Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61694

⸱

25 sierpnia 2020

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Streszczenie

Otyłość i zaburzenia metaboliczne, takie jak cukrzyca, choroby serca i rak, są związane z dramatyczną przebudową tkanki tłuszczowej. Tkankowe komórki progenitorowe tkanki tłuszczowej (APC) odgrywają kluczową rolę w homeostazie tkanki tłuszczowej i mogą przyczyniać się do patologii tkanek. Rosnące zastosowanie technologii analizy pojedynczych komórek – w tym sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i proteomiki pojedynczych komórek – przekształca pole komórek macierzystych/progenitorowych, umożliwiając bezprecedensowe rozwiązywanie zmian ekspresji poszczególnych komórek w kontekście zmian w całej populacji lub tkance. W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły preparowania tkanki tłuszczowej najądrza myszy, izolowania pojedynczych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej i przeprowadzania sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu wzbogacenia żywotnych APC Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119-. Protokoły te umożliwią badaczom przygotowanie wysokiej jakości APC odpowiednich do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek.

Wprowadzenie

Tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w metabolizmie energetycznym. Nadmiar energii jest magazynowany w postaci lipidów, a tkanka tłuszczowa jest zdolna do znacznego rozszerzania lub cofania w zależności od stanu odżywienia i zapotrzebowania energetycznego. Ekspansja tkanki tłuszczowej może wynikać ze wzrostu wielkości adipocytów (hipertrofii) i/lub ze wzrostu liczby adipocytów (hiperplazja); Ten ostatni proces jest ściśle regulowany przez proliferację i różnicowanie komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej1,2. Podczas otyłości tkanka tłuszczowa nadmiernie się rozrasta, a dysfunkcja tkanek – w tym niedotlenienie, stany zapalne i insulinooporność – często się rozwija3,4. Powikłania te są czynnikami ryzyka wielu chorób przewlekłych, w tym nadciśnienia, cukrzycy, chorób układu krążenia, udaru mózgu i raka5. W związku z tym ograniczanie niekontrolowanej ekspansji tkanki tłuszczowej i łagodzenie patologii tkanki tłuszczowej są głównymi priorytetami badań biomedycznych. Podczas ekspansji tkanki tłuszczowej rezydentne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) namnażają się i różnicują sekwencyjnie w preadipocyty (zaangażowane komórki progenitorowe), a następnie w dojrzałe adipocyty6. Ostatnie badania sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) pokazują, że te populacje komórek progenitorowych tłuszczu (APC) (ASC i preadipocyty) wykazują znaczną heterogeniczność molekularną i funkcjonalną7,8,9,10,11,12. Na przykład ASC wykazują zmniejszoną zdolność różnicowania adipogennego, a jednocześnie wykazują wyższe zdolności do proliferacji i ekspansji w porównaniu do preadipocytów7. Dalsze różnice molekularne są zgłaszane w populacjach ASC i preadipocytów, chociaż funkcjonalne znaczenie tych różnic pozostaje niejasne7. Łącznie dane te podkreślają złożoność puli komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej i podkreślają potrzebę opracowania i standaryzacji narzędzi w celu lepszego zrozumienia i manipulowania tymi krytycznymi populacjami komórek.

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację populacji komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej Sca1+ o wysokiej żywotności z poduszeczek tłuszczowych najądrza myszy, które są odpowiednie do czułych analiz dalszych, w tym badań pojedynczych komórek (sekwencjonowanie scRNA) i hodowli komórek. Izolację i dysocjację poduszeczek tłuszczowych najądrza przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem7,13 z niewielkimi modyfikacjami, które poprawiają żywotność izolowanych APC. Krótko mówiąc, zdysocjowane komórki z poduszeczek tłuszczowych najądrza są barwione przeciwciałami przeciwko Sca1, markerowi zarówno ASC, jak i preadipocytów6,7 i innymi markerami linii (Lin): Ter119 (komórki erytroidalne), CD31 (komórki śródbłonka) i CD45 (leukocyty). Żywotne komórki Sca1 + / Ter119 / CD31 / CD45 / DAPI- są następnie sortowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Co ważne, protokół ten został potwierdzony przez udaną izolację i analizę żywotnych komórek progenitorowych tłuszczu Sca1+/Lin- zgłoszonych w niedawnym badaniu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, które zidentyfikowało funkcjonalnie heterogeniczne subpopulacje w obrębie ASC i preadipocytów7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Kliniki Mayo.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotuj 2% (w/v) roztwór kolagenazy, rozpuszczając kolagenazę II 2 g w 100 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS). Podwielokrotność 200 μl dla każdego zastosowania.
  2. Przygotować pożywkę neutralizacyjną, mieszając 84 ml pożywki F-12, 15 ml surowicy końskiej i 1 ml penicyliny/streptomycyny.
  3. Przygotować bufor do cytometrii przepływowej, rozpuszczając 500 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 400 μl 0,5 M EDTA w 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.

2. Rozwarstwienie poduszeczki tłuszczowej najądrza i dysocjacja tkanek

  1. Humanitarna eutanazja (izofluran/zwichnięcie szyjki macicy) jednego samca myszy. W tym protokole użyto czteromiesięcznej myszy FVB.
  2. Nałóż / spryskaj 70% etanol na brzuch i odsłoń dolną część jamy brzusznej za pomocą czystych nożyczek i kleszczy.
  3. Zlokalizuj poduszeczkę tłuszczową najądrza (proksymalną / przyczepioną do jąder). Przytrzymaj połączenie między jądrami a poduszeczką tłuszczową najądrza kleszczami i delikatnie pociągnij, aby uwolnić poduszeczkę tłuszczową najądrza.
  4. Usuń jądra przez cięcie nożyczkami i inkubuj poduszeczkę tłuszczową najądrza w 5 ml HBSS uzupełnionej 3% BSA w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  5. Wirować przy 150 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Weź pływającą poduszeczkę tłuszczową najądrza z rurki stożkowej o pojemności 50 ml i drobno zmiel tkankę czystymi nożyczkami.
  7. Dodaj 200 μl 2% roztworu kolagenazy do 3,8 ml HBSS w probówce hodowlanej o pojemności 13 ml. Dodać zmieloną tkankę i inkubować w inkubatorze obrotowym z prędkością 5 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zamiast inkubatora obrotowego, inkubator do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C może być alternatywnie używany z okazjonalnym mieszaniem.
  8. Przenieść całą zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 10 ml pożywki neutralizującej. Wymieszaj delikatnie, odwracając rurkę 2-3 razy.
  9. Przygotować kolejną stożkową probówkę o pojemności 50 ml wyposażoną w sitko o pojemności 70 μm. Przefiltruj strawioną tkankę do nowej probówki za pomocą sitka do komórek.
  10. Przenieść przepływ do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą 5 ml DPBS. Wirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Ostrożnie usunąć supernatant i dodać 50 μl buforu cytometrii przepływowej. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując i utrzymuj komórki na lodzie. Ze względu na objętość osadów komórkowych i niewielką ilość resztkowego supernatantu, całkowita objętość komórek w buforze cytometrii przepływowej będzie większa niż 50 μl (około 100 μl).

3. Znakowanie przeciwciałami i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)

  1. Po dokładnym wymieszaniu komórek z delikatnym pipetowaniem przenieść 54 μl zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Dodać 6 μl odczynnika blokującego FcR i dobrze wymieszać, delikatnie pipetując. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zachowaj wszelkie pozostałe komórki po pobraniu 54 μl i trzymaj je w lodzie, aby użyć ich jako niezabarwionej kontroli w kroku 3.5 i kroku 3.6.
  2. Podczas inkubacji w kroku 3.1 należy przygotować koktajl przeciwciał, łącząc po 11 μl przeciwciał anty-Sca1-APC, anty-Ter119-FITC, anty-CD31-FITC i anty-CD45-FITC w probówce do mikrowirówki. Dobrze wymieszać delikatnym pipetowaniem i przechowywać na lodzie, chroniąc przed światłem.
  3. Po inkubacji z odczynnikiem blokującym FcR przez 10 minut, dodać 40 μl koktajlu przeciwciał i dobrze wymieszać delikatnym pipetowaniem. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  4. Dodać 500 μl buforu cytometrii przepływowej uzupełnionego 1 μg/ml DAPI do wybarwionych komórek. Dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie i filtrowanie komórek za pomocą probówki o pojemności 5 ml z zatrzaskiem z sitkiem do komórek. Utrzymuj komórki na lodzie.
  5. Dodać 500 μl buforu cytometrii przepływowej do pozostałych komórek w kroku 3.1 i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie. Filtruj komórki za pomocą probówki o pojemności 5 ml z zatrzaskiem do sitka komórkowego. Trzymaj te komórki na lodzie i użyj jako niezabarwionej kontroli w następnym kroku.
  6. Zabierz wybarwione komórki i niebarwioną kontrolę do analizy FACS lub przyrządu do sortowania.
    1. Zidentyfikuj i wyizoluj populację APC+/FITC-/DAPI- za pomocą strategii bramkowania pokazanych na Rysunek 1. Komórki te reprezentują żywotne komórki Sca1 + / Ter119 / CD31 / CD45-. Szczątki i agregaty komórkowe są wyładowywane za pomocą wykresów rozrzutu do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC). Następnie populacja DAPI- jest bramkowana, a następnie bramkowanie populacji APC+/FITC-. Niezabarwione kontrolki powinny być używane do pomocy w ustawianiu parametrów bramkowania.
    2. Zebrać komórki do 500 μl buforu cytometrii przepływowej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Idąc dalej, wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnych warunkach, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Z jednej myszy pobiera się około 50 000 – 100 000 komórek.
  7. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby ocenić żywotność komórek. Ponieważ agregaty komórkowe mogą zakłócać dalsze analizy, ocenia się również obecność agregatów komórkowych w celu zapewnienia minimalnej obecności (<5% liczby komórek zdolnych do życia) tych agregatów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W eksperymencie wykorzystano czteromiesięczne samce myszy FVB. Po wykluczeniu zanieczyszczeń i dubletów za pomocą wykresów FSC/SSC, wytypowano żywe komórki (populacja DAPI-), a następnie wyselekcjonowano populację APC+/FITC- (Rysunek 1). Bramki dla DAPI, APC i FITC wyznaczono na podstawie kontroli niebarwionej. Strategie bramkowania przedstawiono na Rysunku 1.

Po 1 h sortowania jakość izolacji oceniono...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) szybko zyskuje na popularności jako potężne narzędzie do jednoczesnego badania różnych populacji komórek na poziomie pojedynczej komórki. Ze względu na wysokie koszty związane z przygotowaniem próbki i sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości, konieczna jest optymalizacja danych wejściowych komórkowych (wysoka żywotność i czystość), aby zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu eksperymentu. Niektóre protokoły przygotowania komórek opierają się na usuwaniu martwych komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Instytutowi Cytometrii Przepływowej Mikroskopii Komórkowej Kliniki Mayo za pomoc w sortowaniu FACS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,7 mlVWR87003-294
13 ml probówkaThermo Fisher Scientific50-809-216
15 ml probówka stożkowaGreiner Bio-one188 271
5 ml z sitkiem do komórek zatrzaskThermo Fisher Scientific08-771-23
50 ml rurka stożkowaGreiner Bio-one227 261
70 &mikro; m sitko komórkoweThermo Fisher Scientific22-363-548
Przeciwciało anty-CD31-FITCMiltenyi Biotec130-102-519
Przeciwciało anty-CD45-FITCMiltenyi Biotec130-102-491
Przeciwciało anty-Sca1-APCMiltenyi Biotec130-102-833
Przeciwciało anty-Ter119-FITCMiltenyi Biotec130-112-908
BSAGold BiotechnologyA-420-500
Kolagenaza typu IIThermo Fisher Scientific17101-015
DAPIThermo FisherD1306
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy DulbeccoThermoFisher Scientific14190-144
F-12 średniaThermo Fisher Scientific11765-054
Odczynnik blokujący FcRMiltenyi Biotec130-092-575
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Thermo Fisher Scientific14025-092
Surowica dla koniThermo Fisher Scientific16050-122
Penicylina-streptomycynaThermo Fisher Scientific15140-122
Roztwór jodku propidynyMiltenyi BiotecNumer katalogowy: 130-093-233
hodowlana

Bibliografia

  1. Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
  2. Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
  4. Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
  5. Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
  6. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
  7. Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).
  8. Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
  9. Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636(2018).
  10. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501(2019).
  11. Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
  12. Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
  13. De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
  14. Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219(2020).
  15. Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057(2018).
  16. Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
  17. Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
  18. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

t uszczka nadjajdzielnasortowanie kom rek aktywowane fluorescencjsekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rektrawienie tkankiizolacja kom rekcytometria przep ywowaroztw r kolagenazysitko do kom rekkoktajl przeciwcia
Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.