Artykuł metodologiczny

Określanie wielkości i analiza fenotypowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/61695

⸱

23 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Red de Apoyo a la Investigación, Universidad Nacional Autónoma de México e Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, 2Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu, uEVs, od zdrowych ludzkich dawców i ich fenotypową charakterystykę na podstawie wielkości i ekspresji markera powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, EVs, to niejednorodny kompleks błon lipidowych, wydzielanych przez dowolny typ komórek, w dowolnym płynie, takim jak mocz. EV mogą mieć różne rozmiary, od 40-100 nm średnicy, np. w egzosomach, do 100-1000 nm w mikropęcherzykach. Mogą również zawierać różne cząsteczki, które mogą być wykorzystywane jako biomarkery do prognozowania i diagnozowania wielu chorób. Opracowano wiele technik charakteryzowania tych pęcherzyków. Jednym z nich jest cytometria przepływowa. Nie ma jednak istniejących raportów, które pokazywałyby, jak określić ilościowo stężenie EV i zróżnicować je według wielkości, wraz z wykrywaniem biomarkerów. Niniejsza praca ma na celu opisanie procedury izolacji, kwantyfikacji i fenotypyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu, uEV, przy użyciu konwencjonalnego cytometru do analizy bez żadnych modyfikacji jego konfiguracji. Ograniczenia metody obejmują barwienie maksymalnie czterech różnych biomarkerów na próbkę. Metoda jest również ograniczona ilością pojazdów elektrycznych dostępnych w próbie. Pomimo tych ograniczeń, dzięki temu protokołowi i jego późniejszej analizie możemy uzyskać więcej informacji na temat wzbogacenia markerów EVs i obfitości tych pęcherzyków obecnych w próbkach moczu, w chorobach związanych z uszkodzeniem nerek i mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U ssaków krew jest filtrowana przez nerki 250 - 300 razy; w tym czasie powstaje mocz. Produkcja tego biopłynu jest wynikiem szeregu procesów, w tym filtracji kłębuszkowej, reabsorpcji rurkowej i wydzielania. Produkty przemiany materii i elektrolity są głównymi składnikami moczu. Ponadto wydalane są inne produkty uboczne, takie jak peptydy, funkcjonalne białka i pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV)1,2,3,4,5,6. Początkowo pęcherzyki zewnątrzkomórkowe moczu (uEV) zidentyfikowano w próbkach moczu od pacjentów cierpiących na zaburzenia równowagi wodnej. U pacjentów tych wykazano obecność cząsteczek takich jak akwaporyna-2 (AQP2), która została następnie wykorzystana jako biomarker tej choroby7. Kilka kolejnych badań koncentrowało się na identyfikacji pochodzenia komórkowego uEV, opisując, że struktury te mogą być wydzielane przez komórki nerkowe (kłębuszki nerkowe, podocyty itp.) i inne typy komórek linii śródbłonka lub leukocytów. Co więcej, liczba i wzbogacenie cząsteczek w uEV mogą korelować ze statusem wielu chorób i zaburzeń8,9,10,11,12,13,14.

Razem, EV tworzą wysoce heterogeniczną rodzinę cząsteczek otoczonych dwuwarstwami lipidów i uwalnianych przez komórki poprzez mechanizmy pasywne lub aktywne do różnych płynów. W zależności od ich pochodzenia, EV można sklasyfikować jako egzosomy pochodzące z endosomów lub mikropęcherzyki/mikrocząstki pochodzące z błony plazmatycznej. Jednak to kryterium klasyfikacji może być stosowane tylko wtedy, gdy bezpośrednio obserwuje się biogenezę cząstek. W związku z tym inne nietrywialne kryteria, w tym pochodzenie fizyczne, biochemiczne i komórkowe, zostały zatwierdzone przez kilku badaczy w tej dziedzinie15,16,17. W zależności od charakteru analizowanego izolatu zaproponowano różne techniki analityczne do charakterystyki EVs. Na przykład, w oparciu o wzbogacenie dużych (≥100 nm) lub małych (≤100 nm) EV, sugeruje się kwantyfikację za pomocą cytometrii przepływowej lub śledzenia nanocząstek, odpowiednio18.

W dzisiejszych czasach wykorzystanie EV jako biomarkerów wielu chorób stało się istotne, dlatego badane są poszukiwanie różnych źródeł. Jednym z najbardziej obiecujących źródeł jest mocz, ponieważ można go uzyskać w łatwy i nieinwazyjny sposób. Dlatego protokół ten opisuje procedurę izolacji uEV przez wirowanie różnicowe, przetwarzanie przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem i dalszą analizę przy użyciu konwencjonalnego cytometru 2-laserowego/4-kolorowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki ludzkiego moczu zostały pobrane od zdrowych ochotników, którzy podpisali zgodę od dawcy. Procedury te zostały również zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Badań Naukowych Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán.

1. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w moczu

UWAGA: Protokół izolacji uEVs został zmodyfikowany z ref.19. Rysunek 1 przedstawia reprezentację protokołu do izolacji uEVs.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd izolacji uEVs do analizy cytometrii przepływowej. W tym protokole najpierw odwiruj pierwszy mocz w ciągu dnia, aby usunąć komórki i zanieczyszczenia. Następnie odwirować w celu usunięcia dużych pęcherzyków za pomocą obróbki w celu usunięcia białka THP, a na koniec przeprowadzić ultrawirowanie w celu wzbogacenia i uzyskania uEV za pomocą jednego płukania. Kroki mające na celu utrzymanie frakcji moczu do walidacji WB są oznaczone. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Używaj moczu pierwszego ranka (15 ml) od zdrowych ochotników. Odwirować mocz o stężeniu 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć wszystkie komórki i zanieczyszczenia.
    UWAGA: Preferencyjnie używaj świeżego moczu; jeśli nie jest to możliwe, należy użyć moczu przechowywanego maksymalnie przez okres 3 miesięcy w temperaturze -20 °C lub przechowywanego maksymalnie przez okres 6 miesięcy w temperaturze -70 °C. Próbkę moczu rozmrozić na lodzie i energicznie ją zawirować. Wszystkie procedury należy wykonywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Opcjonalnym krokiem do analizy Western blot jest wykonanie duplikatu probówki i podanie 200 μl moczu z pierwszego ranka w osobnej probówce. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C do momentu użycia, oznaczając ją jako "cały mocz", w celu sprawdzenia obecności markerów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
  2. Przenieść supernatant otrzymany w kroku 1.1 do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu o pojemności 8 ml i zakonserwować ją na lodzie.
    UWAGA: Opcjonalnie podwielokrotność 200 μl supernatantu otrzymanego w kroku 1.1 w oddzielnej probówce oznaczonej jako "mocz bez komórek" do analizy Western blot.
    1. Usuwanie białka Tamm-Horsfall, THP
      UWAGA: THP jest obecny w moczu i jest wzbogacany, gdy dana osoba ma chorobę nerek. Doniesiono, że THP zmniejsza wydajność uEV, ponieważ może wiązać się z uEV. Aby usunąć to białko, konieczne jest użycie środka redukującego3,6.
      1. Przygotować roztwór izolacyjny, mieszając 250 mM sacharozy z 10 mM trietanoloaminy. Dostosuj pH do 7,6.
      2. Otrzymany w kroku 1.2 wymieszać z 500 μl roztworu izolacyjnego, a następnie dodać 5 μl β-merkaptoetanolu.
      3. Inkubować mieszaninę osadów w temperaturze 37 °C przez 10 minut, wirując co 2 minuty. Dodać 500 μl roztworu izolacyjnego, a następnie odwirować przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Zebrać otrzymany supernatant (zawierający zredukowany-niezagregowany THP plus uEVs).
  3. Zmieszać oba zarezerwowane supernatanty (z etapów 1.2 i 1.2.1.3) w tej samej probówce do ultrawirowania z poliwęglanu o pojemności 8 ml, a następnie odwirować przy 160 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C, używając wirnika ultrawirówki o stałym kącie nachylenia.
    UWAGA: Opcjonalnie, w przypadku analizy Western blot, należy przechowywać 200 μl supernatantu otrzymanego powyżej, oznaczając go jako "supernatant bez EVs". Próbka ta posłuży jako kontrola negatywna podczas poszukiwania markerów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
  4. Odrzucić supernatant. Dodaj lodowaty 1x PBS do probówki z poliwęglanu o pojemności 8 ml i odwiruj przy 160 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Uważaj, aby nie wyrzucić granulki, ponieważ zawiera ona uEVs. 1x PBS musi być wysterylizowany i przefiltrowany za pomocą filtra strzykawkowego o porach co najmniej 0,22 μm.
  5. Odrzucić supernatant. Dodać resztę supernatantu do probówki z poliwęglanu o pojemności 8 ml i odwirować przy 160 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Wyrzuć supernatant i dodaj 8 ml lodowatego PBS do osadu, aby umyć uEV.
  7. Odrzucić supernatant. Pozostaw granulkę do wyschnięcia, a następnie ponownie zamieszaj ją z 1 ml lodowatego PBS. Przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu użycia.
    UWAGA: W przypadku wykonywania analizy Western blot należy ponownie zawiesić osad duplikatu probówki za pomocą 50 μl buforu RIPA oraz inhibitorów proteazy. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

2. Barwienie uEVs

UWAGA: Przed barwieniem i analizą uEVs, konieczne jest wykonanie przynajmniej jednej metodologii zalecanej przez MISEV201818, aby sprawdzić poprawność izolacji uEVs; tutaj przedstawiono analizę Western blot. Rysunek 2 pokazuje reprezentatywny protokół do barwienia uEVs.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Przegląd barwienia i wychwytywania uEV w cytometrze. (A) Reprezentacja barwienia uEV. W przypadku 500 000 uEV przeciwciało zmieszano i inkubowano w temperaturze 4 °C przez 12 godzin. Następnie dodano CFSE i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 10 minut. UEV miały w sobie CFSE, a przeciwciało zwiąże się z powierzchnią antygenu. 400 μl zimnego PBS użyto do ponownego zawieszenia i wychwycenia 100 μl próbki w cytometrze przepływowym z małą prędkością. (B) Strategia analizy. Pierwszy wykres punktowy (SSC-H VS FL-X) przedstawia kontrolę ujemną dla uEVs, następnie wykres kropkowy pokazujący uEVs barwienie CFSE, a na końcu histogram z barwieniem przeciwciał uEVs (linia), kontrola ujemna jest pokazana w szarej linii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Obliczyć względną liczbę uEV, określając ilościowo zawartość białka przy użyciu dowolnego konwencjonalnego kolorymetrycznego testu białkowego, jak wspomniano w tabeli materiałów. Wykonaj rozcieńczenie uEV w stosunku 1:5 i postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w karcie katalogowej dołączonej do zestawu białek do testu.
  2. Opierając się na wcześniej zgłoszonej formule20, należy przyjąć, że 1 μg/ml białka uEVs jest równe 800 000 uEVs/μL. Upewnij się, że 500 000 uEV jest obecnych w 20 μl lodowatego PBS.
  3. Oznacz probówki, jak wskazano w tabeli 1.
    UWAGA: Liczba użytych probówek będzie zależeć od liczby zastosowanych przeciwciał, ograniczenie dla cytometru 2-laserowego/4-kolorowego to maksymalnie 4 przeciwciała na probówkę, które można zastosować; w związku z tym można było odczytać tylko FL1, FL2, FL3 i FL4 w cytometrze, chociaż potrzebna jest kompensacja. Do tych procedur należy użyć probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml lub probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml do cytometrii przepływowej. Potrzebne rurki przedstawiono w tabeli 1. Probówki 4 i 5 składają się z koktajlu wszystkich przeciwciał, które mają być użyte w tym protokole. Jako przykład podano dwie rurki problemowe (8 i 9); W związku z tym ten zestaw elementów sterujących musi mieć kombinację, która ma być używana w każdej probówce.
Rura 1.Koraliki Megamix FSC
Rura 2.Pbs
Rura 3.PBS z CFSE
Rura 4.PBS ze wszystkimi przeciwciałami problemu 1
Rura 5.PBS ze wszystkimi przeciwciałami problemu 2
Rura 6.Kontrola autofluorescencjiuEVs bez żadnego odczynnika, tylko w PBS.
Rura 7.#uEVsPojazdy elektryczne z CFSE
Rura 8.Zadanie 1Pojazdy uEV z CD37 FITC, CD53 PE, ADAM10 APC
Rura 9.Zadanie 2Pojazdy uEV z CD9 FITC, TSPAN33 APC

Tabela 1: Etykietowanie rur. Przykład pokazujący, jak oznaczyć rurki. Pierwsze rurki to wszystkie potrzebne elementy sterujące. Probówki z przeciwciałami-fluorochromami będą zależeć od barwienia.

  1. Do oznakowanych probówek dodać 20 μl PBS zawierających 500 000 uEV.
  2. Dodać przeciwciała zgodnie ze wskazaniami w Tabeli 1, uprzednio dobrane miareczkowane. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przed barwieniem zaleca się odwirowanie przeciwciał w temperaturze 4 °C na pełnych obrotach przez co najmniej 5 minut, aby zapobiec tworzeniu się agregatów. Zastosowane tutaj przeciwciała są przykładem białek obecnych w uEV i należą do niezależnego manuskryptu, który jest obecnie w przygotowaniu.
  3. Dodać 0,4 μl estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE) [5 nM] do probówki nr 3. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: CFSE to barwnik używany do barwienia wszystkich EV obecnych w próbce i rozróżniania szumu tła podczas przeprowadzania analizy cytometrem przepływowym. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz sekcję Dyskusja.
  4. Dodaj 400 μl lodowatego 1x PBS do wszystkich probówek.
  5. Przechowywać wszystkie probówki w temperaturze 4 °C.

3. Akwizycja uEV za pomocą konwencjonalnego cytometru

UWAGA: Instrukcje dotyczące korzystania z cytometru przepływowego (patrz Tabela Materiałów) są opisane tutaj.

  1. Wykonaj kalibrację jakości cytometru za pomocą kulek 6- i 8-szczytowych.
    UWAGA: %CV ostatniego piku musi być wartością mniejszą niż 6; Technik cytometru zajmie się tym.
  2. Otwórz oprogramowanie cytometru przepływowego.
    UWAGA: Po otwarciu oprogramowania otworzy się nowy eksperyment, pokazujący badanie przesiewowe z szablonem dla 96 próbek, parametrami do uruchomienia i "pustą" sekcją do tworzenia wykresów kropkowych lub histogramów.
  3. Dostosuj parametry na ekranie uruchomionego oprogramowania: 100 μl próbki do przechwycenia, powolny bieg, ustaw próg na 10 000 na FSC-H i 2 000 na SSC-H.
    UWAGA: Zalecany tutaj próg jest przykładowy; Wymagane jest ustawienie progu na podstawie analizowanych próbek.
  4. Rurka obciążeniowa nr 1 (rura Megamix), jak wskazano w tabeli 1. Uchwyć koraliki. Utwórz dwa wykresy kropkowe w "pustej" części ekranu oprogramowania, klikając opcję Wykres punktowy. Utwórz jako panel A i B klasy Rysunek 3.
    UWAGA: Koraliki fluorescencyjne Megamix (koraliki używane do wyznaczania rozmiarów 0,1, 0,3, 0,5 i 0,9 μm oraz tworzenia szablonu dla rozmiarów) mogą być analizowane za pomocą detektora FL1 (FITC). Wszystkie wykresy punktowe i histogramy muszą być wyświetlane w wartościach wysokości. Rejestruj jak najwięcej zdarzeń; Wszelkie modyfikacje w arkuszu nie mają wpływu na dane.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Wykresy punktowe koralików Megamix FSC. Pokazane wykresy punktowe zostały wygenerowane za pomocą oprogramowania cytometru przepływowego; W cytometrze przepływowym obraz będzie bardzo podobny. (A) Pierwszy wykres punktowy wygenerowany w celu wybrania koralików, unikając szumu tła. (SSC-H VS FL1-H). (B) Wykres punktowy wygenerowany przez wybór poprzedniej bramki, pokazujący odmienne rozmiary koralików. (SSC-H KONTRA FSC-H). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. W "pustej" sekcji ekranu oprogramowania utwórz wykres punktowy i histogram dla każdego użytego fluorochromu; użyj algorytmu na rysunku uzupełniającym 1 jako przykładu. Aby to zrobić, kliknij opcję Wykres punktowy lub Histogram dla każdego fluorochromu.
    UWAGA: Szum tła będzie zawsze obecny, jak pokazano na Rysunek 3A. Wszystkie kropki z zakresu od 0 do 1,000 FL1 (oś x) znajdują się poza utworzoną bramką. Dlatego ważne jest, aby użyć wszystkich probówek kontrolnych, aby uzyskać odpowiednie wyniki. Pomiędzy każdym załadowaniem rurki przepłucz wstecznie płyn w osłonie i wykonaj cykl odblokowywania. Delikatnie potrząśnij każdą rurką przed załadowaniem. Po załadowaniu pięciu kolejnych probówek uruchom 100 μL PBS 1x.
  2. Załaduj rury nr 2 i 5, aby ustawić wartości odcięcia (ujemne). W tym celu należy wybrać ikonę Brama prostokątna (znajdująca się pod utworzonym wykresem kropkowym) lub ikonę Bramka liniowa (znajdująca się pod utworzonym histogramem); i umieścić go w miejscu, w którym nie ma sygnału, w celu uzyskania wykresów punktowych i histogramów, takich jak te pokazane na rysunku uzupełniającym 1.
    UWAGA: Wszystkie te lampy wymagają umieszczenia obszaru dodatniego nie dalej niż 0,70%, ponieważ "fluorescencja" nie będzie większa niż 103 (1,500). Jeśli fluorescencja występuje dalej niż ten obszar, należy rozcieńczyć użyte odczynniki. Dlatego ważne jest, aby przed pomiarami końcowymi określić miano odczynników.
  3. Załaduj rurkę nr 6 (rurkę autofluorescencyjną), aby ustawić obszary ujemne dla próbki. W tym celu należy wybrać ikonę Brama prostokątna (znajdująca się pod utworzonym wykresem kropkowym) lub ikonę Bramka liniowa (znajdująca się pod utworzonym histogramem); Umieść go w miejscu, w którym nie ma sygnału.
  4. Załaduj kolejne probówki (rurki od 7 do 9, przedstawione w Tabeli 1).
  5. Zapisz eksperyment.
    UWAGA: W przypadku użytego tutaj oprogramowania cytometru polecenie Zapisz eksperyment odnosi się do zapisania wygenerowanych danych. Innymi słowy, wszystkie probówki, które są rejestrowane przez cytometr przepływowy, oraz dane wygenerowane dla każdej probówki muszą zostać zapisane. Aby to zrobić, należy kliknąć przycisk Zapisz eksperyment.
  6. Eksport danych jako plików FSC.

4. Analiza danych za pomocą oprogramowania cytometru przepływowego.

UWAGA: Instrukcje dotyczące korzystania z oprogramowania cytometru przepływowego przedstawione w tabeli materiałów, są opisane w tej sekcji. Rysunek 4 pokazuje obszar roboczy wraz z krokami tworzenia bramek o określonym rozmiarze.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Obszar roboczy ze wszystkimi krokami umożliwiającymi rozpoczęcie analizy danych. Wszystkie obrazy zostały wygenerowane metodą sitodruku przestrzeni roboczej. (A) Obszar roboczy wygenerowany z dodanymi danymi próbki (po lewej), wykres punktowy wygenerowany przez wybór rurki 1, koraliki FSC, (po prawej). (B,C) pokazują modyfikację osi, tak aby miała SSC-H i FSC-H. (D-F) pokazują dostosowywanie krok po kroku obu osi. (G-I) pokazują wybór i generowanie różnych rozmiarów koralików. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Otwórz oprogramowanie cytometru przepływowego. Dodaj próbki, klikając przycisk Dodaj próbki i wybierz wyeksportowane pliki FCS.
  2. Kliknij rurkę Megamix, aby otworzyć wykres punktowy SSC-H (oś y) VS FSC-H (oś x). Dostosuj obie osie, aby wyświetlić od 0 do 100 000, klikając przycisk T (Transform Data Display), kliknij Dostosuj oś, kliknij SSC-H lub FSSC-H i zmień wartość skali na min 0 i max 100 000 (patrz Rysunek 4A-F).
  3. Ustaw bramki dla 0,1, 0,3, 0,5 i 0,9 μm na wykresie kropkowym wygenerowanym w kroku 4.2. Wybierz przycisk Bramka prostokątna, aby utworzyć bramę, jak pokazano w Rysunek 4G-I.
    UWAGA: Rysunek 5 pokazuje obszar roboczy wraz z krokami tworzenia obszarów dodatnich i uzyskiwania średniej intensywności dla fluorochromu.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Obszar roboczy do analizy uzyskanych danych. Wszystkie obrazy zostały wygenerowane przez sitodruk przestrzeni roboczej. (A) Przestrzeń robocza wygenerowana z bramką rozmiarów zastosowaną do wszystkich próbek. (B) Wybrano rurkę do autofluorescencji, wykres punktowy przedstawiający bramkę rozmiaru i histogram dla jednego wybranego rozmiaru (0,1 μm), użyj tego histogramu, aby uzyskać dodatnią bramkę dla każdego fluorochromu i rozmiaru. (C) Obszar roboczy wygenerowany z bramkami dodatnimi dla każdego fluorochromu i rozmiaru. (D) Obszar roboczy (po lewej) i Edytor układu (po prawej) wygenerowane dla próbek. W Edytorze układu pokazany jest histogram lampy autofluorescencyjnej i lampy dodatniej dla FL1-H oraz sposób uzyskania panelu właściwości, aby je zmodyfikować. (E) Obraz pokazuje, jak uzyskać średnią wartość fluorescencji. (F) Histogramy wygenerowane dla trzech różnych fluorochromów, pokazujące wszystkie zmiany, które oprogramowanie pozwala wprowadzić w informacjach statystycznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zastosować wygenerowane bramki (0,1, 0,3, 0,5 i 0,9 μm) do wszystkich próbek. Wybierz Gates, przeciągnij i upuść opcję All Samples, jak pokazano na Rysunek 5A.
  2. Kliknij rurkę do autofluorescencji. Ustaw obszary dodatnie dla każdego fluorochromu, dla każdego rozmiaru. Otwórz wykres punktowy SSC-H VS FSC-H z bramkami rozmiaru, kliknij Rozmiar pojedynczej bramki. W nowym oknie kliknij oś y, aby wybrać opcję histogramu. Na osi x wybierz FL1-H, a następnie wybierz ikonę Zakres, aby utworzyć region dodatni. Powtórz operację dla FL2-H i FL4-H (patrz Rysunek 5B).
  3. Zastosuj bramki do wszystkich próbek. Wybierz Gates, przeciągnij i upuść w opcji All Samples, jak pokazano w Rysunek 5C.
  4. Otwórz Edytor układu.
  5. Przeciągnij i upuść każdą próbkę w edytorze. Wybierz rozmiar rurki "autofluorescencji", przeciągnij i upuść, a następnie wybierz ten sam rozmiar poplamionej probówki, przeciągnij i upuść.
  6. Kliknij prawy dolny róg histogramu. Otwórz menu Właściwości. Kliknij Legenda. Dodać średnią intensywność dla fluorochromu.
    UWAGA: W oknie Właściwości dostępne są inne narzędzia do modyfikowania wyglądu histogramu.
  7. Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych fluorochromów i rozmiarów.

5. Analiza w celu uzyskania liczby uEV na próbkę.

UWAGA: Rysunek 6 pokazuje obszar roboczy z krokami, które należy wykonać, aby uzyskać liczbę uEV na próbkę.

figure-protocol-6
Rysunek 6: Obszar roboczy do analizy rurki CFSE. Wszystkie obrazy zostały wygenerowane metodą sitodruku przestrzeni roboczej. (A) Obszar roboczy wygenerowany przez wybór wszystkich rozmiarów regionu, suma uEVs (po lewej), wykres punktowy pokazujący wybraną bramę (po prawej). (B) Wykres punktowy SSC-H VS FL1-H dla ujemnego regionu CFSE w probówce autofluorescencyjnej. (C) Wykres punktowy SSC-H VS FL1-H dla CFSE w probówce do barwienia. (D) Obraz tabeli otrzymanej ze statystykami barwienia CFSE, pokazujący liczbę uEV w próbce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Kliknij rurkę do autofluorescencji. Na wykresie kropkowym SSC-H VS FSC-H z bramkami rozmiarów utwórz region zawierający wszystkie rozmiary. Kliknij Nowy region. Ustaw obszar dodatni (patrz Rysunek 6A,B).
  2. Zastosuj bramki do wszystkich próbek. Wybierz bramki, przeciągnij i upuść w opcji Wszystkie próbki.
  3. Kliknij rurkę CFSE + uEVs. Otwórz nowy region i sprawdź region dodatni dla CFSE (FL1-H), jak pokazano na Rysunek 6C.
  4. W obszarze roboczym w Rysunek 6D, skopiuj dane # komórek dla rury. Liczba ta jest #uEVs uzyskanym za pomocą cytometrii przepływowej (#uEVs FC).
  5. Zastosuj następujący wzór, aby obliczyć liczbę uEV na mikrolitr:
    figure-protocol-7
  6. Aby uzyskać #uEVs na mikrolitr dla każdego fluorochromu (#uEVs/μL FLX), w obszarze roboczym skopiuj statystyki dla podzbioru FLX-H, ta liczba jest procentem (podzbiór %FLX).
  7. Zastosuj następujący wzór, aby obliczyć liczbę uEV na mikrolitr dla każdego fluorochromu.
    figure-protocol-8
    UWAGA: W zależności od tego, czy wybrana bramka będzie dla jednego rozmiaru, czy dla wszystkich uEV, zweryfikuj wybrane dane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka punktów kontrolnych w protokole, a przed zabarwieniem uEVs. Dlatego ważne jest, aby najpierw zweryfikować ilość białka obecnego w ekstrakcie z uEVs. Wszystkie grupy badawcze, które pracują z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, określają ilościowo białko, jak wskazano w kroku 2.1. Rysunek uzupełniający 2 przedstawia reprezentatywną 96-dołkową płytkę zawierającą frakcję uEVs w studzienkach 4E, 5E i 6E. Studzienki 1A, 2A i 3A składają się z półfabrykatów, ale jeśli nie ma oczyszczonych uEV, stu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie zastosowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako biomarkerów wielu chorób wzrosło, zwłaszcza w przypadku tych, które można wyizolować z nieinwazyjnych źródeł, takich jak mocz 5,21,22,23,24. Udowodniono, że izolacja uEV jest niezbędnym źródłem informacji o stanie zdrowia osoby oraz diagnozie/rokowaniu pacjentów cierpiących na kilka chorób

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań finansowych lub handlowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z CONACyT (A3-S-36875) i programu UNAM-DGAPA-PAPIIT (IN213020 i IA202318). NH-I był wspierany przez stypendium 587790 z CONACyT.

Autorzy pragną podziękować Leopoldo Flores-Romo†, Vianneyowi Ortizowi-Navarrete, Antony'emu Boucardowi Jr i Dianie Gómez-Martin za ich cenne rady dotyczące realizacji tego protokołu, a także wszystkim zdrowym osobom za pobranie próbek moczu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało APC anty ludzkie CD156c (ADAM10)BioLegend352706Dodaj 5 &mikro; L do 20 i mikro; L uEV w PBS
APC przeciwciało przeciw TSPAN33 ludzkiej (BAAM)BioLegend395406Dodaj 5 i mikro; L do 20 i mikro; L uEVs w wirówce PBS
Avanti z wirnikiem o stałym kącie nachylenia JA-25.5OBeckamn CoulterJ-26S XPI
BD Accuri C6 Cytometr przepływowyBD Biosciences
β-merkaptoetanolSIGMA-AldrichM3148
Wirówka stołowa z wirnikiem A-4-44Eppendorf5804
BLUEstain 2 drabinka białkowaGOLDBIOP008
CD9 (C-4) mysie przeciwciało monoklonalneSanta Cruz Biotechnologysc-13118
CD63 (MX-49.129.5) mysie przeciwciało monoklonalneSanta Cruz Biotechnologysc-5275
Zestaw do proliferacji komórek CFSE do cytometrii przepływowejThermo ScientificC34554
System Chemidoc XRS+BIORAD5837
FITC anty ludzkie przeciwciało CD9BioLegend312104Dodaj 5 &mikro; L do 20 i mikro; L uEV w PBS
FITC anty ludzkim przeciwciałie CD37BioLegend356304Dodaj 5 i mikro; L do 20 i mikro; L z uEVs w PBS
Fluorescencyjne żółte cząstkiSpherotechFP-0252-2
Fluorescencyjne żółte cząstkiSpherotechFP-0552-2
Fluorescencyjne żółte cząstkiSpherotechFP-1552-2
FlowJo SoftwareBecton, Dickinson and Company
Goat anty-mysie immunoglobuliny/HRPDakoP0447
Koktajl inhibitorów proteazy HaltThermo Scientific78429
Membrana PVDF Immun-Blot 0,22&mikro; mKulki BIORAD1620177
Megamix-Plus FSC, COSMO BIO CO. LTD7802
Bufor do próbek NuPAGE LDS 4XThermo ScientificNP0007
Ultrawirówka Optima z wirnikiem 90Ti o stałym kącie 355530Beckamn CoulterXPN100
Page Niebieski roztwór do barwienia białekThermo Scientific24620
PE anty ludzkie przeciwciało CD53BioLegend325406Dodaj 5 &mikro; L do 20 i mikro; L z uEV w PBS
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białekThermo Scientific23227
Bufor Pierce RIPAThermo Scientific89900
Grubościenne probówki wirówkowe z poliwęglanuBeckamn Coulter355630
Kulki walidacyjne Spherotech 8-Peak (FL1-FL3)BD Accuri653144
Kulki walidacyjne Spherotech 6-Peak (FL4)BD Accuri653145
SacharozaSIGMA-Aldrich59378
TrietanoloaminaSIGMA-Aldrich90279

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
  2. Nawaz, M., et al. The emerging role of extracellular vesicles as biomarkers for urogenital cancers. Nature Reviews Urology. 11 (12), 688-701 (2014).
  3. Pisitkun, T., Johnstone, R., Knepper, M. A. Discovery of urinary biomarkers. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1760-1771 (2006).
  4. Urinology Think Tank Writing Group. Urine: Waste product or biologically active tissue. Neurourology and Urodynamics. 37 (3), 1162-1168 (2018).
  5. Wang, S., Kojima, K., Mobley, J. A., West, A. B. Proteomic analysis of urinary extracellular vesicles reveal biomarkers for neurologic disease. EBioMedicine. 45, 351-361 (2019).
  6. Merchant, M. L., Rood, I. M., Deegens, J. K. J., Klein, J. B. Isolation and characterization of urinary extracellular vesicles: implications for biomarker discovery. International Urology and Nephrology. 13 (12), 731-749 (2017).
  7. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  8. Jing, H., et al. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367(2019).
  9. Liu, X., et al. Tubule-derived exosomes play a central role in fibroblast activation and kidney fibrosis. Kidney International. 97 (6), 1181-1195 (2020).
  10. Quaglia, M., et al. Extracellular Vesicles as Mediators of Cellular Crosstalk Between Immune System and Kidney Graft. Frontiers in Immunology. 11, 74(2020).
  11. Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Review of Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  12. Street, J. M., Koritzinsky, E. H., Glispie, D. M., Star, R. A., Yuen, P. S. Urine Exosomes: An Emerging Trove of Biomarkers. Advances in Clinical Chemistry. 78, 103-122 (2017).
  13. Thongboonkerd, V. Roles for Exosome in Various Kidney Diseases and Disorders. Frontiers in Pharmacology. 10, 1655(2019).
  14. Watanabe, Y., et al. Molecular Network Analysis of the Urinary Proteome of Alzheimer's Disease Patients. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders Extra. 9 (1), 53-65 (2019).
  15. Jadli, A. S., Ballasy, N., Edalat, P., Patel, V. B. Inside(sight) of tiny communicator: exosome biogenesis, secretion, and uptake. Molecular and Cellular Biochemistry. 467 (1-2), 77-94 (2020).
  16. Svenningsen, P., Sabaratnam, R., Jensen, B. L. Urinary extracellular vesicles: Origin, role as intercellular messengers and biomarkers; efficient sorting and potential treatment options. Acta Physiologica. 228 (1), 13346(2020).
  17. Witwer, K. W., Thery, C. Extracellular vesicles or exosomes? On primacy, precision, and popularity influencing a choice of nomenclature. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1648167(2019).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Perez-Hernandez, J., et al. Increased Urinary Exosomal MicroRNAs in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. PLoS One. 10 (9), 0138618(2015).
  20. Freyssinet, J. M., Toti, F. Membrane microparticle determination: at least seeing what's being sized. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 311-314 (2010).
  21. D'Anca, M., et al. Exosome Determinants of Physiological Aging and Age-Related Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, 232(2019).
  22. Lawson, C., Vicencio, J. M., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Microvesicles and exosomes: new players in metabolic and cardiovascular disease. Journal of Endocrinology. 228 (2), 57-71 (2016).
  23. Lee, S., Mankhong, S., Kang, J. H. Extracellular Vesicle as a Source of Alzheimer's Biomarkers: Opportunities and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).
  24. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
  25. Hoorn, E. J., et al. Prospects for urinary proteomics: exosomes as a source of urinary biomarkers. Nephrology (Carlton). 10 (3), 283-290 (2005).
  26. Ranghino, A., Dimuccio, V., Papadimitriou, E., Bussolati, B. Extracellular vesicles in the urine: markers and mediators of tissue damage and regeneration. Clinical Kidney Journal. 8 (1), 23-30 (2015).
  27. Zhang, W., et al. Extracellular vesicles in diagnosis and therapy of kidney diseases. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), 844-851 (2016).
  28. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney International. 77 (8), 736-742 (2010).
  29. Royo, F., et al. Different EV enrichment methods suitable for clinical settings yield different subpopulations of urinary extracellular vesicles from human samples. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 29497(2016).
  30. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978(2016).
  31. Lv, C. Y., et al. A PEG-based method for the isolation of urinary exosomes and its application in renal fibrosis diagnostics using cargo miR-29c and miR-21 analysis. International Urology and Nephrology. 50 (5), 973-982 (2018).
  32. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  33. Wang, D., Sun, W. Urinary extracellular microvesicles: isolation methods and prospects for urinary proteome. Proteomics. 14 (16), 1922-1932 (2014).
  34. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530(2015).
  35. van der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
  36. Huyan, T., Du, Y., Huang, Q., Huang, Q., Li, Q. Uptake Characterization of Tumor Cell-derived Exosomes by Natural Killer Cells. Iranian Journal of Public Health. 47 (6), 803-813 (2018).
  37. Puzar Dominkus, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
  38. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling Extracellular Vesicles for Nanoscale Flow Cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1878(2017).
  39. de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Urinary Extracellular VesiclesFlow CytometryEV Size DeterminationPhenotypic AnalysisEV IsolationBiomarker DetectionEV QuantificationConventional CytometerKidney DiseaseBrain Damage
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły