Artykuł metodologiczny

Określanie wielkości i analiza fenotypowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą cytometrii przepływowej

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61695

⸱

23 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Red de Apoyo a la Investigación, Universidad Nacional Autónoma de México e Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, 2Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu, uEVs, od zdrowych ludzkich dawców i ich fenotypową charakterystykę na podstawie wielkości i ekspresji markera powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, EVs, to niejednorodny kompleks błon lipidowych, wydzielanych przez dowolny typ komórek, w dowolnym płynie, takim jak mocz. EV mogą mieć różne rozmiary, od 40-100 nm średnicy, np. w egzosomach, do 100-1000 nm w mikropęcherzykach. Mogą również zawierać różne cząsteczki, które mogą być wykorzystywane jako biomarkery do prognozowania i diagnozowania wielu chorób. Opracowano wiele technik charakteryzowania tych pęcherzyków. Jednym z nich jest cytometria przepływowa. Nie ma jednak istniejących raportów, które pokazywałyby, jak określić ilościowo stężenie EV i zróżnicować je według wielkości, wraz z wykrywaniem biomarkerów. Niniejsza praca ma na celu opisanie procedury izolacji, kwantyfikacji i fenotypyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu, uEV, przy użyciu konwencjonalnego cytometru do analizy bez żadnych modyfikacji jego konfiguracji. Ograniczenia metody obejmują barwienie maksymalnie czterech różnych biomarkerów na próbkę. Metoda jest również ograniczona ilością pojazdów elektrycznych dostępnych w próbie. Pomimo tych ograniczeń, dzięki temu protokołowi i jego późniejszej analizie możemy uzyskać więcej informacji na temat wzbogacenia markerów EVs i obfitości tych pęcherzyków obecnych w próbkach moczu, w chorobach związanych z uszkodzeniem nerek i mózgu.

Wprowadzenie

U ssaków krew jest filtrowana przez nerki 250 - 300 razy; w tym czasie powstaje mocz. Produkcja tego biopłynu jest wynikiem szeregu procesów, w tym filtracji kłębuszkowej, reabsorpcji rurkowej i wydzielania. Produkty przemiany materii i elektrolity są głównymi składnikami moczu. Ponadto wydalane są inne produkty uboczne, takie jak peptydy, funkcjonalne białka i pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV)1,2,3,4,5,6. Początkowo pęcherzyki zewnątrzkomórkowe moczu (uEV) zidentyfikowano w próbkach moczu od pacjentów cierpiących na zaburzenia równowagi wodnej. U pacjentów tych wykazano obecność cząsteczek takich jak akwaporyna-2 (AQP2), która została następnie wykorzystana jako biomarker tej choroby7. Kilka kolejnych badań koncentrowało się na identyfikacji pochodzenia komórkowego uEV, opisując, że struktury te mogą być wydzielane przez komórki nerkowe (kłębuszki nerkowe, podocyty itp.) i inne typy komórek linii śródbłonka lub leukocytów. Co więcej, liczba i wzbogacenie cząsteczek w uEV mogą korelować ze statusem wielu chorób i zaburzeń8,9,10,11,12,13,14.

Razem, EV tworzą wysoce heterogeniczną rodzinę cząsteczek otoczonych dwuwarstwami lipidów i uwalnianych przez komórki poprzez mechanizmy pasywne lub aktywne do różnych płynów. W zależności od ich pochodzenia, EV można sklasyfikować jako egzosomy pochodzące z endosomów lub mikropęcherzyki/mikrocząstki pochodzące z błony plazmatycznej. Jednak to kryterium klasyfikacji może być stosowane tylko wtedy, gdy bezpośrednio obserwuje się biogenezę cząstek. W związku z tym inne nietrywialne kryteria, w tym pochodzenie fizyczne, biochemiczne i komórkowe, zostały zatwierdzone przez kilku badaczy w tej dziedzinie15,16,17. W zależności od charakteru analizowanego izolatu zaproponowano różne techniki analityczne do charakterystyki EVs. Na przykład, w oparciu o wzbogacenie dużych (≥100 nm) lub małych (≤100 nm) EV, sugeruje się kwantyfikację za pomocą cytometrii przepływowej lub śledzenia nanocząstek, odpowiednio18.

W dzisiejszych czasach wykorzystanie EV jako biomarkerów wielu chorób stało się istotne, dlatego badane są poszukiwanie różnych źródeł. Jednym z najbardziej obiecujących źródeł jest mocz, ponieważ można go uzyskać w łatwy i nieinwazyjny sposób. Dlatego protokół ten opisuje procedurę izolacji uEV przez wirowanie różnicowe, przetwarzanie przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem i dalszą analizę przy użyciu konwencjonalnego cytometru 2-laserowego/4-kolorowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki moczu pochodzą od zdrowych ochotników, którzy wyrazili świadomą zgodę na dawstwo. Procedury te zostały również zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Badań Naukowych w Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán.

1. Izolacja pozakomórkowych wędrzeli moczowych

UWAGA: Protokół izolacji uEV został zmodyfikowany w stosunku do publikacji19. Rycina 1 przedstawia schematycznie protokół izolacji uEV.

Schemat procedury wirowania moczu; diagram przedstawia ustawienie wirówki do izolacji zewnątrzkomórkowych wędrzynków.
Rysunek 1: Przegląd izolacji uWZ do analizy cytometrii przepływowej. W tym protokole najpierw wirować pierwszą poranną porcję moczu, aby usunąć komórki i pozostałości. Następnie wykonać wirowanie w celu usunięcia dużych wędrzynków z dodatkowym zabiegiem usuwania białka THP, a na końcu przeprowadzić ultrawirowanie w celu wzbogacenia i uzyskania uWZ z jednokrotnym przemywaniem. Oznaczono kroki, w których należy zachować frakcje moczu do weryfikacji metodą WB. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Użyj porannej porcji moczu (15 mL) od zdrowych ochotników. Odmierz moczu przez 10 min przy 3 000 x g w 4 °C, aby usunąć wszystkie komórki i pozostałości komórkowe.
    NOTKA: Preferencyjnie używaj świeżego moczu; jeśli nie jest dostępny, użyj moczu przechowywanego maksymalnie przez 3 miesiące w -20 °C lub maksymalnie przez 6 miesięcy w -70 °C. Rozmroź próbkę moczu na lodzie i intensywnie wortexuj. Wszystkie procedury wykonuj na lodzie lub w 4 °C. Opcjonalnym krokiem do analizy Western blot jest przygotowanie dodatkowej próbówki i pobranie alikwoty 200 µL porannej porcji moczu do oddzielnej próbki. Przechowuj próbkę w -20 °C do czasu użycia, oznaczając ją jako „całkowity moczu”, w celu sprawdzenia obecności markerów pęcherzyków pozakomórkowych.
  2. Przenieś supernatant uzyskany w kroku 1.1 do nowej stożkowej probówki do wirówki o pojemności 15 mL, a następnie odwirowuj przez 45 min przy 10 000 x g w 4 °C. Przenieś supernatant do 8 mL poliwęglanowej probówki do wirówki ultracentryfugacyjnej i przechowuj na lodzie.
    NOTKA: Opcjonalnie, pobierz alikwotę 200 µL supernatantu uzyskanego w kroku 1.1 do oddzielnej próbki oznaczonej jako „mocz bez komórek” do analizy Western blot.
    1. Usunięcie białka Tamm-Horsfalla (THP)
      NOTKA: THP występuje w moczu i jest wzbogacony u osób z chorobą nerek. Doniesiono, że THP zmniejsza wydajność uEVs, ponieważ może wiązać się z uEVs. Aby usunąć to białko, konieczne jest użycie środka redukującego3,6.
      1. Przygotuj roztwór izolacyjny, mieszając 250 mM sacharozę z 10 mM trietaanolaminą. Dostosuj pH do 7,6.
      2. Wymieszaj osad uzyskany w kroku 1.2 z 500 µL roztworu izolacyjnego, a następnie dodaj 5 µL β-merkaptoetanolu.
      3. Incubuj mieszaninę osadu przez 10 min w 37 °C, wortexując co 2 min. Dodaj 500 µL roztworu izolacyjnego, a następnie odwirowuj przez 10 min przy 17 000 x g w 37 °C. Zbierz uzyskany supernatant (zawierający zredukowane, nieagregowane THP oraz uEVs).
  3. Wymieszaj oba zachowane supernatanty (z kroków 1.2 i 1.2.1.3) w tej samej 8 mL poliwęglanowej probówce do wirówki ultracentryfugacyjnej, a następnie odwirowuj przez 70 min przy 160 000 x g w 4 °C, używając wirówki ultracentryfugacyjnej z wirnikiem kątowym.
    NOTKA: Opcjonalnie, do analizy Western blot, przechowaj 200 µL supernatantu uzyskanego powyżej, oznaczając go jako „supernatant bez EVs”. Próbka ta posłuży jako kontrola ujemna podczas poszukiwania markerów pęcherzyków pozakomórkowych.
  4. Usuń supernatant. Dodaj lodowato zimy 1x PBS do 8 mL poliwęglanowej probówki i odwirowuj przez 70 min przy 160 000 x g w 4 °C.
    NOTKA: Uważaj, aby nie odrzucić osadu, ponieważ zawiera on uEVs. 1x PBS musi być sterylizowany i filtrowany przynajmniej 0,22 µm membraną filtracyjną.
  5. Usuń supernatant. Dodaj resztę supernatantu do 8 mL poliwęglanowej probówki i odwirowuj przez 70 min przy 160 000 x g w 4 °C.
  6. Usuń supernatant. Dodaj 8 mL lodowato zimy PBS do osadu, aby przemyć uEVs.
  7. Usuń supernatant. Pozwól osadowi wyschnąć, a następnie zawieś go w 1 mL lodowato zimy PBS. Przechowuj w -70 °C do czasu użycia.
    NOTKA: Jeśli przeprowadzasz analizę Western blot, zawieś osad z dodatkowej próbówki w 50 µL buforze RIPA z inhibitorami proteaz. Przechowuj w -20 °C do czasu użycia.

2. Barwienie uEV

UWAGA: Przed barwieniem i analizą uEV konieczne jest wykonanie co najmniej jednej metody zalecanej przez MISEV201818 w celu potwierdzenia prawidłowego wyizolowania uEV; w tym przypadku przedstawiono analizę za pomocą western blot. Rycina 2 przedstawia reprezentatywny protokół barwienia uEV.

Schemat cytometrii przepływowej z oznakowaniem przeciwciałami i barwieniem CFSE do analizy komórek; wykres fluorescencji.
Rycina 2: Ogólny widok barwienia i przechwytywania uEV w cytometrze. (A) Schemat barwienia uEV. Dla 500 000 uEV przeciwciało było mieszane i inkubowane w 4 °C przez 12 h. Następnie dodano CFSE i inkubowano w 37 °C przez 10 min. uEV zawierały CFSE wewnątrz, a przeciwciało wiązało się z powierzchnią antygenu. 400 µL zimnego roztworu PBS użyto do zawieszenia i pobrania 100 µL próbki do cytometru przepływowego przy niskiej prędkości. (B) Strategia analizy. Pierwszy wykres punktowy (SSC-H vs. FL-X) przedstawia kontrolę ujemną dla uEV, po nim wykres punktowy pokazujący barwienie uEV za pomocą CFSE, a na końcu histogram z barwieniem uEV przeciwciałem (czarna linia), kontrolę ujemną przedstawiono szarą linią. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Oblicz względną liczbę uEV poprzez oznaczenie zawartości białka za pomocą dowolnej konwencjonalnej kolorymetrycznej metody oznaczania białka, wspomnianej w Tabeli materiałów. Wykonaj rozcieńczenie uEV w stosunku 1:5 i postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w karcie danych zestawu do oznaczania białka.
  2. Na podstawie wcześniej opublikowanego wzoru20, przyjmij, że 1 µg/mL białka uEV odpowiada 800 000 uEV/µL. Zapewnij obecność 500 000 uEV w 20 µL lodowato zimnego roztworu PBS.
  3. Oznacz probówki, jak wskazano w Tabeli 1.
    UWAGA: Liczba używanych probówek zależy od liczby stosowanych przeciwciał; ograniczeniem dla cytometru 2-laserowego/4-kolorowego jest maksymalnie 4 przeciwciała na probówkę, które mogą być użyte; w związku z tym można odczytać tylko kanały FL1, FL2, FL3 i FL4 w cytometrze, choć wymagana jest kompensacja. W tych procedurach użyj probówek mikrocentryfugowych o pojemności 1,5 mL lub probówek o pojemności 5 mL z zaokrąglonym dnem do cytometrii przepływowej. Potrzebne probówki przedstawiono w Tabeli 1. Probówki 4 i 5 zawierają koktajl wszystkich przeciwciał, które będą używane w tym protokole. Przykładowo podano dwie probówki problemowe (8 i 9); zatem ten zestaw kontroli musi zawierać kombinacje przeciwciał, które będą stosowane w każdej probówce.
Probówka 1.Kulki Megamix FSC
Probówka 2.PBS
Probówka 3.PBS z CFSE
Probówka 4.PBS ze wszystkimi przeciwciałami problemu 1
Probówka 5.PBS ze wszystkimi przeciwciałami problemu 2
Probówka 6.Kontrola autofluorescencjiuEV bez żadnego odczynnika, tylko w PBS.
Probówka 7.#uEVsuEV z CFSE
Probówka 8.Problem 1uEV z CD37 FITC, CD53 PE, ADAM10 APC
Probówka 9.Problem 2uEV z CD9 FITC, TSPAN33 APC

Tabela 1: Oznaczenie probówek. Przykład pokazujący sposób oznaczania probówek. Pierwsze probówki to wszystkie potrzebne kontrole. Probówki z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami będą zależeć od barwienia.

  1. Dodaj 20 µL roztworu PBS zawierającego 500 000 uEV do oznaczonych probówek.
  2. Dodaj przeciwciała zgodnie z informacjami podanymi w Tabeli 1, wcześniej wytyrowane. Inkubuj całą noc w 4 °C.
    UWAGA: Przed barwieniem zaleca się odwirowanie przeciwciał w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością przez co najmniej 5 min, aby zapobiec powstawaniu agregatów. Przeciwciała użyte w tym przypadku są przykładem białek obecnych w uEV i pochodzą z niezależnego manuskryptu aktualnie w przygotowaniu.
  3. Dodaj 0,4 µL estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) [5 nM] do probówki numer 3. Inkubuj przez 10 min w 37 °C.
    UWAGA: CFSE to barwnik służący do barwienia wszystkich EV obecnych w próbce, umożliwiający odróżnienie sygnału od tła podczas analizy cytomem metry przepływowej. Więcej informacji zawiera sekcja Dyskusja.
  4. Dodaj 400 µL lodowato zimnego buforu 1x PBS do wszystkich probówek.
  5. Przechowuj wszystkie probówki w temperaturze 4 °C.

3. Pozyskiwanie uEV za pomocą konwencjonalnego cytometru

UWAGA: Poniżej opisano instrukcje obsługi cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów).

  1. Przeprowadź kalibrację jakościową cytomierza za pomocą kulek 6- i 8-szczytowych.
    UWAGA: Wartość %CV ostatniego szczytu musi być mniejsza niż 6; kalibrację wykonuje technik cytomierza.
  2. Otwórz oprogramowanie cytomierza przepływowego.
    UWAGA: Po otwarciu oprogramowania otworzy się nowy eksperyment, wyświetlający ekran z szablonem dla 96 próbek, parametrami uruchomienia oraz pustym obszarem do tworzenia wykresów punktowych lub histogramów.
  3. Dostosuj parametry na ekranie uruchomionego oprogramowania: 100 µL próbki do zebrania, powolne przepływanie, ustaw próg na 10 000 dla FSC-H i 2 000 dla SSC-H.
    UWAGA: Zalecany próg jest przykładem; należy ustawić próg w zależności od analizowanych próbek.
  4. Umieść probówkę numer 1 (probówka Megamix), zgodnie z informacją w Tabela 1. Zebranie kulek. Utwórz dwa wykresy punktowe w pustym obszarze ekranu oprogramowania, klikając opcję Wykres punktowy. Utwórz jako panel A i B na Rysunek 3.
    UWAGA: Kulkę fluorescencyjne Megamix (kulkę służące do wyznaczenia rozmiarów 0,1, 0,3, 0,5 i 0,9 µm oraz stworzenia szablonu rozmiarów) można analizować za pomocą detektora FL1 (FITC). Wszystkie wykresy punktowe i histogramy należy wyświetlać w wartościach wysokości. Zarejestruj jak największą liczbę zdarzeń; żadna modyfikacja arkusza nie zmienia danych.

Diagram przepływowego cytometru; SSC-H vs. FITC/FSC-H, bramkowanie Megamix, rozkład rozmiarów cząstek.
Rycina 3: Wykresy punktowe kulek Megamix FSC. Wykresy punktowe zostały wygenerowane za pomocą oprogramowania cytometru przepływowego; na cytometrze przepływowym obraz będzie bardzo podobny. (A) Pierwszy wykres punktowy wygenerowany w celu wybrania kulek, unikając zakłóceń tła. (SSC-H vs. FL1-H). (B) Wykres punktowy wygenerowany po wybraniu poprzedniej bramki, pokazujący różne rozmiary kulek. (SSC-H vs. FSC-H). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. W sekcji „pusta” ekranu oprogramowania utwórz wykres punktowy i histogram dla każdego z użytych fluorochromów; jako przykład wykorzystaj algorytm przedstawiony na Suplementarnej Figurze 1. Aby to zrobić, kliknij opcję Wykres punktowy lub Histogram dla każdego fluorochromu.
    UWAGA: Zawsze będzie obecny szum tła, jak pokazano na Rysunku 3A. Wszystkie kropki pomiędzy 0 a 1000 na kanale FL1 (oś x) znajdują się poza utworzoną bramką. Dlatego konieczne jest użycie wszystkich próbek kontrolnych, aby uzyskać odpowiednie wyniki. Po załadowaniu każdej próbki przepłucz ciecz osłonową i wykonaj cykl odblokowania. Delikatnie wstrząśnij każdą próbką przed załadowaniem. Po załadowaniu pięciu kolejnych próbek uruchom 100 µL roztworu PBS 1x.
  2. Załaduj próbki numer 2 i 5, aby ustalić wartości progowe (ujemne). Aby to zrobić, wybierz ikonę Bramki prostokątnej (znajdującą się pod utworzonym wykresem punktowym) lub ikonę Bramki liniowej (znajdującą się pod utworzonym histogramem) i umieść ją tam, gdzie nie ma sygnału, aby uzyskać wykresy punktowe i histogramy podobne do tych pokazanych na Suplementarnej Figurze 1.
    UWAGA: W przypadku wszystkich tych próbek położenie regionu dodatniego nie powinno przekraczać 0,70%, ponieważ nie będzie „fluorescencji” powyżej 103 (1500). Jeśli występuje jakaś fluorescencja poza tym regionem, rozcieńcz używane odczynniki. Dlatego ważne jest, aby wyznaczyć tytrowanie odczynników przed ostatecznymi pomiarami.
  3. Załaduj próbkę numer 6 (próbkę autofluorescencji), aby ustalić regiony ujemne dla badanego materiału. Aby to zrobić, wybierz ikonę Bramki prostokątnej (znajdującą się pod utworzonym wykresem punktowym) lub ikonę Bramki liniowej (znajdującą się pod utworzonym histogramem) i umieść ją tam, gdzie nie ma sygnału.
  4. Załaduj kolejne próbki (próbki 7–9, przedstawione w Tabeli 1).
  5. Zapisz eksperyment.
    UWAGA: Dla używanego tutaj oprogramowania cytometru komendę Zapisz eksperyment należy rozumieć jako zapis wygenerowanych danych. Innymi słowy, wszystkie próbki pozyskane przez cytometr przepływowy oraz dane wygenerowane dla każdej próbki należy zapisać. Aby to zrobić, konieczne jest kliknięcie przycisku Zapisz eksperyment.
  6. Wyeksportuj dane jako pliki FSC.

4. Analiza danych za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej.

UWAGA: W tej sekcji opisano instrukcje obsługi oprogramowania cytometru przepływowego przedstawionego w tabeli materiałów. Rysunek 4 przedstawia obszar roboczy z krokami niezbędnymi do utworzenia bramek rozmiarowych.

Analiza danych z cytometrii przepływowej; interfejs oprogramowania; wykresy rozrzutu i histogramy; dostosowywanie parametrów.
Rysunek 4: Przestrzeń robocza ze wszystkimi krokami umożliwiającymi rozpoczęcie analizy danych. Wszystkie obrazy zostały wygenerowane poprzez drukowanie sitowe obszaru roboczego.A) Przestrzeń robocza wygenerowana z dodanymi danymi przykładowymi (po lewej), wykres punktowy wygenerowany po wybraniu probówki 1, kulek FSC (po prawej).B, C) pokazują modyfikację osi w celu uzyskania SSC-H i FSC-H. (D-F) pokazują krok po kroku dostosowanie obu osi. (G-I) pokazują wybór i generowanie różnych rozmiarów kulek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Otwórz oprogramowanie cytometru przepływowego. Dodaj próbki, klikając przycisk Dodaj próbki i wybierając wyeksportowane pliki FCS.
  2. Kliknij na rurkę Megamix, aby otworzyć wykres punktowy SSC-H (oś y) względem FSC-H (oś x). Dostosuj obie osie, aby wyświetlały zakres od 0 do 100 000, klikając przycisk T (Transform Data Display), następnie kliknij Dostosuj oś, wybierz SSC-H lub FSSC-H i zmień wartość skali na min. 0 i maks. 100 000 (patrz Rycina 4A-F).
  3. Ustaw bramki dla 0,1, 0,3, 0,5 i 0,9 µm na wykresie punktowym uzyskanym w kroku 4.2. Wybierz przycisk Bramka prostokątna, aby utworzyć bramkę, jak pokazano na Rycina 4G-I.
    UWAGA: Rycina 5 przedstawia obszar roboczy z krokami tworzenia dodatnich regionów oraz uzyskiwania średniej intensywności dla fluorochromu.

Analiza danych z cytometrii przepływowej, histogramy intensywności fluorescencji, interfejs oprogramowania, diagram.
Rysunek 5: Przestrzeń robocza do analizy uzyskanych danych. Wszystkie obrazy zostały wygenerowane przez zrzut ekranu przestrzeni roboczej. (A) Przestrzeń robocza wygenerowana z bramkowaniem rozmiaru zastosowanym do wszystkich próbek. (B) Wybrana probówka z autofluorescencją, wykres punktowy przedstawiający bramkowanie rozmiaru oraz histogram dla jednego wybranego rozmiaru (0,1 µm); histogram ten należy wykorzystać do określenia bramki pozytywnej dla każdego fluorochromu i rozmiaru. (C) Przestrzeń robocza wygenerowana z pozytywnymi bramkami dla każdego fluorochromu i rozmiaru. (D) Przestrzeń robocza (po lewej) i Edytor układu (po prawej) wygenerowane dla próbek. W Edytorze układu pokazano histogram dla probówki z autofluorescencją i probówki pozytywnej dla FL1-H oraz sposób uzyskania panelu właściwości do ich modyfikacji. (E) Obraz pokazuje, jak uzyskać wartość średniej intensywności fluorescencji. (F) Histogramy wygenerowane dla trzech różnych fluorochromów, pokazujące wszystkie zmiany, które oprogramowanie pozwala wprowadzić w informacji statystycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Zastosuj wygenerowane bramki (0,1, 0,3, 0,5 i 0,9 µm) do wszystkich próbek. Wybierz opcję Bramki, przeciągnij i upuść w opcji Wszystkie próbki, jak pokazano na Rysunek 5A.
  2. Kliknij na rurkę Autofluorescencja. Ustaw dodatnie obszary dla każdego fluorochromu, dla każdego rozmiaru. Otwórz wykres punktowy SSC-H względem FSC-H z bramkami rozmiaru, kliknij Pojedyncza bramka rozmiaru. W nowym oknie kliknij na oś y, aby wybrać opcję histogramu. Na osi x wybierz FL1-H, a następnie wybierz ikonę Zakres, aby utworzyć dodatni obszar. Powtórz czynność dla FL2-H i FL4-H (zobacz Rysunek 5B).
  3. Zastosuj bramki do wszystkich próbek. Wybierz Bramki, przeciągnij i upuść w opcji Wszystkie próbki, jak pokazano na Rysunek 5C.
  4. Otwórz Edytor układu.
  5. Przeciągnij i upuść każdą próbkę w edytorze. Wybierz rozmiar rurki „autofluorescencji”, przeciągnij i upuść, następnie wybierz ten sam rozmiar rurki barwionej, przeciągnij i upuść.
  6. Kliknij prawym przyciskiem myszy w prawym dolnym rogu histogramu. Otwórz menu Właściwości. Kliknij Legaenda. Dodaj średnią intensywność dla fluorochromu.
    UWAGA: W menu Właściwości dostępne są inne narzędzia do modyfikacji wyglądu histogramu.
  7. Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych fluorochromów i rozmiarów.

5. Analiza w celu uzyskania liczby uEV na próbkę.

UWAGA: Rycina 6 przedstawia obszar roboczy z krokami niezbędnymi do uzyskania liczby uEV na próbkę.

Analiza danych z cytometrii przepływowej; wykresy rozrzutu i tabela wyników; statystyki populacji komórkowych.
Rysunek 6: Przestrzeń robocza do analizy próbki CFSE. Wszystkie obrazy wygenerowano przez zrzut ekranu przestrzeni roboczej. (A) Przestrzeń robocza po wybraniu regionu wszystkich rozmiarów, całkowita liczba uEV (po lewej), wykres punktowy przedstawiający wybrane wrota (po prawej). (B) Wykres punktowy SSC-H względem FL1-H dla regionu ujemnego pod względem CFSE w próbce autofluorescencyjnej. (C) Wykres punktowy SSC-H względem FL1-H dla CFSE w próbce barwionej. (D) Obraz tabeli uzyskanej ze statystyk barwienia CFSE, pokazujący liczbę uEV w próbce. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Kliknij na Autofluorescencja rurka. Na wykresie punktowym SSC-H vs FSC-H z bramkami rozmiaru utwórz region obejmujący wszystkie rozmiary. Kliknij na Nowy region. Ustaw region dodatni (patrz Rycina 6A,B).
  2. Zastosuj bramki do wszystkich próbek. Wybierz bramki, przeciągnij i upuść w opcji Wszystkie próbki.
  3. Kliknij na CFSE + uEVs rurka. Otwórz nowy region i sprawdź region dodatni dla CFSE (FL1-H), jak pokazano na Rycina 6C.
  4. Na obszarze roboczym na Rycina 6D skopiuj dane dotyczące liczby komórek dla rurki. Ta liczba to liczba uEVs uzyskana metodą cytometrii przepływowej (#uEVs FC).
  5. Zastosuj poniższy wzór, aby obliczyć liczbę uEVs na mikrolitr:
    <wzór stężenia uEVs, równanie do obliczania mikropęcherzyków, metoda naukowa>
  6. Aby uzyskać liczbę uEVs na mikrolitr dla każdego fluorochromu (#uEVs/µL FLX), na obszarze roboczym skopiuj statystyki dla podzbioru FLX-H; ta liczba to procentowy udział podzbioru (%FLX subset).
  7. Zastosuj poniższy wzór, aby obliczyć liczbę uEVs na mikrolitr dla każdego fluorochromu.
    Wzór do kwantyfikacji mikropęcherzyków; równanie; oblicza #uEVs/μL FLX dla analizy %FLX subset.
    UWAGA: W zależności od tego, czy wybrana bramka dotyczy jednego rozmiaru, czy wszystkich uEVs, sprawdź wybrane dane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W protokole istnieje kilka punktów kontrolnych, w tym przed barwieniem uEVs. Dlatego niezbędne jest najpierw zweryfikowanie ilości białka obecnego w ekstrakcie uEVs. Wszystkie grupy badawcze pracujące z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi ilościowo określają zawartość białka, zgodnie z opisem w kroku 2.1. Rycina uzupełniająca 2 przedstawia reprezentatywną płytkę 96-dołkową zawierającą frakcję uEVs w dołkach 4E, 5E i 6E. Dołki 1A, 2A i 3A stanowią próbki kontrolne (blanki), jednak w przypadku braku oczyszczo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecnie zastosowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako biomarkerów wielu chorób wzrosło, zwłaszcza w przypadku tych, które można wyizolować z nieinwazyjnych źródeł, takich jak mocz 5,21,22,23,24. Udowodniono, że izolacja uEV jest niezbędnym źródłem informacji o stanie zdrowia osoby oraz diagnozie/rokowaniu pacjentów cierpiących na kilka chorób

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań finansowych lub handlowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z CONACyT (A3-S-36875) i programu UNAM-DGAPA-PAPIIT (IN213020 i IA202318). NH-I był wspierany przez stypendium 587790 z CONACyT.

Autorzy pragną podziękować Leopoldo Flores-Romo†, Vianneyowi Ortizowi-Navarrete, Antony'emu Boucardowi Jr i Dianie Gómez-Martin za ich cenne rady dotyczące realizacji tego protokołu, a także wszystkim zdrowym osobom za pobranie próbek moczu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało APC anty ludzkie CD156c (ADAM10)BioLegend352706Dodaj 5 &mikro; L do 20 i mikro; L uEV w PBS
APC przeciwciało przeciw TSPAN33 ludzkiej (BAAM)BioLegend395406Dodaj 5 i mikro; L do 20 i mikro; L uEVs w wirówce PBS
Avanti z wirnikiem o stałym kącie nachylenia JA-25.5OBeckamn CoulterJ-26S XPI
BD Accuri C6 Cytometr przepływowyBD Biosciences
β-merkaptoetanolSIGMA-AldrichM3148
Wirówka stołowa z wirnikiem A-4-44Eppendorf5804
BLUEstain 2 drabinka białkowaGOLDBIOP008
CD9 (C-4) mysie przeciwciało monoklonalneSanta Cruz Biotechnologysc-13118
CD63 (MX-49.129.5) mysie przeciwciało monoklonalneSanta Cruz Biotechnologysc-5275
Zestaw do proliferacji komórek CFSE do cytometrii przepływowejThermo ScientificC34554
System Chemidoc XRS+BIORAD5837
FITC anty ludzkie przeciwciało CD9BioLegend312104Dodaj 5 &mikro; L do 20 i mikro; L uEV w PBS
FITC anty ludzkim przeciwciałie CD37BioLegend356304Dodaj 5 i mikro; L do 20 i mikro; L z uEVs w PBS
Fluorescencyjne żółte cząstkiSpherotechFP-0252-2
Fluorescencyjne żółte cząstkiSpherotechFP-0552-2
Fluorescencyjne żółte cząstkiSpherotechFP-1552-2
FlowJo SoftwareBecton, Dickinson and Company
Goat anty-mysie immunoglobuliny/HRPDakoP0447
Koktajl inhibitorów proteazy HaltThermo Scientific78429
Membrana PVDF Immun-Blot 0,22&mikro; mKulki BIORAD1620177
Megamix-Plus FSC, COSMO BIO CO. LTD7802
Bufor do próbek NuPAGE LDS 4XThermo ScientificNP0007
Ultrawirówka Optima z wirnikiem 90Ti o stałym kącie 355530Beckamn CoulterXPN100
Page Niebieski roztwór do barwienia białekThermo Scientific24620
PE anty ludzkie przeciwciało CD53BioLegend325406Dodaj 5 &mikro; L do 20 i mikro; L z uEV w PBS
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białekThermo Scientific23227
Bufor Pierce RIPAThermo Scientific89900
Grubościenne probówki wirówkowe z poliwęglanuBeckamn Coulter355630
Kulki walidacyjne Spherotech 8-Peak (FL1-FL3)BD Accuri653144
Kulki walidacyjne Spherotech 6-Peak (FL4)BD Accuri653145
SacharozaSIGMA-Aldrich59378
TrietanoloaminaSIGMA-Aldrich90279

Bibliografia

  1. Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
  2. Nawaz, M., et al. The emerging role of extracellular vesicles as biomarkers for urogenital cancers. Nature Reviews Urology. 11 (12), 688-701 (2014).
  3. Pisitkun, T., Johnstone, R., Knepper, M. A. Discovery of urinary biomarkers. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1760-1771 (2006).
  4. Urinology Think Tank Writing Group. Urine: Waste product or biologically active tissue. Neurourology and Urodynamics. 37 (3), 1162-1168 (2018).
  5. Wang, S., Kojima, K., Mobley, J. A., West, A. B. Proteomic analysis of urinary extracellular vesicles reveal biomarkers for neurologic disease. EBioMedicine. 45, 351-361 (2019).
  6. Merchant, M. L., Rood, I. M., Deegens, J. K. J., Klein, J. B. Isolation and characterization of urinary extracellular vesicles: implications for biomarker discovery. International Urology and Nephrology. 13 (12), 731-749 (2017).
  7. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  8. Jing, H., et al. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367(2019).
  9. Liu, X., et al. Tubule-derived exosomes play a central role in fibroblast activation and kidney fibrosis. Kidney International. 97 (6), 1181-1195 (2020).
  10. Quaglia, M., et al. Extracellular Vesicles as Mediators of Cellular Crosstalk Between Immune System and Kidney Graft. Frontiers in Immunology. 11, 74(2020).
  11. Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Review of Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  12. Street, J. M., Koritzinsky, E. H., Glispie, D. M., Star, R. A., Yuen, P. S. Urine Exosomes: An Emerging Trove of Biomarkers. Advances in Clinical Chemistry. 78, 103-122 (2017).
  13. Thongboonkerd, V. Roles for Exosome in Various Kidney Diseases and Disorders. Frontiers in Pharmacology. 10, 1655(2019).
  14. Watanabe, Y., et al. Molecular Network Analysis of the Urinary Proteome of Alzheimer's Disease Patients. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders Extra. 9 (1), 53-65 (2019).
  15. Jadli, A. S., Ballasy, N., Edalat, P., Patel, V. B. Inside(sight) of tiny communicator: exosome biogenesis, secretion, and uptake. Molecular and Cellular Biochemistry. 467 (1-2), 77-94 (2020).
  16. Svenningsen, P., Sabaratnam, R., Jensen, B. L. Urinary extracellular vesicles: Origin, role as intercellular messengers and biomarkers; efficient sorting and potential treatment options. Acta Physiologica. 228 (1), 13346(2020).
  17. Witwer, K. W., Thery, C. Extracellular vesicles or exosomes? On primacy, precision, and popularity influencing a choice of nomenclature. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1648167(2019).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Perez-Hernandez, J., et al. Increased Urinary Exosomal MicroRNAs in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. PLoS One. 10 (9), 0138618(2015).
  20. Freyssinet, J. M., Toti, F. Membrane microparticle determination: at least seeing what's being sized. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 311-314 (2010).
  21. D'Anca, M., et al. Exosome Determinants of Physiological Aging and Age-Related Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, 232(2019).
  22. Lawson, C., Vicencio, J. M., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Microvesicles and exosomes: new players in metabolic and cardiovascular disease. Journal of Endocrinology. 228 (2), 57-71 (2016).
  23. Lee, S., Mankhong, S., Kang, J. H. Extracellular Vesicle as a Source of Alzheimer's Biomarkers: Opportunities and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).
  24. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
  25. Hoorn, E. J., et al. Prospects for urinary proteomics: exosomes as a source of urinary biomarkers. Nephrology (Carlton). 10 (3), 283-290 (2005).
  26. Ranghino, A., Dimuccio, V., Papadimitriou, E., Bussolati, B. Extracellular vesicles in the urine: markers and mediators of tissue damage and regeneration. Clinical Kidney Journal. 8 (1), 23-30 (2015).
  27. Zhang, W., et al. Extracellular vesicles in diagnosis and therapy of kidney diseases. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), 844-851 (2016).
  28. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney International. 77 (8), 736-742 (2010).
  29. Royo, F., et al. Different EV enrichment methods suitable for clinical settings yield different subpopulations of urinary extracellular vesicles from human samples. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 29497(2016).
  30. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978(2016).
  31. Lv, C. Y., et al. A PEG-based method for the isolation of urinary exosomes and its application in renal fibrosis diagnostics using cargo miR-29c and miR-21 analysis. International Urology and Nephrology. 50 (5), 973-982 (2018).
  32. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  33. Wang, D., Sun, W. Urinary extracellular microvesicles: isolation methods and prospects for urinary proteome. Proteomics. 14 (16), 1922-1932 (2014).
  34. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530(2015).
  35. van der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
  36. Huyan, T., Du, Y., Huang, Q., Huang, Q., Li, Q. Uptake Characterization of Tumor Cell-derived Exosomes by Natural Killer Cells. Iranian Journal of Public Health. 47 (6), 803-813 (2018).
  37. Puzar Dominkus, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
  38. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling Extracellular Vesicles for Nanoscale Flow Cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1878(2017).
  39. de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wyznaczanie wielko ci EVIzolacja EVDetekcja biomarker wKwantyfikacja EVKonwencjonalny cytometrChoroby nerekUszkodzenia m zgu
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły