Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Julia Ratke; Franziska Krämer; Frederic Strobl

doi:10.3791/61713

Method Article

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

DOI:

10.3791/61713

⸱

September 9th, 2020

Julia Ratke*¹ , Franziska Krämer*¹ , Frederic Strobl¹

¹Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF - MC), Goethe-Universität

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych oferuje skuteczne rozwiązania do badania złożonych procesów w wielu biologicznie istotnych skalach. Konfiguracje oparte na komorze na próbki, które są specjalnie zaprojektowane w celu zachowania trójwymiarowej integralności próbki i zwykle charakteryzują się rotacją próbki, są najlepszym wyborem w biologii rozwoju. Na przykład wykorzystano je do udokumentowania całej morfogenezy embrionalnej muszki owocowej Drosophila melanogaster i chrząszcza mącznego Tribolium castaneum. Jednak wiele dostępnych protokołów obrazowania na żywo zapewnia tylko ramy eksperymentalne dla pojedynczych zarodków. Szczególnie w przypadku badań porównawczych takie podejścia są niewygodne, ponieważ na sekwencyjnie obrazowane próbki wpływa wariancja otoczenia. Co więcej, ogranicza to liczbę próbek, które można oznaczyć w danym czasie. Zapewniamy eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo, które zwiększają przepustowość w konfiguracjach opartych na komorze na próbki, a tym samym zapewniają podobne warunki otoczenia dla wszystkich próbek. Po pierwsze, zapewniamy wytyczne dotyczące kalibracji mikroskopów fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi. Po drugie, proponujemy metodę montowania wielu zarodków, która jest zgodna z rotacją próbek. Po trzecie, udostępniamy przykładowe trójwymiarowe zestawy danych obrazowania na żywo Drosophila, dla których zestawiamy trzy linie transgeniczne z fluorescencyjnie znakowanymi jądrami, a także Tribolium, dla których porównujemy wydajność trzech podlinii transgenicznych, które przenoszą ten sam transgen, ale w różnych lokalizacjach genomowych. Nasz protokół został specjalnie zaprojektowany do badań porównawczych, ponieważ proaktywnie zajmuje się wariancją otoczenia, która jest zawsze obecna w sekwencyjnym obrazowaniu na żywo. Jest to szczególnie ważne dla analiz ilościowych i charakterystyki fenotypów aberracyjnych, które wynikają np. z eksperymentów z nokautem. Co więcej, zwiększa ogólną przepustowość, co jest bardzo wygodne, gdy dostęp do mikroskopów fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi jest ograniczony. Wreszcie, proponowana metoda montażu może być dostosowana do innych gatunków owadów i innych organizmów modelowych, np. danio pręgowanego, w zasadzie bez wysiłku optymalizacyjnego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna jest jedną z najważniejszych technik obrazowania w naukach przyrodniczych, szczególnie w biologii komórkowej i rozwojowej. W konfokalnych mikroskopach fluorescencyjnych¹, które są najnowocześniejsze w trójwymiarowym obrazowaniu fluorescencyjnym od połowy lat 90., ta sama soczewka jest używana do wzbudzania fluoroforu i wykrywania światła emisyjnego. Wiązka lasera rozświetlającego wzbudza wszystkie fluorofory wzdłuż osi oświetlenia/detekcji, a odpowiedni sygnał nieostry jest rozróżniany przed wykryciem przez otwór otworkowy. W związku z tym dla każdego dwuwymiarowego obrazu oświetlana jest cała próbka. W związku z tym....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Praca przygotowawcza

Wybierz kombinację soczewki oświetleniowej/soczewki detekcyjnej/kamery dla LSFM, która odpowiada pytaniu naukowemu i ustaw mikroskop. Wielkość pola widzenia to iloraz wielkości chipa kamery i powiększenia soczewki detekcyjnej. Soczewka oświetleniowa powinna być tak dobrana, aby całe pole widzenia było pokryte mniej więcej płaskim arkuszem światła³⁴. W tabeli 1 wymieniono trzy zalecane kombinacje.
Aby przygotować porcje agarozy i naczynia do pobierania, dodaj 2 g niskotopliwej agarozy do 200 ml autoklawowanej wody z kranu i podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej o mocy 600-800 W....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy dla porównawczego obrazowania fluorescencji na żywo w LSFM opartych na komorze na próbki. Na przykład, ramy te mogą być wykorzystane do zestawienia (i) zarodków dwóch lub więcej gatunków, (ii) zarodków linii, w których jeden lub więcej genów jest znokautowanych oraz kontroli typu dzikiego, (iii) wielu zarodków tej samej linii transgenicznej, (iv) zarodków z różnych linii transgenicznych, lub (v) zarodków z podlinii, które są nosicielami tego samego transgenu, ale w różnych loka.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z wyłącznych obszarów zastosowań LSFM jest biologia rozwojowa. W tej dyscyplinie ważne jest przyjrzenie się żywym okazom, w przeciwnym razie procesy morfogenetyczne nie mogą być opisane w sposób dynamiczny. Eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo w LSFM opartych na komorze próbek, jak opisano tutaj, są wygodne z dwóch głównych powodów.

Wariancja otoczenia, która jest nieunikniona w sekwencyjnym obrazowaniu na żywo, może być proaktywnie eliminowana. W obrazowaniu na żyw.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Ernstowi H. K. Stelzerowi za możliwość skorzystania z jego zasobów, jak również cennych komentarzy dotyczących manuskryptu, Anicie Anderl za wsparcie w obrazowaniu na żywo Tribolium, Svenowi Plathowi za wsparcie techniczne, a także Ilanowi Davisowi, Nicole Grieder i Geroldowi Schubigerowi za udostępnienie swoich transgenicznych linii Drosophila za pośrednictwem Bloomington Stock Center.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Płytka 6-dołkowa	Orange Scientific	4430500
24-dołkowa płytka	Orange	Scientific 4430300	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium
35-mm i Oslash; Szalka Petriego	Fisher Scientific	153066	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila.
90 mm i Oslash; szalka Petriego	Fisher Scientific	L9004575
100 µ m Sitko do komórek o wielkości oczek	BD Biosciences	352360
250 &mikro; m sito o rozmiarze oczek	VWR International	200.025.222-038	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium
300 µ m sito o rozmiarze oczek	VWR International	200.025.222-040	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium
710 i mikro; m sito o rozmiarze oczek	VWR International	200.025.222-050	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium
800 µ m Sito o rozmiarze oczek	VWR International	200.025.222-051	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem drobnej mąki pszennej Tribolium
405	Demeter e.V.	SP061006	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem pożywki Tribolium
dostępnej w handlu	Genesee Scientific	66-115	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila / Niestandardowe podłoże Drosophila mogą być również używane
mikrosfery fluorescencyjne, 1,0 i mikro; m i Oslash;	Thermo Fisher Scientific	T7282
nieaktywne suche drożdże	Genesee Scientific	62-108
agaroza niskotopliwa	Carl Roth	6351.2
wąskie fiolki	Genesee Scientific	32-109	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila
mały pędzel	VWR International	149-2121
podchloryn sodu (NaOCl), ~12% aktywny Cl	Carl Roth	9062.3	Uwaga: podchloryn sodu jest
mąka pszenna pełnoziarnista	Demeter e.V.	SP061036	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium / Wielka Brytania:
fiolki o szerokości	Genesee Scientific	32-110	Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila

mąki pełnoziarnistej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles