Method Article

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

DOI:

10.3791/61713

⸱

September 9th, 2020

 ,  , 
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF - MC), Goethe-Universität

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych oferuje skuteczne rozwiązania do badania złożonych procesów w wielu biologicznie istotnych skalach. Konfiguracje oparte na komorze na próbki, które są specjalnie zaprojektowane w celu zachowania trójwymiarowej integralności próbki i zwykle charakteryzują się rotacją próbki, są najlepszym wyborem w biologii rozwoju. Na przykład wykorzystano je do udokumentowania całej morfogenezy embrionalnej muszki owocowej Drosophila melanogaster i chrząszcza mącznego Tribolium castaneum. Jednak wiele dostępnych protokołów obrazowania na żywo zapewnia tylko ramy eksperymentalne dla pojedynczych zarodków. Szczególnie w przypadku badań porównawczych takie podejścia są niewygodne, ponieważ na sekwencyjnie obrazowane próbki wpływa wariancja otoczenia. Co więcej, ogranicza to liczbę próbek, które można oznaczyć w danym czasie. Zapewniamy eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo, które zwiększają przepustowość w konfiguracjach opartych na komorze na próbki, a tym samym zapewniają podobne warunki otoczenia dla wszystkich próbek. Po pierwsze, zapewniamy wytyczne dotyczące kalibracji mikroskopów fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi. Po drugie, proponujemy metodę montowania wielu zarodków, która jest zgodna z rotacją próbek. Po trzecie, udostępniamy przykładowe trójwymiarowe zestawy danych obrazowania na żywo Drosophila, dla których zestawiamy trzy linie transgeniczne z fluorescencyjnie znakowanymi jądrami, a także Tribolium, dla których porównujemy wydajność trzech podlinii transgenicznych, które przenoszą ten sam transgen, ale w różnych lokalizacjach genomowych. Nasz protokół został specjalnie zaprojektowany do badań porównawczych, ponieważ proaktywnie zajmuje się wariancją otoczenia, która jest zawsze obecna w sekwencyjnym obrazowaniu na żywo. Jest to szczególnie ważne dla analiz ilościowych i charakterystyki fenotypów aberracyjnych, które wynikają np. z eksperymentów z nokautem. Co więcej, zwiększa ogólną przepustowość, co jest bardzo wygodne, gdy dostęp do mikroskopów fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi jest ograniczony. Wreszcie, proponowana metoda montażu może być dostosowana do innych gatunków owadów i innych organizmów modelowych, np. danio pręgowanego, w zasadzie bez wysiłku optymalizacyjnego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna jest jedną z najważniejszych technik obrazowania w naukach przyrodniczych, szczególnie w biologii komórkowej i rozwojowej. W konfokalnych mikroskopach fluorescencyjnych1, które są najnowocześniejsze w trójwymiarowym obrazowaniu fluorescencyjnym od połowy lat 90., ta sama soczewka jest używana do wzbudzania fluoroforu i wykrywania światła emisyjnego. Wiązka lasera rozświetlającego wzbudza wszystkie fluorofory wzdłuż osi oświetlenia/detekcji, a odpowiedni sygnał nieostry jest rozróżniany przed wykryciem przez otwór otworkowy. W związku z tym dla każdego dwuwymiarowego obrazu oświetlana jest cała próbka. W związku z tym dla każdego trójwymiarowego obrazu, czyli stosu przestrzennie następujących po sobie obrazów dwuwymiarowych, cały próbk jest oświetlany od kilkudziesięciu do kilkuset razy2, co sprzyja fotowybielaniu i fototoksyczności3.

Prawie dwadzieścia lat temu, technologia oparta na arkuszach świetlnych4 pojawiła się jako obiecująca alternatywa dla trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego i tym samym stała się cennym narzędziem w biologii rozwojowej5. W tym podejściu oświetlenie i detekcja są rozłączone. Soczewka iluminacyjna służy do generowania arkusza świetlnego o głębokości zaledwie kilku mikrometrów w płaszczyźnie ogniskowej prostopadle ułożonej soczewki detekcyjnej. W związku z tym dla każdego obrazu dwuwymiarowego oświetlana jest tylko cienka płaska objętość wokół płaszczyzny ogniskowej. W związku z tym, dla każdego trójwymiarowego obrazu, cała próbka jest oświetlona tylko raz, co znacznie zmniejsza fotowybielanie i fototoksyczność6. Z tego powodu mikroskopy fluorescencyjne z arkuszami świetlnymi (LSFM) oferują skuteczne rozwiązania do badania złożonych procesów w wielu biologicznie istotnych skalach i dlatego mają szczególną wartość w biologii rozwojowej, w której próbki o wielkości kilku milimetrów muszą być analizowane na poziomie subkomórkowym.

Historycznie rzecz biorąc, LSFM były oparte na komorach próbkowania7,8. W tych konfiguracjach osie oświetlenia (x) i detekcji (z) są zwykle ustawione prostopadle do osi grawitacji (y). Komory na próbki oferują dużą swobodę eksperymentowania. Po pierwsze, zapewniają duże pojemności bufora obrazowania, co z kolei ułatwia korzystanie z systemu perfuzyjnego do kontrolowania środowiska, np. w celu utrzymania określonej temperatury9 lub zastosowania stresorów biochemicznych. Co więcej, obsługują one niestandardowe metody montażu10, które są dostosowane do odpowiednich potrzeb eksperymentalnych, zachowując jednocześnie trójwymiarową, w niektórych przypadkach dynamiczną11, integralność próbki. Dodatkowo, konfiguracje oparte na komorze na próbki są zwykle wyposażone w funkcję obracania, która służy do obracania próbek wokół osi y, a tym samym obrazowania ich wzdłuż dwóch, czterech lub nawet więcej kierunków. Ponieważ zarodki powszechnie stosowanych organizmów modelowych są, w kontekście mikroskopii, stosunkowo duże, kolejne obrazowanie wzdłuż osi brzuszno-grzbietowej, bocznej i/lub przednio-tylnej ciała zapewnia bardziej wszechstronną reprezentację. Pozwala to np. na długoterminowe śledzenie komórek, które poruszają się wzdłuż złożonych trójwymiarowych ścieżek migracji12,13.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych została szeroko zastosowana do badania morfogenezy embrionalnej Drosophila melanogaster, zarówno systematycznie14,15, jak również ze szczególnym naciskiem na biofizyczne aspekty rozwoju. Na przykład wykorzystano go do zebrania danych morfogenetycznych o wysokiej rozdzielczości w celu wykrycia biomechanicznego związku między wgłębieniem endodermy a wydłużeniem osi podczas wydłużania pasma zarodkowego16 i dalej, aby powiązać złożony przepływ komórkowy z wzorcami generowania siły podczas gastrulacji17. Został również połączony z innymi najnowocześniejszymi technikami, np. optogenetyką, aby zbadać regulację sygnalizacji Wnt podczas wzorca przednio-tylnego w epidermie18.

Jednak badanie tylko jednego gatunku nie daje wglądu w ewolucję rozwoju. Aby zrozumieć embriogenezę w kontekście filogenetycznym, przeprowadzono intensywne badania z wykorzystaniem alternatywnych organizmów modelowych owadów. Jednym z najwszechstronniej zbadanych gatunków jest chrząszcz mączny Tribolium castaneum, ekonomicznie istotny przechowywany szkodnik zbożowy19, którego morfogeneza embrionalna została już również systematycznie zobrazowana za pomocą LSFM20. Morfogeneza embrionalna tych dwóch gatunków różni się znacznie w kilku aspektach, np. tryb segmentacji21, a także tworzenie i degradacja błon pozaembrionalnych22. Ten ostatni aspekt został już szeroko przeanalizowany przy użyciu LSFM. Na przykład wykazano, że surowiczka, tkanka pozaembrionalna, która otacza i chroni zarodek Tribolium przed różnymi zagrożeniami przez większą część jego embriogenezy23,24, działa również jako morfogenetyczny "sterownik" dla własnego procesu wycofywania podczas zamknięcia grzbietowego25. Ponadto wykazano, że podczas gastrulacji określony obszar blastodermy pozostaje zakotwiczony w błonie witeliny w celu wytworzenia asymetrycznych ruchów tkanki26 i, zgodnie z tą obserwacją, że regionalizacja tkanek umożliwia komórkom sekwencyjne opuszczanie krawędzi surowiczej podczas zamykania okna surowiczego27.

We wszystkich badaniach związanych z Drosophila i Tribolium, cytowanych powyżej, użyto LSFM opartych na komorze próbnej. W większości przypadków zarodki rejestrowano w wielu kierunkach za pomocą funkcji rotacji próbki. Chociaż nie zostało to wyraźnie powiedziane, można założyć, że zostały one zarejestrowane indywidualnie, a tym samym niezależnie od siebie w sekwencyjnych testach obrazowania na żywo, podobnie jak w naszej poprzedniej pracy nad Tribolium20,28. W niektórych scenariuszach takie podejście jest dopuszczalne, ale szczególnie w ilościowych podejściach porównawczych wariancja otoczenia może zniekształcić wyniki. Na przykład od dawna wiadomo, że szybkość rozwoju owadów jest zależna od temperatury29, ale nowsze badania sugerują, że u Drosophila temperatura może również wpływać na stężenie morfogenów30. W rezultacie, jeśli pewne cechy embriogenezy, np. proporcje dynamiczne, tempo podziału i prędkości migracji komórek, mają być dokładnie określone ilościowo, wymagana jest wystarczająca liczba powtórzeń bez zmienności otoczenia. Minimalizuje to odchylenia standardowe i błędy standardowe, co z kolei ułatwia zestawienie z innymi, nawet tylko nieznacznie rozbieżnymi warunkami eksperymentalnymi.

Jednak LSFM oparte na komorze na próbki są przede wszystkim przeznaczone do testów o wysokiej zawartości, a nie o wysokiej przepustowości. W przeciwieństwie do mikroskopów konfokalnych, które są zwykle wyposażone w znormalizowane mechanizmy zaciskowe do szkiełek mikroskopowych, szalek Petriego i płytek studzienkowych, prawie wszystkie LSFM oparte na komorze na próbki wykorzystują cylindryczne mechanizmy zaciskowe. Mechanizmy te są przeznaczone dla niestandardowych uchwytów na próbki, które są kompatybilne z rotacją, a także nieinwazyjne10, ale zwykle nie są przeznaczone dla więcej niż jednej próbki20,31,32. Ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo dwóch lub więcej zarodków, w których zalety konfiguracji opartych na komorze próbki nie są zagrożone, rozwiązują problem wariancji otoczenia, zwiększając tym samym wartość LSFM w badaniach porównawczych.

W naszym protokole prezentujemy eksperymentalne ramy do porównawczego obrazowania na żywo w próbkach LSFM opartych na komorze (Rysunek 1A), w którym oś y jest używana jako opcja do "układania" zarodków. Po pierwsze, udostępniamy wytyczne dotyczące kalibracji opartej na mikrosferach fluorescencyjnych dla LSFM opartych na komorze na próbki, co jest szczególnie ważne w przypadku urządzeń, które nie mają asystenta kalibracji. Po drugie, opisujemy metodę mocowania wielu zarodków w oparciu o uchwyt pajęczyny28 (Rysunek 1B), która jest zgodna z rotacją próbek, a tym samym umożliwia jednoczesne obrazowanie wielu próbek w wielu kierunkach (Rysunek 1C). Kilka zarodków ustawia się na cienkiej warstwie agarozy, a po wprowadzeniu do komory na próbkę przesuwa się kolejno przez arkusz świetlny, aby uzyskać trójwymiarowe obrazy. Po trzecie, udostępniamy trzy przykładowe zestawy danych obrazowania na żywo dla Drosophila, a także dla Tribolium. W pierwszym przypadku zestawiamy linie transgeniczne z fluorescencyjnie znakowanymi jądrami. W przypadku tych ostatnich porównujemy wydajność podlinii transgenicznych, które przenoszą ten sam transgen, ale w różnych lokalizacjach genomowych. Na koniec omawiamy znaczenie równoległości w odniesieniu do porównawczego obrazowania na żywo i wariancji otoczenia33, dyskutujemy o limicie przepustowości naszej struktury eksperymentalnej i oceniamy adaptację naszego podejścia do innych organizmów modelowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Praca przygotowawcza

  1. Wybierz kombinację soczewki oświetleniowej/soczewki detekcyjnej/kamery dla LSFM, która odpowiada pytaniu naukowemu i ustaw mikroskop. Wielkość pola widzenia to iloraz wielkości chipa kamery i powiększenia soczewki detekcyjnej. Soczewka oświetleniowa powinna być tak dobrana, aby całe pole widzenia było pokryte mniej więcej płaskim arkuszem światła34. W tabeli 1 wymieniono trzy zalecane kombinacje.
  2. Aby przygotować porcje agarozy i naczynia do pobierania, dodaj 2 g niskotopliwej agarozy do 200 ml autoklawowanej wody z kranu i podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej o mocy 600-800 W, aż wszystkie cząstki agarozy się rozpuszczą. Przygotować kilka porcji agarozy o pojemności 1 ml w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml lub 2 ml, a następnie napełnić agarozą kilka szalek Petriego o średnicy 90 mm o wysokości 3-5 mm. Zestalone porcje i szalki przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Dla Drosophila: Aby przygotować świeże fiolki hodowlane, należy ugotować odpowiednią ilość przygotowanej na zamówienie lub dostępnej w handlu pożywki Drosophila, przenieść 5-15 ml do szerokich fiolek i przechowywać je w temperaturze 4 °C. Aby przygotować potrawy do składania jaj, dodaj 1 g niskotopliwej agarozy do 50 ml autoklawowanej wody z kranu i podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej o mocy 600-800 W, aż wszystkie cząsteczki agarozy się rozpuszczą. Pozostaw mieszaninę do ostygnięcia do 45 °C, a następnie dodaj 50 ml soku owocowego (najlepiej jabłkowego lub z czerwonych winogron) i dokładnie wymieszaj. Wlać mieszaninę do szalek Petriego Ø 35 mm i przechowywać zestalone naczynia do składania jaj w temperaturze 4 °C.
  4. Dla tribolium: Aby przygotować pożywkę, przełóż mąkę pełnoziarnistą oraz nieaktywne suche drożdże przez sito o oczkach 710 μm, a następnie uzupełnij przesianą mąkę 5% (w/w) przesianych drożdży. Aby przygotować podłoże do składania jaj, przełóż drobną mąkę pszenną oraz nieaktywne suche drożdże przez sito o oczkach 250 μm, a następnie uzupełnij przesianą mąkę 5% (w/w) przesianych drożdży.

2. Kalibracja LSFM opartych na komorze na próbki za pomocą mikrosfer fluorescencyjnych

UWAGA: Celem kalibracji jest wyrównanie punktów ogniskowych soczewek oświetleniowych i detekcyjnych (Rysunek 2A), ponieważ jest to przesłanka do uzyskania wyraźnych obrazów. LSFM należy kalibrować regularnie, co najmniej raz na 3-4 tygodnie.

  1. Ponownie upłynnić porcję agarozy w suchym podgrzewaczu/mieszalniku w temperaturze 80 °C, a następnie pozostawić podwielokrotność agarozy do ostygnięcia do 35 °C.
  2. Przenieść 50 μl agarozy do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i dodać 0,5 μl fluorescencyjnego roztworu mikrosfery. Mieszać z prędkością 1 400 obr./min przez 1 min.
  3. Wypełnić szczelinowy otwór w uchwycie pajęczyny 10 μl mieszaniny agarozy i fluorescencyjnego roztworu mikrosfery, a następnie odessać jak najwięcej agarozy, aż pozostanie tylko cienka warstwa agarozy. Poczekaj 30-60 s na zestalenie.
  4. Napełnij komorę na próbkę autoklawowaną wodą z kranu. Powoli włóż uchwyt pajęczyny do komory na próbkę i przesuń szczelinowy otwór ze stopniami mikrotranslacyjnymi przed soczewką detekcyjną.
  5. Obróć uchwyt pajęczyny ze stolikiem obrotowym do pozycji 45° względem osi oświetlenia (x) i wykrywania (z). Uchwyt pajęczyny nie powinien być widoczny w kanale światła transmisyjnego.
  6. Przełącz się na odpowiedni kanał fluorescencyjny i dostosuj moc lasera oraz czas naświetlania tak, aby mikrosfery fluorescencyjne dostarczały odpowiedni sygnał.
  7. Określ objętość widoku, która całkowicie pokrywa teraz poprzecznie zorientowaną warstwę agarozy. Zdefiniuj odstęp z, obliczając maksymalną możliwą rozdzielczość osiową dla odpowiedniej kombinacji soczewki oświetleniowej/soczewki detekcyjnej34. Alternatywnie, 4-krotność rozdzielczości bocznej może być użyta jako przybliżone przybliżenie.
  8. Nagraj trójwymiarowy stos testowy z mikrosfer fluorescencyjnych i porównaj maksymalne projekcje x, y i z z tabelą kalibracji (Rysunek 2). Jeśli mikrosfery wydają się rozmyte, rozmyte i/lub zniekształcone (Rysunek 2B,C), dostosuj położenie soczewki oświetleniowej i/lub detekcyjnej.

3. Kolekcja zarodków Drosophila

  1. Przenieś 100-200 dorosłych osobników z wybranej linii Drosophila do świeżej fiolki hodowlanej na 2-3 dni przed testem obrazowym w celu ustalenia kultury pobrania jaj. Jeśli jeszcze nie istnieje, rozważ użycie starej fiolki do hodowli, aby rozpocząć hodowlę potomstwa. Aby upewnić się, że dorosłe osobniki nie mają więcej niż dwa tygodnie, należy zastąpić kulturę pobrania zarodków na czas kulturą potomstwa.
  2. Podgrzej naczynie do składania jaj do temperatury pokojowej i dodaj kroplę pasty drożdżowej na wierzch agaru.
  3. Przenieś dorosłe osobniki z kultury do zbioru jaj do pustej wąskiej fiolki i umieść ją na naczyniu do składania jaj. Inkubować zestaw do zbierania jaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Jeśli to możliwe, unikaj znieczulenia (zimno, CO2 ) podczas tego etapu.
  4. Umieścić dorosłe osobniki z powrotem w fiolce do chowu. Inkubować naczynie do składania jaj w dogodnej kombinacji temperatury/czasu, a następnie przenieść 10-20 zarodków małym pędzlem z naczynia do składania jaj do sitka o wielkości oczek 100 μm. Wyrzuć naczynie do składania jaj.
  5. Powtórz kroki od 3.1 do 3.4 dla każdej linii Drosophila.

4. Kolekcja zarodków Tribolium

UWAGA: Dla wygody, przedstawiono schemat procedury pobierania jaj Tribolium (Rysunek 3A), do którego odnoszą się również liczby w nawiasach w tym kroku.

  1. Przenieś 200-300 dorosłych (około 400-700 mg) wybranej linii Tribolium do pustej szklanej butelki o pojemności 1 litra 2-10 dni przed testem obrazowania, aby ustalić hodowlę jaj (Rysunek 3A_01). Napełnij butelkę 50-100 g świeżego podłoża wzrostowego. Jeśli jeszcze nie istnieje, rozważ rozpoczęcie hodowli potomstwa przy użyciu dostępnych larw i poczwarek. Aby upewnić się, że dorosłe osobniki nie mają więcej niż 3 miesiące, zastąp kulturę pobierania jaj na czas kulturą potomstwa.
  2. Przepuść kulturę zbierającą jaja przez sito o rozmiarze oczek 800 μm (Rysunek 3A_02). Umieść pożywkę wzrostową, która zawiera zarodki niew stadium zaawansowania, do początkowej butelki (Ryc. 3A_03) i przenieś dorosłe osobniki do pustej szklanej butelki o pojemności 1 l (Rycina 3A_04). Dodać 10 g podłoża do składania jaj ( Rysunek 3A_05) i inkubować zestaw do zbierania jaj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę ( Rysunek 3A_06,07).
  3. Przełóż zestaw do zbierania jaj przez sito o rozmiarze oczek 800 μm (Rysunek 3A_08). Wróć dorosłych do ich początkowej butelki (Rysunek 3A_09). W zależności od procesu rozwojowego, który powinien być zobrazowany, inkubuj pożywkę do składania jaj, która zawiera teraz około 30-100 zarodków, w dogodnej kombinacji temperatury / czasu (Ryc. 3A_10).
  4. Przełóż pożywkę do składania jaj przez sito o rozmiarze oczek 300 μm ( Rysunek 3A_11) i przenieś zarodki ( Rycina 3A_12) do sitka do komórek o rozmiarze oczek 100 μm. Wyrzuć przesiane podłoże do składania jaj (Rysunek 3A_13).
  5. Powtórz kroki od 4.1 do 4.4 dla każdej linii tribolium.

5. Dechorionacja na bazie podchlorynu sodu

UWAGA: Zarówno zarodki Drosophila, jak i Tribolium są pokryte kosmówką, ochronną i silnie rozpraszającą światło warstwą białka, która nie jest niezbędna do prawidłowego rozwoju, o ile zarodki są utrzymywane w wilgoci po usunięciu. Protokół dechorionacji dla zarodków obu gatunków jest identyczny.

  1. Przygotuj płytkę 6-dołkową, wypełniając studzienki A1, A2, A3 i B3 8 ml autoklawowanej wody z kranu, a studzienki B1 i B2 7 ml autoklawowanej wody z kranu i 1 ml roztworu podchlorynu sodu (NaOCl) (Rysunek 3B). Obserwuj proces dekorionacji pod mikroskopem stereoskopowym, najlepiej w świetle transmisyjnym.
    UWAGA: Podchloryn sodu jest.
  2. Włożyć sitko do komórek zawierających zarodki (krok 3.4 i/lub 4.4) do studzienki A1 i umyć zarodki około 30-60 s pod delikatnym mieszaniem.
  3. Przenieś sitko do komórek do dołka B1 i energicznie potrząsaj płytkami przez 30 s, a następnie przenieś je do dołka A2 i myj zarodki przez 1 minutę pod delikatnym mieszaniem.
  4. Przenieś sitko do komórek do dołka B2 i energicznie potrząsaj płytką, aż większość zarodków zostanie całkowicie zdechorionowana (Ryc. 3C), a następnie przenieś je do dołka A3 i myj zarodki przez 1 minutę pod delikatnym mieszaniem.
  5. Przechowuj sitko do komórek w B3 dobrze przed przystąpieniem do procedury montażu.
  6. Powtórz kroki od 5.1 do 5.5 dla każdego wiersza.

6. Montaż wielu zarodków za pomocą uchwytu na pajęczynę

  1. Ponownie upłynnić porcję agarozy w suchym podgrzewaczu/mieszalniku w temperaturze 80 °C, a następnie pozostawić podwielokrotność agarozy do ostygnięcia do 35 °C.
  2. Odmierzyć pipetą 10 μl agarozy na wierzch szczelinowego otworu w uchwycie pajęczyny. Końcówką pipety rozprowadź agarozę na szczelinowym otworze, a następnie odessaj jak najwięcej agarozy, aż pozostanie tylko cienki film agarozowy. Poczekaj 30-60 s na zestalenie.
  3. Dla każdej linii ostrożnie wybierz jeden lub więcej zarodków małym pędzlem i umieść je na folii agarozowej.
  4. Ułóż zarodki wzdłuż długiej osi otworu szczelinowego, a następnie wyrównaj ich oś przednio-tylną z długą osią otworu szczelinowego (Rysunek 3D).
  5. Ostrożnie ustabilizować zarodki, odpipetowując 1-2 μl agarozy w szczelinę między zarodkami a folią agarozową. Poczekaj 30-60 s na zestalenie.
  6. Powoli włożyć uchwyt pajęczyny z zamontowanymi zarodkami do komory na próbki wypełnionej buforem obrazu.

7. Porównawcze obrazowanie na żywo w LSFM opartych na komorze próbek

  1. Przesuń jeden z zarodków z etapami mikrotranslacji przed soczewkę detekcyjną. Upewnij się, że uchwyt pajęczyny znajduje się w pozycji 45° względem osi oświetlenia (x) i wykrywania (z) (por. Rysunek 1C).
  2. W kanale światła transmisyjnego przesuń zarodek do środka pola widzenia. Uchwyt na pajęczynę nie powinien być widoczny.
  3. Przesuwaj zarodek z etapami mikrotranslacji w z tak długo, aż płaszczyzna środkowa zarodka zajdzie na płaszczyznę ogniskową, tj. do momentu, gdy kontur stanie się ostry. Nie przełączając się na kanał fluorescencyjny, określ objętość widzenia, oddalając się o 250 μm od płaszczyzny środkowej w obu kierunkach.
  4. Opcjonalnie, jeśli wymagane jest obrazowanie w wielu kierunkach, należy odpowiednio obrócić zarodek i powtórzyć kroki 7.2 i 7.3. Uchwyt pajęczyny obsługuje do czterech orientacji w krokach co 90°.
  5. Powtórz kroki od 7.1 do 7.3 (lub 7.4) dla wszystkich pozostałych zarodków zamontowanych na uchwycie pajęczyny (Rysunek 3E). Upewnij się, że zarodek znajdujący się najwyżej w górze nie opuszcza bufora obrazowania, gdy zarodek znajdujący się najniżej znajduje się przed soczewką wykrywającą.
  6. Zdefiniuj parametry kanału fluorescencji (moc lasera, czas ekspozycji, filtr detekcji) i poklatkowy (interwał, całkowity czas trwania) i rozpocznij proces obrazowania. Aby uzyskać informacje o wartościach orientacyjnych, zapoznaj się z tabelą metadanych przykładowych zestawów danych (tabela uzupełniająca 1). W przypadku testów, które trwają kilka dni, należy rozważyć przynajmniej częściowe zakrycie otworu komory próbki, aby zmniejszyć parowanie.

8. Pobieranie i dalsza hodowla zobrazowanych zarodków

  1. Po zakończeniu badania obrazowego ostrożnie wyjmij uchwyt pajęczyny z komory próbki.
  2. Odłącz zarodki od filmu agarozowego za pomocą małego pędzelka i przenieś je na odpowiednio oznakowane szkiełko mikroskopowe. Umieścić szkiełko w naczyniu do pobierania i inkubować w odpowiednich standardowych warunkach chowu.
  3. Jeśli chodzi o metody eksperymentalne, oszacuj, kiedy embriogeneza jest zakończona. W miarę zbliżania się punktu wylęgu należy często sprawdzać szalki do pobierania i przenosić wyklute larwy Drosophila do indywidualnych fiolek hodowlanych, a larwy Tribolium do indywidualnych studzienek na 24-dołkowej płytce. Napełnij studzienki do połowy pożywką wzrostową. Inkubować w odpowiednich standardowych warunkach chowu.
  4. Gdy obserwowane osobniki osiągną dorosłe osobniki, należy zapewnić im odpowiedniego partnera do krycia i po kilku dniach sprawdzić, czy nie ma potomstwa.

9. Przetwarzanie danych obrazu i dokumentacja metadanych

UWAGA: Do przetwarzania danych obrazu zalecana jest metoda pochodna ImageJ FIJI35 (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI nie wymaga instalacji i dostępne są wersje 32- i 64-bitowe. Jednym z najczęściej używanych formatów danych LSFM jest format tagged image file format (TIFF), który umożliwia przechowywanie stosów obrazów w postaci kontenera TIFF.

  1. Obliczanie maksymalnych rzutów z dla wszystkich stosów z (punkt menu Obraz | Stosy | Z Project (Maksymalna intensywność), wybierz opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność). Maksymalne projekcje to podejścia upraszczające dane, które zmniejszają liczbę wymiarów przestrzennych z trzech do dwóch. Dostarczony jest skrypt FIJI do przetwarzania wsadowego (plik uzupełniający 1).
  2. Połącz odpowiednie maksymalne projekcje z, aby utworzyć stosy czasu (t stosów). Zapisz je w jednym kontenerze TIFF. Należy to zrobić dla wszystkich zarejestrowanych zarodków, a także dla odpowiednich kierunków i kanałów fluorescencyjnych, jeśli ma to zastosowanie.
  3. Obróć stos z i t wokół osi z, aby wyrównać oś przednio-tylną zarodków z osią obrazu x lub y (Zdjęcie | Przekształcanie | Obrót). Przytnij stosy z wzdłuż wszystkich trzech osi obrazu i stos t na osiach obrazu x i y, tak aby pozostało tylko minimalne miejsce w buforze (20-40 pikseli wzdłuż osi x i y, 5-10 obrazów wzdłuż osi z) wokół zarodka (Zdjęcie | Dostosuj | Rozmiar płótna dla osi x i y, Obraz | Stosy | Narzędzia | Slice Keeper dla osi z).
    1. Należy to zrobić indywidualnie dla wszystkich zarejestrowanych zarodków, a także zgodnie z odpowiednimi wskazówkami, jeśli ma to zastosowanie. Kanały fluorescencyjne, jeśli ma to zastosowanie, powinny być przetwarzane z identycznymi parametrami rotacji i kadrowania.
  4. Udokumentuj metadane tak szczegółowo, jak to możliwe. Jako wskazówkę można użyć tabeli metadanych przykładowych zestawów danych, które znajdują się w sekcji Reprezentatywne wyniki (tabela uzupełniająca 1).

10. Wizualizacja danych

UWAGA: Ta wytyczna dotycząca wizualizacji danych skupia się przede wszystkim na tworzeniu matryc obrazów o maksymalnej projekcji, które pokazują kilka zarejestrowanych zarodków w różnych kierunkach i/lub w czasie. W poniższych krokach opisano procedurę wizualizacji danych, która została zastosowana do przykładowych zestawów danych w celu utworzenia pokazanych rysunków i filmów wideo, do których łącza znajdują się w sekcji Reprezentatywne wyniki.

  1. Połącz t stosów w wielu kierunkach (Obraz | Stosy | Narzędzia | Połącz) i/lub połącz wiele kanałów fluorescencyjnych (Zdjęcie | Kolor | Merge Channels) w celu wizualizacji struktury biologicznej i/lub procesu będącego przedmiotem zainteresowania.
  2. Dostosuj intensywność stosów t (Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast) w zależności od potrzeb za pomocą funkcji "Set". Minimalna wyświetlana wartość powinna być ustawiona nieco powyżej sygnału tła, maksymalna wyświetlana wartość powinna skutkować wygodnym kontrastem. Udokumentuj obie wartości, ponieważ można ich użyć do konsekwentnego dopasowania odpowiednich stosów z. Korekta nadruku za pomocą funkcji "Zastosuj". W zależności od metod eksperymentalnych należy rozważyć przetworzenie wszystkich zarejestrowanych zarodków o identycznych wartościach.
  3. Zapisz stosy t o dostosowanej intensywności jako osobne pliki, nie zastępuj nieskorygowanych stosów t. Skompiluj odpowiednie stosy podrzędne z dostosowanych stosów t za pomocą dedykowanych funkcji wyboru obrazu (np. Obraz | Stosy | Narzędzia | Slice Keeper) i użyj narzędzia do montażu (Obraz | Stosy | Make Montage), aby utworzyć siatki obrazów, które można wykorzystać do projektowania postaci.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy dla porównawczego obrazowania fluorescencji na żywo w LSFM opartych na komorze na próbki. Na przykład, ramy te mogą być wykorzystane do zestawienia (i) zarodków dwóch lub więcej gatunków, (ii) zarodków linii, w których jeden lub więcej genów jest znokautowanych oraz kontroli typu dzikiego, (iii) wielu zarodków tej samej linii transgenicznej, (iv) zarodków z różnych linii transgenicznych, lub (v) zarodków z podlinii, które są nosicielami tego samego transgenu, ale w różnych loka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z wyłącznych obszarów zastosowań LSFM jest biologia rozwojowa. W tej dyscyplinie ważne jest przyjrzenie się żywym okazom, w przeciwnym razie procesy morfogenetyczne nie mogą być opisane w sposób dynamiczny. Eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo w LSFM opartych na komorze próbek, jak opisano tutaj, są wygodne z dwóch głównych powodów.

Wariancja otoczenia, która jest nieunikniona w sekwencyjnym obrazowaniu na żywo, może być proaktywnie eliminowana. W obrazowaniu na żyw...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Ernstowi H. K. Stelzerowi za możliwość skorzystania z jego zasobów, jak również cennych komentarzy dotyczących manuskryptu, Anicie Anderl za wsparcie w obrazowaniu na żywo Tribolium, Svenowi Plathowi za wsparcie techniczne, a także Ilanowi Davisowi, Nicole Grieder i Geroldowi Schubigerowi za udostępnienie swoich transgenicznych linii Drosophila za pośrednictwem Bloomington Stock Center.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytka 6-dołkowaOrange Scientific4430500 
24-dołkowa płytkaOrangeScientific 4430300Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium
35-mm i Oslash; Szalka PetriegoFisher Scientific153066Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila.
90 mm i Oslash; szalka PetriegoFisher ScientificL9004575
100 µ m Sitko do komórek o wielkości oczekBD Biosciences352360
250 &mikro; m sito o rozmiarze oczekVWR International200.025.222-038Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium
300 µ m sito o rozmiarze oczekVWR International200.025.222-040Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium
710 i mikro; m sito o rozmiarze oczekVWR International200.025.222-050Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium
800 µ m Sito o rozmiarze oczekVWR International200.025.222-051Tylko do obrazowania na żywo z udziałem drobnej mąki pszennej Tribolium
405Demeter e.V.SP061006Tylko do obrazowania na żywo z udziałem pożywki Tribolium
dostępnej w handluGenesee Scientific66-115Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila / Niestandardowe podłoże Drosophila mogą być również używane
mikrosfery fluorescencyjne, 1,0 i mikro; m i Oslash;Thermo Fisher ScientificT7282
nieaktywne suche drożdżeGenesee Scientific62-108
agaroza niskotopliwaCarl Roth6351.2
wąskie fiolkiGenesee Scientific32-109Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila
mały pędzelVWR International149-2121
podchloryn sodu (NaOCl), ~12% aktywny ClCarl Roth9062.3Uwaga: podchloryn sodu jest
mąka pszenna pełnoziarnistaDemeter e.V.SP061036Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Tribolium / Wielka Brytania:
fiolki o szerokościGenesee Scientific32-110Tylko do obrazowania na żywo z udziałem Drosophila
mąki pełnoziarnistej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
  2. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
  3. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003(2017).
  4. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
  6. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
  7. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  8. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  9. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
  10. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
  11. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  12. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
  13. Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
  14. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  15. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
  16. Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292(2015).
  17. Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454(2018).
  18. Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636(2017).
  19. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  20. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
  21. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
  22. Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
  23. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082(2013).
  24. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111(2014).
  25. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834(2016).
  26. Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
  27. Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193(2019).
  28. Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629(2017).
  29. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
  30. Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
  31. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
  32. Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
  33. Mcdonald, J. H. Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , Sparky House Publication. (2013).
  34. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
  35. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  36. Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677(2018).
  37. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
  38. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  39. vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
  40. Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240(2017).
  41. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
  42. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  43. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
  44. He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065(2019).
  45. Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
  46. Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
  47. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , Springer. (1997).
  48. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
  49. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
  50. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555(2014).
  51. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
  52. Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
  53. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  54. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  55. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
  56. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
  57. Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
  58. Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616(2018).
  59. Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
  60. Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
  61. Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Light Sheet MicroscopySample Chamber SetupSimultaneous Embryo ImagingCobweb Holder MountingFluorescent Microsphere CalibrationDrosophila Embryo ImagingTribolium Embryo ImagingEmbryo Dechorionation ProtocolAgarose Film EmbeddingComparative Live Imaging

Related Articles