Artykuł metodologiczny

Ocena regionalnego osadzania się płuc przy użyciu specyficznych dla pacjenta modeli płuc drukowanych w 3D

DOI:

10.3791/61706

⸱

11 listopada 2020

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy wysokoprzepustową metodę in vitro do ilościowego określania regionalnego osadzania się płuc na poziomie płata za pomocą tomografii komputerowej, wydrukowanych w 3D modeli płuc z regulowanymi profilami przepływu powietrza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój terapii celowanych w chorobach płuc jest ograniczony przez dostępność metod badań przedklinicznych z możliwością przewidywania regionalnego dostarczania aerozoli. Wykorzystując druk 3D do generowania modeli płuc specyficznych dla pacjenta, nakreślamy projekt wysokoprzepustowej konfiguracji eksperymentalnej in vitro do ilościowego oznaczania zrazikowego osadzania się płuc. System ten jest wykonany z połączenia dostępnych na rynku i drukowanych w 3D komponentów i umożliwia niezależną kontrolę natężenia przepływu przez każdy płat płuca. Dostarczanie aerozoli fluorescencyjnych do każdego płata mierzy się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten ma potencjał, aby promować rozwój medycyny spersonalizowanej w chorobach układu oddechowego dzięki swojej zdolności do modelowania szerokiego zakresu danych demograficznych pacjentów i stanów chorobowych. Zarówno geometrię wydrukowanego w 3D modelu płuc, jak i ustawienie profilu przepływu powietrza można łatwo modulować, aby odzwierciedlić dane kliniczne dla pacjentów w różnym wieku, rasie i płci. Klinicznie istotne urządzenia do dostarczania leków, takie jak rurka dotchawicza, mogą być włączone do zestawu testowego, aby dokładniej przewidzieć zdolność urządzenia do ukierunkowanego dostarczania terapeutycznego do chorego obszaru płuc. Wszechstronność tej eksperymentalnej konfiguracji pozwala na dostosowanie jej do wielu warunków inhalacji, zwiększając rygor przedklinicznych testów terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele chorób płuc, takich jak rak płuc i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), wykazuje regionalne różnice w charakterystyce choroby; jednak brakuje dostępnych technik terapeutycznych, które pozwoliłyby na dostarczanie leków tylko do chorych regionów płuc1. Wiele modeli obliczeniowej dynamiki płynów (CFD) wykazało, że możliwe jest modulowanie profili osadzania się leków poprzez identyfikację określonych linii przepływu w płucach2,3. W naszym laboratorium trwają prace nad inhalatorami i adapterami do rurki dotchawiczej (ET) z możliwością kierowania na regiony, aby kontrolować dystrybucję aerozolu do chorych obszarów płuc. Rozszerzenie tych zasad na zastosowanie kliniczne jest ograniczone przez obecne możliwości badań przedklinicznych. Wiadomo, że dokładna lokalizacja złogów leku w płucach jest najlepszym predyktorem skuteczności; Jednak obecne oceny farmaceutyczne leków wziewnych są najczęściej przewidywane przy użyciu korelacji wielkości cząstek in vitro-in vivo, aby jedynie przybliżyć depozycję4. Technika ta nie pozwala na żadną analizę przestrzenną w celu określenia wpływu różnych geometrii dróg oddechowych na dystrybucję regionalną w różnych płatach płuc. Ponadto w testach tych brakuje anatomicznie dokładnych geometrii płuc, które, jak wykazali naukowcy, mogą mieć znaczący wpływ na profile osadzania5. Podjęto pewne wysiłki w celu włączenia geometrii płuc specyficznej dla pacjenta do protokołów badań poprzez dodanie górnych dróg oddechowych; Jednak większość z tych podejść polega na próbkowaniu dostarczania aerozolu do różnych generacji płuc, a nie do każdego płata płuca6,7,8. Poniższy protokół przedstawia wysokoprzepustową metodę generowania specyficznych dla pacjenta modeli płuc ze zdolnością do ilościowego określania względnego osadzania cząstek w każdym z pięciu płatów płuca9.

