie.
  7. Po założeniu szwów poproś asystenta, aby pomógł ustawić kulę ziemską, przytrzymując szwy na godzinie 12, wiążąc lub używając kleszczy Bishopa-Harmona. Pozwól chirurgowi ustabilizować również gałkę ziemską, używając kleszczy Castroviejo 0,12 mm do przytrzymania tkanki obok miejsca sklerotomii.
    1. Wprowadzić port witrektomii 23 G za pomocą trokaru przez twardówkę zarówno na godzinie 2, jak i 10, skierowaną pod kątem w kierunku nerwu wzrokowego, aby uniknąć kontaktu z soczewką.
    2. Sprawdź, czy port irygacyjny znajduje się w ciele szklistym, delikatnie naciskając port za pomocą kleszczy do wiązania, aby końcówka mogła być uwidoczniona w ciele szklistym. Po potwierdzeniu prawidłowego położenia przymocuj linię irygacyjną do portu i ustaw linię za pomocą cienkich bandaży samoprzylepnych, aby przykleić ją na miejscu. Ustawić infuzję witrektomii buforu BSS początkowo na 30–35 mmHg, naciskając przyciski strzałek (w górę lub w dół) znajdujące się na przednim panelu urządzenia do witrektomii.
  8. Niech asystent przytrzyma na rogówce powiększającą soczewkę witrektomijną Machemer, aby umożliwić wizualizację tylnego odcinka oka podczas kolejnych etapów. Podłącz soczewkę witrektomii irygacyjnej do zestawu kroplówkowego zapewniającego stały dopływ płynu, aby połączyć soczewkę z rogówką.
    UWAGA: Można również stosować inne formy soczewek witrektomii kontaktowej. Przyciemnij lub wyłącz światła w pomieszczeniu, aby ułatwić wizualizację za pomocą mikroskopu operacyjnego.
  9. Włóż sondę/nóż do witrektomii 23 G (2,500 cpm) przez port narzędzia (przylegający do dominującej ręki chirurga, tj. portu na godzinie 10 dla chirurga praworęcznego) i wykonaj częściową witrektomię rdzenia.
    1. Następnie należy całkowicie usunąć ciało szkliste z powierzchni siatkówki w obszarze, w którym zostanie przeszczepiony (jest to ważne dla powodzenia zabiegu) poprzez odłączenie ciała szklistego od siatkówki.
    2. Umieść sondę witrektomijną nad głową nerwu wzrokowego tak, aby port był skierowany od powierzchni siatkówki i zastosuj wyższe podciśnienie, aby rozpocząć odwarstwienie ciała szklistego.
  10. Przygotuj kryształy triamcynolonu do użytku wewnątrzgałkowego. Jeśli zawiesina triamcynolonu nie jest przeznaczona specjalnie do stosowania doszklistkowego, należy umyć kryształy, a następnie ponownie zawiesić w BSS.
    1. Początkowo należy przefiltrować zawiesinę za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego o porach 0,22 μm z membraną PES (dołączoną do strzykawki o pojemności 1 ml) w celu wychwycenia kryształów.
    2. Następnie umyj uwięzione kryształy triamcynolonu, zasysając BSS w strzykawce o pojemności 1 ml i przepłukując przez filtr (kryształy pozostają uwięzione w filtrze). Spowoduje to usunięcie konserwantów z roztworu. Powtórz mycie 3 razy, po czym kryształy są ponownie zawieszone w 1 ml BSS.
  11. Wprowadzić igłę strzykawki z triamcynolonem przez port instrumentu. Uważaj, aby nie dotknąć soczewki, obserwując końcówkę igły przez źrenicę podczas wprowadzania igły przez port instrumentu. Wstrzyknąć od 0,25 do 0,5 ml zawiesiny krystalicznej. Następnie włóż sondę do witrektomii przez port instrumentu i przesuń ją blisko głowy nerwu wzrokowego, tak aby port był z dala od powierzchni siatkówki i użyj wysokiej podciśnienia, aby pomóc odłączyć powierzchnię ciała szklistego od siatkówki.
    UWAGA: Kryształy triamcynolonu przyklejają się do pozostałego ciała szklistego, a tym samym je podkreślają. Ostrożnie usuń ciało szkliste powyżej i obok miejsca planowanej implantacji organoidów (np. centralne dno tapety w pobliżu obszaru centralis).
  12. Za pomocą iniektora podsiatkówkowego, np. iniektora podsiatkówkowego 23 G z wysuwaną kaniulą 41 G podłączonej do sterylnej gazoszczelnej strzykawki Luer lock o pojemności 250 μl wypełnionej sterylnym BSS.
    1. Przed utworzeniem pęcherzyka podsiatkówkowego należy zmniejszyć ciśnienie infuzji do 10 mmHg, aby ułatwić tworzenie pęcherzyków.
    2. Włóż wtryskiwacz przez port przyrządu i przesuń go w kierunku powierzchni siatkówki. Wysuń końcówkę kaniuli i delikatnie dociśnij ją do powierzchni siatkówki. Poproś asystenta, aby lekko i szybko nacisnął tłok strzykawki, aby rozpocząć odwarstwienie siatkówki, które zmniejsza ciśnienie wstrzyknięcia, aby umożliwić powolne zwiększanie odwarstwienia siatkówki, aż do osiągnięcia pożądanego rozmiaru (stosuje się około 100 do 200 μl BSS).
  13. Jeśli utworzona retinotomia znajduje się w odpowiedniej pozycji, co pozwala uniknąć przecięcia siatkówki między miejscem implantacji a głową nerwu wzrokowego, aby zapobiec przecięciu warstwy włókna nerwowego pochodzącej z miejsca implantacji i uniknąć głównych naczyń krwionośnych siatkówki (jest to również określone przez projekt badania, w naszym przypadku wybrano centralną siatkówkę), następnie należy go nieznacznie powiększyć za pomocą kaniuli 41 G wstrzykiwacza, mając na celu ułatwienie wprowadzenia nożyczek do siatkówki.
  14. Wyjmij wtryskiwacz z oka i usuń port twardówki na godzinie 10. Powiększ sklerotomię w tym miejscu za pomocą prostego noża/keratomu o średnicy 2,85 mm skierowanego w stronę nerwu wzrokowego, aby uniknąć dotykania soczewki. Utrzymuj ciśnienie infuzji na poziomie 10–15 mmHg.
  15. Przedłuż retinotomię za pomocą pionowych nożyczek witreoretinalnych 80° z uchwytem do ściskania, unikając przecinania naczyń siatkówki, aby zapobiec krwotokowi siatkówki i pamiętaj, aby przeciąć siatkówkę na krawędzi pęcherzyka z dala od głowy nerwu wzrokowego, aby uniknąć przecinania włókien nerwowych prowadzących od siatkówki w obszarze przeszczepu do nerwu wzrokowego. Retinotomia powinna mieć wystarczającą szerokość, aby można było przyjąć organoidy.
  16. Wprowadzić wstępnie załadowaną szklaną kapilarnę zawierającą organoidy (patrz krok 2.10) przez powiększoną sklerotomię i przesunąć ją w kierunku miejsca retinotomii pod bezpośrednią wizualizacją.
    1. Użyj końcówki szklanej kapilary, aby lekko otworzyć retinotomię, aby uzyskać dostęp do otworu w pęcherzyku podsiatkówkowym.
    2. Poproś asystenta, aby powoli naciskał tłok wstrzykiwacza, obserwując przez mikroskop, wstrzykując organoidy do pęcherzyka podsiatkówkowego. BSS powinien poprzedzać organoidy i wypłukiwać retinotomię.
    3. Delikatnie wepchnij organoidy w pęcherzyku końcówką szklanej kapilary, jeśli znajdują się na krawędzi retinotomii.
  17. Przytrzymaj szklaną kapilarnę podczas retinotomii przez kilka sekund, aby spróbować zamknąć retinotomię i zapobiec ucieczce organoidów do ciała szklistego.
  18. Bardzo powoli usuń szklaną kapilarnę z oka, unikając nagłego uwolnienia płynu z oka, aby uniknąć ruchu płynu w oku, który mógłby wydalić organoidy z pęcherzyka podsiatkówkowego.
  19. Powoli zwiększaj ciśnienie infuzji do 20–30 mmHg, aby zapobiec krwotokowi wewnątrzgałkowemu, uważając, aby płyn infuzyjny nie spływał bezpośrednio na pęcherzyk. Odbywa się to poprzez naciśnięcie przycisków strzałek w górę znajdujących się na przednim panelu maszyny do witrektomii.
  20. Zamknij sklerotomię za pomocą wstępnie założonego szwu w kształcie krzyża (poliglaktyna 6-0 lub 7-0). W razie potrzeby dodaj dodatkowe proste szwy przerywane, aby uszczelnić sklerotomię.
  21. Poproś asystenta o usunięcie portu infuzyjnego i pozwól chirurgowi szybko zawiązać wcześniej założony szew, aby uszczelnić sklerotomię i zapobiec utracie ciśnienia wewnątrzgałkowego.
  22. Zamknij nacięcie spojówki (peritomię) za pomocą poliglaktyny 6-0 lub 7-0 w prostym, ciągłym wzorze.
  23. Zobrazuj dno oka (np. za pomocą kamery wideo RetCam II, Clarity lub podobnej) i zarejestruj bezpośrednie położenie organoidów w przestrzeni podsiatkówkowej.
  24. Ponownie przygotuj powierzchnię oka po obrazowaniu przy użyciu 0,2% roztworu jodu powidonu za pomocą aplikatorów z bawełnianymi końcówkami i wacików. Usuń trzy szwy podporowe i wziernik pokrywy.
  25. Zamknij kantotomię boczną szwem poliglaktynowym 6-0. Umieść pojedynczy zakopany szew, a następnie rysunek 8 szwów skórnych, aby zreformować boczny kantu, a następnie użyj prostych przerwanych szwów skórnych, aby zamknąć resztę rany.
  26. Po zakończeniu zabiegu chirurgicznego należy wykonać wstrzyknięcie podspojówkowe kombinacji steroidów i antybiotyków (2 mg octanu metyloprednizolonu, 0,1 mg deksametazonu i 1 mg gentamycyny). Umieść lubrykant okulistyczny (sztuczne łzy) na rogówce.
  27. Odzyskaj zwierzę ze znieczulenia i uważnie obserwuj podczas rekonwalescencji wszelkie oznaki bólu, które wymagałyby dodatkowego leczenia, takie jak wyraźny skurcz powiek, silna niechęć do manipulacji, letarg lub zmniejszony apetyt oraz przyspieszone oddychanie i tętno. W razie potrzeby należy zastosować analgezję pooperacyjną i uważnie monitorować pod kątem dyskomfortu.
    UWAGA: Tylko odpowiednio przeszkolony personel powinien być odpowiedzialny za znieczulanie i monitorowanie kocich pacjentów przed, w trakcie i po operacji. Postępuj zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etyki zwierząt dotyczącymi opieki pooperacyjnej.

4. Procedury poimplantacyjne, leczenie pooperacyjne i ocena

  1. Kontynuuj leczenie doustnymi lekami immunosupresyjnymi (1 mg/kg prednizolonu i 2 mg/kg cyklosporyny doustnie dwa razy dziennie), aby pomóc w kontrolowaniu stanu zapalnego i odrzucania organoidów. Zapewnienie ogólnoustrojowego leczenia antybiotykami (np. doustna doksycyklina w dawce 5 mg/kg mc. dwa razy na dobę – ten antybiotyk został wybrany ze względu na ryzyko oportunistycznego zakażenia mykoplazmatycznego u zwierząt z obniżoną odpornością).
  2. Wykonuj regularne badania okulistyczne w celu monitorowania stanu zapalnego lub rozwoju zdarzeń niepożądanych. Monitoruj pęcherzyk siatkówki pod kątem spłaszczenia, które występuje w ciągu pierwszych kilku dni po operacji, pomimo dużej retinotomii wymaganej do wstrzyknięcia organoidów do przestrzeni podsiatkówkowej. Rejestruj obrazy dna oka podczas każdego badania, aby zarejestrować pozycję i wygląd przeszczepionych organoidów.
  3. Zobrazuj zwierzęta w znieczuleniu ogólnym za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (cSLO) i domeny spektralnej – optycznej tomografii koherentnej (SD-OCT)5,31 podczas okresu monitorowania i przed zakończeniem eksperymentu.
  4. Humanitarną eutanazję zwierząt po zakończeniu eksperymentu przy użyciu metody zatwierdzonej przez AVMA, np. dożylnego podania 85 mg/kg pentobarbitalu. Po sedacji należy umieścić cewnik dożylny do podania pentobarbitalu, aby zminimalizować stres. Potwierdź śmierć przez zatrzymanie bicia serca i wykonaj nacięcie w klatce piersiowej, aby utworzyć odmę opłucnową.
  5. Usuń oczy za pomocą standardowego dostępu przezspojówkowego i napraw w razie potrzeby. W przypadku immunohistochemii (IHC) natychmiast zanurz oczy w 4% roztworze paraformaldehydu po wstrzyknięciu 0,3 ml roztworu utrwalającego do tylnego segmentu przez 3 szczeliny wykonane przez pars plana za pomocą ostrza Parkera 11 (~3-4 mm od rąbka).
  6. Rozciąć muszle oczne po 3,5 godzinach od utrwalenia w temperaturze 4 °C. Usunąć resztki ciała szklistego, upewniając się, że siatkówka i organoidy pozostają nienaruszone. Umieścić z powrotem w utrwalaczu na dodatkowe 30 minut w temperaturze 4 °C, a następnie płukać muszle oczne 3 razy każdy przez 10 minut w PBS. Przenieść muszlę oczną na 15% sacharozy na 2 godziny, a następnie na 30% sacharozy na kolejne 2 godziny.
  7. Przepłukać muszlę oczną dwukrotnie PBS i zanurzyć w pożywce OCT (związek o optymalnej temperaturze cięcia) i błyskawicznie zamrozić, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu sekcji do badań histologicznych i immunochemicznych.
  8. Wybierz przeciwciała do IHC na podstawie protokołu i celów badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura umożliwia udaną i powtarzalną implantację organoidów siatkówki pochodzących z hPSC w przestrzeni podsiatkówkowej modelu zwierzęcego dużego oka (pokazane tutaj na 2 przykładach: koty typu dzikiego ze zdrowymi fotoreceptorami (PR) i koty CrxRdy/+ z degenerującymi się PR i siatkówką). Postępując zgodnie z krokami wskazanymi w Rysunek 1, przygotuj i załaduj organoidy siatkówki pochodzące z hPSC do kaniuli ze szkła borokrzemianowego urządzenia do wstrzyki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Implantacja tkanki siatkówki pochodzącej z hPSC (organoidów siatkówki) do przestrzeni podsiatkówkowej jest obiecującym podejściem eksperymentalnym do przywracania wzroku w późnym stadium choroby zwyrodnieniowej siatkówki spowodowanej śmiercią komórek PR (głęboka lub terminalna ślepota). Prezentowane podejście opiera się na wcześniej opracowanej i z powodzeniem przetestowanej terapii eksperymentalnej opartej na podsiatkówkowym przeszczepie fragmentu tkanki siatkówki ludzkiego płodu 23,24,25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Ratnesh K. Singh, dr Francois Binette i dr Igor O. Nasonkin są pracownikami Lineage Cell Therapeutics, Inc. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez NEI Fast-track SBIR grant R44-EY027654-01A1 i SBIR grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones jest współkierownikiem projektu). Autorzy chcieliby podziękować Pani Janice Querubin (MSU RATTS) za jej pomoc w znieczuleniu i ogólnej opiece nad zwierzętami włączonymi do tego badania, a także pomoc w ustawieniu chirurgicznym i przygotowaniu/sterylizacji narzędzi. Autorzy pragną podziękować dr Paige Winkler za pomoc w otrzymaniu organoidów i umieszczeniu ich w pożywce w dniu poprzedzającym implantację oraz za pomoc w dniu implantacji. Autorzy są również wdzięczni panu Randy'emu Garcharowi (LCTX) za staranną wysyłkę organoidów siatkówki, montaż transportera i pobieranie zapisów temperatury i przeciążenia G po każdej wysyłce. Praca ta została wykonana, gdy autor Igor Nasonkin był zatrudniony przez Biotime (obecnie Lineage).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; Filtr strzykawkowy m porowy z membraną PESCameoNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Wstrzykiwacz podsiatkówkowy 23G z wysuwaną kaniulą 41 GDORC1270.EXT
250 i mikro; L hamilton gazoszczelna strzykawka luer lockHamiltonNAmożna znaleźć u różnych dostawców
6-0 Szew jedwabnyEthicon707G
6-0/7-0 szew poliglaktynowyEthiconJ570G
Maleinian acepromazyny 500mg/5mL (Aceproject)Henry Schein Animal HealthNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Buprenorfina 0,3 mg / mlPar FarmaceutycznyNAmożna znaleźć u różnych dostawców
cSLO + SD-OCTHeidelberg EngineeringSpectralis HRA+ OCT
CyklosporynaNovartisNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Deksametazon 2 mg / ml (Az)VetonNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Doksycylina 25 mg / 5 mlCiplaNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Roztwór Fatal Plus (roztwór pentobarbitalu)VortechNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Gentamycyna 20 mg / 2 mlHospiraNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Kapilara szklana (cienkościenna standardowa borokrzemian z pojedynczą lufą (Schott Duran) Rurki szklaneWorld Precision InstrumentsTW150-4
Aktetan metyloprednizolonu 40 mg / mlPfizerNAmożna znaleźć u różnych dostawców
MikroskopZeissNA
OCT medium (Tissue-Tek OCT Compound)Sakura4583
Olympic Vac-Pac Rozmiar 23NatusNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Paraformaldehyd 16% roztwórEMS15719
Chlorowodorek fenylefryny 10% roztwór okulistycznyAkornNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Prednizolon 15 mg / 5 mlAkornNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Propofol 500 mg / 50 ml (10 mg / ml) (PropoFlo28)ZoetisNAmożna znaleźć u różnych dostawców
RetCam II kamera wideo do badania dna okaClarity Medical SystemsNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Triamcynolon 400mg/10 mL (Kenalog-40)Bristol -Myers Squibb CompanyNAmożna znaleźć za pośrednictwem różnych dostawców
Tropikamid 1% roztwór okulistycznyAkornNAmożna znaleźć u różnych dostawców
Witrektomia 23G portAlconSystemy
Maszyna do witrektomii SystemyAlconAccurus
Nożyczki szklistkowo-siatkówkowe pionowe 80& z uchwytem do wyciskaniaFrimenFT170206T
Accurus

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
  2. Dias, M. F., et al. Molecular genetics and emerging therapies for retinitis pigmentosa: Basic research and clinical perspectives. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 107-131 (2018).
  3. Petersen-Jones, S. M., et al. Patients and animal models of CNGbeta1-deficient retinitis pigmentosa support gene augmentation approach. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 190-206 (2018).
  4. Winkler, P. A., et al. A large animal model for CNGB1 autosomal recessive retinitis pigmentosa. PLoS One. 8 (8), 72229(2013).
  5. Occelli, L. M., Tran, N. M., Narfstrom, K., Chen, S., Petersen-Jones, S. M. CrxRdy Cat: A large animal model for CRX-associated leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (8), 3780-3792 (2016).
  6. Mowat, F. M., et al. Early-onset progressive degeneration of the area centralis in RPE65-deficient dogs. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (7), 3268-3277 (2017).
  7. Occelli, L. M., et al. Gene supplementation rescues rod function and preserves photoreceptor and retinal morphology in dogs, leading the way towards treating human PDE6A-retinitis pigmentosa. Human Gene Therapy. 28 (12), 1189-1201 (2017).
  8. Eckhorn, R., et al. Visual resolution with retinal implants estimated from recordings in cat visual cortex. Vision Research. 46 (17), 2675-2690 (2006).
  9. Pardue, M. T., et al. Status of the feline retina 5 years after subretinal implantation. Journal of Rehabilitation Research and Development. 43 (6), 723-732 (2006).
  10. Chow, A. Y., et al. Subretinal implantation of semiconductor-based photodiodes: durability of novel implant designs. Journal of Rehabilitation Research and Development. 39 (3), 313-321 (2002).
  11. Volker, M., et al. In vivo assessment of subretinally implanted microphotodiode arrays in cats by optical coherence tomography and fluorescein angiography. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 242 (9), 792-799 (2004).
  12. Chow, A. Y., et al. Implantation of silicon chip microphotodiode arrays into the cat subretinal space. Institute of Electrical and Electronics Engineering Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 9 (1), 86-95 (2001).
  13. Sachs, H. G., et al. Subretinal implantation and testing of polyimide film electrodes in cats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 464-468 (2005).
  14. Villalobos, J., et al. A wide-field suprachoroidal retinal prosthesis is stable and well tolerated following chronic implantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (5), 3751-3762 (2013).
  15. Bragadottir, R., Narfstrom, K. Lens sparing pars plana vitrectomy and retinal transplantation in cats. Veterinary Ophthalmology. 6 (2), 135-139 (2003).
  16. Narfstrom, K., Holland Deckman, K., Menotti-Raymond, M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. Journal of Ophthalmology. , 906943(2011).
  17. Seiler, M. J., et al. Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Veterinary Ophthalmology. 12 (3), 158-169 (2009).
  18. Aramant, R. B., Seiler, M. J. Transplanted sheets of human retina and retinal pigment epithelium develop normally in nude rats. Experimental Eye Research. 75 (2), 115-125 (2002).
  19. Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
  20. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (6), 661-687 (2012).
  21. Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
  22. Lorach, H., et al. Transplantation of mature photoreceptors in rodents with retinal degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 30(2019).
  23. Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
  24. Radtke, N. D., Aramant, R. B., Seiler, M. J., Petry, H. M., Pidwell, D. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient with retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 122 (8), 1159-1165 (2004).
  25. Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
  26. Lorach, H., Palanker, E. Retinal prostheses: High-resolution photovoltaic implants. Medical Science (Paris). 31 (10), 830-831 (2015).
  27. Mathieson, K., et al. Photovoltaic retinal prosthesis with high pixel density. Nature Photonics. 6 (6), 391-397 (2012).
  28. Banin, E., et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24 (2), 246-257 (2006).
  29. Hambright, D., et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Molecular Vision. 18, 920-936 (2012).
  30. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  31. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells and Development. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  32. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  33. Assawachananont, J., et al. Transplantation of embryonic and induced pluripotent stem cell-derived 3D retinal sheets into retinal degenerative mice. Stem Cell Reports. 2 (5), 662-674 (2014).
  34. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  35. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  36. Singh, R. K., et al. Characterization of three-dimensional retinal tissue derived from human embryonic stem cells in adherent monolayer cultures. Stem Cells and Development. 24 (23), 2778-2795 (2015).
  37. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766(2017).
  38. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047(2014).
  39. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  40. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  41. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 81-90 (2016).
  42. Mandai, M., et al. iPSC-derived retina transplants improve vision in rd1 end-stage retinal-degeneration mice. Stem Cell Reports. 8 (4), 1112-1113 (2017).
  43. Scruggs, B. A., et al. Optimizing donor cellular dissociation and subretinal injection parameters for stem cell-based treatments. Stem Cells Translational Medicine. 8 (8), 797-809 (2019).
  44. Singh, R., et al. Pluripotent stem cells for retinal tissue engineering: Current status and future prospects. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (4), 463-483 (2018).
  45. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11, 475(2019).
  46. Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (6), 835-846 (2007).
  47. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  48. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  49. Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
  50. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a Phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  51. Petersen-Jones, S. M., Komaromy, A. M. Dog models for blinding inherited retinal dystrophies. Human Gene Therapy. Clinical Development. 26 (1), 15-26 (2015).
  52. Beltran, W. A., et al. Canine retina has a primate fovea-like bouquet of cone photoreceptors which is affected by inherited macular degenerations. PLoS One. 9 (3), 90390(2014).
  53. Nasonkin, I. O., et al. Transplantation of human embryonic stem cell derived retinal tissue in the subretinal space of immunodeficient rats with retinal degeneration (RD). Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (9), 3109(2019).
  54. Singh, R. K., et al. Development of a protocol for maintaining viability while shipping organoid-derived retinal tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (2), 388-394 (2020).
  55. Petersen-Jones, S. M. Drug and gene therapy of hereditary retinal disease in dog and cat models. Drug Discovery Today. Disease Models. 10 (4), 215-223 (2013).
  56. Machemer, R., Buettner, H., Norton, E., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1972).
  57. Machemer, R., Norton, E. W. Vitrectomy, a pars plana approach. II. Clinical experience. Modern Problems in Ophthalmology. 10, 178-185 (1972).
  58. Machemer, R., Parel, J., Norton, E. Vitrectomy: a pars plana approach. Technical improvements and further results. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 76 (2), 462-466 (1972).
  59. O'Malley, C., Heintz, R. M. Vitrectomy with an alternative instrument system. Annals of Ophthalmology. 7 (4), 585-588 (1975).
  60. Machemer, R., Hickingbotham, D. The three-port microcannular system for closed vitrectomy. American Journal of Ophthalmology. 100 (4), 590-592 (1985).
  61. Petersen-Jones, S. M., et al. AAV retinal transduction in a large animal model species: comparison of a self-complementary AAV2/5 with a single-stranded AAV2/5 vector. Molecular Vision. 15, 1835-1842 (2009).
  62. Annear, M. J., et al. Successful gene therapy in older Rpe65-deficient dogs following subretinal injection of an adeno-associated vector expressing RPE65. Human Gene Therapy. 24 (10), 883-893 (2013).
  63. Beltran, W. A., et al. Optimization of retinal gene therapy for X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR mutations. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1866-1880 (2017).
  64. Bainbridge, J. W. B., et al. Long-term effect of gene therapy on Leber's Congenital Amaurosis. The New England Journal of Medicine. 372 (20), 1887-1897 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Koci model zwierz cyschorzenia degeneracyjne siatk wkidostarczanie organoid wchirurgia witreoretinalnakonfokalna skaningowa oftalmoskopia laserowaoptyczna koherentna tomografia w domenie spektralnejhistologiczne analizy immunohistochemiczne

Powiązane artykuły