Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61709

⸱

25 czerwca 2021

 ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medical Sciences, University of New South Wales

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Streszczenie

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) to technika molekularna, która identyfikuje obecność i przestrzenną dystrybucję specyficznych transkryptów RNA w komórkach. Fenotypowanie neurochemiczne funkcjonalnie zidentyfikowanych neuronów zwykle wymaga jednoczesnego znakowania wieloma przeciwciałami (białko celujące) przy użyciu immunohistochemii (IHC) i optymalizacji hybrydyzacji in situ (celowanie w RNA), w tandemie. Można uzyskać "sygnaturę neurochemiczną" w celu scharakteryzowania poszczególnych neuronów, jednak czynniki komplikujące obejmują konieczność weryfikacji celów FISH i IHC przed połączeniem metod oraz ograniczoną liczbę RNA i białek, które mogą być celowane jednocześnie w tym samym odcinku tkanki.

Tutaj opisujemy protokół, wykorzystujący zarówno świeżo mrożone, jak i utrwalone preparaty mózgu myszy, który wykrywa wiele mRNA i białek w tej samej sekcji mózgu za pomocą RNAscope FISH, a następnie fluorescencji immunologicznej, odpowiednio. Używamy metody połączonej do opisania wzorca ekspresji mRNA o niskiej liczebności (np. receptor galaniny 1) i mRNA o wysokiej obfitości (np. transporter glicyny 2), w immunohistochemicznie zidentyfikowanych jądrach pnia mózgu.

Kluczowe kwestie dotyczące znakowania białek po teście FISH wykraczają poza przygotowanie tkanek i optymalizację etykietowania sondy FISH. Na przykład odkryliśmy, że na swoistość wiązania przeciwciał i znakowania może mieć szkodliwy wpływ etap proteazy w teście sondy FISH. Proteazy katalizują hydrolityczne rozszczepienie wiązań peptydowych, ułatwiając wnikanie sondy FISH do komórek, jednak mogą również trawić białko docelowe w kolejnym teście IHC, powodując wiązanie poza celem. Subkomórkowa lokalizacja docelowego białka jest kolejnym czynnikiem przyczyniającym się do sukcesu IHC po teście FISH probe. Zaobserwowaliśmy, że swoistość IHC jest zachowana, gdy docelowe białko jest związane z błoną, podczas gdy IHC ukierunkowane na białko cytoplazmatyczne wymagało rozległego rozwiązywania problemów. Wreszcie, stwierdziliśmy, że obsługa zamrożonej tkanki montowanej na szkiełku jest trudniejsza niż świeżo zamrożona tkanka, jednak jakość IHC była ogólnie lepsza w przypadku utrwalonej zamrożonej tkanki w połączeniu z RNAscope.

Wprowadzenie

Białka i mRNA, które neurochemicznie definiują subpopulacje neuronów, są powszechnie identyfikowane odpowiednio za pomocą kombinacji immunohistochemii (IHC) i/lub hybrydyzacji in situ (ISH). Połączenie technik ISH z IHC ułatwia charakterystykę wzorców kolokalizacji unikalnych dla funkcjonalnych neuronów (kodowanie neurochemiczne) poprzez maksymalizację zdolności znakowania multipleksowego.

Metody fluorescencyjne ISH (FISH), w tym RNAscope, mają wyższą czułość i specyficzność w porównaniu do wcześniejszych metod wykrywania RNA, takich jak radioaktywne ISH i nieradioaktywne chromogenne ISH. FISH umożliwia wizualizację pojedynczych transkryptów mRNA jako punktowych plam barwionych 1. Co więcej, test RNAscope pozwala na znakowanie zwiększonej liczby celów RNA jednocześnie przy użyciu różnych znaczników fluoroforowych. Pomimo tych zalet, ograniczenia techniczne mogą wpływać na liczbę fluoroforów/chromogenów, które można zastosować w jednym eksperymencie. Należą do nich dostępność zestawów filtrów mikroskopowych; takie rozważania są spotęgowane, gdy identyfikacja neurochemiczna wykorzystuje połączone FISH i IHC, w porównaniu z użyciem każdej techniki osobno, ponieważ nieodłączne etapy optymalne dla jednej metody mogą być szkodliwe dla drugiej.

Poprzednie zastosowanie FISH w połączeniu z IHC wykazało ekspresję specyficznych celów komórkowych w ludzkich chłoniakach B-komórkowych2, zarodki piskląt3, zarodki danio pręgowanego4, mouse retina5 i komórki ucha wewnętrznego myszy6. W tych badaniach preparatyka tkankowa polegała na zatopieniu w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE)2,3,5 lub fresh whole mount4,6. W innych badaniach zastosowano chromogenny RNAscope na stałych preparatach mózgu myszy i szczura7,8,9. W szczególności Baleriola i wsp.8 opisał dwa różne preparaty tkankowe dla połączonego ISH-IHC; poprawiono sekcje mózgu myszy i sekcje ludzkiego mózgu FFPE. W niedawnej publikacji połączyliśmy FISH i fluorescencyjne IHC na świeżo mrożonych skrawkach, aby jednocześnie uwidocznić mRNA o niskiej obfitości (receptor galaniny 1, GalR1), mRNA o wysokiej obfitości (transporter glicyny 2, GlyT2) i białko pęcherzykowego transportera acetylocholiny (vAChT) 10 w siatkowatej formacji pnia mózgu.

Jądro przewodu samotnego (NTS) jest głównym obszarem mózgu zaangażowanym w funkcje autonomiczne. Ta heterogeniczna populacja neuronów, zlokalizowana w tyłomózgowiu, odbiera i integruje ogromną liczbę sygnałów autonomicznych, w tym tych, które regulują oddychanie. NTS zawiera kilka populacji neuronów, które mogą być fenotypowo charakteryzowane przez wzorzec ekspresji celów mRNA, w tym GalR1 i GlyT2 oraz markery białkowe dla enzymu hydroksylazy tyrozyny (TH) i czynnika transkrypcyjnego Paired-like homeobox 2b (Phox2b).

Właściciel RNAscope zaleca preparaty świeżo mrożonych tkanek, ale tkanka przygotowana przez transkardialną perfuzję całego zwierzęcia, wraz z długoterminową krioprotekcji (przechowywanie w temperaturze -20 °C) stałych zamrożonych skrawków tkanki, jest powszechna w wielu laboratoriach. W związku z tym staraliśmy się ustalić protokoły dla FISH w połączeniu z IHC przy użyciu świeżo mrożonych i utrwalonych zamrożonych preparatów tkankowych. W tym miejscu zapewniamy świeżo mrożone i utrwalone zamrożone skrawki mózgu: (1) protokół dla połączonych FISH i fluorescencyjnych IHC (2) opis jakości znakowania mRNA i białek wytwarzanych przy użyciu każdego preparatu (3) opis ekspresji GalR1 i GlyT2 w NTS.

Nasze badanie wykazało, że w połączeniu z metodologią RNAscope, sukces IHC różnił się w świeżo mrożonych i utrwalonych preparatach mrożonych i zależał od lokalizacji docelowych białek w komórce. W naszych rękach znakowanie białek związanych z błoną zawsze kończyło się sukcesem. W przeciwieństwie do tego, IHC dla białka cytoplazmatycznego wymagało rozwiązania nawet w przypadkach, gdy białko cytoplazmatyczne było nadmiernie eksprymowane u transgenicznego zwierzęcia (Phox2b-GFP)11. Wreszcie, podczas gdy GalR1 ulega ekspresji w neuronach niekatecholaminergicznych w NTS, ekspresja GlyT2 jest nieobecna w NTS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Podsumowanie etapów wstępnego przetwarzania tkanek znajduje się na Rysunku 1. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wymogami Komisji ds. Opieki i Etyki Zwierząt Uniwersytetu Nowej Południowej Wales, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wykorzystania i opieki nad zwierzętami w celach naukowych (Australijska Krajowa Rada Badań nad Zdrowiem i Medycyną).

1. Przygotowanie próbek ze świeżo zamrożonej tkanki mózgowej

  1. Perfuzja transkardialna
    1. Przygotować heparynowany (2500 U/L) 0.1 M bufor fosforanowy (PB), pH 7.5. Przygotować zawiesinę etanolu z suchym lodem poprzez wymieszanie suchego lodu z etanolem. Temperatura takiej mieszaniny wyniesie około −72 °C i zostanie ona wykorzystana do natychmiastowego zamrożenia pobranej tkanki.
    2. Uśmiercić dorosłe myszy C57BL/6 oraz Phox2b-GFP11 (identyfikator bazy Mouse Genome Informatics MGI:5776545) poprzez podanie znieczulenia sodowym pentobarbitalem (70 mg/kg, i.p.), używając igły o rozmiarze 27.5 G.
      OSTROŻNIE: Pentobarbital jest barbituranem. W wysokich dawkach jest silnie toksyczny i może spowodować śmierć w wyniku zatrzymania oddechu. Przed użyciem należy zapoznać się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki zdrowotnej, kwestii prawnych oraz bezpieczeństwa materiałowego.
    3. Odsłonić serce i zakanulować lewą komorę za pomocą igły do pobierania (rozmiar 23 G). Przeprowadzić perfuzję transkardialną heparynowanym 0.1 M PB aż do całkowitego wypłukania krwi (2-3 minuty) przy szybkości przepływu 11-13 mL/min. Stopień wypłukania krwi określić poprzez monitorowanie zabarwienia wątroby oraz odcieku z prawego przedsionka12.
    4. Wyizolować mózg z jamy czaszki, natychmiast zatopić go w związku OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) w formie do kriotomii lub folii aluminiowej i umieścić w kąpieli z etanolu i suchego lodu. Zamrożoną tkankę w bloku przechowywać w szczelnym pojemniku w temperaturze - 80 °C do 3 miesięcy.
  2. Krojenie świeżo zamrożonej tkanki
    1. Ustawić temperaturę kriotomatu na -20 °C. Pozostawić tkankę zatopioną w OCT oraz uchwyt kriotomatu w urządzeniu przez ok. 30 minut w celu wyrównania temperatury.
      UWAGA: Tkankę należy przez cały czas utrzymywać w stanie zamrożonym; transportować tkankę z zamrażarki -80 °C do kriotomatu na suchym lodzie.
    2. Zamocować tkankę do schłodzonego uchwytu kriotomatu za pomocą związku OCT. W niniejszym protokole bloki tkankowe montowano na uchwycie w płaszczyźnie czołowej.
      UWAGA: Za pomocą żyletki usunąć nadmiar OCT z tkanki, aby zminimalizować ilość związku wycinanego przez kriotomat i następnie przenoszonego na szkiełko przedmiotowe.
    3. Wyciąć przekroje czołowe o grubości 14 µm i nanieść je na naładowane szkiełka mikroskopowe.
      1. Przed naniesieniem przekrojów ogrzać szkiełka do temperatury pokojowej. Po naniesieniu przekroju przechowywać szkiełka w kasetce wewnątrz kriotomatu.
      2. Jeśli na jednym szkiełku należy nanieść więcej niż jeden przekrój, ogrzać miejsce dla drugiego przekroju, przykładając palec do przeciwległej strony szkiełka przez 5-10 sekund, aby ułatwić przyleganie tkanki do szkła. Zimny przekrój tkankowy nie przywrze do zimnego szkiełka. Przekroje powinny przylegać do szkiełek płasko; ich zagięcie spowoduje odpadnięcie ze szkiełek podczas etapów płukania.
      3. W przypadku zauważenia pęknięć w przekrojach, zwiększyć temperaturę kriotomatu o 1-5 °C, aby temu zapobiec. Szczególnie ważne jest umieszczenie przekrojów tkankowych w bliskim sąsiedztwie na tym samym szkiełku. Zapobiegnie to marnowaniu sond FISH i odczynników podczas badania.
    4. Przekroje tkankowe naniesione na szkiełka przechowywać w szczelnym pojemniku w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.
      UWAGA: Przekroje należy przez cały czas utrzymywać w stanie zamrożonym i unikać cykli zamrażania i rozmrażania, aby zapobiec degradacji RNA. Transportować kasetkę ze szkiełek z kriotomatu do zamrażarki -80 °C na suchym lodzie.
  3. Fiksacja świeżo zamrożonej tkanki
    1. W dniu planowanego wykonania badania z użyciem sond FISH przygotować 4% paraformaldehyd (PFA) w 0.1 M PB, pH 7.5 (roztwór 4% PFA). Przefiltrować roztwór, przepuszczając go przez papier filtracyjny (Grade 1: 11 µm, Tabela materiałów) w lejku Büchnera lub filtrze tyglowym.
      OSTROŻNIE: PFA jest szkodliwy i toksyczny w przypadku kontaktu ze skórą lub inhalacji. Wszystkie procedury z roztworem PFA należy przeprowadzać w komorze dygestorium. Odpady z roztworu PFA należy utylizować ostrożnie, zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa.
    2. Schłodzić roztwór 4% PFA do 4 °C. Transportować tkankę na szkiełkach z zamrażarki -80 °C na suchym lodzie i natychmiast zanurzyć w schłodzonym utrwalaczu na 15 minut.
      UWAGA: Ważne jest, aby etap fiksacji nie przekraczał 15 minut, ponieważ nadmierne utrwalenie spowoduje nieswoiste tło fluorescencyjne.
  4. Odwadnianie świeżo zamrożonej tkanki
    1. Odwodnić przekroje tkankowe poprzez zanurzanie szkiełek w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu. W naczyniu Coplina najpierw zanurzyć w etanolu 50%, następnie 70% i na koniec w etanolu absolutnym, po 5 minut w każdym roztworze w temperaturze pokojowej. Powtórzyć ostatnią inkubację w etanolu absolutnym drugi raz.
    2. Osuszyć szkiełka na powietrzu i obrysować grupę przekrojów za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, dbając o to, aby obszar wewnętrzny był jak najmniejszy.
      UWAGA: Przed narysowaniem bariery hydrofobowej należy upewnić się, że szkiełko przedmiotowe jest całkowicie suche. Bariera hydrofobowa powinna całkowicie otaczać przekroje tkankowe bez przerw i musi być sucha przed dalszą obróbką.

2. Przygotowanie próbek utrwalonej mrożonej tkanki mózgowej

  1. Fiksacja poprzez perfuzję transkardialną
    1. Eutanazję myszy przeprowadza się poprzez znieczulenie pentobarbitalem sodu (70 mg/kg, i.p.), a następnie perfuzję transkardialną, najpierw 0,1 M PB, a potem 4% roztworem PFA. Fiksację prowadzi się przez 10 minut perfuzji z przepływem 11-13 mL/min.
    2. Po perfuzji i fiksacji wyizolować mózg z jamy czaszki i zanurzyć go na noc w 4% roztworze PFA w temperaturze 4 °C.
  2. Sekcjonowanie utrwalonej tkanki
    1. Mózg należy wypłukać w sterylnym 0,1 M roztworze soli fosforanowej (PBS) przed usunięciem błon oponowych za pomocą pęsety precyzyjnej przy użyciu mikroskopu sekcyjnego.
    2. Mózg należy precyzyjnie pociąć na bloki (oddzielając pień mózgu od przedmózgowia przed sekcjonowaniem w wibrotomie) przy użyciu matrycy do mózgu (Tabela materiałów). W szczególności pień mózgu należy przeciąć w części ogonowej na wysokości skrzyżowania piramid i odseparować móżdżek. Analogicznie należy przeciąć przedmózg bezpośrednio w części rostralnej względem skrzyżowania wzrokowego.
    3. Tkankę należy przymocować do stolika wibrotomu za pomocą cyjanoakrylanu i zatopić w 2% roztworze agaru.
    4. Za pomocą wibrotomu należy wykonać skrawki tkankowe o grubości 30 µm i przechowywać je w roztworze krioprotekcyjnym (30% sacharozy wolnej od RNazy, 30% glikolu etylenowego, 1% poliwinylopirolidonu (PVP-40) w 0,1 M PB, pH 7,4). Skrawki tkankowe można przechowywać w krioprotektorze w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy.
  3. Przygotowanie utrwalonych skrawków przed FISH
    1. W dniu przeprowadzania FISH wolno pływające skrawki należy przemyć trzykrotnie, przez 10 minut podczas każdego mycia, aby usunąć roztwór krioprotekcyjny. W celu mycia skrawki umieszcza się w 0,1 M PBS w 12-dołkowej płytce hodowlanej i miesza na rotacyjnym wstrząsarce (90 - 100 rpm).
    2. Po przemyciu, za pomocą pędzelka, należy nanieść skrawki na szklane laminki mikroskopowe i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 2 godziny.
      UWAGA: Skrawki powinny przylegać płasko do laminek, ponieważ wszelkie wyraźne zagięcia spowodują ich odklejenie podczas mycia.
    3. Za pomocą hydrofobowego pisaka do barier należy narysować obrys wokół skrawków, aby ograniczyć dostęp odczynników FISH wyłącznie do tkanek. Ponownie podkreśla się, że ważne jest zminimalizowanie powierzchni wewnętrznej obrysu narysowanego pisakiem.
      MOŻLIWY PUNKT PRZERWANIA: Skrawki można przechowywać w temperaturze pokojowej przez noc, aby kontynuować badanie następnego dnia.

3. Analiza FISH

UWAGA: Pozostała część protokołu odnosi się zarówno do mrożonych tkanek świeżych, jak i utrwalonych.

  1. Przygotowanie odczynników i instrumentów do etapów hybrydyzacji i amplifikacji.
    1. Ustaw inkubator laboratoryjny oraz łaźnię wodną na 40 °C.
    2. Przygotuj wilgotną, chronioną przed światłem komorę do inkubacji szkiełek. Nawilżenie zapobiega wysychaniu tkanek – szkiełka są bezpiecznie umieszczone nad wilgotnym zbiornikiem. Idealnie, jeśli komora jest wykonana z wytrzymałego polistyrenu, jest światłoszczelna i hermetyczna, aby utrzymać nasyconą atmosferę pary wodnej. Zamknięcie komory opiera się na minimalnym tarciu, aby uniknąć przemieszczania. Użyliśmy pudełka na szkiełka wyłożonego na dnie mokrymi chusteczkami laboratoryjnymi (Tabela materiałów). Umieść pudełko na szkiełka w inkubatorze, aby wstępnie ogrzać je do 40 °C.
    3. Podgrzej 50x Bufor do płukania (Tabela materiałów) oraz sondy do 40 °C przez 10 minut w łaźni wodnej, a następnie schłodź do temperatury pokojowej.
    4. Przygotuj 1 L 1x Buforu do płukania z roztworu stokowego o stężeniu 50x.
    5. Przygotuj mieszaninę sond (Tabela materiałów): sonda C1 jest gotowa do użycia w stężeniu stokowym, natomiast sondy C2 i C3 są dostarczane w stężeniu 50x i wymagają rozcieńczenia rozcieńczalnikiem dołączonym do zestawu.
      UWAGA: Mieszaniny sond można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
  2. Obróbka proteazą
    1. Inkubuj skrawki z Proteazą III (Tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      UWAGA: Upewnij się, że Proteaza III oraz odczynniki inkubacyjne w kolejnych procesach (mieszanina sond, roztwory amplifikacyjne, bufor blokujący i sera przeciwciał) całkowicie pokrywają skrawki. Do rozprowadzenia odczynnika na skrawku, aby pokryć cały obszar wewnątrz bariery hydrofobowej, można użyć końcówki pipety.
    2. Przepłucz szkiełka dwukrotnie 0,1 M PBS, po 2 minuty za każdym razem, w dużej plastikowej kwadratowej płytce Petriego. W tym przypadku użyto kwadratowej płytki do bioanaliz o wymiarach 245 mm x 245 mm (Tabela materiałów). Trzymając za jedną stronę płytki, przechylaj ją delikatnie 3-5 razy. Po płukaniu strząśnij nadmiar 0,1 M PBS ze szkiełka i natychmiast dodaj kolejny odczynnik. Nie dopuszczaj do wyschnięcia skrawków tkanki.
      UWAGA: Podczas każdego płukania szkiełka są zanurzone w roztworze w temperaturze pokojowej. Jest to schemat postępowania dla wszystkich kolejnych etapów płukania. Utrwalone skrawki o grubości 30 µm odrywają się od szkiełek łatwiej niż skrawki o grubości 14 µm, dlatego należy zachować ostrożność podczas płukania.
  3. Hybrydyzacja i amplifikacja
    1. Po wypłukaniu roztworu proteazy umieść szkiełka w nawilżonej, wstępnie ogrzanej komorze. Inkubuj skrawki z mieszaniną sond (Tabela materiałów) przez 2 godziny w temperaturze 40 °C w inkubatorze laboratoryjnym.
      UWAGA: Upewnij się, że odłożono co najmniej 2 skrawki dla sond kontrolnych dodatnich i ujemnych, aby ocenić jakość RNA w próbce i optymalną permeabilizację. Sondy kontrolne dodatnie celują w geny konstytutywne; w tym przypadku był to koktajl RNA celujący w ubikwitynę C (UBC; wysoka liczebność), peptydylo-propyloizomerazę B (PPIB; umiarkowana liczebność) i polimerazę RNA 2a (POLR2A; niska liczebność). Sondy kontrolne ujemne celują w bakteryjny gen 4-hydroksy-tetrahydrodipikolinianu reduktazy (DapB), który zazwyczaj nie występuje w próbkach mózgu myszy. Dodatni sygnał DapB wskazuje na sygnał nieswoisty i/lub zanieczyszczenie próbki bakteriami.
    2. Po hybrydyzacji z mieszaniną sond etapy amplifikacji sygnału polegają na inkubacji z Amp 1-FL (30 minut), następnie z Amp 2-FL (15 minut), a potem z Amp 3-FL (30 minut) i na koniec z Amp 4-FL (15 minut) – każdy etap w temperaturze 40 °C. Używając dostarczonych buteleczek z zakraplaczem, pokryj skrawki tkanki roztworem amplifikacyjnym. Po ostatnim etapie amplifikacji przystąp do analizy IHC.
    3. Płucz szkiełka dwukrotnie Buforem do płukania przez 2 minuty pomiędzy hybrydyzacją sond a każdym etapem amplifikacji.

4. Analiza IHC

  1. Etap blokowania w IHC
    1. Aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał, po przeprowadzeniu testu FISH inkubować skrawki przez 1 h w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym zawierającym 10% normalnego surowicy konia, 0,3% Tween20 w 1x TBSm (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% mertiolatu). Przeciwciała pierwszorzędowe przygotować w buforze rozcieńczającym zawierającym 1x TBSm, 5% normalnej surowicy konia i 0,1% Tween20. Dostawcy przeciwciał pierwszorzędowych są wymienieni w Tabeli Materiałów.
  2. Immunohistochemia
    1. Usunąć nadmiar buforu blokującego poprzez lekkie potrząśnięcie szkiełkiem i inkubować skrawki z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Przemyć szkiełka 3 razy (po 5 minut każdorazowo) roztworem 1x TBSm i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w rozcieńczalniku zawierającym 1x TBSm, 1% normalnej surowicy konia i 0,1% Tween20 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przeciwciała drugorzędowe użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
    3. Przemyć szkiełka 3 razy roztworem 1x TBSm (po 5 minut każdorazowo) przed przykryciem szkiełek medium montażowym z DAPI lub bez (Tabela Materiałów).

5. Obrazowanie

  1. Analizę barwienia immunocytochemicznego przeprowadźcie pod mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w kamerę (patrz Tabela materiałów (po szczegóły). Pozyskać reprezentatywne obrazy przy 20-krotnym powiększeniu i zapisać je w formacie plików TIFF.
  2. Wyeksportuj reprezentatywne obrazy do oprogramowania do przetwarzania obrazów (Tabela materiałów) w celu regulacji jasności/kontrastu, aby zwiększyć przejrzystość i zapewnić wierne odwzorowanie obrazu.

6. OPCJONALNIE: Analiza ilościowa transkryptów docelowych

UWAGA: Jest to artykuł metodologiczny i nie przedstawiono w nim wyników ilościowych. Metoda ilościowa zaprezentowana w niniejszym opracowaniu pochodzi z pracy Dereli et al.10.

  1. Należy pozyskać obrazy z obszarów zainteresowania zgodnie z opisem w punkcie 5.1, stosując te same ustawienia mikroskopu i kamery (takie jak czas ekspozycji i natężenie światła) dla wszystkich obrazów tego samego fluoroforu.
  2. Należy wykreślić profile neuronalne przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu (Tabela Materiałów).
  3. Należy wyrównać przekroje względem poziomu Bregma zgodnie ze stereotaktycznym atlasem mózgu13.
  4. Należy zastosować tę samą jasność i kontrast dla wszystkich obrazów tego samego fluoroforu. Należy brać pod uwagę wyłącznie neurony z jądrami zabarwionymi DAPI.
  5. Należy ręcznie policzyć liczbę komórek wykazujących ekspresję mRNA, białka, koekspresję mRNA/mRNA, białko/białko oraz mRNA/białko w obrębie obszaru zainteresowania.
  6. Aby zmniejszyć błąd systematyczny w wynikach eksperymentalnych, osoba dokonująca kwantyfikacji wyników nie powinna znać przydziału grup eksperymentalnych (metoda ślepej próby).
  7. Należy zastosować korektę Abercrombiego14 do całkowitej liczby komórek, korzystając z następującego równania Abercombiego:
    Skorygowana liczba komórek = ręcznie policzona liczba komórek x grubość przekroju / (grubość przekroju + rozmiar jądra)
    Na przykład dla przekrojów o grubości 14 µm, średnia szerokość jądra została obliczona na 7,7 ± 0,3 µm, a średnia grubość przekroju na 14 ± 1 µm na podstawie odpowiednio 30 komórek i 10 przekrojów u 5 zwierząt10. Zgodnie z równaniem Abercombiego, skorygowana liczba komórek wynosiłaby: ręcznie policzona liczba komórek x 14/(14+7,7).

Schemat perfuzji i ekstrakcji tkanki; metoda transkardialna; etapy przygotowania eksperymentu FISH.
Rysunek 1: Równoległy schemat etapów wstępnego przygotowania tkanki świeżo zamrożonej oraz utrwalonej paraformaldehydem. Etapy przetwarzania tkanki świeżo zamrożonej przedstawiono w ramkach z czerwoną obwódką, natomiast etapy dla tkanki utrwalonej paraformaldehydem (PFA) przedstawiono w ramkach z niebieską obwódką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu FISH i immunohistochemii; obejmuje hybrydyzację oraz etapy amplifikacji i znakowania białek.
Rysunek 2: Podsumowanie połączonej procedury z użyciem sondy FISH i immunohistochemii. Po wstępnym przygotowaniu tkanki, tkanka zamocowana na szkiełku zostaje obramowana za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, jak pokazano w pierwszej ramce, a następnie inkubowana w roztworze proteazy w temperaturze pokojowej. Po przemyciu tkankę przenosi się do inkubatora laboratoryjnego na 2 godziny w celu przeprowadzenia hybrydyzacji przed kolejnymi etapami amplifikacji. System hybrydyzacji in situ wykorzystuje zastrzeżony projekt „sondy Z”, preamplifikatory i amplifikatory, jak pokazano w ramkach 3-66. Po zakończeniu przetwarzania tkanki z sondą FISH, zostaje ona przemyta przed blokowaniem za pomocą normalnej surowicy konia. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym jest prowadzona przez noc w temperaturze 4 °C, aby zmaksymalizować wiązanie przeciwciało-antygen. Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym (2 godziny) była prowadzona w temperaturze pokojowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę łączenia multipleksowej hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) z fluorescencyjnym immunohistochemią (IHC) w celu lokalizacji ekspresji mRNA dla GalR1 i GlyT2, odpowiednio z wykorzystaniem tkanek świeżo zamrożonych oraz utrwalonych w paraformaldehydzie w jądrze tractus solitarii (NTS) myszy. Schemat przetwarzania tkanek, procedur FISH oraz IHC opisanych w metodach przedstawiono na Rysunku 1 oraz Rysunku 2. Tab...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W neuronaukach FISH i IHC są rutynowo wykorzystywane do badania organizacji przestrzennej i funkcjonalnego znaczenia mRNA lub białek w subpopulacjach neuronalnych. Protokół opisany w tym badaniu zwiększa zdolność do jednoczesnego wykrywania mRNA i białek w sekcjach mózgu. Nasz połączony test multipleksowy FISH-IHC umożliwił fenotypową identyfikację odrębnych subpopulacji neuronalnych w NTS zarówno w świeżo mrożonych, jak i utrwalonych preparatach mózgu. Projekt FISH-IHC w utrwalonych preparatach tkanek mrożonych pozwolił...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych DP180101890 grantu Discovery Project oraz grant Fundacji Badań Medycznych Rebecci L Cooper PG2018110

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ANIMALS
C57BL/6 myszAustralian BioResources, MossVale MGI: 2159769
Mysz Phox2b-eGFPAustralian BioResources, MossVale MGI: 5776545
ODCZYNNIKI
CyjanoakrylanLoctite
Glikol etylenowySigma-Aldrich324558
Heparyna-SódClifford Hallam Healthcare1070760Skonsultuj się z lokalnym lekarzem weterynarii lub apteką.
Lethabarb (pentabarbitol sodu) Eutanazja w wstrzyknięciuVirbac (Australia) Pty LtdNieSkonsultuj się z weterynarzem w celu uzyskania lokalnych przepisów farmaceutycznych dotyczących pentabarbitolu sodu
Agaroza w proszku klasy cząsteczkowejSigma Aldrich5077
Związek OCT, 118 mlScigen Ltd4586
Paraformaldehyd, bryłki, 95%Sigma-Aldrich441244-1KG
Poliwinylopirolidon o średniej mol 40 000 kg (PVP-40)Sigma-AldrichPVP40
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930Z lub bez zestawu
odczynników fluorescencyjnych DAPI RNAscope Multiplex (do 3-plex)Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)ADV320850Zawiera 50x bufor do płukania i RNazę proteazy III
Thermo-Fisher Scientific7003
Tris (hydroksymetyl)aminometanSigma-Aldrich252859
Tween-20, do biologii molekularnejSigma-AldrichP9416
EQUIPMENT
Inkubator stołowyMikroinkubator naukowy ThermolineModel: TEI-13G
Brain Matrix, Mysz, 30g Dorosły, Coronal, 1mmTed Pella15050
CryostatLeicaCM1950
Igła do rysowania (przekrój 23 cale)BD0288U07
Hydrofobowy długopis barierowyVector labsH-4000
Kimtech Science Kimwipes Delikatne chusteczki do zadańKimberley Clark Professional34120
Olympus BX51OlympusBX-51
PompaperystaltycznaSeria Coleparmer MasterflexL/S 
Aparat cyfrowy Retiga 2000RQImagingRET-2000R-F-CLR Kolorowyaparat
SuperFrost Plus Szkiełka Szkiełkowe SuperFrost Plus (białe)Termo-Fisher Scientific4951PLUS4
Mikrotom wibracyjny (Vibratome)jakościowa LeicaVT1200S
Whatman, klasa 1, średnica 110 mmMerckWHA1001110
OPROGRAMOWANIE
CorelDRAW Corel CorporationVersion 7
FIJI (ImageJ Distribution)Open Source/GNU General Public License (GPL)N/AImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. i in. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data" [ImageJ2: ImageJ dla następnej generacji naukowych danych obrazowych], BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z    i Fidżi: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. i in. (2012), "Fidżi: platforma open source do analizy obrazów biologicznych", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 
PIERWOTNE
Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozynyMilliporeSigma AB1542Poliklonalne owce (rozcieńczenie 1:1000), RRID: AB_90755
Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozyny, klon LNC1Millipore SigmaMAB318Mysi monoklonalny (rozcieńczenie 1:1000), RRID: AB_2201528
Przeciwciało przeciwpęcherzykowe transportera acetylocholiny (VAchT)Sigma-AldrichABN100Koza poliklonalna (rozcieńczenie 1:1000), RRID: AB_2630394
Przeciwciało GFPNovus BiologicalsNB600-308Poliklonalny królik (rozcieńczenie 1:1000), RRID: AB_10003058
Przeciwciało Phox2b (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-376997Mysi monoklonalny (rozcieńczenie 1:1000), RRID: AB_2813765
WTÓRNE
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min x bov, ck, gt, GP, sy hms, hrs, hu, ms, rat, shp sr prot) Jackson ImmunoResearch711-545-152Osioł anty-Królik (rozcieńczenie 1:400), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (h + L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch713-155-147Anty-owce osła (rozcieńczenie 1:400), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min x Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch705-175-147Osioł anty-kozy (rozcieńczenie 1:400), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min x Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)Jackson ImmunoResearch715-175-151Osioł anty-mysz (rozcieńczenie 1:400), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch713-175-147Anty-owce osła (rozcieńczenie 1:400), RRID: AB_2340730
RNASCOPE SONDES
Galanin Receptor 1 sonda oligonukleotydowaACDBio448821-C1celuje w bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Transporter glicyny 2 sonda oligonukleotydowaACDBio409741-C3celuje w bp 925 - 2153 (nr ref. Genebank: NM_148931.3)
Sonda oligonukleotydowa Phox2bACDBio407861-C2celuje w bp 1617 - 2790 (nr ref. Genebanku: NM_008888.3)
dotyczy Bibuła filtracyjna

Bibliografia

  1. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  2. Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
  3. Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
  4. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55(2014).
  5. Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
  6. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  7. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120(2015).
  8. Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).
  9. Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  10. Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343(2019).
  11. Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).
  14. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
  15. Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
  16. Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
  17. Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
  18. Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
  19. Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
  20. Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
  21. Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
  22. Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
  23. Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  24. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  25. Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
  26. Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
  27. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

RNAscope FISHświeżo zamrożona tkankautrwalone przekroje mózguznakowanie multipleksowesubkomórkowa lokalizacja białektraktowanie proteaząmikroskopia epifluorescencyjnajądra pnia mózgu
Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.