Anatomicznie dokładne modele płuc są generowane przez drukowanie 3D skanów tomografii komputerowej (CT) pacjenta. W połączeniu z łatwym w montażu systemem przepływu, względne natężenia przepływu przez każdy z modelowych płatów płuc mogą być niezależnie kontrolowane i dostosowywane tak, aby naśladować te dla różnych grup demograficznych pacjenta i/lub stanów chorobowych. Dzięki tej metodzie naukowcy mogą przetestować skuteczność potencjalnych metod terapeutycznych w odpowiedniej geometrii płuc i skorelować działanie każdej metody z postępem morfologii choroby. W tym przypadku dwie konstrukcje urządzeń opracowane w naszym laboratorium są testowane pod kątem ich zdolności do zwiększania osadzania się w pożądanym płacie płuc poprzez kontrolowanie miejsca uwalniania aerozolu w jamie ustnej lub tchawicy. Protokół ten ma również potencjał, aby znacząco wpłynąć na rozwój spersonalizowanych procedur dla pacjentów, ułatwiając szybkie przewidywanie skuteczności leczenia w modelowym płucu specyficznym dla danych z tomografii komputerowej tego pacjenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie eksperymentalnych komponentów drukowanych w 3D

UWAGA: Całe oprogramowanie użyte w protokole jest wskazane w Tabeli Materiałów. Ponadto zastosowane oprogramowanie do krojenia jest specyficzne dla drukarki 3D wymienionej w Tabeli materiałów; jednak protokół ten można rozszerzyć na szeroką gamę drukarek 3D stereolitografii (SLA).

  1. Konwertuj skany tomografii komputerowej pacjenta na obiekty 3D (pliki .stl).
    UWAGA: Bardziej szczegółowe omówienie cech geometrycznych konkretnego modelu płuc użytego w tych badaniach można znaleźć w Feng et al.5.
    1. Renderuj skany CT do obiektu 3D za pomocą oprogramowania do tomografii komputerowej (patrz tabela materiałów). Otwórz tomografię komputerową i utwórz maskę w przestrzeni powietrznej za pomocą narzędzia Próg z ustawieniem w zakresie od -800 do -1000. Korzystając z narzędzia Podgląd 3D, wyświetl rendering 3D i wyeksportuj obiekt (punkt menu Plik | Eksport) jako plik .stl.
    2. Importując pliki do oprogramowania do edycji siatki (patrz Tabela materiałów), usuń wszelkie postrzępione elementy za pomocą narzędzia Wybierz (Rzeźba | Pędzle: "Shrink/Smooth" | Właściwości: Wytrzymałość (50), Rozmiar (10), Głębokość (0)). Wygładź powierzchnię (Ctrl+A | Deformacja | Gładki | Wygładzanie (0,2), skala wygładzania (1)).
    3. W oprogramowaniu do edycji siatek wydłuż ścianę tych obiektów o 2 mm (Ctrl+A | Edycja | Przesunięcie) i pozwól, aby obiekt wewnętrzny pozostał pusty, tak aby pozostała tylko ściana. Podziel obiekt na plasterki (Zaznacz | Edycja | Płaskie cięcie) w tchawicy w celu utworzenia wlotu oraz w generacjach 2 lub 3, gdzie obiekt rozgałęzia się do każdego płata, tworząc ujścia (Rysunek 1A).
      UWAGA: Grubość 2 mm została wybrana na podstawie dopuszczalnych rozmiarów elementów określonych przez producenta drukarki 3D wymienionych w Tabeli Materiałów. Grubość tę można dostosować w oparciu o specyfikację dostępnej drukarki 3D, jeśli zachowana jest geometria wewnętrzna modelu.
  2. Zmodyfikowanie geometrii ujścia płuc pacjenta tak, aby były zgodne z wcześniej zaprojektowanymi elementami nasadki wylotu płata (Rysunek 1B,C) wymienionymi w Tabeli Materiałów.
    1. Zaimportuj obiekt 3D, który replikuje skan CT od wewnątrz, ma grubość ścianki 2 mm i jest otwarty na wlocie i wylocie, do oprogramowania do modelowania 3D (patrz Tabela materiałów) jako ciało stałe (Otwórz | Pliki siatki | Opcje | Ciało stałe).
    2. Utwórz płaszczyznę na podstawie powierzchni w każdym z wylotów (Wstaw | Geometria odniesienia | Samolot). Za pomocą narzędzia do łączenia obrysuj wewnętrzną i zewnętrzną ścianę wylotu w szkicu na płaszczyźnie (punkt menu Szkic | Splajn).
    3. Loft cylinder (OD 18,5 mm, ID 12,5 mm, H 15,15 mm) do połączenia z wewnętrzną i zewnętrzną ścianą modelu, wydłużając w ten sposób wylot, aby był jednolity w każdym płacie (Funkcje | Wyciągnięty dodatek/podstawa). Dodaj wcięcie wokół krawędzi wylotu, aby pasowało do nasadki (Funkcje | Cięcie wytłaczane | Przesunięcie).
      UWAGA: Nasadka (Rysunek 1D) to pusty cylinder pasujący do wymiarów wylotów i posiadający półkę, która łączy się z wycięciem modelowego wylotu. Jeden koniec nasadki jest zablokowany w taki sposób, że ID jest mniejsze niż reszta części, co zapewnia ścisłe dopasowanie wokół połączenia rurki kolczastej (Rysunek 1E). Połączenie rurki kolczastej ma kształt stożka kolczastego, tak że zadzior przechodzi przez otwór nasadki, ale reszta części nie, dzięki czemu połączenie rurki bezpiecznie pasuje do nasadki. W ten sposób nasadka ściśle przylega zarówno do połączenia rurki kolczastej, jak i do modelu płuc (Rysunek 1F,G).
    4. Zmodyfikuj wlot modelu płuc w zależności od pożądanych warunków eksperymentalnych. Obszary gardła i krtani mogą być włączone w celu naśladowania pacjenta, który może samodzielnie oddychać (Ryc. 1B). Obszary nad tchawicą można usunąć za pomocą wytłaczanego cięcia, aby naśladować zaintubowanego pacjenta na podparciu respiratora (Funkcje | Extruded Cut) (Rysunek 1C).
  3. Orientowanie i obsługa eksperymentalnych komponentów w oprogramowaniu do krojenia dostarczonym przez producenta drukarki 3D.
    1. Zaimportuj pliki części 3D do oprogramowania do krojenia drukarki 3D i wybierz odpowiednią żywicę. Użyj twardej żywicy do wydrukowania modeli płuc i połączeń rurek kolczastych, a miękkiej żywicy do wydrukowania nasadek.
      UWAGA: Żywica używana do drukowania nakrętek musi mieć właściwości elastyczne, aby umożliwić jej rozciągnięcie się nad wylotem płata i stworzenie hermetycznego uszczelnienia.
    2. Ustaw orientację elementu w taki sposób, aby zminimalizować wszelkie "wyspy" i niewentylowane objętości. Najlepszą orientacją dla modeli płuc jest to, aby wyloty płatków były skierowane od platformy drukującej. Upewnij się, że zarówno połączenia rurek kolczastych, jak i zaślepki mają szersze części skierowane w stronę platformy drukującej.
      UWAGA: Poszczególne przekroje można przeglądać, aby sprawdzić, czy pojawiają się "wyspy", czyli sekcje części, które po raz pierwszy pojawiają się w przekroju, nie będąc połączone z główną bryłą części. Funkcja przeglądu może być używana do sprawdzania, czy nie ma plasterków z niewentylowanymi objętościami, czyli obszarów, w których nieutwardzona żywica może zostać uwięziona wewnątrz części podczas drukowania. Zarówno "wyspy", jak i niewentylowane woluminy obniżają jakość wydruku i mogą prowadzić do niepowodzenia drukowania.
    3. Patrząc na każdy przekrój z osobna, dodaj podpory do wszystkich pozostałych "wysp" w części, a także do wszelkich obszarów ze znacznymi zwisami. Wyeksportuj i wyświetl plasterki do wydruku, aby sprawdzić, czy wszystkie obszary są prawidłowo obsługiwane.
  4. Drukuj eksperymentalne komponenty i pełną obróbkę końcową zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Wszystkie opisane poniżej etapy przetwarzania końcowego są specyficzne dla drukarki 3D wymienionej w Tabeli materiałów. W przypadku korzystania z alternatywnych drukarek lub materiałów dostosuj te kroki tak, aby odzwierciedlały instrukcje producenta.
    1. W przypadku części wydrukowanych z miękkiej żywicy należy umyć alkoholem izopropylowym (IPA) o czystości ≥99% w celu usunięcia nadmiaru nieutwardzonej żywicy i utwardzić termicznie w piecu konwekcyjnym przez 8 godzin zgodnie ze specyfikacją producenta.
      UWAGA: Części wydrukowane w miękkiej żywicy mogą być bardzo delikatne bezpośrednio po wydrukowaniu, dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas czyszczenia. Narażenie na IPA powinno być utrzymywane poniżej limitu narażenia materiału na rozpuszczalnik, aby zapobiec degradacji części.
    2. W przypadku części wydrukowanych z twardej żywicy, umyj IPA, aby usunąć nadmiar nieutwardzonej żywicy i utwardź w piecu UV (światło 365 nm przy 5-10 mW/cm2) przez 1 minutę na stronę.
      UWAGA: Aby ocenić dokładność repliki wydrukowanej w 3D, zaleca się użycie skanowania μCT części drukowanej i oprogramowania do skanowania CT w celu ilościowego porównania różnic między oryginalnym renderingiem 3D a wydrukowaną repliką 3D.

2. Montaż systemu rur do kontroli natężenia przepływu

  1. Przykręć złączki z rurą kolczastą 1/4" z boku kolektora z 6 portami (Rysunek 2A-6) i rurą kolczastą 3/8" pasującą do pozostałego portu.
  2. Przytnij rurkę 1/4" na żądane długości i włóż do każdego końca zaworów wciskanych (Rysunek 2A-5). Podłącz każdy zawór do jednej ze złączek 1/4" włożonych do kolektora.
  3. Podłącz przepływomierz (Rysunek 2A-4) do drugiego końca każdego zaworu.
  4. Umieść system rurek na drewnianej desce tak, aby pojedyncza złączka kolektora 3/8" wystawała poza krawędź płyty. Aby zabezpieczyć na miejscu, wkręć dwie z boku drewnianej deski i przymocuj kolektor do za pomocą drutu.
  5. Dodaj cztery umieszczone wokół każdego z zaworów i przepływomierzy i użyj drutu, aby przymocować każdy z nich do drewnianej deski (Rysunek 2E).
  6. Za pomocą około 6" rurki ID 3/8" podłącz kolektor do wbudowanego filtra próżniowego o wielkości porów 0,1 μm. Podłącz drugi koniec filtra do regulatora przepływu za pomocą kolejnej rurki ID 6" lub 3/8"
    UWAGA: System przewodów należy zmontować tylko raz.

3. Montaż nasadek wylotowych płatków z modelem płuc pacjenta

UWAGA: Ta część protokołu musi być ukończona przed każdym eksperymentem.

  1. Włóż kolczaste połączenie rurki do nasadki z dyszą wystającą przez otwór w podstawie nasadki. Najpierw włóż jeden koniec owalnej podstawy łączącej rurkę kolczastą do nasadki. Następnie ostrożnie rozciągnij elastyczną nasadkę na drugim końcu owalnej podstawy, zwracając szczególną uwagę, aby nie popękać cienkiej podstawy.
    UWAGA: Nowo wydrukowane nakrętki mogą być sztywniejsze niż pożądane i można je rozciągnąć, przesuwając dwoma palcami wzdłuż wnętrza nasadki.
  2. Przyciąć bibułę filtracyjną o grubości 10 μm tak, aby była nieco większa niż obszar wylotowy. Złóż bibułę filtracyjną na wylocie krzywki i przytrzymaj jedną ręką
    3. .
  3. Drugą ręką użyj pęsety, aby rozciągnąć nasadkę z połączeniem z rurką kolczastą nad wylotem. Dociśnij nasadkę w dół, aż wcięcie nasadki zrówna się z odpowiednim wcięciem na wylocie płata (Rysunek 2C).
    UWAGA: Rozdarcie bibuły filtracyjnej na tym etapie może unieważnić wyniki, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć nadmiernej siły podczas dociskania nasadki do wylotu.
  4. Powtórz te czynności dla wszystkich pozostałych wylotów płatów (Rysunek 2D).

4. Generowanie klinicznie istotnego profilu przepływu powietrza

UWAGA: Ta część protokołu musi być ukończona przed każdym eksperymentem.

  1. Podłącz każdy wylot krzywki modelu płuc do rurki odpowiedniego przepływomierza i zaworu, uważając, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku bocznego na połączenie rurki kolczastej. Przymocuj elektroniczny przepływomierz do wlotu ust modelu płuc, aby zmierzyć całkowite natężenie przepływu powietrza do modelu płuc.
  2. Włącz regulator przepływu (Rysunek 2A-7) i pompę próżniową (Rysunek 2A-8). Wybierz ustawienie "konfiguracja testu" w regulatorze przepływu i powoli zwiększaj natężenie przepływu, aż elektroniczny przepływomierz wyświetli żądane całkowite natężenie przepływu.
  3. Za pomocą zaworów (Rysunek 2E-5), wyreguluj natężenie przepływu przez każdy z pięciu płatów płuc: prawy górny (RU), prawy środkowy (RM), prawy dolny (RL), lewy górny (LU) i lewy dolny (LL). Gdy natężenia przepływu krzywki pokazane na przepływomierzach (Rysunek 2E-4) ustabilizują się na żądanym poziomie, ponownie sprawdź ogólne natężenie przepływu na przepływomierzu elektronicznym, aby upewnić się, że w systemie nie ma nieszczelności.
    1. Jeśli występuje rozbieżność w całkowitym natężeniu przepływu, zmniejsz natężenie przepływu za pomocą regulatora przepływu, ustaw wszystkie zawory w konfiguracji całkowicie otwartej i powtórz kroki 4.2 i 4.3.
      UWAGA: Przedstawione tutaj wyniki uzyskano przy użyciu profili przepływu powietrza na podstawie danych zgłoszonych przez Sul et al.10 Te frakcje przepływu płatowego zostały obliczone przy użyciu cienkowarstwowych obrazów tomografii komputerowej płuc pacjenta przy pełnym wdechu i wydechu, porównując względne zmiany objętości każdego płata płuca. Wyniki przedstawiono dla dwóch różnych warunków przepływu, przy całkowitym natężeniu przepływu na wlocie wynoszącym 1 l/min. Profil przepływu wylotowego zdrowego płata płuc jest rozprowadzany do każdego wylotu przez następujący procent przepływu wlotowego: LL-23,7%, LU-23,7%, RL-18,7%, RM-14,0%, RU-20,3%. Profil przepływu krzywki wylotowej POChP jest rozdzielany między każdy wylot według następującego procentu przepływu wlotowego: LL-10.0%, LU-29.0%, RL-13.0%, RM-5.0%, RU-43.0%9,10.
  4. Wyjdź z funkcji "konfiguracja testowa" regulatora przepływu, ale pozostaw włączoną pompę próżniową.
    UWAGA: Wyłączenie pompy próżniowej pomiędzy ustawieniem natężenia przepływu a wykonaniem eksperymentu osadzania może prowadzić do niedokładności generowanego profilu przepływu. Zaleca się pozostawienie pompy próżniowej włączonej po ustawieniu żądanych natężeń przepływu w celu zakończenia testu osadzania aerozolu.

5. Dostarczanie aerozolu do modelu płuc

UWAGA: Eksperymenty muszą być przeprowadzane w dygestorium z zamkniętym skrzydłem, aby zminimalizować narażenie na jakiekolwiek aerozole generowane przez nebulizator.

  1. Napełnij nebulizator roztworem pożądanych cząstek fluorescencyjnych (Rysunek 2A-1) i podłącz do wlotu modelu płuc ( Rysunek 2B).
    UWAGA: Przedstawione tutaj wyniki uzyskano przy użyciu 30 ml rozcieńczenia 1:100 cząstek fluorescencyjnego polistyrenu w metanolu w stosunku 1:100.
    1. Aby zweryfikować konfigurację eksperymentalną, podłącz nebulizator bezpośrednio do wlotu modelu płuc bez żadnego urządzenia celującego.
    2. Aby zmierzyć skuteczność urządzenia celującego, podłącz nebulizator do urządzenia i włóż urządzenie do modelu płuca.
  2. Podłącz przewód sprężonego powietrza do nebulizatora i zamknij skrzydło dygestoria tak bardzo, jak to możliwe.
  3. Ustaw regulator przepływu tak, aby działał przez jedną 10-sekundową próbę. Przed naciśnięciem przycisku start należy lekko otworzyć zawór sprężonego powietrza, aby rozpocząć wytwarzanie aerozolu w nebulizatorze.
  4. Nacisnąć start na regulatorze przepływu i natychmiast całkowicie otworzyć zawór sprężonego powietrza. Gdy regulator przepływu osiągnie około 9 s, zacznij zamykać zawór sprężonego powietrza.
  5. Po całkowitym zamknięciu zaworu sprężonego powietrza odłącz nebulizator od przewodu sprężonego powietrza, całkowicie zamknij skrzydło dygestoria, wyłącz pompę próżniową i pozwól, aby wszelkie aerozole usunęły się z dygestorium przez około 10 minut.
    UWAGA: Ważne jest, aby wyłączyć pompę próżniową po zakończeniu pracy, aby zapobiec tworzeniu się podciśnienia w systemie przewodów.
  6. Po odczekaniu odpowiedniej ilości czasu odłącz model płuca od systemu przewodów, zwracając szczególną uwagę, aby nie pęknąć połączeń przewodów kolczastych.
  7. Zdejmij zaślepki wylotowe płatka, przesuwając pęsetę pod krawędzią nasadki i delikatnie podnosząc ją z modelu płuc.
  8. Zdejmij bibułę filtracyjną z nasadki i umieść ją na płytce 24-dołkowej tak, aby strona, na której osadzone cząstki, znajdowała się na dnie skierowanym w stronę dołka płytki. Powtórz dla pozostałych wylotów i oznacz studzienkę odpowiadającą każdemu płatowi.
    UWAGA: Aby zapobiec wpływowi osadzania się cząstek resztkowych na kolejne eksperymenty, ważne jest, aby między seriami przepłukać zarówno model płuca, jak i elementy nasadki alkoholem izopropylowym lub odpowiednim rozpuszczalnikiem. Można je dowolnie gromadzić i uwzględniać w analizie. Ponadto prowadzony jest dziennik, aby upewnić się, że wszystkie używane repliki były minimalnie narażone na IPA w celu utrzymania integralności części, a przed użyciem zalecana jest kontrola wzrokowa części.

6. Obrazowanie bibuły filtracyjnej na wylocie

  1. Umieść płytkę studzienkową w cyfrowym mikroskopie fluorescencyjnym i ustaw mikroskop na 4-krotne powiększenie i odpowiedni kanał fluorescencyjny.
  2. Wizualnie określ, która bibuła filtracyjna krzywka ma największą ilość osadzanych cząstek i użyj funkcji "Automatyczna ekspozycja". Zwróć uwagę na wynikowe wartości ekspozycji i czasu integracji.
  3. Zastosuj tę ekspozycję do wszystkich filtrów w danym przebiegu i oceń, czy ustawienie daje zadowalający obraz dla wszystkich obszarów filtrów o wysokim stopniu osadzania.
    UWAGA: Ustawienia ostrości można zmieniać z filtra na filtr; Jednak wszystkie filtry dla danego przebiegu muszą być analizowane przy tych samych ustawieniach ekspozycji. Możliwe jest ustawienie ostrości tylko w jednej klatce na raz, więc zagięcia lub rozdarcia bibuły filtracyjnej mogą uniemożliwić ustawienie ostrości na wszystkich osadzonych cząstkach w widoku. Można tego uniknąć, upewniając się, że bibuła filtracyjna przylega płasko do dna płyty studzienki.
  4. Zrób co najmniej trzy zdjęcia bibuły filtracyjnej każdego płata w losowych miejscach i zapisz jako .tiff pliki.

7. Kwantyfikacja osadzania cząstek

  1. Zaimportuj wszystkie obrazy z bibuły filtracyjnej dla danego przebiegu do sesji ImageJ.
  2. Zmień typ każdego obrazu na 8-bitowy, wybierając Obraz | Rodzaj | 8-bitowy.
  3. Otwórz zdjęcie o najwyższej fluorescencji i wybierz Obraz | Dostosuj | Próg, aby otworzyć okno progu. Dostosuj wartości progowe, aby zminimalizować sygnał tła z bibuły filtracyjnej i wyraźnie zdefiniować krawędzie cząstek. Zobacz Rysunek 3 dla opisów progów dobrej i złej jakości.
    UWAGA: W przypadku filtrów o wysokim poziomie osadzania można zaobserwować "koronę" fluorescencji, spowodowaną dyfrakcją światła przez włókna bibuły filtracyjnej, wokół dużych grup cząstek. Podczas progowania tych obrazów, zbyt duży zakres wyświetla małe kropki lub "piórkowate" kształty wokół tych grup, jak zaobserwowano na "słabych" obrazach progowych w Rysunek 3. Można to poprawić, stopniowo zwiększając dolną granicę progu, aż sygnał z włókien bibuły filtracyjnej zostanie zminimalizowany bez zasłaniania sygnału od samych cząstek.
  4. Propaguje ustawienia progowe dla obrazu o najwyższej fluorescencji na wszystkie inne obrazy.
  5. Określ ilościowo liczbę cząstek i całkowitą powierzchnię fluorescencyjną, wybierając opcję Analizuj | Analizuj cząstki.
    UWAGA: Zestawy danych są porównywane za pomocą testu wielokrotnych porównań firmy Sidak i dwukierunkowej analizy ANOVA. Dodatkowo, osadzanie się tylko w płacie będącym przedmiotem zainteresowania jest porównywane za pomocą testu T Studenta przy założeniu równej wariancji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cząstki w tym zakresie wielkości (1-5 μm) i warunkach przepływu (1-10 L/min) podążają za liniami strumienia płynu na podstawie zarówno teoretycznej liczby Stokesa, jak i danych in vivo; dlatego, w przypadku braku ukierunkowanego urządzenia dostarczającego, oczekuje się, że cząstki uwolnione do modelu płuc będą się osadzać zgodnie z procentem całkowitego przepływu powietrza skierowanego do każdego płata. Względne ilości cząstek dostarczanych do każdego płata można następnie porównać z danymi klinicznymi dotyczącymi natęże...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie najnowocześniejszym urządzeniem do badań farmaceutycznych płuc pełnej dawki inhalacyjnej jest Next Generator Impactor (NGI), który mierzy średnicę aerodynamiczną aerozolu4. Te dane dotyczące rozmiaru są następnie wykorzystywane do przewidywania generacji płuc, przy której aerozol będzie się osadzał, w oparciu o korelację opracowaną dla zdrowego dorosłego mężczyzny11. Niestety, zdolność tej metody do oceny różnic w regionalnym odkładaniu się w płucach, określania wpł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują profesorowi Yu Fengowi, dr Jennie Briddell, Ianowi Woodwardowi i Lucasowi Attii za ich pomocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1/4 "Plastikowa rura kolczastaMcMaster Carr5372K111
10 um Bibuła filtracyjnaFisher1093-110
1um Fluorescencyjne cząstki polistyrenuPolysciences15702-10
1um Niefluorescencyjne cząstki polistyrenuPolysciences8226
2-PropanolFisherA516-4Skierowany do w protokole jako "IPA"
3/8" Plastikowa rura kolczastapowietrza McMaster Carr5372K117
(1 - 280 ml / min)McMaster Carr41695K32Określany w protokole jako "przepływomierz"
Drukarka 3D Carbon M1Carbon 3Dhttps://www.carbon3d.com/, Powiązane oprogramowanie określane w protokole jako "oprogramowanie do krojenia"
Collison Nebulizator strumieniowyCH TechnologiesARGCNB0008 (CN-25)6 Poziome zderzenie w stylu Jet MRE ze szklanym słoikiem, Określany w protokole jako "nebulizator", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf
Piec konwekcyjnyYamatoDKN602
Kontroler przepływu krytycznego Copley TPK2000 Reve 120VMSP Corp0001-01-9810Określany w protokole jako "regulator przepływu"
Pompa o dużej wydajności Copley Model HCP5MSP Corp0001-01-9982Określana w protokole jako "pompa próżniowa"
CytationBioTekCYT5MPVWielofunkcyjny spektrofotometr / obrazowanie fluorescencyjne wyposażony w obiektywy 4x/20x/40x i DAPI/GFP/TexasCzerwone kostki laserowe/filtracyjne
EPU40 ResinCarbon 3Dhttps://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, określany w protokole jako "miękka żywica"
Filtr do pompy próżniowejPrzepływomierz Whatman6722-5000
Model DFM 2000MSP Corp0001-01-8764Określany w protokole jako "elektroniczny przepływomierz"
Oprogramowanie ImageJImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Liniowy zawór sterujący przepływem powietrza (Push-to-Connect)McMaster Carr62005K333Określany w protokole jako "zawór"
Liniowe urządzenia filtrująceWhatmanWHA67225000
Arkusz sklejki morskiejMcMaster Carr62005K333Określany w protokole jako "drewniana tablica"
Materialise Naśladuje oprogramowanieMaterialisehttps://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Określane w protokole jako "Oprogramowanie do skanowania CT"
Oprogramowanie MeshmixerAutodeskhttp://www.meshmixer.com/, Określane w protokole jako "oprogramowanie do edycji siatki
MethanolFisherA454-4
Opticure LED CubeAPM Technica102843Określane w protokole jako "piec UV"
PR25 Żywicawęglowa 3Dhttps://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Określana w protokole jako "twarda żywica"
PVC Rurka do chemikaliówMcMaster Carr5231K1611/4"
SolidWorks SoftwareDassault Systè mes  SolidWorks Corporationhttps://www.solidworks.com/, określany w protokole jako "oprogramowanie do modelowania 3D"
Prostokątny rozdzielacz o prostym przepływieMcMaster Carr1125T31
Rurka do kontrolera przepływuMcMaster Carr5233K653/8"
Przewód
Przepływomierz " ID identyfikacyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goel, A., Baboota, S., Sahni, J. K., Ali, J. Exploring targeted pulmonary delivery for treatment of lung cancer. International Journal of Pharmaceutical Investigation. 3 (1), 8-14 (2013).
  2. Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Li, Z., Roberts, W. L., Rojas, C. A new methodology for targeting drug-aerosols in the human respiratory system. International Journal of Heat and Mass Transfer. 51 (23), 5578-5589 (2008).
