Artykuł metodologiczny

Pomiar trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach przy użyciu 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61720

⸱

27 października 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

W tym artykule

Podsumowanie

Ze względu na niski stosunek sygnału do szumu (SNR) czujników opartych na transferze energii rezonansu (FRET) Fӧrster, pomiar sygnałów cAMP był wyzwaniem, zwłaszcza w trzech wymiarach przestrzennych. W tym miejscu opisujemy metodologię obrazowania i analizy hiperspektralnej FRET, która umożliwia pomiar rozkładu cAMP w trzech wymiarach przestrzennych.

Streszczenie

Cykliczny AMP to drugi komunikator, który bierze udział w szerokim zakresie aktywności komórkowych i fizjologicznych. Kilka badań sugeruje, że sygnały cAMP są podzielone na przedziały, a podział na przedziały przyczynia się do specyficzności sygnalizacyjnej w szlaku sygnałowym cAMP. Opracowanie biosensorów opartych na rezonansowym transferze energii (FRET) Fӧrster zwiększyło możliwości pomiaru i wizualizacji sygnałów cAMP w komórkach. Jednak pomiary te są często ograniczone do dwóch wymiarów przestrzennych, co może skutkować błędną interpretacją danych. Do tej pory pomiary sygnałów cAMP w trzech wymiarach przestrzennych (x, y i z) były bardzo ograniczone ze względu na ograniczenia techniczne w stosowaniu czujników FRET, które z natury wykazują niski stosunek sygnału do szumu (SNR). Ponadto tradycyjne podejścia do obrazowania oparte na filtrach są często nieskuteczne w dokładnym pomiarze sygnałów cAMP w zlokalizowanych regionach subkomórkowych ze względu na szereg czynników, w tym przesłuchy spektralne, ograniczoną siłę sygnału i autofluorescencję. Aby przezwyciężyć te ograniczenia i umożliwić stosowanie bioczujników opartych na FRET z wieloma fluoroforami, opracowaliśmy podejścia do obrazowania i analizy hiperspektralnej FRET, które zapewniają swoistość spektralną do obliczania wydajności FRET i możliwość spektralnego oddzielania sygnałów FRET od zakłócającej autofluorescencji i / lub sygnałów z dodatkowych znaczników fluorescencyjnych. W tym miejscu przedstawiono metodologię realizacji obrazowania hiperspektralnego FRET, a także konieczność skonstruowania odpowiedniej biblioteki spektralnej, która nie jest ani niedostatecznie próbkowana, ani nadmiernie próbkowana w celu przeprowadzenia demiksowania spektralnego. Chociaż przedstawiamy tę metodologię pomiaru trójwymiarowych rozkładów cAMP w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc (PMVEC), metodologia ta może być wykorzystana do badania rozkładów przestrzennych cAMP w różnych typach komórek.

Wprowadzenie

Cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP) jest drugim przekaźnikiem zaangażowanym w kluczowe procesy komórkowe i fizjologiczne, w tym podział komórek, napływ wapnia, transkrypcję genów i transdukcję sygnału. Coraz więcej dowodów sugeruje istnienie przedziałów cAMP w komórce, dzięki którym osiągana jest specyficzność sygnalizacji1,2,3,4,5,6,7. Do niedawna podział na przedziały cAMP był wnioskowany na podstawie różnych efektów fizjologicznych lub komórkowych indukowanych przez różnych agonistów receptora sprzężonego z G8,9,10,11. Niedawno sondy do obrazowania fluorescencyjnego oparte na FRET dostarczyły nowych podejść do bezpośredniego pomiaru i obserwacji sygnałów cAMP w komórce12,13,14.

Rezonansowy transfer energii Förstera (FRET) to zjawisko fizyczne, w którym transfer energii zachodzi między cząsteczkami donorowymi i akceptorowymi w sposób nieradiacyjny, gdy cząsteczki znajdują się w bliskiej odległości15,16. Wraz z rozwojem wskaźników fluorescencyjnych opartych na FRET, to zjawisko fizyczne zostało wykorzystane w zastosowaniach biologicznych do badania interakcji białko-białko17, kolokalizacja białek18, sygnalizacja Ca+219, ekspresja genów20, podział komórek21 i cykliczna sygnalizacja nukleotydowa. Wskaźniki cAMP oparte na FRET zazwyczaj składają się z domeny wiążącej cAMP, fluoroforu donorowego i akceptora fluoroforu22. Na przykład czujnik cAMP H188 12,22 używany w tej metodologii składa się z domeny wiążącej cAMP uzyskanej z Epac, umieszczonej pomiędzy fluoroforami turkusowymi (donorowymi) i Venus (akceptorowymi). W warunkach podstawowych (niezwiązanych) turkus i Wenus są w takiej orientacji, że między fluoroforami występuje FRET. Po związaniu cAMP z domeną wiążącą zachodzi zmiana konformacyjna, w wyniku której turkus i Wenus oddalają się od siebie, co powoduje spadek FRET.

Metody obrazowania oparte na FRET oferują obiecujące narzędzie do badania i wizualizacji sygnałów cAMP w komórce. Jednak obecne techniki obrazowania mikroskopowego oparte na FRET są często tylko częściowo skuteczne w osiąganiu wystarczającej siły sygnału do pomiaru FRET z subkomórkową przejrzystością przestrzenną. Wynika to z kilku czynników, w tym ograniczonej siły sygnału wielu reporterów FRET, wysokiego poziomu precyzji wymaganego do dokładnego ilościowego określenia zmian wydajności FRET oraz obecności czynników zakłócających, takich jak autofluorescencja komórkowa23,24. Rezultatem jest często obraz FRET, który jest nękany przez słaby SNR, co bardzo utrudnia wizualizację zmian subkomórkowych w FRET. Ponadto, badania przestrzennie zlokalizowanych sygnałów cAMP były prowadzone prawie wyłącznie w dwóch wymiarach przestrzennych, a osiowy rozkład cAMP był rzadko brany pod uwagę25. Jest to prawdopodobne, ponieważ niski SNR utrudniał pomiar i wizualizację gradientów cAMP w trzech wymiarach przestrzennych. Aby przezwyciężyć ograniczenia związane z używaniem czujników FRET o niskim SNR, wdrożyliśmy metody obrazowania i analizy hiperspektralnej do pomiaru FRET w pojedynczych komórkach25,26,27.

Metody obrazowania hiperspektralnego zostały opracowane przez NASA w celu rozróżnienia obiektów naziemnych obecnych na zdjęciach satelitarnych28,29. Od tego czasu techniki te zostały przetłumaczone na pole mikroskopii fluorescencyjnej30, z kilkoma komercyjnymi systemami mikroskopów konfokalnych oferującymi detektory spektralne. W tradycyjnym (niespektralnym) obrazowaniu fluorescencyjnym próbka jest wzbudzana za pomocą filtra pasmowo-przepustowego lub linii laserowej, a emisja jest zbierana za pomocą drugiego filtra pasmowo-przepustowego, często dobieranego tak, aby pasował do szczytowej długości fali emisji fluoroforu (fluoroforów). Z kolei podejścia do obrazowania hiperspektralnego mają na celu pobranie pełnego profilu spektralnego emisji fluorescencji26,31,32 lub excitation33,34 w określonych odstępach długości fali. W naszych poprzednich badaniach wykazaliśmy, że metody obrazowania i analizy hiperspektralnej mogą oferować lepszą kwantyfikację sygnałów FRET w komórkach w porównaniu z tradycyjnymi technikami obrazowania FRET opartymi na filtrach26. W tym miejscu przedstawiamy metodologię wykonywania 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET w celu pomiaru i wizualizacji rozkładów cAMP w trzech wymiarach przestrzennych. Podejścia te umożliwiły wizualizację gradientów przestrzennych cAMP indukowanych przez agonistów w pojedynczych komórkach25. Co ciekawe, w zależności od agonisty, gradienty cAMP mogą być widoczne w komórkach. Przedstawiona tutaj metodologia wykorzystuje spektralne mieszanie niejednorodnego tła i autofluorescencji komórkowej w celu poprawy dokładności pomiarów FRET. Chociaż metodologia ta została zademonstrowana na komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc (PMVEC) przy użyciu biosensora cAMP FRET, metodologię tę można łatwo zmodyfikować do użytku z alternatywnymi reporterami FRET lub alternatywnymi liniami komórkowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Alabamy.

1. Przygotowanie komórek, próbek i odczynników do obrazowania

  1. Wyizolować komórki śródbłonka mikrokrążenia płuc szczura (PMVECs) zgodnie z wcześniej opisaną procedurą35.
    UWAGA: Komórki zostały wyizolowane i hodowane przez Cell Culture Core na Uniwersytecie Południowej Alabamy w Mobile, AL, w naczyniach hodowlanych o średnicy 100 mm.
  2. Zasiać wyizolowane PMVECs na okrągłych szkiełkach podstawkowych o średnicy 25 mm i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C do czasu osiągnięcia przez komórki co najmniej 80% konfluencji (przez co najmniej 24 godziny).
    UWAGA: Komórki i ich typ mogą różnić się w zależności od badania, dlatego podczas zasiewania i hodowli należy stosować procedury specyficzne dla danej linii komórkowej. Protokół zasiewania i hodowli komórek stosowany w tych badaniach jest dostępny jako informacje uzupełniające w pliku o nazwie „Supplemental File_Cell Culture and Transfection”.
  3. Przeprowadzić transfekcję PMVECs biosensorem FRET i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Protokół transfekcji PMVECs jest również opisany w pliku z informacjami uzupełniającymi o nazwie „Supplemental File_Cell Culture and Transfection”.
  4. W dniu obrazowania podgrzać bufor Tyrode'a do 37 °C w kąpieli wodnej.
    UWAGA: Bufor Tyrode'a składa się z 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glukozy, 1 mM MgCl2 i 1 mM CaCl2
  5. Umieścić szkiełko podstawkowe z transfektowanymi komórkami w komorze komórkowej i zabezpieczyć górną część uszczelką montażową, aby zapobiec wyciekom.
  6. Przetrzeć spód szkiełka podstawkowego delikatną chusteczką bezpyłową, aby usunąć nadmiar medium lub przylegające komórki.
  7. Dodać 800 µL buforu roboczego oraz 4 µL znacznika jądrowego o stężeniu 5 mM do komory komórkowej i delikatnie kołysać przez 5–10 sekund.
    UWAGA: Podczas dodawania buforu lub roztworów odczynników na szkiełka zamontowane w komorze komórkowej należy robić to ostrożnie i przy ściance komory, aby nie odkleić przylegających komórek. Dodanie 4 µL znacznika jądrowego o stężeniu 5 mM do 800 µL buforu daje końcowe stężenie znacznika jądrowego wynoszące 25 µM. W przypadku komórek słabo przylegających, takich jak komórki HEK293, należy najpierw zmieszać znacznik jądrowy z buforem w probówce, a następnie dodać mieszaninę na szkiełka zamontowane w komorze komórkowej. Zapobiegnie to odrywaniu się komórek od szkiełka.
  8. Przykryć komorę komórkową folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem, i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Przygotowanie odczynnika: dodać 1 µL forskoliny o stężeniu 50 mM do 199 µL buforu. Pozwoli to uzyskać końcowe stężenie forskoliny 50 µM po dodaniu do komórek przygotowanych w 800 µL buforu. Należy również przygotować 1 µL DMSO w 199 µL buforu jako kontrolę nośnika.
    UWAGA: W tych badaniach forskolina jest używana jako aktywator adenylocyklazy w celu stymulacji produkcji cAMP. W razie potrzeby metodologię tę można łatwo zmodyfikować, aby umożliwić zastosowanie alternatywnych odczynników stymulujących lub hamujących adenylocyklazę, fosfodiesterazy itp.

2. Akwizycja obrazu

  1. Należy użyć mikroskopu konfokalnego wyposażonego w detektor spektralny.
    UWAGA: Wszystkie opisane tutaj etapy akwizycji obrazów zostały opracowane przy użyciu komercyjnie dostępnego systemu mikroskopowego Nikon A1R. Kroki te mogą wymagać dostosowania w przypadku użycia innego mikroskopu spektralnego. Należy upewnić się, że wszystkie urządzenia zostały włączone co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, aby osiągnęły stabilne warunki pracy.
  2. Wybierz obiektyw imersyjny 60x i nanieś kroplę wody na obiektyw.
    UWAGA: Do obrazowania żywych komórek w wysokiej rozdzielczości zaleca się stosowanie obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej. Informacje na temat obiektywu wykorzystanego w tych badaniach znajdują się w Liście Materiałów.
  3. Umieść załadowaną komorę z komórkami (z kroku 1.7) na stoliku mikroskopu.
  4. Wybierz zestaw filtrów DFT (DAPI/FITC/TRITC), obracając pokrętło filtrów znajdujące się po prawej stronie mikroskopu.
  5. Należy obsługiwać mikroskop w trybie fluorescencji szerokopolowej, korzystając z okularów w celu wyboru pola widzenia zawierającego komórki wykazujące ekspresję sensora FRET dla cAMP.
    UWAGA: Należy upewnić się, że średnia intensywność sygnału FRET na szczycie długości fali emisji donora lub akceptora w wybranej komórce wynosi co najmniej 100 jednostek intensywności (A.U.) lub jest co najmniej 4-krotnie wyższa od sygnału tła w obszarze bez komórek wykazujących ekspresję. Można to potwierdzić za pomocą przeglądarki profili widm dostępnej w oprogramowaniu NIS Elements. Podczas poszukiwania komórki z dobrym sygnałem zaleca się odrzucenie komórek nadmiernie jasnych (mogą być one uszkodzone).
  6. Otwórz oprogramowanie NIS, przełącz się w tryb konfokalny, odblokuj przycisk blokady lasera (laser interlock) i kliknij w Na żywo.
  7. Używając pokrętła ostrości, ustaw ostrość na komórkach, obserwując podgląd na ekranie.
  8. Skonfiguruj w oprogramowaniu ustawienia urządzenia, akwizycji oraz stosu Z (z-stack), zgodnie z poniższym opisem.
  9. Ustawienia akwizycji:
    UWAGA: Ustawienia kamery i akwizycji urządzenia można zastosować, korzystając z wcześniej wykonanego obrazu. Otwórz obraz, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Ponowne wykorzystanie ustawień kamery.
    1. Otwórz menu ustawień A1, zaznacz pola odpowiadające liniom laserowym 405 nm i 561 nm, wybierz SD dla detektora widmowego wybierz wartość 10 dla rozdzielczości oraz 31 dla kanałów.
      UWAGA: Menu ustawień A1 jest reprezentowane przez małą ikonę koła zębatego w lewym górnym rogu okna ustawień A1 Plus. Laser 405 nm jest używany do wzbudzenia donora, a laser 561 nm do wzbudzenia znacznika jądrowego.
    2. Ustaw zakres długości fali (410–730 nm), wybierając wartości początkowej i końcowej długości fali.
    3. Kliknij ikonę binningu/pomijania (binning/skip) w menu ustawień A1, zaznacz pole o numerze 15, a następnie kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. w menu ustawień A1.
      UWAGA: Ma to na celu usunięcie kanału długości fali odpowiadającego laserowi wzbudzającemu o długości 561 nm (zazwyczaj jest to 15th kanał długości fali). Ważne jest, aby nie używać tego pasma długości fali, aby uniknąć sztucznie niskiego sygnału, co może doprowadzić do powstania artefaktu widmowego. Sygnał w tym pasmie jest niższy ze względu na mechaniczny palec, który osłania element detektora, chroniąc go przed uszkodzeniem laserowym.
    4. Ustaw intensywność laserów na 8% dla lasera 405 nm i 2% dla lasera 561 nm, wzmocnienie detektora (Si Hv) na 149 oraz promień pinhole na 2,4 jednostki dysku Airy’ego (AU).
      UWAGA: Intensywność laserów może wymagać dostosowania w zależności od wieku urządzenia i stanu laserów. W przypadku regulacji intensywności laserów pomiędzy różnymi próbkami lub grupami eksperymentalnymi ważne jest zachowanie tej samej proporcji intensywności laserów (np. 8:2). Dodatkowo należy wybrać taką intensywność laserów, aby nie była ona zbyt wysoka, co mogłoby prowadzić do szybkiego fotoblaknięcia. Wzmocnienie detektora (gain) powinno zostać dostrojone tak, aby zmaksymalizować intensywność sygnału przy jednoczesnej minimalizacji szumów detektora. W tych badaniach zastosowano wzmocnienie wynoszące 149. Wybrano rozmiar otworu pinhole wynoszący 2,4 AU, aby zachować równowagę między uzyskaniem obrazów o wystarczającym stosunku sygnału do szumu (SNR) a utrzymaniem przekroju optycznego (konfokalności). Zwiększenie rozmiaru otworu pinhole zwiększa SNR, ale zmniejsza konfokalność.
    5. Ustaw prędkość skanowania na 0,25 klatki widmowej na sekundę, wybierz ikonę odpowiadającą skanowaniu jednokierunkowemu, wprowadź wartość 4 dla liczby powtórzeń oraz ustaw rozmiar skanowania na 1024 x 1024.
      UWAGA: Sygnały FRET są słabe i często wymagana jest niska prędkość skanowania. Przy prędkości skanowania 0,25 akwizycja spektralnego stosu Z (z-stack) trwa około 3 minut. Prędkość skanowania można zwiększyć lub zmniejszyć w zależności od użytych fluoroforów. Na przykład w przypadku jaśniejszych fluoroforów, takich jak eGFP, można zastosować wyższą prędkość skanowania (2 klatki/sekundę). Wartość wpisana w polu count odpowiada wartości uśredniania klatek wynoszącej 4, co pomaga w redukcji szumów podczas akwizycji obrazu. W przypadku bardzo stabilnych próbek i braku ograniczeń czasowych można zastosować wyższe wartości uśredniania (do 16), aby uzyskać obrazy o lepszym stosunku sygnału do szumu (SNR).
  10. Zdefiniuj parametry akwizycji stosu z (z-stack):
    UWAGA: Wartości wprowadzone w krokach 2.10 mogą wymagać dostosowania w zależności od zmian w wiązaniu lub stężeniu znacznika fluorescencyjnego, rodzaju znacznika, liczby użytych znaczników, linii komórkowej oraz innych zmian w przygotowaniu próbek, które mogą wpływać na gęstość znakowania komórek i/lub autofluorescencję komórkową. Podczas dostosowywania parametrów akwizycji należy dbać o uzyskanie wystarczającego stosunku sygnału do szumu (SNR), minimalizując jednocześnie fotobielenie. Ponadto podczas konfiguracji spektralnego testu FRET należy upewnić się, że parametry działają prawidłowo we wszystkich grupach badawczych. Zaleca się przeprowadzenie próby dla każdej grupy badawczej z proponowanymi ustawieniami parametrów, aby upewnić się, że SNR jest wystarczający, a fotobielenie zostało zminimalizowane.
    1. Otwórz okno akwizycji ND, klikając widok → kontrola akwizycji → Pozyskiwanie danych ND.
    2. W oknie wyskakującym wprowadź ścieżkę/miejsce docelowe oraz nazwę pliku, aby zapisać plik ND.
    3. Zaznacz pole odpowiadające seria z.
    4. Kliknij w na żywo w oknie ustawień A1 Plus. Spowoduje to otwarcie okna podglądu na żywo.
    5. Dostosuj pokrętło ostrości mikroskopu, aby wybrać górną część komórki, i kliknij Góra w oknie akwizycji ND, aby ustawić aktualną pozycję jako górną.
      UWAGA: Zaleca się ustawienie ostrości nieco powyżej górnej krawędzi komórki, aby upewnić się, że cała komórka zostanie objęta próbkowaniem w serii z.
    6. Przekręć pokrętło ostrości mikroskopu, aby ustawić ostrość na dno komórki, a następnie kliknij w Dół w oknie akwizycji ND, aby ustawić aktualną pozycję jako dno.
      UWAGA: Skupić ostrość nieco poniżej dna komórki, aby upewnić się, że pobrano próbkę z całej komórki.
    7. Wprowadź 1 µm w polu wielkości kroku wybierz opcję top-bottom dla kierunku skanowania w osi Z, a następnie kliknij uruchom w oknie ND Acquisition w celu wykonania akwizycji stosu z (z-stack).
      UWAGA: Wielkość kroku określa liczbę obrazów w osi Z (z-slices), które zostaną pozyskane, w zależności od górnej i dolnej lokalizacji (tj. przebytej odległości). A 1 µm wielkość kroku dobrano jako kompromis pomiędzy szybkością obrazowania, próbkowaniem w osi Z a fotoblaknięciem. Zastosowanie średnicy przysłony konfokalnej wynoszącej 2,4 AU oraz obiektywu z imersją wodną 60x pozwoliło uzyskać grubość przekroju optycznego wynoszącą 1.73 µmZatem, a 1 µm wielkość kroku jest nieco poniżej kryterium próbkowania Nyquista, jednak jest to kompromis przyjęty w celu skrócenia czasu potrzebnego na pozyskanie stosu z (z-stack). W przypadku bardzo stabilnych próbek, dla których szybkość nie jest krytyczna, można zastosować mniejszy krok w osi z oraz ewentualnie mniejszą średnicę otworu pinhole konfokalu, aby zwiększyć rozdzielczość w osi z. Skanowanie od dołu do góry powinno dać podobne wyniki i może być wykorzystane do oceny ewentualnych efektów fotobielenia, które mogą wystąpić podczas skanowania w osi z.
  11. Skonfiguruj system idealnego ostrzenia (Perfect Focus System, PFS), jeśli jest dostępny:
    UWAGA: Funkcja PFS umożliwia systemowi kompensację wahań głębokości ogniskowej podczas akwizycji obrazu. Poniższe kroki mogą zostać wykorzystane do konfiguracji funkcji PFS; mogą one nieznacznie różnić się w zależności od wersji systemu Nikon A1R oraz wersji oprogramowania NIS Elements.
    1. Zaznacz tryb symetryczny (symmetric mode), zdefiniowany przez ikonę zakresu w oknie akwizycji ND.
    2. Włącz przycisk PFS na przednim panelu mikroskopu (upewnij się, że pokrętło lustra dichroicznego znajdujące się w sekcji pod stolikiem znajduje się w pozycji „in”).
    3. Zdefiniuj ponownie wartości górną (obrót przeciwnie do ruchu wskazówek zegara) i dolną (obrót zgodnie z ruchem wskazówek zegara), używając pokrętła na przedniej ściance kontrolera przesunięcia PFS.
    4. Zdefiniuj względną pozycję z/głębokość z, klikając przycisk „relative” w oknie akwizycji ND.
    5. Kliknij funkcję pamięci (memory) na przednim panelu mikroskopu, aby oprogramowanie zapamiętało względną głębokość osi z.
  12. Po zakończeniu akwizycji stosu z (z-stack), należy delikatnie dodać odpowiedni odczynnik (forskolinę lub kontrolę pojazdu) za pomocą pipety i odczekać 10 minut.
    UWAGA: Odczynnik należy dodawać bardzo delikatnie, aby nie zakłócić stanu komórek ani nie przesunąć komory komórkowej na stole mikroskopu w osiach XY; zaleca się zweryfikować w kolejnym podglądzie na żywo lub na obrazie, czy pole widzenia nie przesunęło się podczas dodawania odczynnika. 10-minutowy czas oczekiwania służy temu, aby traktowanie forskoliną zaczęło działać. W przypadku zastosowania alternatywnej metody traktowania czas oczekiwania może wymagać korekty.
  13. Po 10 minutach zmień nazwę pliku i kliknij uruchom w oknie akwizycji ND.
  14. Powtórzyć kroki 2.11–2.13 zgodnie z powyższym opisem dla co najmniej 5 szkiełek podstawowych, aby uzyskać wyniki wystarczające do analizy statystycznej (n=5 dla każdej grupy badawczej – z forskoliną i kontrolą nośnikiem).
  15. Przygotuj próbki oraz próbki ślepe do stworzenia biblioteki widm i wykonaj obrazowanie spektralne, stosując parametry akwizycji zbliżone do tych opisanych w krokach 2.9 i 2.10.

3. Analiza obrazu

UWAGA: Obrazy te zostaną wykorzystane do stworzenia biblioteki widm zawierającej czyste widma wszystkich poszczególnych komponentów (endmembers) obecnych w badaniu. Komponenty w bibliotece widm mogą różnić się w zależności od badania, jeśli zostaną użyte inne fluorofory. Szczegółowa procedura tworzenia biblioteki widm znajduje się w pliku z informacjami uzupełniającymi o nazwie „Supplemental File_Spectral Library”. Poniżej opisano eksport danych do plików .tiff, liniowe rozdzielanie widm (linear spectral unmixing), pomiary wydajności FRET, rekonstrukcję trójwymiarową oraz szacowanie poziomu cAMP. Analiza obrazów może być przeprowadzona przy użyciu różnych platform do analizy obrazu i programowania, takich jak ImageJ, Python, MATLAB lub CellProfiler. W niniejszych badaniach wykorzystano skrypty MATLAB.

  1. Eksportuj dane obrazu:
    1. Utwórz nowe foldery o nazwach odpowiadających nazwom plików obrazów spektralnych z serii z-stack, pozyskanych w krokach 2.13 i 2.14.
      UWAGA: Poniższe kroki opisujące eksport danych są specyficzne dla wersji 4.30.01 oprogramowania NIS Elements AR. Kroki te mogą się nieznacznie różnić w zależności od wersji oprogramowania.
    2. Kliknij Plik, co otworzy okno wyboru pliku. Przejrzyj dostępne pliki, wybierz plik obrazu widmowego pozyskanego w kroku 2.12 i kliknij Otwórz.
    3. Po załadowaniu pliku kliknij Plik→ Import/Eksport→ Eksportuj dokument ND.
    4. W oknie wyskakującym: przejrzyj i wybierz folder utworzony w kroku 3.1.1, wybierz Tagged Image Format (TIF) jako typ pliku, a następnie wybierz Obraz monochromatyczny dla każdego kanału i Zachowaj głębię bitową.
      UWAGA: Przedrostek pliku zostanie wygenerowany automatycznie; wartość tę można zmienić dla większej wygody. Kolejność indeksowania zmieni się w zależności od wybranych kanałów i powinna wyświetlać „z, c” w przypadku indeksowania najpierw według położenia warstwy z, a następnie numeru pasma długości fali. Należy upewnić się, że pola odpowiadające Zastosuj tablice LUT lub Wstaw nakładki lub Użyj nazw punktów nie zostały wybrane.
    5. Kliknij Eksport aby wyeksportować pliki TIFF do folderu docelowego jako poszczególne pliki TIFF.
    6. Powtórzyć kroki 3.1.2 – 3.1.5, aby wyeksportować pliki obrazów spektralnych pozyskane w kroku 2.13.
  2. Liniowe rozdzielanie widmowe:
    1. Otwórz oprogramowanie do programowania.
      UWAGA: Specjalnie opracowany skrypt programistyczny do rozdzielania surowych obrazów spektralnych jest dostępny na stronie University of South Alabama BioImaging and BioSystems, w zakładce Resources (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. Otwórz plik o nazwie „Linear Unmixing.m” i kliknij uruchom przycisk na pasku narzędzi edytora.
    3. Przejrzyj i wybierz folder zawierający wyeksportowaną sekwencję plików *.tif wygenerowaną przez oprogramowanie NIS Elements.
    4. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. aby kontynuować, co otworzy nowe okno o nazwie Długość fali i warstwa Z (Z-Slice).
    5. Skopiuj nazwę pierwszego pliku (bez numeru warstwy z oraz numeru kanału) w folderze wybranym w kroku 3.2.4 i wklej ją w pierwszym kroku okna dialogowego zatytułowanego „Enter the Image Name”.
    6. Wprowadź liczbę kanałów w drugim kroku zatytułowanym „Enter the number of wavelength bands”, liczbę przekrojów Z w trzecim kroku zatytułowanym „Enter the number of Z-slices”, a następnie kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
      UWAGA: Liczba pasm długości fal może ulec zmianie w przypadku modyfikacji ustawień akwizycji, takich jak dostosowanie zakresu długości fali lub kroku długości fali. Liczba plastrów Z może również ulec zmianie w zależności od wysokości komory.
    7. Przeglądaj i wybierz plik długości fali o nazwie „Wavelength.mat” w oknie wyskakującym z etykietą „Select the wavelength information file”, a następnie kliknij otwórz.
    8. Przejrzyj i wybierz plik „Library.mat” w nowym oknie wyskakującym zatytułowanym „Select the spectral library file”, kliknij otwórz i należy poczekać do zakończenia procesu rozdzielania (unmixing) obrazów z poszczególnych warstw.
      UWAGA: Plik Library.mat jest plikiem zawierającym czyste widma dla każdego fluoroforu końcowego (endmember), a także sygnatury spektralne autofluorescencji komórek i tła. W tym przypadku fluorofory końcowe obejmują Turquoise, Venus oraz DRAQ5. Sygnatury spektralne tła obejmują autofluorescencję komórkową lub macierzy, fluorescencję szkiełka podstawowego oraz dyfrakcję szkiełka podstawowego. Plik Wavelength.mat jest plikiem zawierającym informacje o kanałach długości fali wykorzystanych do pozyskania obrazu spektralnego. Przykładowy plik biblioteki oraz plik długości fali są dostępne na stronie internetowej Bioimaging and Biosystems (patrz uwaga pod punktem 3.2.1). Więcej informacji na temat generowania biblioteki spektralnej i plików długości fali znajduje się w pliku z informacjami uzupełniającymi o nazwie „Supplemental File_Spectral Library”. Obrazy po rozdzieleniu spektralnym (unmixed images) odpowiadające każdemu przekrojowi z zostaną zapisane w folderze „Unmixed”, utworzonym podczas procesu rozdzielania wewnątrz folderu wybranego w kroku 3.2.3.
  3. Obliczanie wydajności FRET:
    1. Otwórz skrypt programistyczny o nazwie „multiFRRCF.m” i kliknij uruchom.
      UWAGA: Plik programistyczny ten jest dostępny na stronie internetowej University of South Alabama Bioimaging and Biosystems (patrz uwaga pod krokiem 3.2.1).
    2. Wprowadź liczbę prób doświadczalnych do analizy w oknie dialogowym o nazwie „how many folders to reslice”, a następnie kliknij Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia..
      UWAGA: Dane obrazowe z każdego eksperymentu należy zapisać w osobnym folderze z obrazami po rozdzieleniu sygnałów (unmixed). Ten krok służy jedynie temu, aby kod analizy mógł przetwarzać wiele folderów w pętli, co pozwala zaoszczędzić czas.
    3. Przeglądaj i zaznacz folder(y) z niezmiksowanymi próbkami, a następnie kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
      UWAGA: Liczba okien wyskakujących „Przeglądaj foldery” zależy od wartości wprowadzonej w polu dialogowym „Ile folderów ma zostać ponownie podzielone na plastry” w poprzednim kroku. Przeglądaj i wybieraj foldery jeden po drugim.
    4. W nowym oknie wyskakującym wprowadź następujące informacje w odpowiednie pola: czynnik skalujący wynosi 12,4, Próg wynosi 5,6, X, Y, or częstotliwość Z wynoszą odpowiednio 5, 5 i 1, a algorytm wygładzania jest rozkładem Gaussa.
      UWAGA: Współczynnik skalowania jest wartością wyrażoną w pikselach/µm i zostanie wykorzystany do przeskalowania próbkowania w kierunku Z do poziomu próbkowania w kierunku XY. Współczynnik skalowania uzyskuje się z rozmiaru piksela obrazu, który w większości systemów mikroskopów konfokalnych jest zazwyczaj dostarczany jako metadane obrazu. Na przykład, jeśli obraz zostanie pozyskany przy użyciu 0.08 µm/pixeodstępów l, współczynnik skalowania powinien wynosić 12,5 piksela/µmWartość progowa zostanie wykorzystana do progowania obrazów i wygenerowania maski binarnej komórki. Utworzyliśmy listę optymalnych wartości w zależności od natężenia sygnału donora i akceptora. Należy zastosować wartość progową 4,5, jeśli obraz charakteryzuje się wysokim natężeniem sygnału donora i akceptora oraz niskim tłem; wartość od 5,6 do 6,5 dla obrazów o umiarkowanym natężeniu sygnału donora i akceptora i/lub wyższym tle oraz wartość 7,5 lub wyższą dla obrazów, w których natężenie sygnału donora i akceptora jest niższe od tła. Wartość częstotliwości odpowiada interwałowi, wyrażonemu w liczbie pikseli, w którym wykonywane jest przekrawanie w kolejnych krokach. Na przykład, jeśli głębokość Z komórki wynosi 17 µm z a 1 μm wielkość kroku oraz współczynnik skalowania wynoszący 12,5 piksela/μm Jeśli zostanie zastosowany kierunek XY, głębokość trójwymiarowego zbioru danych obrazowych zostanie przeprobowana do 212 pikseli (kierunek Z). Na podstawie wprowadzonej wartości częstotliwości Z (na przykład 1 piksel), trójwymiarowy zbiór danych obrazowych zostanie ponownie przecięty, zaczynając od górnej części zbioru danych, a następnie przesuwając się w dół w przyrostach o 1 piksel. W rezultacie powstanie 212 ponownie przeciętych obrazów. Gdyby dla częstotliwości Z wprowadzono większą wartość interwału, wygenerowano by mniej ponownie przeciętych obrazów. Ponownie przecięte obrazy są zapisywane w kolejnych krokach.
    5. Kliknij uruchom i należy poczekać, aż wszystkie pomiary FRET oraz ponowne tworzenie przekrojów zostaną wykonane.
      UWAGA: W katalogu nadrzędnym tworzony jest osobny folder, w którym zapisywane są przetworzone obrazy efektywności FRET w skali szarości oraz kolorowe obrazy efektywności FRET (z zastosowaną mapą kolorów). Na przykład wszystkie obrazy FRET w skali szarości i z mapą kolorów, przetworzone w kierunku X (płaszczyzna YZ), są zapisywane w folderze o nazwie „Resliced_XFRET”.
    6. Powtórzyć analizę z podobnymi ustawieniami dla wszystkich eksperymentów – przed i po zastosowaniu forskoliny oraz dla kontroli nośnikiem.
      UWAGA: Kroki opisane w sekcji 3.3 określają wartości, które należy wprowadzić do niestandardowego skryptu programistycznego do analizy FRET w celu wygenerowania trójwymiarowych danych obrazowych FRET. Skrypt ten wykonuje podczas działania szereg operacji, w tym: ładowanie danych obrazowych, tworzenie stosów obrazów, wygładzanie, obliczenia wydajności FRET, tworzenie i nakładanie maski obrysu komórki, trójwymiarową rekonstrukcję obrazu, ponowne przekrawanie obrazów trójwymiarowych w określonych odstępach (częstotliwościach), nakładanie mapy kolorów w celu wizualizacji zmian FRET oraz zapisywanie ponownie przekrawanych danych obrazowych w tym samym katalogu. Dodatkowe szczegóły zostały zawarte w formie komentarzy w skrypcie programu.

4. Mapowanie wydajności FRET na poziomy cAMP

  1. Otwórz plik programistyczny o nazwie „Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m” i kliknij run w głównym oknie.
    UWAGA: Plik jest dostępny na stronie internetowej BioImaging and BioSystems (patrz uwaga pod punktem 3.2.1). Plik ten odczytuje obrazy efektywności FRET w skali szarości i przelicza je na poziomy cAMP na podstawie krzywej charakterystycznej. Krzywa charakterystyczna ta wykorzystuje zależność między cAMP a FRET udokumentowaną w literaturze15,36, opisaną równaniem Hilla (trzecie równanie poniżej). Jednakże Kd sondy w nienaruszonych komórkach jest trudne do oszacowania, dlatego w obliczeniach przyjęto wartość 1 μM. W związku z tym wyniki przedstawiono jako funkcję Kd (tj. [cAMP] = x* Kd). Równania stosowane do pomiaru efektywności FRET i mapowania FRET na poziomy cAMP przedstawiono poniżej:
    figure-protocol-1
    Gdzie E to efektywność FRET, a  aapparent oraz dapparent to odpowiednio intensywności niezmieszanych pikseli obrazów akceptora i donora.
    Qa i Qd to wydajności kwantowe akceptora i donora. Należy zauważyć, że  Qa i Qd znoszą się, gdy równanie dla kλ zostaje włączone do równania efektywności FRET; kλ jest współczynnikiem korekcyjnym:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3 oraz figure-protocol-4 to współczynniki ekstynkcji donora i akceptora przy długości fali wzbudzenia donora, i (405nm).
    figure-protocol-5
    E to efektywność FRET, a KD  = stała dysocjacji = 1 μM.
  2. Przejdź do pierwszego obrazu FRET w skali szarości (zapisanego w kroku 3.3.5), zaznacz go i kliknij OK.
  3. Otwórz obrazy FRET/cAMP, aby przeanalizować rozkład sygnałów cAMP w trzech wymiarach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie obrazowania hiperspektralnego FRET oraz metod analizy w celu pomiaru gradientów cAMP w trzech wymiarach przestrzennych w żywych komórkach. Wygenerowanie tych wyników wiąże się z kilkoma kluczowymi etapami, które wymagają szczególnej uwagi podczas analizy i kwantyfikacji danych. Do kluczowych kroków należą: stworzenie odpowiedniej biblioteki spektralnej, odejmowanie tła metodą unmixingu spektralnego, progowanie w celu identyfikacji granic komórek oraz obliczenia wydajności FRET.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rozwój bioczujników FRET umożliwił pomiar i wizualizację cyklicznych sygnałów nukleotydowych w pojedynczych komórkach i jest bardzo obiecujący w wizualizacji subkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych 13,22,37,38. Jednak zastosowanie bioczujników FRET ma kilka ograniczeń, w tym niską charakterystykę sygnału do szumu wielu reporterów FRET opartych na białkach fluorescencyjnych oraz słabą wydajność ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Doktorzy Leavesley i Rich ujawniają udziały finansowe w start-upie SpectraCyte, LLC, który został utworzony w celu komercjalizacji technologii obrazowania spektralnego. Jednak wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu dostępnych na rynku produktów niezwiązanych ze SpectraCyte, LLC.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować dr Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute and van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Holandia) za dostarczenie nam biosensora H188 cAMP FRET oraz Kenny'emu Trinhowi (College of Engineering, University of South Alabama) za pomoc techniczną w skróceniu czasu potrzebnego na uruchomienie naszych niestandardowych skryptów programistycznych.

Autorzy pragną podziękować za źródła finansowania: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora komórkowa AttofluorInvitrogenA7816Attofluor zawiera stalowe komory ogniw oraz gumowy O-ring. Komora komórkowa utrzymuje szkiełko nakrywkowe, a O-ring zapewnia mechanizm blokujący do utrzymywania buforu w komorze komórkowej bez wycieku
Siarcotlenek dimetylu (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Rozpuszczalnik używany do przygotowania roztworu podstawowego dla skoliny.
DRAQ5 Roztwór sondy fluoroscencyjnejThermo Scientific62252Etykieta jądrowa
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-092Zawiera składniki odżywcze i czynniki wzrostu, dzięki którym komórki mogą rosnąć i dzielić się w naczyniach hodowlanych.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF6178Suplement czynnika wzrostu, który jest dodawany do pożywki hodowlanej, DMEM
ForskolinSigmaF3917Aktywator cyklazy Adenyly.
H188 Cykliczny bioczujnik AMP FRETNetherland Cancer Institute, Dr. K. JalinkPrezentPlazmid kodujący turkus (fluorofor donorowy), Venus (fluorofor akceptorowy) i domenę wiążącą uzyskaną z Epac.
Image Jimage.netDo pobrania za darmoKolejna platforma przetwarzania obrazu służąca do ekstrakcji informacji spektralnych i przetwarzania obrazu.
Integracja SphereOcean OpticsFOIS-1Służy do pomiaru intensywności oświetlenia linii laserowej przy różnych natężeniach lasera (?).
Białko myszy Laminin, naturalnyInvitrogen23017-015Szkiełka nakrywkowe są pokryte lamininą, co pomaga w przyczepianiu komórek, wzroście i ruchliwości komórki.
Zestaw do transfekcji Lipofectamine 3000InvitrogenL3000-015Odczynnik do transfekcji stosowany do transfekcji komórek za pomocą biosensora H188 FRET
MATLABMathworksR2019aOperacje przetwarzania obrazu (liniowe rozmieszanie i obliczenia wydajności FRET) są wykonywane poprzez pisanie niestandardowych programów w środowisku programistycznym MATLAB
Mikroskop konfokalny Nikon A1RInstrumenty NikonNikon A1RAkwizycja obrazu spektralnego odbywa się za pomocą mikroskopu konfokalnego.
Oprogramowanie Nikon ElementsKlucz sprzętowy oprogramowaniaNikon Instrumentssłużący do eksportowania i obsługi plików obrazów nd2 (wielowymiarowych plików obrazów), które są pozyskiwane za pomocą lampy kalibracyjnej Nikon A1R
NIST-TraceableOpticsLS-1-CAL-INTLampa o znanym widmie do użytku jako standard
PBS pH 7,4 (1X)Gibco10010-023coomonly używany bufor do hodowli komórkowej
Komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc (PMVEC)W domu - rdzeń hodowli komórkowej, Uniwersytet Południowej AlabamyWyizolowane z mikrokrążenia płucnego szczuraPMVEC tworzą wewnętrzną wyściółkę naczynia krwionośnego.
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140-122są dodawane do culture medum, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek.
Wstępnie oczyszczone mikroszkiełka Gold SealClay Adams3010Szkiełka mikroskopowe używane do mocowania komórek
ProLong Diamond Antifade Mounting MediaInvitrogenP36961Jeśli próbki są utrwalane za pomocą mocowania zapobiegającego blaknięciu, to ten ostatni chroni barwniki fluorescencyjne i chromofory przed blaknięciem.
SpektrometrOcean OpticsQE65000Służy do pomiaru odpowiedzi spektralnej źródła światła (?)
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco25200-056Trawi wiązanie białko-białko między komórką a macierzą komórkową i pomaga w dyscypacji i podnoszeniu komórek podczas powlekania komórek.
Bufor TyrodesWykonany we własnymzakresie Bufor Tyrodes służy do wytwarzania roztworów roboczych i utrzymywania komórek w roztworze wodnym podczas akwizycji obrazu.
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejCorning3506Szkiełka nakrywkowe pokryte laminą umieszcza się w 6-dołkowym naczyniu hodowlanym (jedna pokrywa / studzienka). Komórki wraz z pożywką dodaje się do każdej studzienki.
Okrągłe szkiełka nakrywkowe mikroskopu 25 mmFisher Scientific12545102Komórki hodowano na okrągłych szklanych szkiełkach nakrywkowych
60X OjectiveNikon InstrumentsPlan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27zanurzenie w wodzie i powszechnie stosowany obiektyw do komórek
Ocean Antybiotyki

Bibliografia

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031(2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58(2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513(2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586(2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010(2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332(2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003(2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453(2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozk ad cAMPodmieszanie widmowemikroskopia konfokalnaobrazowanie 3Dcykliczny AMPwydajno FRETbiblioteka widmowaliniowe odmieszanie

Powiązane artykuły