Artykuł metodologiczny

Izolacja płynów proksymalnych w celu zbadania mikrośrodowiska guza gruczolakoraka trzustki

DOI:

10.3791/61687

⸱

5 listopada 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Pancreatic Surgery, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 2Department of Immunology and Inflammation, Humanitas Clinical and Research Center-IRCCS, 3Department of Biomedical Sciences, Humanitas University, 4Giotto Biotech S.R.L., 5Section of Bioanalytical Chemistry, Division of Systems Medicine, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Imperial College London, 6National Phenome Centre, Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Imperial College London, 7Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sok z trzustki jest cennym źródłem biomarkerów ludzkiego raka trzustki. Opisujemy tutaj metodę procedury pobrania śródoperacyjnego. Aby sprostać wyzwaniu polegającemu na zastosowaniu tej procedury w modelach mysich, sugerujemy alternatywną próbkę, płyn śródmiąższowy guza, i opisujemy tutaj dwa protokoły jego izolacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruczolakorak trzustki (PDAC) jest czwartą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem, a wkrótce stanie się drugą. Istnieje pilne zapotrzebowanie na zmienne związane z określonymi patologiami trzustki, aby pomóc w przedoperacyjnej diagnostyce różnicowej i profilowaniu pacjenta. Sok trzustkowy jest stosunkowo mało zbadanym płynem ustrojowym, który ze względu na bliskie sąsiedztwo miejsca guza odzwierciedla zmiany w otaczającej tkance. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę pobrania śródoperacyjnego. Niestety, przełożenie pobierania soku z trzustki na mysie modele PDAC w celu przeprowadzenia badań mechanistycznych jest technicznie bardzo trudne. Płyn śródmiąższowy guza (TIF) to płyn zewnątrzkomórkowy, poza krwią i osoczem, który obmywa komórki guza i zrębu. Podobnie jak sok trzustkowy, ze względu na swoją właściwość zbierania i koncentrowania cząsteczek rozcieńczonych w osoczu, TIF może być wykorzystywany jako wskaźnik zmian mikrośrodowiskowych i jako cenne źródło biomarkerów związanych z chorobą. Ponieważ TIF nie jest łatwo dostępny, zaproponowano różne techniki jego izolacji. Opisujemy tutaj dwie proste i niewymagające technicznie metody jego izolacji: wirowanie tkanek i elucję tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z najbardziej agresywnych nowotworów, a wkrótce stanie się drugą najczęstszą przyczyną zgonów1,2,3. Jest dobrze znany ze swojego immunosupresyjnego mikrośrodowiska i braku reakcji na protokoły immunoterapii4. Obecnie resekcja chirurgiczna jest nadal jedyną opcją leczenia PDAC, jednak istnieje duża częstotliwość wczesnych nawrotów i powikłań pooperacyjnych. Brak specyficznych objawów aż do zaawansowanego stadium nie pozwala na wczesną diagnozę, przyczyniając się do przewlekłości choroby. Co więcej, nakładanie się objawów między PDAC a innymi łagodnymi patologiami trzustki może utrudniać osiągnięcie szybkiej i wiarygodnej diagnozy przy obecnych strategiach diagnostycznych. Identyfikacja zmiennych związanych z określonymi patologiami trzustki może ułatwić proces podejmowania decyzji chirurgicznych i poprawić profilowanie pacjentów.

Obiecujące wyniki w odkrywaniu biomarkerów zostały osiągnięte przy użyciu łatwo dostępnych płynów ustrojowych, takich jak krew5,6,7, urine8, saliva9 i sok trzustkowy10,11,12. W wielu badaniach wykorzystano kompleksowe podejścia "omiczne", takie jak techniki genomiczne, proteomiczne i metabolomiczne, w celu zidentyfikowania potencjalnych cząsteczek lub sygnatur, które mogłyby odróżniać PDAC od innych łagodnych schorzeń trzustki. Niedawno wykazaliśmy, że sok trzustkowy, stosunkowo niezbadany płyn ustrojowy, może być używany do identyfikacji sygnatur metabolicznych pacjentów o różnych profilach klinicznych12. Sok trzustkowy to płyn bogaty w białko, który gromadzi sekretom komórek przewodowych trzustki i przepływa do głównego przewodu trzustkowego, a następnie do głównego przewodu żółciowego wspólnego. Ze względu na bliskość trzustki, może być silnie dotknięty zaburzeniami mikrośrodowiskowymi wywołanymi masą guza (Ryc. 1), a zatem bardziej pouczający niż krew lub mocz lub profilowanie oparte na tkankach. W kilku badaniach zbadano potencjał soku trzustkowego do identyfikacji nowych biomarkerów choroby przy użyciu różnych podejść, w tym analizy cytologicznej13, analizy proteomicznej przeprowadzonej za pomocą spektrometrii mas14,15, ocena markerów genetycznych i epigenetycznych, takich jak mutacje K-ras i p5316,17, zmiany w metylacji DNA18, oraz miRNAs19. Technicznie rzecz biorąc, sok trzustkowy może być pobierany śródoperacyjnie lub za pomocą minimalnie inwazyjnych procedur, takich jak endoskopowe badanie ultrasonograficzne, wsteczna cholangio-pankreatografia lub endoskopowe pobieranie wydzieliny soku z dwunastnicy20. Nie jest jeszcze jasne, w jakim stopniu zastosowana technika pobierania ma wpływ na skład soku trzustkowego. Opisujemy tutaj procedurę śródoperacyjnego pobierania i pokazujemy, że sok trzustkowy może stanowić cenne źródło biomarkerów PDAC.

figure-introduction-1
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie pobierania soku trzustkowego. (A) Schematyczne przedstawienie przedstawiające wydzielanie soku trzustkowego do przewodu trzustkowego i jego gromadzenie podczas operacji. Wstawka przedstawia zbliżenie mikrośrodowiska guza: sok trzustkowy zbiera cząsteczki uwalniane przez komórki nowotworowe i zrębowe w przewodach trzustkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Gromadzenie soku trzustkowego w genetycznych i ortotopowych mysich modelach PDAC byłoby mile widziane w perspektywie wykorzystania tego biopłynu w przedklinicznych badaniach mechanistycznych; jednak ta procedura może być technicznie bardzo trudna i niewykonalna dla prostszych modeli, takich jak guzy podskórne. Z tego powodu zidentyfikowaliśmy płyn śródmiąższowy guza (TIF) jako alternatywne źródło soku trzustkowego, ze względu na jego podobną charakterystykę działania jako wskaźnik otaczających perturbacji. Płyn śródmiąższowy (IF) to płyn zewnątrzkomórkowy, znajdujący się poza naczyniami krwionośnymi i limfatycznymi, który obmywa komórki tkankowe21. Na skład IF wpływa zarówno krążenie krwi do narządu, jak i miejscowe wydzielanie; w rzeczywistości otaczające komórki aktywnie produkują i wydzielają białka w klasie IF21. Śródmiąższ odzwierciedla zmiany mikrośrodowiskowe otaczających tkanek i dlatego może stanowić cenne źródło do odkrywania biomarkerów w kilku kontekstach patologicznych, takich jak nowotwory. Wysokie stężenie lokalnie wydzielanych białek w TIF może być wykorzystane do identyfikacji cząsteczek kandydujących do przetestowania jako biomarkery prognostyczne lub diagnostyczne w plazmie22,23,24. Kilka badań dowiodło, że TIF jest odpowiednią próbką dla wysokoprzepustowych podejść proteomicznych, takich jak techniki spektrometrii mas23,24,25, a także podejścia multipleksowe ELISA26 i profilowanie mikroRNA27.

Zaproponowano kilka podejść do izolacji IF w nowotworach, które można ogólnie sklasyfikować jako in vivo (ultrafiltracja kapilarna28,29,30,31 i mikrodializa32,33,34,35) i metody ex vivo (wirowanie tkanek22,36,37,38 i elucja tkanek39,40,41,42). Techniki te zostały szczegółowo przeanalizowane43,44. Przy wyborze odpowiedniej metody należy wziąć pod uwagę takie kwestie, jak dalsze analizy i zastosowania oraz odzyskana objętość. Niedawno użyliśmy tego podejścia jako dowodu zasadności, aby zademonstrować różną aktywność metaboliczną nowotworów z dwóch linii komórkowych gruczolakoraka trzustki u myszy12. Opierając się na literaturze24,38, zdecydowaliśmy się na metodę wirowania z niską prędkością, aby uniknąć pękania komórek i rozcieńczania od zawartości wewnątrzkomórkowej. Zarówno ilość glukozy, jak i mleczanu w TIF odzwierciedlała różne cechy glikolityczne dwóch różnych linii komórkowych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół dla dwóch najczęściej stosowanych metod izolacji TIF: wirowania tkanek i elucji tkanek (Rysunek 2).

figure-introduction-2
Rycina 2: Schematyczne przedstawienie metod izolacji płynu śródmiąższowego guza. Schematyczne zobrazowanie technik szczegółowo opisanych w protokole, a mianowicie wirowania tkanek (A) i elucji tkanek (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla wszystkich pacjentów zapisanych pobrano krew obwodową i sok trzustkowy podczas operacji, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Etyczny Instytucji. Wszyscy pacjenci zostali włączeni do badania po podpisaniu świadomej zgody, w tym po pobraniu próbek biologicznych i danych klinicznych. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Instytucji (numer protokołu ICH-595, zatwierdzenie wydane w maju 2009 r.). Procedury dotyczące myszy i opieki nad nimi były zgodne z wytycznymi UE i instytucjonalnymi (protokół ID 121/2016-PR).

1. Izolacja soku trzustkowego

UWAGA: Pobranie soku trzustkowego odbywa się w kontekście otwartej procedury resekcji trzustki (np. pankreatykoduodenektomia, całkowita pankreatektomia, dystalna pankreatektomia) przez wykwalifikowanych chirurgów trzustki.

  1. Selekcja pacjentów
    1. Do zabiegu należy wziąć pod uwagę każdego pacjenta, u którego zaplanowano otwartą resekcję trzustki.
    2. Potwierdzić włączenie, jeśli rozmiar głównego przewodu trzustkowego jest uważany za wystarczający, aby umożliwić pobranie soku trzustkowego. Minimalna granica średnicy głównego przewodu trzustkowego wynosi 2 mm w obrazowaniu CT ze wzmocnieniem kontrastowym.
  2. Badanie przedoperacyjne przewodu trzustkowego w obrazowaniu CT ze wzmocnieniem kontrastowym, aby pomóc w planowaniu pobrania soku trzustkowego
    1. Trójwymiarowo zlokalizuj główny przewód trzustkowy w gruczole na poziomie szyi trzustki: zmierz odległość głównego przewodu trzustkowego od przedniego, górnego i dolnego brzegu trzustki na slajdach przekroju poprzecznego oraz renderingi koronalne i strzałkowe. Na sali operacyjnej należy skorzystać z tych pomiarów, aby określić w przybliżeniu właściwe miejsce, w którym należy nakłuć trzustkę, aby kaniulować przewód Wirsung i pobrać sok trzustkowy.
  3. Przygotowanie materiału
    1. Sterylny materiał: Otwórz sterylną kopertę z jedną igłą 25 G i jedną strzykawką 3 ml i umieść je w sterylnym polu we współpracy z pielęgniarką szorującą.
    2. Materiał niesterylny: Probówkę próżniową K2EDTA o pojemności 3 ml należy przechowywać w pobliżu na sali operacyjnej w celu przechowywania płynu.
  4. Przygotowanie pacjenta
    1. Ułóż pacjenta na łóżku na sali operacyjnej. Wywołać mieszane znieczulenie ogólne za pomocą Remifentanylu, Sevorane i Rocuronium, a następnie zaintubować i rozpocząć wentylację pacjenta. Ułóż pacjenta w pozycji odleżynowej z prawą ręką przyciśniętą do ciała, a lewą ręką odprowadzoną pod kątem 90° przytwierdzoną na podłokietniku.
    2. Zdezynfekuj skórę brzucha w miejscu nacięcia. Stwórz i utrzymuj sterylne pole na brzuchu otulające pacjenta.
  5. Zabiegu chirurgicznego
    1. Wykonaj nacięcie podżebrowe i uzyskaj dostęp do jamy brzusznej. Ustaw retrakcję brzucha Rochard do odsłonięcia narządów.
    2. Odsłoń i zmobilizuj trzustkę poprzez manewr Kochera, otwarcie więzadła żołądkowo-kolkowego, nacięcie tkanki zaotrzewnowej wzdłuż górnej i dolnej granicy trzustki, tworząc płaszczyznę rozwarstwienia między szyją trzustki a żyłą krezkową górną położoną z tyłu.
    3. Po zmobilizowaniu i odsłonięciu trzustki przystąp do pobrania soku trzustkowego przed sekcją szyi trzustki.
  6. Identyfikacja i lokalizacja przewodu trzustkowego
    1. Oszacuj położenie przewodu trzustkowego za pomocą pomiaru wykonanego podczas obrazowania, a następnie zbadaj palpacyjnie przednią powierzchnię trzustki, aby określić jej dokładną lokalizację.
  7. Pobranie soku trzustkowego
    1. Chwyć głowę trzustki i dwunastnicę od spodu i podnieś je lewą ręką, zaznaczając położenie przewodu trzustkowego pierwszą cyfrą.
    2. Chwycić prawą ręką strzykawkę o pojemności 3 ml z założoną igłą 25 G.
    3. Prawą ręką wbij igłę w trzustkę dystalnie do lewego kciuka. Zdecyduj o głębokości penetracji i stopniu nachylenia igły na podstawie pomiarów przedoperacyjnych i wrażenia penetracji ściany kanału.
    4. Pobrać sok za pomocą strzykawki. Jeśli nie jest możliwe odzyskanie soku, przesuń igłę w czterech kierunkach, próbując kaniulować przewód trzustkowy.
    5. Po pobraniu soku trzustkowego przenieś go poza sterylne pole i przenieś do probówki próżniowej K2EDTA o pojemności 3 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przeniesienia próbki do laboratorium i jak najszybciej przystąpić do dalszego przetwarzania.
      UWAGA: Objętość soku trzustkowego, którą można odzyskać za pomocą tej procedury, jest bardzo zróżnicowana, z naszego doświadczenia wynika, że wynosi od około 0,2 ml do 3 ml. Ilość pobranego soku jest w dużym stopniu zależna od pacjenta: wymiaru przewodu Wirsunga i stanu funkcjonalnego trzustki (funkcjonowanie a gruczoł zanikowy). Z naszego doświadczenia wynika, że nie ma środka, który można by zastosować w celu zwiększenia ilości pobieranego soku trzustkowego.

2. Przetwarzanie soku trzustkowego

  1. Odwirować sok trzustkowy o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich komórek lub zanieczyszczeń.
    UWAGA: Sok trzustkowy przed odwirowaniem powinien być klarowny i przezroczysty. Czasami może dojść do zanieczyszczenia krwi podczas operacji, co powoduje, że próbka wydaje się bardziej mętna i czerwona. Należy rozważyć wyłączenie takich próbek z dalszych analiz.
  2. Odzyskać supernatant, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszych analiz.

3. Indukcja guzów podskórnych

UWAGA: Mysie linie komórkowe Panc02 i DT6606 zostały uzyskane odpowiednio od prof. Lorenzo Piemontiego (San Raffaele Diabetes Institute, Mediolan, Włochy) i prof. Francesco Novelli (Center for Experimental Research and Medical Studies, Turyn, Włochy), jak wcześniej opisano12.

  1. Wzrost komórek nowotworowych
    1. Hodowla komórek Panc02 i DT6606 w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2mM L-glutaminy i 1% antybiotyku penicylina-streptomycyna.
    2. Rozmrozić zamrożone komórki 1-2 tygodnie przed wstrzyknięciem guza, w zależności od tempa wzrostu linii komórkowej.
    3. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% w sterylnych warunkach.
    4. Odłącz komórki z 0,025% roztworem trypsyny/EDTA na 5 minut w temperaturze 37 °C, gdy osiągną 80% konfluencji i wyeliminuj trypsynę przez odwirowanie.
      UWAGA: DT6606 są pierwotnymi, nie unieśmiertelnionymi komórkami, pochodzącymi z myszy LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre i nie powinny być pasażowane więcej niż 3 razy przed wstrzyknięciem in vivo, aby zachować ich pierwotne cechy. Zaleca się rozmrożenie komórek DT6606 na 7-10 dni przed wstrzyknięciem.
  2. Iniekcja komórek nowotworowych in vivo
    1. Trypsynizować komórki (patrz krok 3.1.4) i przemyć je raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Wyeliminuj PBS przez odwirowanie i ponowne zawieś komórki w świeżym PBS przed zliczeniem.
    2. Policz komórki i ponownie zawieś je w PBS w stężeniu 0,5-1 x 107 komórek/ml, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-1 x 106 komórek/100 μl do wstrzyknięcia każdej myszy. Przygotuj komórki w nadmiarze. Przechowywać komórki w temperaturze 4 °C lub na lodzie do końca zabiegu.
    3. Pogrupuj zwierzęta (8-tygodniowe samice myszy C57BL/6J) w różnych klatkach zgodnie z różnymi liniami komórkowymi lub zabiegami.
    4. Krępować zwierzęta ręcznie i znieczulać je mieszaniną ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) lub zgodnie z lokalnie zatwierdzonymi procedurami.
    5. Ogolić miejsce wstrzyknięcia, zwykle bok nad nogą, golarką elektryczną i dokładnie oczyścić miejsce wstrzyknięcia alkoholem.
    6. Pipetować w górę i w dół zawiesiny komórek za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza, przesuwając tłok w górę i w dół. Przymocować igłę 25 G do strzykawki i popchnąć tłok do góry, aż zawiesina komórek dotrze do otworu igły.
    7. Uszczypnij skórę boku kleszczami z płaską końcówką i ostrożnie włóż igłę u podstawy fałdu skórnego między kleszcze, nie nakłuwając jamy otrzewnej ani mięśni. Aby sprawdzić prawidłowe położenie igły, delikatnie spróbuj przesunąć końcówkę igły na boki pod skórą. Igła powinna poruszać się swobodnie.
    8. Powoli wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórek (zawierających 0,5-1 x 106 komórek), delikatnie zaciskać miejsce wstrzyknięcia przez kilka sekund i powoli wyjmować igłę bez żadnych ruchów na boki.
    9. Wróć mysz z powrotem do klatki i monitoruj powrót do zdrowia po znieczuleniu.
    10. Sprawdzaj wzrost guza za pomocą suwmiarki przez 3-4 tygodnie. Poddaj zwierzęta eutanazji, gdy guzy osiągną około 0,5-1cm3 za pomocą CO2 lub zgodnie z lokalnie zatwierdzonymi procedurami.

4. Izolacja płynu śródmiąższowego guza (TIF)

  1. Wycięcie guzów podskórnych
    1. Zablokuj kończyny zwierząt taśmą papierową i oczyść skórę alkoholem. Rozetnij skórę na brzuchu, aby oddzielić ją od otrzewnej i przejdź do kończyn. Wytnij guz wyrosły pod skórą boku za pomocą nożyczek, zacisków i ostatecznie skalpela.
    2. Zważ guz i trzymaj go w czystej probówce na lodzie do czasu wyizolowania TIF.
  2. Izolacja TIF przez odwirowanie
    1. Przetnij guz na pół, szybko opłucz dwie części w PBS i delikatnie osusz je na bibule filtracyjnej, aby usunąć nadmiar PBS. Wykonaj te kroki tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć parowania z guza.
    2. Natychmiast przenieś guz do sitka z komórek nylonowych o wielkości 20 μm umieszczonego na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    3. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: To wirowanie o niskiej prędkości zachowuje integralność komórek, unikając zanieczyszczenia TIF przez przedział wewnątrzkomórkowy. Wyciek zawartości wewnątrzkomórkowej można przetestować w dalszych zastosowaniach, na przykład poprzez ocenę obecności wewnątrzkomórkowych białek porządkujących, takich jak białka rybosomalne25.
    4. Odzyskać TIF z dna probówki, ostatecznie podzielić go na porcje i natychmiast zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
      Opcjonalnie: Na podstawie dalszej analizy proteomicznej, którą należy przeprowadzić, rozcieńczyć próbkę w PBS koktajlem inhibitorów proteazy, aby uniknąć degradacji określonych cząsteczek.
      UWAGA: W zależności od składu guza, w niektórych przypadkach bardzo małe guzy nie wytwarzają płynu.
  3. Izolacja TIF przez elucję
    1. Pokrój guz na małe kawałki (≈1-3 mm3) nożyczkami lub skalpelem i dokładnie spłucz zimnym PBS.
      UWAGA: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby pracować szybko i wykonywać minimalne manipulacje, aby uniknąć uszkodzenia komórek.
    2. Przenieś kawałki guza do probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 500 μl PBS z koktajlem inhibitorów proteazy, aby uniknąć degradacji analitów. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Odzyskać supernatant i przenieść go do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia jakichkolwiek komórek z próbki.
    4. Przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie odwirować przy 2 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie odwirować przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń. Odzyskać supernatant. Natychmiast podwielokrotność próbki TIF należy podzielić na suchy lód i zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępowaliśmy zgodnie z procedurą opisaną powyżej, aby uzyskać sok trzustkowy od pacjentów z PDAC (n=31) i innymi łagodnymi dolegliwościami trzustki (nie-PDAC, n=9), w tym zapaleniem trzustki (n=2), guzami brodawkowato-bańkowymi (n=4), guzami neuroendokrynnymi (n=2), wewnątrzprzewodową brodawkowatą neoplazją śluzową (IPMN; n=1)12. Próbki soku trzustkowego poddano następnie analizie metabolomicznej przy użyciu magnetycznego rezonansu jądrowego (1H-NMR)12

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opisaliśmy technikę śródoperacyjnego pobierania soku trzustkowego, w dużej mierze niezbadaną biopsję płynu. Niedawno wykazaliśmy, że sok trzustkowy może być wykorzystywany jako źródło metabolicznych markerów choroby12. Analiza metabolomiczna innych płynnych biopsji, takich jakkrew 5,6,7, mocz 8 i ślina9, wykazała obiecujące wyniki w rozróżniani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Robercie Migliore za pomoc techniczną. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie ze środków Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) w ramach projektu IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlBD Biosciences309659
1,5 ml Probówka EppendorfGreiner BioOneGR616201
20 µ m nylonowe sitko komórkowepluriSelect43-50020-03
Igła 25GBD Biosciences305122
3 mL Vacutainer K2EDTA StrzykawkaBD Biosciences366473
3 mLBD Biosciences309656
50 mL Falcon probówkaCorning352098
Zaciski Medicon06.20.12
Skalpel jednorazowyMedicom9000-10
Surowica bydlęcaMicrotechMG10432
Kleszcze płaskieMedicon06.00.10
Penicylina-StreptomycynaLonzaECB3001D
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8537
Koktajl inhibitorów proteazyRoche
RPMI mediumEurocloneECB9006L
NożyczkiMedicon02.04.09
Trypsyna/EDTA 1xLonzaBE17-161F
Ultraglutamina 100xLonzaBE17-605E/U1
34044100

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costello, E., Greenhalf, W., Neoptolemos, J. P. New biomarkers and targets in pancreatic cancer and their application to treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (8), 435-444 (2012).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
  3. Neoptolemos, J. P., et al. Therapeutic developments in pancreatic cancer: current and future perspectives. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (6), 333-348 (2018).
  4. Sahin, I. H., Askan, G., Hu, Z. I., O'Reilly, E. M. Immunotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma: an emerging entity. Annals of Oncology. 28 (12), 2950-2961 (2017).
  5. Mayerle, J., et al. Metabolic biomarker signature to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from chronic pancreatitis. Gut. 67 (1), 128-137 (2018).
  6. Bathe, O. F., et al. Feasibility of identifying pancreatic cancer based on serum metabolomics. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 20 (1), 140-147 (2011).
  7. Mayers, J. R., et al. Elevation of circulating branched-chain amino acids is an early event in human pancreatic adenocarcinoma development. Nature Medicine. 20 (10), 1193-1198 (2014).
  8. Napoli, C., et al. Urine metabolic signature of pancreatic ductal adenocarcinoma by (1)h nuclear magnetic resonance: identification, mapping, and evolution. Journal of Proteome Research. 11 (1), 1274-1283 (2012).
  9. Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
  10. Chen, R., et al. Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis. Pancreas. 34 (1), 70-79 (2007).
  11. Mori, Y., et al. A minimally invasive and simple screening test for detection of pancreatic ductal adenocarcinoma using biomarkers in duodenal juice. Pancreas. 42 (2), 187-192 (2013).
  12. Cortese, N., et al. Metabolome of Pancreatic Juice Delineates Distinct Clinical Profiles of Pancreatic Cancer and Reveals a Link between Glucose Metabolism and PD-1+ Cells. Cancer Immunology Research. , (2020).
  13. Tanaka, M., et al. Cytologic Analysis of Pancreatic Juice Increases Specificity of Detection of Malignant IPMN-A Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 17 (11), 2199-2211 (2019).
  14. Chen, K. T., et al. Potential prognostic biomarkers of pancreatic cancer. Pancreas. 43 (1), 22-27 (2014).
  15. Tian, M., et al. Proteomic analysis identifies MMP-9, DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients. BMC Cancer. 8, 241(2008).
  16. Shi, C., et al. Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis, potential for early detection. Cancer Biology & Therapy. 7 (3), 353-360 (2008).
  17. Rogers, C. D., et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs. Cancer Biology & Therapy. 5 (10), 1383-1389 (2006).
  18. Matsubayashi, H., et al. DNA methylation alterations in the pancreatic juice of patients with suspected pancreatic disease. Cancer Research. 66 (2), 1208-1217 (2006).
  19. Cote, G. A., et al. A pilot study to develop a diagnostic test for pancreatic ductal adenocarcinoma based on differential expression of select miRNA in plasma and bile. The American Journal of Gastroenterology. 109 (12), 1942-1952 (2014).
  20. Yu, J., et al. Digital next-generation sequencing identifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected from the duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillary mucinous neoplasms. Gut. , (2016).
  21. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiological Reviews. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  22. Haslene-Hox, H., et al. A new method for isolation of interstitial fluid from human solid tumors applied to proteomic analysis of ovarian carcinoma tissue. PLoS One. 6 (4), 19217(2011).
  23. Zhang, J., et al. In-depth proteomic analysis of tissue interstitial fluid for hepatocellular carcinoma serum biomarker discovery. British Journal of Cancer. 117 (11), 1676-1684 (2017).
  24. Sullivan, M. R., et al. Quantification of microenvironmental metabolites in murine cancers reveals determinants of tumor nutrient availability. Elife. 8, (2019).
  25. Matas-Nadal, C., et al. Evaluation of Tumor Interstitial Fluid-Extraction Methods for Proteome Analysis: Comparison of Biopsy Elution versus Centrifugation. Journal of Proteome Research. 19 (7), 2598-2605 (2020).
  26. Espinoza, J. A., et al. Cytokine profiling of tumor interstitial fluid of the breast and its relationship with lymphocyte infiltration and clinicopathological characteristics. Oncoimmunology. 5 (12), 1248015(2016).
  27. Halvorsen, A. R., et al. Profiling of microRNAs in tumor interstitial fluid of breast tumors - a novel resource to identify biomarkers for prognostic classification and detection of cancer. Molecular Oncology. 11 (2), 220-234 (2017).
  28. Yang, S., Huang, C. M. Recent advances in protein profiling of tissues and tissue fluids. Expert Review of Proteomics. 4, 515-529 (2007).
  29. Huang, C. M., et al. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6 (22), 6107-6116 (2006).
  30. Leegsma-Vogt, G., Janle, E., Ash, S. R., Venema, K., Korf, J. Utilization of in vivo ultrafiltration in biomedical research and clinical applications. Life Sciences. 73 (16), 2005-2018 (2003).
  31. Schneiderheinze, J. M., Hogan, B. L. Selective in vivo and in vitro sampling of proteins using miniature ultrafiltration sampling probes. Analytical Chemistry. 68 (21), 3758-3762 (1996).
  32. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clinical Applications. 5 (11-12), 636-643 (2011).
  33. Xu, B. J., et al. Microdialysis combined with proteomics for protein identification in breast tumor microenvironment in vivo. Cancer Microenvironment. 4 (1), 61-71 (2010).
  34. Bendrik, C., Dabrosin, C. Estradiol increases IL-8 secretion of normal human breast tissue and breast cancer in vivo. The Journal of Immunology. 182 (1), 371-378 (2009).
  35. Ao, X., Stenken, J. A. Microdialysis sampling of cytokines. Methods. 38 (4), 331-341 (2006).
  36. Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
  37. Choi, J., et al. Intraperitoneal immunotherapy for metastatic ovarian carcinoma: Resistance of intratumoral collagen to antibody penetration. Clinical Cancer Research. 12 (6), 1906-1912 (2006).
  38. Wiig, H., Aukland, K., Tenstad, O. Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (1), 416-424 (2003).
  39. Li, S., Wang, R., Zhang, M., Wang, L., Cheng, S. Proteomic analysis of non-small cell lung cancer tissue interstitial fluids. World Journal of Surgical Oncology. 11, 173(2013).
  40. Fijneman, R. J., et al. Proximal fluid proteome profiling of mouse colon tumors reveals biomarkers for early diagnosis of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 18 (9), 2613-2624 (2012).
  41. Teng, P. N., Hood, B. L., Sun, M., Dhir, R., Conrads, T. P. Differential proteomic analysis of renal cell carcinoma tissue interstitial fluid. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1333-1342 (2011).
  42. Turtoi, A., et al. Novel comprehensive approach for accessible biomarker identification and absolute quantification from precious human tissues. Journal of Proteome Research. 10 (7), 3160-3182 (2011).
  43. Wagner, M., Wiig, H. Tumor Interstitial Fluid Formation, Characterization, and Clinical Implications. Frontiers in Oncology. 5, 115(2015).
  44. Haslene-Hox, H., Tenstad, O., Wiig, H. Interstitial fluid-a reflection of the tumor cell microenvironment and secretome. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2336-2346 (2013).
  45. Hsieh, S. Y., et al. Secreted ERBB3 isoforms are serum markers for early hepatoma in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Journal of Proteome Research. 10, 4715-4724 (2011).
  46. Sun, W., et al. Characterization of the liver tissue interstitial fluid (TIF) proteome indicates potential for application in liver disease biomarker discovery. Journal of Proteome Research. 9 (2), 1020-1031 (2010).
  47. Haslene-Hox, H., et al. Increased WD-repeat containing protein 1 in interstitial fluid from ovarian carcinomas shown by comparative proteomic analysis of malignant and healthy gynecological tissue. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2347-2359 (2013).
  48. Wang, T. H., et al. Stress-induced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation. Molecular & Cellular Proteomics. 9, 1873-1884 (2010).
  49. Gromov, P., et al. Up-regulated proteins in the fluid bathing the tumour cell microenvironment as potential serological markers for early detection of cancer of the breast. Molecular Oncology. 4 (1), 65-89 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sok trzustkowyp yn r dmi szowy guzawirowanie tkanekelucja z tkankiodkrywanie biomarker wanaliza metabolomicznaprofilowanie mikroRNAspektrometria masusuwanie szcz tk w kom rkowych

Powiązane artykuły