  3. Feng, Y., Chen, X., Yang, M. An In Silico Investigation of a Lobe-Specific Targeted Pulmonary Drug Delivery Method. Design of Medical Devices Conference. , (2018).
  4. Marple, V. A., et al. Next generation pharmaceutical impactor (a new impactor for pharmaceutical inhaler testing). Part I: Design. Journal of Aerosol Medicine. 16 (3), 283-299 (2003).
  5. Feng, Y., Zhao, J., Chen, X., Lin, J. An In Silico Subject-Variability Study of Upper Airway Morphological Influence on the Airflow Regime in a Tracheobronchial Tree. Bioengineering. 4 (4), 90(2017).
  6. Huynh, B. K., et al. The Development and Validation of an In Vitro Airway Model to Assess Realistic Airway Deposition and Drug Permeation Behavior of Orally Inhaled Products Across Synthetic Membranes. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 31 (2), 103-108 (2018).
  7. Lizal, F., Elcner, J., Hopke, P. K., Jedelsky, J., Jicha, M. Development of a realistic human airway model. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 226 (3), 197-207 (2011).
  8. Wei, X., Hindle, M., Delvadia, R. R., Byron, P. R. In Vitro Tests for Aerosol Deposition. V: Using Realistic Testing to Estimate Variations in Aerosol Properties at the Trachea. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 30 (5), 339-348 (2017).
  9. Kolewe, E. L., Feng, Y., Fromen, C. A. Realizing Lobe-Specific Aerosol Targeting in a 3D-Printed In Vitro Lung Model. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. , (2020).
  10. Sul, B., et al. Assessing Airflow Sensitivity to Healthy and Diseased Lung Conditions in a Computational Fluid Dynamics Model Validated In Vitro. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
  11. Martonen, T. B., Katz, I. Deposition Patterns of Polydisperse Aerosols Within Human Lungs. Journal of Aerosol Medicine. 6 (4), 251-274 (1993).
  12. Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
  13. Nichols, S. C., et al. A Multi-laboratory in Vitro Study to Compare Data from Abbreviated and Pharmacopeial Impactor Measurements for Orally Inhaled Products: a Report of the European Aerosol Group (EPAG). AAPS PharmSciTech. 17 (6), 1383-1392 (2016).
  14. Yoshida, H., Kuwana, A., Shibata, H., Izutsu, K. I., Goda, Y. Comparison of Aerodynamic Particle Size Distribution Between a Next Generation Impactor and a Cascade Impactor at a Range of Flow Rates. AAPS PharmSciTech. 18 (3), 646-653 (2017).
  15. Feng, Y., et al. An in silico inter-subject variability study of extra-thoracic morphology effects on inhaled particle transport and deposition. Journal of Aerosol Science. 123, 185-207 (2018).
  16. Kleinstreuer, C., Seelecke, S. Inhaler system for targeted maximum drug-aerosol delivery. United States patent. , (2005).
  17. Pietila, T. How Medical 3D Printing is Gaining Ground in Top Hospitals. , Available from: https://www.materialise.com/en/blog/3d-printing-hospitals (2019).
  18. Weber, P. W., Price, O. T., McClellan, G. E. Demographic Variability of Inhalation Mechanics: A Review. Defense Threat Reduction Agency. , (2016).
  19. Jiang, Y. Y., Xu, X., Su, H. L., Liu, D. X. Gender-related difference in the upper airway dimensions and hyoid bone position in Chinese Han children and adolescents aged 6-18 years using cone beam computed tomography. Acta Odontologica Scandinavica. 73 (5), 391-400 (2015).
  20. Martin, S. E., Mathur, R., Marshall, I., Douglas, N. J. The effect of age, sex, obesity and posture on upper airway size. European Respiratory Journal. 10 (9), 2087(1997).
  21. Xi, J., Longest, P. W., Martonen, T. B. Effects of the laryngeal jet on nano- and microparticle transport and deposition in an approximate model of the upper tracheobronchial airways. Journal of Applied Physiology. 104 (6), 1761-1777 (2008).
  22. Zhao, J., Feng, Y., Fromen, C. A. Glottis motion effects on the particle transport and deposition in a subject-specific mouth-to-trachea model: A CFPD study. Computers in Biology and Medicine. 116, 103532(2020).
  23. Kim, S. S., et al. Chronic obstructive pulmonary disease: lobe-based visual assessment of volumetric CT by Using standard images--comparison with quantitative CT and pulmonary function test in the COPDGene study. Radiology. 266 (2), 626-635 (2013).
  24. The Cancer Imaging Archive. , Available from: https://www.cancerimagingarchive.net/ (2020).
  25. Li, A., Ahmadi, G. Computer Simulation of Deposition of Aerosols in a Turbulent Channel Flow with Rough Walls. Aerosol Science and Technology. 18 (1), 11-24 (1993).
  26. Khalili, S. F., Ghanbarzadeh, S., Nokhodchi, A., Hamishehkar, H. The effect of different coating materials on the prevention of powder bounce in the next generation impactor. Research in Pharmaceutical Sciences. 13 (3), 283-287 (2018).
  27. Galliger, Z., Vogt, C. D., Panoskaltsis-Mortari, A. 3D bioprinting for lungs and hollow organs. Translational Research. 211, 19-34 (2019).
  28. Schwarz, K., Biller, H., Windt, H., Koch, W., Hohlfeld, J. M. Characterization of exhaled particles from the healthy human lung--a systematic analysis in relation to pulmonary function variables. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23 (6), 371-379 (2010).
  29. Patton, J. S., Byron, P. R. Inhaling medicines: delivering drugs to the body through the lungs. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (1), 67-74 (2007).
  30. Zhang, Z., Kleinstreuer, C., Kim, C. S. Cyclic micron-size particle inhalation and deposition in a triple bifurcation lung airway model. Journal of Aerosol Science. 33 (2), 257-281 (2002).
  31. Ju, Y., et al. Engineering of Nebulized Metal-Phenolic Capsules for Controlled Pulmonary Deposition. Advanced Science. 7 (6), 1902650(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drukowane w 3D modele p ucspersonalizowane modele p ucdostarczanie aerozolu fluorescencyjnegokontrola nat enia przep ywumikroskopia fluorescencyjnatestowanie rurek endotrachealnychmonta za lepki wylotu p atagenerowanie aerozolu przez nebulizatorosadzanie na papierze filtracyjnym

Powiązane artykuły