Artykuł metodologiczny

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

DOI:

10.3791/61709

⸱

25 czerwca 2021

 ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medical Sciences, University of New South Wales

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) to technika molekularna, która identyfikuje obecność i przestrzenną dystrybucję specyficznych transkryptów RNA w komórkach. Fenotypowanie neurochemiczne funkcjonalnie zidentyfikowanych neuronów zwykle wymaga jednoczesnego znakowania wieloma przeciwciałami (białko celujące) przy użyciu immunohistochemii (IHC) i optymalizacji hybrydyzacji in situ (celowanie w RNA), w tandemie. Można uzyskać "sygnaturę neurochemiczną" w celu scharakteryzowania poszczególnych neuronów, jednak czynniki komplikujące obejmują konieczność weryfikacji celów FISH i IHC przed połączeniem metod oraz ograniczoną liczbę RNA i białek, które mogą być celowane jednocześnie w tym samym odcinku tkanki.

Tutaj opisujemy protokół, wykorzystujący zarówno świeżo mrożone, jak i utrwalone preparaty mózgu myszy, który wykrywa wiele mRNA i białek w tej samej sekcji mózgu za pomocą RNAscope FISH, a następnie fluorescencji immunologicznej, odpowiednio. Używamy metody połączonej do opisania wzorca ekspresji mRNA o niskiej liczebności (np. receptor galaniny 1) i mRNA o wysokiej obfitości (np. transporter glicyny 2), w immunohistochemicznie zidentyfikowanych jądrach pnia mózgu.

Kluczowe kwestie dotyczące znakowania białek po teście FISH wykraczają poza przygotowanie tkanek i optymalizację etykietowania sondy FISH. Na przykład odkryliśmy, że na swoistość wiązania przeciwciał i znakowania może mieć szkodliwy wpływ etap proteazy w teście sondy FISH. Proteazy katalizują hydrolityczne rozszczepienie wiązań peptydowych, ułatwiając wnikanie sondy FISH do komórek, jednak mogą również trawić białko docelowe w kolejnym teście IHC, powodując wiązanie poza celem. Subkomórkowa lokalizacja docelowego białka jest kolejnym czynnikiem przyczyniającym się do sukcesu IHC po teście FISH probe. Zaobserwowaliśmy, że swoistość IHC jest zachowana, gdy docelowe białko jest związane z błoną, podczas gdy IHC ukierunkowane na białko cytoplazmatyczne wymagało rozległego rozwiązywania problemów. Wreszcie, stwierdziliśmy, że obsługa zamrożonej tkanki montowanej na szkiełku jest trudniejsza niż świeżo zamrożona tkanka, jednak jakość IHC była ogólnie lepsza w przypadku utrwalonej zamrożonej tkanki w połączeniu z RNAscope.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka i mRNA, które neurochemicznie definiują subpopulacje neuronów, są powszechnie identyfikowane odpowiednio za pomocą kombinacji immunohistochemii (IHC) i/lub hybrydyzacji in situ (ISH). Połączenie technik ISH z IHC ułatwia charakterystykę wzorców kolokalizacji unikalnych dla funkcjonalnych neuronów (kodowanie neurochemiczne) poprzez maksymalizację zdolności znakowania multipleksowego.

Metody fluorescencyjne ISH (FISH), w tym RNAscope, mają wyższą czułość i specyficzność w porównaniu do wcześniejszych metod wykrywania RNA, takich jak radioaktywne ISH i nieradioaktywne chromogenne ISH. FISH umożliwia wizualizację pojedynczych transkryptów mRNA jako punktowych plam barwionych 1. Co więcej, test RNAscope pozwala na znakowanie zwiększonej liczby celów RNA jednocześnie przy użyciu różnych znaczników fluoroforowych. Pomimo tych zalet, ograniczenia techniczne mogą wpływać na liczbę fluoroforów/chromogenów, które można zastosować w jednym eksperymencie. Należą do nich dostępność zestawów filtrów mikroskopowych; takie rozważania są spotęgowane, gdy identyfikacja neurochemiczna wykorzystuje połączone FISH i IHC, w porównaniu z użyciem każdej techniki osobno, ponieważ nieodłączne etapy optymalne dla jednej metody mogą być szkodliwe dla drugiej.

Poprzednie zastosowanie FISH w połączeniu z IHC wykazało ekspresję specyficznych celów komórkowych w ludzkich chłoniakach B-komórkowych2, zarodki piskląt3, zarodki danio pręgowanego4, mouse retina5 i komórki ucha wewnętrznego myszy6. W tych badaniach preparatyka tkankowa polegała na zatopieniu w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE)2,3,5 lub fresh whole mount4,6. W innych badaniach zastosowano chromogenny RNAscope na stałych preparatach mózgu myszy i szczura7,8,9. W szczególności Baleriola i wsp.8 opisał dwa różne preparaty tkankowe dla połączonego ISH-IHC; poprawiono sekcje mózgu myszy i sekcje ludzkiego mózgu FFPE. W niedawnej publikacji połączyliśmy FISH i fluorescencyjne IHC na świeżo mrożonych skrawkach, aby jednocześnie uwidocznić mRNA o niskiej obfitości (receptor galaniny 1, GalR1), mRNA o wysokiej obfitości (transporter glicyny 2, GlyT2) i białko pęcherzykowego transportera acetylocholiny (vAChT) 10 w siatkowatej formacji pnia mózgu.

Jądro przewodu samotnego (NTS) jest głównym obszarem mózgu zaangażowanym w funkcje autonomiczne. Ta heterogeniczna populacja neuronów, zlokalizowana w tyłomózgowiu, odbiera i integruje ogromną liczbę sygnałów autonomicznych, w tym tych, które regulują oddychanie. NTS zawiera kilka populacji neuronów, które mogą być fenotypowo charakteryzowane przez wzorzec ekspresji celów mRNA, w tym GalR1 i GlyT2 oraz markery białkowe dla enzymu hydroksylazy tyrozyny (TH) i czynnika transkrypcyjnego Paired-like homeobox 2b (Phox2b).

Właściciel RNAscope zaleca preparaty świeżo mrożonych tkanek, ale tkanka przygotowana przez transkardialną perfuzję całego zwierzęcia, wraz z długoterminową krioprotekcji (przechowywanie w temperaturze -20 °C) stałych zamrożonych skrawków tkanki, jest powszechna w wielu laboratoriach. W związku z tym staraliśmy się ustalić protokoły dla FISH w połączeniu z IHC przy użyciu świeżo mrożonych i utrwalonych zamrożonych preparatów tkankowych. W tym miejscu zapewniamy świeżo mrożone i utrwalone zamrożone skrawki mózgu: (1) protokół dla połączonych FISH i fluorescencyjnych IHC (2) opis jakości znakowania mRNA i białek wytwarzanych przy użyciu każdego preparatu (3) opis ekspresji GalR1 i GlyT2 w NTS.

Nasze badanie wykazało, że w połączeniu z metodologią RNAscope, sukces IHC różnił się w świeżo mrożonych i utrwalonych preparatach mrożonych i zależał od lokalizacji docelowych białek w komórce. W naszych rękach znakowanie białek związanych z błoną zawsze kończyło się sukcesem. W przeciwieństwie do tego, IHC dla białka cytoplazmatycznego wymagało rozwiązania nawet w przypadkach, gdy białko cytoplazmatyczne było nadmiernie eksprymowane u transgenicznego zwierzęcia (Phox2b-GFP)11. Wreszcie, podczas gdy GalR1 ulega ekspresji w neuronach niekatecholaminergicznych w NTS, ekspresja GlyT2 jest nieobecna w NTS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podsumowanie etapów wstępnego przetwarzania tkanek można znaleźć w Rysunek 1. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Komisją ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu Nowej Południowej Walii zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wykorzystywania i opieki nad zwierzętami do celów naukowych (Australijska Narodowa Rada Zdrowia i Badań Medycznych).

1. Przygotowanie próbki świeżo zamrożonej tkanki mózgowej

  1. Perfuzja przezsercowa
    1. Przygotować heparynizowany (2500 U/L) 0,1 M bufor fosforanowy (PB) o pH 7,5. Zrób zawiesinę etanolu z suchego lodu, mieszając suchy lód z etanolem. Będzie on miał temperaturę około -72 °C i zostanie wykorzystany do natychmiastowego zamrożenia pobranej tkanki.
    2. Eutanazja dorosłych myszy C57BL/6 i Phox2b-GFP11 (identyfikator bazy danych Mouse Genome Informatics MGI:5776545) przez znieczulenie pentobarbitalem sodu (70 mg/kg, i.p.), przy użyciu igłomierza 27,5 cala.
      UWAGA: Pentobarbital jest barbituranem. Jest ostro toksyczny w dużych dawkach i może spowodować śmierć przez zatrzymanie oddechu. Przed użyciem należy zapoznać się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki zdrowotnej, prawem i bezpieczeństwem materiałów.
    3. Odsłoń serce i kaniuluj lewą komorę za pomocą igły do pobierania (średnica 23 cale). Wykonaj perfuzję przezsercową heparynizowaną 0,1 M PB, aż krew się oczyści (2-3 minuty) z szybkością przepływu 11-13 ml / min. Określ oczyszczanie krwi, monitorując zabarwienie wątroby i wydzieliny z prawego przedsionka12.
    4. Odizoluj mózg od jamy czaszki, natychmiast zanurz go w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w folii kriomoldowej lub aluminiowej i umieść na kąpieli etanolowej z suchym lodem. Zamrożoną osadzoną tkankę należy przechowywać w hermetycznym pojemniku w temperaturze -80 °C przez okres do 3 miesięcy.
  2. Cięcie świeżo zamrożonych tkanek
    1. Ustaw temperaturę kriostatu na -20 °C. Pozostaw tkankę osadzoną w OCT i uchwyt do kriostatu w kriostacie na ~30 minut, aby umożliwić zrównoważenie do nowej temperatury.
      UWAGA: Utrzymuj tkankę zamrożoną przez cały czas; przetransportować tkankę z zamrażarki o temperaturze -80 °C do kriostatu na suchym lodzie.
    2. Przymocuj tkankę do wstępnie schłodzonego uchwytu kriostatu za pomocą związku OCT. W tym protokole bloki tkanek zostały zamontowane na uchwycie w płaszczyźnie koronalnej.
      UWAGA: Odetnij nadmiar OCT z tkanki za pomocą żyletki, aby zminimalizować ilość OCT przecinaną przez kriostat, a następnie przenoszoną na szkiełko podstawowe.
    3. Wytnij przekroje koronalne o grubości 14 μm i zamontuj je na naładowanych szklanych szkiełkach mikroskopowych.
      1. Przed zamontowaniem sekcji rozgrzej prowadnice do temperatury pokojowej. Po zamontowaniu sekcji należy przechowywać szkiełka w pudełku na suwaki w kriostacie.
      2. Jeśli na jednym slajdzie musi być zamontowana więcej niż jedna sekcja, ogrzej obszar drugiej sekcji, kładąc palec po przeciwnej stronie szkiełka na 5-10 sekund, aby ułatwić przyleganie sekcji do szkiełka. Zimny wycinek tkanki nie przyczepi się do zimnego szkiełka. Sekcje powinny przylegać do zjeżdżalni płasko; Złożenie spowoduje, że spadną one ze szkiełek podczas prania.
      3. Jeśli w sekcjach zauważysz pęknięcia, zwiększ temperaturę kriostatu o 1-5 °C, aby tego uniknąć. Szczególnie ważne jest, aby na tym samym szkiełku umieścić skrawki tkanek w bliskiej odległości od siebie. Zapobiegnie to marnotrawstwu sond i odczynników FISH podczas testu.
    4. Skrawki tkanek zamontowane na szkiełkach podstawowych należy przechowywać w hermetycznym pojemniku w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
      UWAGA: Skrawki należy zawsze przechowywać w stanie zamrożonym i unikać cykli zamrażania i rozmrażania, aby zapobiec degradacji RNA. Przetransportować pojemnik na szkiełka z wnętrza kriostatu do zamrażarki o temperaturze -80 °C na suchym lodzie.
  3. Utrwalanie świeżo zamrożonej tkanki
    1. W dniu, w którym ma być wykonany test FISH, należy przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M PB, pH 7,5 (4% roztwór PFA). Filtrować, przepuszczając przez bibułę filtracyjną (stopień 1: 11 μm, tabela materiałów) w lejku Buchnera lub filtrze tyglowym.
      UWAGA : PFA jest szkodliwy i toksyczny w kontakcie ze skórą lub wdychaniu . Wszystkie zabiegi z roztworem PFA należy wykonywać w komorze dygestoria. Odpady roztworu PFA należy utylizować ostrożnie, zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa.
    2. Schłodzić 4% roztwór PFA do temperatury 4 °C. Chusteczkę nasączkową należy przetransportować z zamrażarki o temperaturze -80 °C w suchym lodzie i natychmiast zanurzyć ją w wstępnie schłodzonym utrwalaczu na 15 minut.
      UWAGA: Ważne jest, aby ten etap fiksacji nie przekraczał 15 minut, ponieważ nadmierne utrwalenie spowoduje niespecyficzne oznakowanie tła.
  4. Odwodnienie świeżo zamrożonych tkanek
    1. Odwodnić skrawki tkanek, zanurzając szkiełka w stopniowanych stężeniach etanolu. W słoiku Coplin najpierw zanurz w 50%, następnie w 70%, a na końcu w etanolu absolutnym, na 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć końcową bezwzględną inkubację etanolu po raz drugi.
    2. Suche szkiełka na powietrzu i obrysować grupę sekcji za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, upewniając się, że powierzchnia wewnętrzna jest ograniczona do minimum.
      UWAGA: Upewnij się, że szkiełko jest całkowicie suche przed narysowaniem bariery hydrofobowej. Bariera hydrofobowa powinna otaczać skrawki tkanek całkowicie bez szczelin i musi być sucha przed dalszą obróbką.

2. Przygotowanie próbki zamrożonej tkanki mózgowej

  1. Zespolenie perfuzji przezsercowej
    1. Eutanazja myszy przez znieczulenie pentobarbitalem sodu (70 mg / kg, i.p), a następnie perfuzją przezsercową, najpierw 0,1 M PB, a następnie 4% roztworem PFA. Utrwal za pomocą 10 minut perfuzji w tempie 11-13 ml/min.
    2. Po utrwaleniu perfuzji odizolować mózg od jamy czaszki i zanurzyć na noc w 4% roztworze PFA w temperaturze 4 °C.
  2. Cięcie tkanek utrwalonych
    1. Wypłucz mózg w sterylnym 0,1 M roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przed usunięciem warstw opon mózgowych, za pomocą mikroskopu preparacyjnego, za pomocą cienkich kleszczy.
    2. Dokładnie pokrój mózg na bloki (oddziel pień mózgu od przodomózgowia przed sekcją wibratomową) za pomocą matrycy mózgowej (tabela materiałów). W szczególności przeciąć pień mózgu doogonowo w miejscu odcięcia piramidy i wypreparować móżdżek. Podobnie, przeciąć przodomózgowie bezpośrednio rostralnie do skrzyżowania wzrokowego.
    3. Przymocuj tkankę do wibrującego uchwytu mikrotomowego za pomocą cyjanoakrylanu i zanurz w 2% roztworze agaru.
    4. Wyciąć skrawki tkanek o grubości 30 μm za pomocą mikrotomu wibracyjnego i przechowywać pocięte skrawki w roztworze krioprotektantu (30% sacharozy wolnej od RNazy, 30% glikolu etylenowego, 1% poliwinylopirolidonu (PVP-40), w 0,1 M PB, pH 7,4). Wycinki tkanek mogą być przechowywane w krioprotektancie w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
  3. Przygotowanie stałych sekcji przed FISH
    1. W dniu FISH umyj swobodnie pływające sekcje trzy razy, po 10 minut na mycie, aby usunąć roztwór krioprotektantu. Aby umyć, umieść skrawki w 0,1 M PBS na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowych i wymieszaj na wytrząsarce z obrotową platformą (90 - 100 obr./min).
    2. Po umyciu za pomocą pędzla zamontuj skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych i schnij na powietrzu przez co najmniej 2 godziny.
      UWAGA: Sekcje powinny przylegać płasko do szkiełek, ponieważ wszelkie wyraźne fałdy spowodują ich oderwanie się podczas prania.
    3. Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj barierę wokół sekcji, aby ograniczyć odczynniki FISH do sekcji. Po raz kolejny ważne jest, aby zminimalizować wewnętrzną powierzchnię konturu narysowanego pisakiem barierowym.
      MOŻLIWY PUNKT PRZERWANIA: Skrawki można przechowywać w temperaturze pokojowej przez noc, aby kontynuować test następnego dnia.

3. Test RYB

UWAGA: Reszta protokołu dotyczy zarówno świeżo zamrożonej, jak i utrwalonej zamrożonej tkanki.

  1. Przygotuj odczynniki i instrumenty do etapów hybrydyzacji i amplifikacji.
    1. Ustawić inkubator stołowy i łaźnię wodną na temperaturę 40 °C.
    2. Przygotuj nawilżoną, chronioną przed światłem komorę do inkubacji szkiełek. Nawilżanie zapobiega wysuszaniu tkanek - szkiełka są bezpiecznie umieszczone nad wilgotnym zbiornikiem. Idealnie, komora jest wykonana z wytrzymałego polistyrenu, jest światłoszczelna i szczelna, aby utrzymać nasyconą atmosferę pary wodnej. Zamknięcie komory opiera się na minimalnym tarciu, aby uniknąć ruchu. Użyliśmy pudełka ze szkiełkami wyłożonego mokrymi chusteczkami laboratoryjnymi (Tabela Materiałów) na dole. Umieścić pojemnik na szkiełka w inkubatorze, aby ogrzać go do 40 °C.
    3. Podgrzej 50x bufor do płukania (tabela materiałów) i sondy do 40 °C przez 10 minut, używając łaźni wodnej, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.
    4. Przygotuj 1 l 1x buforu do płukania z 50-krotnego stężenia bulionu.
    5. Przygotuj mieszaninę sondy (tabela materiałów): sonda C1 jest gotowa do użycia przy stężeniu podstawowym, podczas gdy sondy C2 i C3 są wysyłane w stężeniu 50x i wymagają rozcieńczenia rozcieńczalnikiem dostarczonym w zestawie.
      UWAGA: Mieszaniny sond można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
  2. Leczenie proteazy
    1. Inkubować skrawki z proteazą III (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      UWAGA: Upewnij się, że proteaza III i odczynniki do inkubacji w dalszych procesach (mieszanina sondy, roztwory amplifikacyjne, bufor blokujący i surowice przeciwciał) całkowicie pokrywają sekcje. Końcówka pipety może być użyta do rozprowadzenia odczynnika na sekcji, aby pokryć cały obszar wewnątrz bariery hydrofobowej.
    2. Umyj szkiełka dwukrotnie 0,1 M PBS, za każdym razem przez 2 minuty, na dużej plastikowej kwadratowej szalce Petriego. W tym przypadku użyto kwadratowej płytki do testów biologicznych o wymiarach 245 mm x 245 mm (tabela materiałów). Przytrzymaj z jednej strony naczynie i delikatnie przechyl 3-5 razy. Po umyciu strzepnąć nadmiar 0,1 M PBS ze szkiełka i natychmiast dodać następny odczynnik. Nie dopuścić do wyschnięcia skrawków tkanki.
      UWAGA: Podczas każdego prania szkiełka zanurza się w roztworze o temperaturze pokojowej. Jest to przepływ pracy dla wszystkich kolejnych etapów mycia. Stałe sekcje o grubości 30 μm łatwiej usuwają się ze szkiełek niż sekcje o grubości 14 μm, należy zachować ostrożność podczas prania.
  3. Hybrydyzacja i amplifikacja
    1. Po zmyciu roztworu proteazy umieść szkiełka w nawilżonej, wstępnie ogrzanej komorze. Inkubować sekcje z mieszaniną sondy (tabela materiałów) przez 2 godziny w temperaturze 40 °C w inkubatorze stołowym.
      UWAGA: Upewnij się, że są co najmniej 2 sekcje przeznaczone na sondy kontroli dodatniej i ujemnej, aby ocenić jakość próbki RNA i optymalną przepuszczalność. Sondy kontroli pozytywnej są ukierunkowane na geny związane z utrzymaniem porządku; w tym przypadku był to koktajl RNA ukierunkowany na ubikwitynę C (UBC; wysoka obfitość), peptydylopropylową izomerazę B (PPIB; umiarkowana obfitość) i polimerazę RNA 2a (POLR2A; niska obfitość). Sondy kontroli ujemnej są ukierunkowane na bakteryjny gen reduktazy 4-hydroksy-tetrahydrodipifolinianowej (DapB), który zwykle jest nieobecny w próbkach mózgu myszy. Dodatni sygnał DapB wskazuje na niespecyficzny sygnał i/lub zanieczyszczenie bakteryjne próbki.
    2. Po hybrydyzacji z mieszaniną sondy, etapy wzmacniania sygnału składają się z inkubacji z Amp 1-FL (30 minut), następnie z Amp 2-FL (15 minut), następnie Amp 3-FL (30 minut) i na końcu Amp 4-FL (15 minut) - każdy w temperaturze 40 °C. Korzystając z dołączonych butelek z zakraplaczem, przykryj skrawki tkanek roztworem amplifikacyjnym. Przejdź do testu IHC po ostatnim kroku amplifikacji.
    3. Przepłukać szkiełka buforem do płukania dwukrotnie przez 2 minuty między hybrydyzacją sondy a każdym etapem amplifikacji.

4. Test IHC

  1. Stopień blokujący IHC
    1. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał, inkubować skrawki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym zawierającym 10% normalnej surowicy końskiej, 0,3% Tween20 w 1x TBSm (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% mertionianu) po teście FISH. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w buforze rozcieńczającym zawierającym 1x TBSm, 5% normalnej surowicy końskiej i 0,1% Tween20. Pierwszorzędowi dostawcy przeciwciał są wymienieni w Tabeli Materiałów.
  2. Immunohistochemia
    1. Usunąć nadmiar buforu blokującego, przesuwając szkiełko i inkubować sekcje z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Przemyć szkiełka 3 razy (po 5 minut każde) 1x TBSm i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym w rozcieńczalniku zawierającym 1x TBSm, 1% normalnej surowicy końskiej i 0,1% Tween20 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przeciwciała drugorzędowe stosowane w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
    3. Umyj szkiełka 3 razy 1x TBSm (5 minut każde) przed nakryciem za pomocą medium montażowego z lub bez DAPI (Tabela Materiałów).

5. Obrazowanie

  1. Zbadaj barwienie immunologiczne pod mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w kamerę (szczegółowe informacje znajdują się w tabeli materiałów). Uzyskuj reprezentatywne obrazy w 20-krotnym powiększeniu i zapisuj je jako pliki TIFF.
  2. Eksportuj reprezentatywne obrazy do oprogramowania do przetwarzania obrazu (tabela materiałów) w celu dostosowania jasności/kontrastu w celu zwiększenia klarowności i odzwierciedlenia prawdziwego renderowania.

6. OPCJONALNIE: Analiza ilościowa docelowych transkryptów

UWAGA: To jest artykuł o metodach i wyniki ilościowe nie są dostarczane. Przedstawiona tutaj metoda kwantyfikacji pochodzi z Dereli et al.10.

  1. Uzyskaj obrazy z obszarów zainteresowania, jak wyjaśniono w 5.1 i zastosuj te same ustawienia mikroskopu i kamery (takie jak czas ekspozycji i natężenie światła) do wszystkich obrazów tego samego fluoroforu.
  2. Wykreśl profile neuronalne za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (tabela materiałów).
  3. Wyrównaj sekcje z odniesieniem do poziomu Bregma zgodnie ze stereotaktycznym atlasem mózgu13.
  4. Zastosuj tę samą jasność i kontrast do wszystkich obrazów tego samego fluoroforu. Weź pod uwagę tylko neurony z jądrami barwionymi DAPI.
  5. Ręcznie policz liczbę komórek mRNA, ekspresji białka, mRNA/mRNA, białka/białka i mRNA/białka koeksprymujących komórki w interesującym Cię regionie.
  6. Aby zmniejszyć stronniczość w wynikach eksperymentalnych, niech osoba kwantyfikująca wyniki eksperymentalne jest ślepa na grupy eksperymentalne.
  7. Zastosuj poprawkę Abercrombiego14 do całkowitej liczby komórek, używając następującego równania Abercombiego:
    Poprawiona liczba komórek = ręczna liczba komórek x grubość sekcji / (grubość sekcji + rozmiar jądra)
    Na przykład dla odcinków o grubości 14 μm średnia szerokość jądra wynosi 7,7 ± 0,3 μm, a średnia grubość przekroju wynosi 14 ± 1 μm na podstawie odpowiednio 30 komórek i 10 sekcji u 5 zwierząt10. Zgodnie z równaniem Abercrombiego, skorygowana liczba komórek to ręczna liczba komórek x 14/(14+7,7).

Schemat blokowy przetwarzania tkanek: perfuzja przezsercowa, sekcja do kriostatu/wibratomi, przygotowanie FISH.
Rysunek 1: Równoległy przebieg etapów wstępnego przetwarzania tkanek zarówno dla świeżo mrożonych, jak i utrwalonych paraformaldehydowych tkanek. Etapy przetwarzania świeżo zamrożonych tkanek są wyświetlane w czerwonych ramkach, natomiast etapy przetwarzania tkanek utrwalonych paraformaldehydem (PFA) są wyświetlane w niebieskich ramkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i diagram przepływu pracy immunohistochemii.
Rysunek 2: Podsumowanie połączonej procedury badania FISH i immunohistochemii. Po wstępnym przetworzeniu tkanki, tkanka zamontowana na szkiełku jest otoczona za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, jak pokazano na pierwszej klatce, i inkubowana w roztworze proteazy w temperaturze pokojowej. Po przemyciu tkanka jest przenoszona do inkubatora laboratoryjnego w celu hybrydyzacji na 2 godziny przed sekwencyjnymi etapami amplifikacji. System hybrydyzacji in situ wykorzystuje zastrzeżoną konstrukcję "sondy Z", przedwzmacniaczy i wzmacniaczy, jak widać w klatkach 3-66. Po przetworzeniu sondy FISH tkanka jest myta przed zablokowaniem normalną surowicą końską. Pierwotną inkubację przeciwciał przeprowadza się przez noc w temperaturze 4 °C, aby zmaksymalizować wiązanie przeciwciało-antygen. Drugorzędową inkubację przeciwciał (2 godziny) przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy metodę łączenia multipleksu FISH z fluorescencyjnym IHC w celu lokalizacji ekspresji mRNA dla GalR1 i GlyT2 przy użyciu świeżo mrożonych i paraformaldehydowych tkanek odpowiednio w mysim NTS. Przebieg procesów przetwarzania tkanek, FISH i IHC opisanych w metodach jest wyświetlany na Rysunek 1 i Rysunek 2. Tabela 1 zawiera podsumowanie kombinacji sondy FISH i przeciwciał zastosowanych na każdym rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W neuronaukach FISH i IHC są rutynowo wykorzystywane do badania organizacji przestrzennej i funkcjonalnego znaczenia mRNA lub białek w subpopulacjach neuronalnych. Protokół opisany w tym badaniu zwiększa zdolność do jednoczesnego wykrywania mRNA i białek w sekcjach mózgu. Nasz połączony test multipleksowy FISH-IHC umożliwił fenotypową identyfikację odrębnych subpopulacji neuronalnych w NTS zarówno w świeżo mrożonych, jak i utrwalonych preparatach mózgu. Projekt FISH-IHC w utrwalonych preparatach tkanek mrożonych pozwolił...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych DP180101890 grantu Discovery Project oraz grant Fundacji Badań Medycznych Rebecci L Cooper PG2018110

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ANIMALS
C57BL/6 myszAustralian BioResources, MossVale MGI: 2159769
Mysz Phox2b-eGFPAustralian BioResources, MossVale MGI: 5776545
ODCZYNNIKI
CyjanoakrylanLoctite
Glikol etylenowySigma-Aldrich324558
Heparyna-SódClifford Hallam Healthcare1070760Skonsultuj się z lokalnym lekarzem weterynarii lub apteką.
Lethabarb (pentabarbitol sodu) Eutanazja w wstrzyknięciuVirbac (Australia) Pty LtdNieSkonsultuj się z weterynarzem w celu uzyskania lokalnych przepisów farmaceutycznych dotyczących pentabarbitolu sodu
Agaroza w proszku klasy cząsteczkowejSigma Aldrich5077
Związek OCT, 118 mlScigen Ltd4586
Paraformaldehyd, bryłki, 95%Sigma-Aldrich441244-1KG
Poliwinylopirolidon o średniej mol 40 000 kg (PVP-40)Sigma-AldrichPVP40
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930Z lub bez zestawu
odczynników fluorescencyjnych DAPI RNAscope Multiplex (do 3-plex)Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)ADV320850Zawiera 50x bufor do płukania i RNazę proteazy III
Thermo-Fisher Scientific7003
Tris (hydroksymetyl)aminometanSigma-Aldrich252859
Tween-20, do biologii molekularnejSigma-AldrichP9416
EQUIPMENT
Inkubator stołowyMikroinkubator naukowy ThermolineModel: TEI-13G
Brain Matrix, Mysz, 30g Dorosły, Coronal, 1mmTed Pella15050
CryostatLeicaCM1950
Igła do rysowania (przekrój 23 cale)BD0288U07
Hydrofobowy długopis barierowyVector labsH-4000
Kimtech Science Kimwipes Delikatne chusteczki do zadańKimberley Clark Professional34120
Olympus BX51OlympusBX-51
PompaperystaltycznaSeria Coleparmer MasterflexL/S 
Aparat cyfrowy Retiga 2000RQImagingRET-2000R-F-CLR Kolorowyaparat
SuperFrost Plus Szkiełka Szkiełkowe SuperFrost Plus (białe)Termo-Fisher Scientific4951PLUS4
Mikrotom wibracyjny (Vibratome)jakościowa LeicaVT1200S
Whatman, klasa 1, średnica 110 mmMerckWHA1001110
OPROGRAMOWANIE
CorelDRAW Corel CorporationVersion 7
FIJI (ImageJ Distribution)Open Source/GNU General Public License (GPL)N/AImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. i in. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data" [ImageJ2: ImageJ dla następnej generacji naukowych danych obrazowych], BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z    i Fidżi: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. i in. (2012), "Fidżi: platforma open source do analizy obrazów biologicznych", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 
PIERWOTNE
Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozynyMilliporeSigma AB1542Poliklonalne owce (rozcieńczenie 1:1000), RRID: AB_90755
Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozyny, klon LNC1Millipore SigmaMAB318Mysi monoklonalny (rozcieńczenie 1:1000), RRID: AB_2201528
Przeciwciało przeciwpęcherzykowe transportera acetylocholiny (VAchT)Sigma-AldrichABN100Koza poliklonalna (rozcieńczenie 1:1000), RRID: AB_2630394
Przeciwciało GFPNovus BiologicalsNB600-308Poliklonalny królik (rozcieńczenie 1:1000), RRID: AB_10003058
Przeciwciało Phox2b (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-376997Mysi monoklonalny (rozcieńczenie 1:1000), RRID: AB_2813765
WTÓRNE
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min x bov, ck, gt, GP, sy hms, hrs, hu, ms, rat, shp sr prot) Jackson ImmunoResearch711-545-152Osioł anty-Królik (rozcieńczenie 1:400), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (h + L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch713-155-147Anty-owce osła (rozcieńczenie 1:400), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min x Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch705-175-147Osioł anty-kozy (rozcieńczenie 1:400), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min x Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)Jackson ImmunoResearch715-175-151Osioł anty-mysz (rozcieńczenie 1:400), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch713-175-147Anty-owce osła (rozcieńczenie 1:400), RRID: AB_2340730
RNASCOPE SONDES
Galanin Receptor 1 sonda oligonukleotydowaACDBio448821-C1celuje w bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)
Transporter glicyny 2 sonda oligonukleotydowaACDBio409741-C3celuje w bp 925 - 2153 (nr ref. Genebank: NM_148931.3)
Sonda oligonukleotydowa Phox2bACDBio407861-C2celuje w bp 1617 - 2790 (nr ref. Genebanku: NM_008888.3)
dotyczy Bibuła filtracyjna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  2. Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
  3. Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
  4. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55(2014).
  5. Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
  6. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  7. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120(2015).
  8. Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).
  9. Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  10. Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343(2019).
  11. Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).
  14. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
  15. Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
  16. Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
  17. Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
  18. Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
  19. Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
  20. Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
  21. Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
  22. Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
  23. Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  24. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  25. Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
  26. Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
  27. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNAscope FISHwie o zamro ona tkankautrwalone przekroje m zguznakowanie multipleksowesubkom rkowa lokalizacja bia ektraktowanie proteazmikroskopia epifluorescencyjnaj dra pnia m zgu

Powiązane artykuły