Method Article

Ekotoksykologiczny wpływ mikrodrobin plastiku na rozwój zarodków ptaków poprzez wylęg bez skorupki jaja

DOI:

10.3791/61696

⸱

August 14th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Xinjiang Key Laboratory of Environmental Pollution and Bioremediation, Xinjiang Institute of Ecology and Geography, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Key Laboratory of Microbial Technology for Industrial Pollution Control of Zhejiang Province, College of Environment, Zhejiang University of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia metodę wylęgu bez użycia skorupki jajka do badań toksykologicznych zanieczyszczeń cząstkowych, takich jak mikroplastik.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroplastik to nowy globalny rodzaj zanieczyszczeń, który stanowi wielkie zagrożenie dla zdrowia zwierząt ze względu na ich pobieranie i translokację w tkankach i organach zwierzęcych. Wpływ ekotoksykologiczny mikrodrobin plastiku na rozwój zarodków ptaków nie jest znany. Ptasie jajo jest kompletnym systemem rozwoju i odżywiania, a cały rozwój zarodka zachodzi w skorupce jaja. W związku z tym bezpośredni zapis rozwoju zarodków ptaków pod wpływem zanieczyszczeń, takich jak mikrodrobiny plastiku, jest wysoce ograniczony przez nieprzezroczystą skorupkę jaja w tradycyjnym wylęgu. W tym badaniu wpływ mikrodrobin plastiku na rozwój zarodków przepiórek był wizualnie monitorowany poprzez wylęganie się bez skorupki jaja. Główne etapy obejmują czyszczenie i dezynfekcję zapłodnionych jaj, inkubację przed ekspozycją, krótkotrwałą inkubację po ekspozycji oraz ekstrakcję próbki. Wyniki pokazują, że w porównaniu z grupą kontrolną, mokra masa ciała i długość ciała grupy narażonej na mikrodrobiny plastiku wykazywały różnicę statystyczną, a udział wątroby w całej grupie narażonej znacznie wzrósł. Dodatkowo oceniliśmy czynniki zewnętrzne, które wpływają na inkubację: temperaturę, wilgotność, kąt rotacji jaj i inne warunki. Ta eksperymentalna metoda dostarcza cennych informacji na temat ekotoksykologii mikrodrobin plastiku oraz nowego sposobu badania niekorzystnego wpływu zanieczyszczeń na rozwój zarodków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja odpadów z tworzyw sztucznych wyniosła około 6300 Mt w 2015 roku, z czego jedna dziesiąta została poddana recyklingowi, a reszta została spalona lub zakopana pod ziemią. Szacuje się, że do 2050 roku około 12 000 Mt odpadów z tworzyw sztucznych zostanie zakopanych pod ziemią1. Zwracając uwagę społeczności międzynarodowej na odpady z tworzyw sztucznych, Thompson po raz pierwszy zaproponował koncepcję mikroplastiku w 2004 roku2. Mikrodrobiny plastiku (MP) odnoszą się do małych cząstek tworzyw sztucznych o średnicy cząstek mniejszej niż 5 mm. Obecnie badacze wykryli wszechobecną obecność MP na wybrzeżach różnych kontynentów, wyspach Atlantyku, jeziorach śródlądowych, Arktyce i siedliskach głębinowych3,4,5,6,7. W związku z tym coraz więcej badaczy zaczęło badać zagrożenia środowiskowe związane z MP.

Organizmy mogą połykać MP w środowisku. MP znaleziono w przewodzie pokarmowym 233 organizmów morskich na całym świecie (w tym 100% gatunków żółwi, 36% gatunków fok, 59% gatunków wielorybów, 59% gatunków ptaków morskich, 92 rodzajów ryb morskich i 6 rodzajów bezkręgowców)8. Co więcej, posłowie mogą blokować układ trawienny organizmów, gromadzić się i migrować w ich bobies9. Stwierdzono, że MP mogą być przenoszone przez łańcuch pokarmowy, a ich spożycie różni się w zależności od zmian siedliska, etapu wzrostu, nawyków żywieniowych i źródeł pożywienia10. Niektórzy badacze donieśli o istnieniu MP w odchodach ptaków morskich11, co oznacza, że ptaki morskie działają jako nosiciele MP. Ponadto spożycie MP może wpływać na zdrowie niektórych organizmów. Na przykład, MP mogą być zaplątane w przewodzie pokarmowym, zwiększając w ten sposób śmiertelność waleni12.

Same MP mają toksyczne działanie na organizmy, jak również wspólne działanie toksyczne na organizmy z innymi zanieczyszczeniami. Połknięcie stężeń plastikowych zanieczyszczeń związanych ze środowiskiem może zakłócić funkcjonowanie układu hormonalnego dorosłych ryb13. Wielkość mikrodrobin plastiku jest jednym z ważnych czynników wpływających na ich pobieranie i akumulację przez organizmy14,15. Tworzywa sztuczne o małych rozmiarach, zwłaszcza tworzywa sztuczne o rozmiarach nano, są podatne na interakcje z komórkami i organizmami o wysokiej toksyczności16,17,18,19. Chociaż szkodliwy wpływ mikrodrobin plastiku o rozmiarach nanocząstek na organizmy przekracza obecny poziom badań, wykrywanie i ilościowe oznaczanie mikrodrobin plastiku o rozmiarach mniejszych niż kilka mikrometrów, zwłaszcza submikronowych/nanodrobin plastiku w środowisku, jest nadal dużym wyzwaniem. Ponadto nanotworzywa sztuczne mają również pewien wpływ na zarodki. Polistyren może szkodzić rozwojowi zarodków jeżowców poprzez regulację profili białkowych i genowych20.

Aby zbadać potencjalny wpływ MP na organizmy, przeprowadziliśmy to badanie. Ze względu na podobieństwo między embrionami ptaków i ludzkimi, są one zwykle wykorzystywane w badaniach nad biologią rozwojową21, w tym angiogenezie i antyangiogenezie, inżynierii tkankowej, implantach biomateriałowych i nowotworach mózgu22,23,24. Zarodki ptaków mają zalety niskiego kosztu, krótkiego cyklu hodowli i łatwej obsługi25,26. Dlatego wybraliśmy zarodki przepiórcze o krótkim cyklu wzrostu jako zwierzę doświadczalne w tym badaniu. Jednocześnie możemy bezpośrednio obserwować zmiany morfologiczne zarodków przepiórek wystawionych na działanie MP w fazie rozwoju embrionalnego przy użyciu technologii wylęgu bez skorupek jaj. Użytymi materiałami doświadczalnymi były polipropylen (PP) i polistyren (PS). Ponieważ PP i PS27 stanowią największą część typów polimerów uzyskiwanych w osadach i zbiornikach wodnych na całym świecie, najczęstszymi typami polimerów ekstrahowanymi z pochwyconych organizmów morskich są etylen i propylen28. Ten protokół eksperymentalny opisuje cały proces wizualnej oceny skutków toksykologicznych MP na zarodki przepiórek narażonych na działanie MP. Możemy łatwo rozszerzyć tę metodę, aby zbadać toksyczność innych zanieczyszczeń dla rozwoju zarodkowego innych zwierząt jajorodnych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie przed ekspozycją

  1. Do badania narażenia wybrać zapłodnione jaja przepiórcze urodzone tego samego dnia.
  2. Wybierz jaja przepiórcze o podobnej wadze. Każde zapłodnione jajo przepiórcze to około 10-12 g.
  3. Całkowicie oczyść wszystkie zapłodnione jaja przepiórcze z zewnętrznego kału i innych zanieczyszczeń.
  4. Wysterylizuj każde wstępnie wyklute zapłodnione jajo przepiórcze i jaja, które mają być użyte (wybierz jaja o podobnym kształcie skorupy, zwłaszcza końcówkę jaja) roztworem antybiotyku (penicylina i streptomycyna, 1:1000, temperatura pokojowa). Wysterylizuj inkubator 75% etanolem.
  5. Otwórz jajka końcem wiertła dentystycznego, pozostawiając skorupkę jajka na końcu do dalszego użycia. Przed przeniesieniem zapłodnionych jaj wylewa się zawartość jaj. Ma to na celu utrzymanie wilgotności skorupki jajka. Średnica otworu jajka wynosiła około 3 cm.
    UWAGA: Aby zmniejszyć uszkodzenie zarodka przepiórki, użyj wiertła dentystycznego, aby otworzyć koniec jaja i sprawić, by pęknięcie było tak gładkie, jak to możliwe.
  6. Po sterylizacji umieść zapłodnione jaja przepiórcze w inkubatorze o temperaturze 38 °C i wilgotności 60% na 24-48 godzin. Upewnij się, że koniec jaja przepiórczego jest skierowany do góry.
  7. Podczas inkubacji zapłodnionych jaj przepiórczych wysterylizuj narzędzia potrzebne w kolejnych eksperymentach w doniczce do sterylizacji. Narzędzia te obejmują folię plastikową, zlewkę, sterylną wodę, końcówki do pipet, proste nożyczki chirurgiczne, pęsetę i łyżkę.
    UWAGA: Używaj folii o wystarczająco wysokiej tolerancji temperatury, aby uniknąć problemów ze sterylizacją w wysokiej temperaturze.

2. Wykluwanie jaja przepiórczego bez skorupki

  1. Przenieś wstępnie wyklute zapłodnione jaja przepiórcze z inkubatora na czystą ławkę i połóż je płasko na pojemniku, aby je ustabilizować na około 1-2 minuty.
  2. Za pomocą nożyczek (proste nożyczki chirurgiczne 12,5 cm) wybij mały otwór (średnica 3 mm) w środkowej osi wyklutych zapłodnionych jaj przepiórczych i wytnij mały otwór o średnicy 1-2 cm. Ostrożnie przenieś białko i żółtko zapłodnionych jaj przepiórczych do pokrojonej skorupki jajka.
    UWAGA: Podczas wycinania małego otworu nożyczkami należy unikać dotykania żółtka jaj przepiórczych.
  3. Dodać roztwór kontrolny (bez MPs) i odsłonięty roztwór o różnej masie (0,1, 0,2 i 0,3 mg) mikrodrobin plastiku o trzech wielkościach cząstek (100, 200 i 500 nm) do zawartości jaj za pomocą pipety. W tym samym czasie dodaj 1 kroplę penicyliny i 1 kroplę streptomycyny za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
  4. Przykryj otwór skorupki jajka wysterylizowaną folią (krok 1.6).
  5. Zgodnie z krokami 2.1-2.4 potraktuj wszystkie zapłodnione jaja przepiórcze.
  6. Przeniesione zarodki przepiórcze należy umieścić w inkubatorze o temperaturze 38 °C o wilgotności 60% na niezbędny okres. W tym eksperymencie użyj kąta obrotu jajka ±30°. Obracaj jajka raz na godzinę.
    UWAGA: Transfer powinien być jak najszybszy, co wymaga większej wprawy na wczesnym etapie.

3. Pobieranie próbek

  1. Po siedmiu dniach hodowli należy usunąć z żółtka dobrze rozwinięte zarodki obserwowane gołym okiem i przemyć roztworem buforowym fosforanu (PBS).
  2. Wysuszyć nadmiar roztworu na zewnątrz oczyszczonego zarodka papierem absorpcyjnym i zważyć na czystej szalce Petriego.
  3. Otwórz całą jamę klatki piersiowej, oddziel wątrobę i serce od wnętrzności za pomocą szczypiec z igłami i umieść w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml natychmiast po oczyszczeniu.
  4. Szybko zapisz wagę na wadze elektronicznej i oblicz wskaźnik hepatosomatyczny (HIS = masa wątroby / masa ciała x 100). Zmierz długość mostka i tułowia.
  5. Na podstawie powyższych wskaźników oceń wpływ MP na rozwój embrionalny.
    UWAGA: Jakość zarodka odnosi się tutaj do jakości usuwania żółtka.

4. Analiza danych

  1. Przedstawić dane doświadczalne w postaci średniego błędu standardowego ± (SEM).
  2. Użyj jednoczynnikowej analizy wariancji, aby porównać średnie z wielu grup prób. Istotna wartość różnicy wyniosła α = 0,05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla analizy danych eksperymentalnych porównaliśmy mokrą masę, długość ciała, długość mostka i zmianę indeksu hepatosomatycznego między grupą kontrolną a 6 grupami eksperymentalnymi, mierząc i odzwierciedlając wzrost i rozwój zarodków przepiórek z perspektywy makro. W każdej grupie wykryliśmy sześć normalnych zarodków przepiórek. Każdy zarodek osiągnął wymagane stadium hamburgera i Hamiltona (HH).

W Rysunek 1, przenieśliśmy wstępnie wyklutą zawartość zapłodnionych ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono skuteczny schemat eksperymentalny do oceny rozwoju zarodków przepiórek poprzez wykrycie podstawowych wskaźników rozwoju. Jednak nadal istnieją pewne ograniczenia tego eksperymentu.

Po pierwsze, śmiertelność zarodków przepiórczych w późniejszym etapie wylęgu jest wyższa z powodu wylęgu bez skorupy. Istnieją sztucznie niekontrolowane czynniki, takie jak zniszczenie normalnego stosunku białka w procesie eksperymentalnym. Ograniczyliśmy czas ekspozycji embrionów, aby zape...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Wszyscy autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę nad tym artykułem.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez kluczowe projekty badawczo-rozwojowe w Regionie Autonomicznym Sinciang-Ujgur (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Młynek do tkanek z wieloma próbkamiShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.Tissuelyser-24Miel duże tworzywa sztuczne na małe w niskiej temperaturze
Waga elektronicznaOHAUS corporationPR PrecyzjaSłuży do ważenia
Zapłodnionych jaj przepiórczychGuangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd.Jaja przepiórcze do wylęgu bez skorupy
Fluorescencyjne cząstki polipropylenuFoshan Juliang Optical Material Co., Ltd.Rodzaje tworzyw sztucznych wybranych do eksperymentu
InkubatorShandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd.264 sztZapewnij miejsce do wzrostu i rozwoju zarodka
Mikrosfery polistyrenowe w skali nanometrowejXi' Ruixi Biological Technology Co., Ltd.100 nm, 200 nm, 500 nmRodzaje tworzyw sztucznych wybranych do eksperymentu
Linijka stalowaDeli Group20 cmSłuży do pomiaru  długości
Pionowy ciśnieniowy sterylizator parowy do ogrzewaniaFabryka instrumentów medycznych Shenan w SzanghajuLDZM-80KCS-IISterylizuj artykuły eksperymentalne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5(2017).
  2. Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
  3. Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
  4. Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
  5. Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
  6. Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
  7. Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R. Microplastic pollution in deep-sea sediments. Environmental Pollution. 182, 495-499 (2013).
  8. Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
  9. Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
  10. Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
  11. Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
  12. Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
  13. Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
  14. Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7(2017).
  15. Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
  16. Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
  17. Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13(2012).
  18. Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
  19. Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
  20. Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
  21. El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
  22. Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
  23. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  24. Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
  25. Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
  26. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  27. Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
  28. Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microplastics EcotoxicologyBird Embryo DevelopmentHatching Without EggshellQuail Embryo ExposureEggshell Removal TechniqueIncubation Process MonitoringSample Extraction MethodTemperature Humidity ControlLiver Proportion AnalysisWet Weight Measurement

Related Articles