Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)

Edward  M. Hsieh; Jimena Carrillo-Tripp; Adam G. Dolezal

doi:10.3791/61725

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61725

⸱

26 sierpnia 2020

Edward M. Hsieh¹ , Jimena Carrillo-Tripp² , Adam G. Dolezal¹

¹Department of Entomology, University of Illinois, ²Department of Microbiology, Center for Scientific Research and Higher Education of Ensenada (CICESE)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy dwa protokoły: pierwszy do rozmnażania, ekstrakcji, oczyszczania i ilościowego oznaczania dużych ilości bezotoczkowych cząsteczek wirusa pszczoły miodnej, w tym metoda usuwania poczwarek pszczół miodnych, a drugi do testowania skutków infekcji wirusowej za pomocą wysoce powtarzalnego, wysokoprzepustowego testu biologicznego w klatce.

Streszczenie

Pszczoły miodne mają ogromne znaczenie ekologiczne i rolnicze na całym świecie, ale są również poddawane różnorodnym presjom, które negatywnie wpływają na zdrowie pszczół, w tym narażeniu na patogeny wirusowe. Takie wirusy mogą powodować wiele różnych niszczycielskich skutków i często mogą być trudne do zbadania ze względu na wiele czynników, które utrudniają oddzielenie efektów eksperymentalnych terapii od istniejącej wcześniej infekcji tła. W tym miejscu przedstawiamy metodę masowej produkcji dużych ilości cząstek wirusa wraz z wysokoprzepustowym testem biologicznym do testowania infekcji wirusowej i skutków. Ze względu na obecny brak ciągłej, wolnej od wirusów linii komórkowej pszczoły miodnej, cząsteczki wirusa są amplifikowane in vivo przy użyciu poczwarek pszczół miodnych, które są ekstrahowane z ula w dużych ilościach przy użyciu minimalnie stresującej metodologii. Te cząsteczki wirusa mogą być następnie wykorzystane w testach biologicznych klatek pszczół miodnych do testowania żywotności inokulantów, a także różnych innych dynamik infekcji wirusowych, w tym interakcji z odżywianiem, pestycydami i innymi patogenami. Główną zaletą stosowania takich cząstek jest to, że znacznie zmniejsza to szanse na wprowadzenie nieznanych zmiennych w późniejszych eksperymentach w porównaniu z obecnymi alternatywami, takimi jak zakażenie przez zakażoną hemolimfę pszczelą lub homogenat, chociaż nadal należy zachować ostrożność przy pozyskiwaniu pszczół, aby zminimalizować zanieczyszczenie wirusem tła. Testy klatkowe nie zastępują zakrojonych na szeroką skalę, realistycznych eksperymentów testujących skutki infekcji wirusem na poziomie kolonii, ale zamiast tego funkcjonują jako metoda ustalania podstawowych odpowiedzi wirusa, które w połączeniu z półczystymi cząsteczkami wirusa mogą służyć jako ważne narzędzia do badania różnych wymiarów fizjologicznych interakcji wirusa pszczoły miodnej.

Wprowadzenie

Pszczoły miodne (Apis mellifera) odgrywają kluczową rolę we współczesnym globalnym krajobrazie rolniczym, ale obecnie cierpią z powodu kombinacji stresorów biotycznych i abiotycznych, w tym ekspozycji na pestycydy, niskiej jakości paszy, pasożytów i patogenów1^,². Jednym z najważniejszych patogenów budzących obawy są wirusy, z których wiele jest przenoszonych przez inny z głównych czynników stresogennych pszczół miodnych, pasożytniczy roztocz Varroa (Varroa destructor). Wirusy te mogą powodować szereg negatywnych skutków u pszczół miodnych, w tym zmniejszoną przeżywalność czerwiu, wady rozwojowe i paraliż, które mogą prowadzić do całkowitego zawalenia się ula zarówno przed, jak i po okresie zimowania³^,⁴^,⁵. Chociaż nastąpił obiecujący postęp w rozwoju technologii wykorzystywanych do zwalczania infekcji wirusowych⁶^,⁷^,⁸^,⁹, dynamika, dzięki której wiele wirusów rozprzestrzenia się, rozprzestrzenia i oddziałuje w obrębie pszczoły miodnej lub kolonii, jest nadal słabo poznana5^,¹⁰. Zrozumienie podstawowej biologii interakcji pszczół miodnych i wirusów oraz ich związków z innymi czynnikami środowiskowymi ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych technik zarządzania wirusami.

Jednak badanie interakcji między pszczołą miodną a wirusem stanowi wyzwanie z wieloma znanymi i nieznanymi czynnikami, które komplikują ten proces. Obejmują one interakcje z diet¹¹^,¹², pestycydami exposure¹³ i tłem genetycznym pszczół¹⁴^,¹⁵. Nawet jeśli skupiamy się wyłącznie na infekcji wirusowej, powikłania są powszechne, ponieważ populacje pszczół miodnych, zarówno kontrolowane, jak i dzikie, zawsze mają pewien stopień infekcji wirusem w tle, choć często bez objawów ostrych¹⁶^,¹⁷, a skutki koinfekcji wirusem nie są dobrze poznane¹⁸. To sprawiło, że badania nad wpływem wirusa pszczół miodnych są trudne do rozwikłania.

Wiele badań nad wirusem pszczół miodnych wykorzystywało poszlakowe infekcje wirusowe do szukania interakcji z innymi czynnikami stresogennymi, obserwując, jak infekcje tła zmieniają się wraz z innymi metodami leczenia¹²^,¹⁹^,²⁰^,²¹. Chociaż podejście to odniosło sukces w identyfikacji ważnych efektów, zwłaszcza w odkrywaniu, w jaki sposób pestycydy lub zabiegi dietetyczne wpływają na poziom i replikację wirusa, inokulacja wirusem o znanej zawartości i stężeniu ma kluczowe znaczenie dla eksperymentalnego testowania dynamiki infekcji wirusowych. Mimo to oddzielenie leczenia eksperymentalnego od infekcji tła może również stanowić wyzwanie. W badaniach terenowych naukowcy zróżnicowali szczepy wirusa zdeformowanych skrzydeł (DWV), aby dostarczyć dowodów na przenoszenie wirusa z pszczół miodnych na trzmiele²², ale zastosowanie tego podejścia byłoby trudne w przypadku samych pszczół miodnych. Zakaźne klony wirusów są potężnym narzędziem, nie tylko do śledzenia infekcji²³^,²⁴^,²⁵, ale także do badań genetyki odwrotnej wirusów pszczoły miodnej oraz do badań interakcji wirus-gospodarz²⁶^,²⁷^,²⁸. Jednak w większości przypadków zakaźne klony są nadal wymagane do wypełnienia cyklu infekcji wewnątrz komórek w celu wytworzenia cząstek. Takie cząstki są preferowane jako inokulatory do eksperymentalnych terapii, ponieważ ich zakaźność jest wyższa niż nagiego wirusowego RNA, a inokulacja zamkniętymi genomami naśladuje naturalną infekcję.

Produkcja czystej, nieskażonej inokulacji wirusa pszczoły miodnej (szczepy wirusa dzikiego typu lub pochodzące z zakaźnych klonów) również stanowi wyzwanie. Wynika to przede wszystkim z trudności w uzyskaniu niezawodnej, stale replikującej, wolnej od wirusów linii komórkowej pszczoły miodnej w celu produkcji czystych wirusów ²⁹^,³⁰. Chociaż wyprodukowano już pewne linie komórkowe, systemy te pozostają niedoskonałe; Mimo to istnieje nadzieja, że uda się wyprodukować realną linię komórkową²⁹, co pozwoliłoby na dokładniejszą kontrolę produkcji i badań nad wirusem. Dopóki taka linia nie stanie się powszechnie dostępna, większość protokołów produkcji wirusów będzie nadal opierać się na produkcji i oczyszczaniu wirusów in vivo¹⁸^,³¹^,³²^,³³^,³⁴. Podejścia te polegają na identyfikacji i oczyszczaniu interesujących nas cząsteczek wirusa (lub produkcji zakaźnego klonu) i wykorzystywaniu ich do infekowania pszczół miodnych, zwykle jako poczwarek. Poczwarkom wstrzykuje się docelowego wirusa, a następnie uśmierca, a dalsze cząstki są ekstrahowane i oczyszczane. Ponieważ jednak żadna pszczoła nie jest wolna od wirusów, zawsze występuje pewien stopień zanieczyszczenia śladami innych wirusów w każdym takim koncentracie, dlatego należy zachować dużą ostrożność przy wyborze pszczół o niskim prawdopodobieństwie infekcji tła. Co więcej, metody usuwania poczwarek z komórek grzebienia do użycia w tych protokołach³³ są bardzo pracochłonne i mogą wywoływać stres u pszczół, ograniczając produkcję w ten sposób¹⁸^,³². W tym miejscu przedstawiamy alternatywną metodę, która pozwala na usuwanie larw na dużą skalę przy niewielkim nakładzie pracy i mniejszym obciążeniu mechanicznym pszczół.

Po uzyskaniu poczwarek i wstrzyknięciu im początkowego inokulum wirusa, muszą one zostać poddane inkubacji, aby dać wirusowi czas na replikację. Następnie wytworzone cząsteczki wirusa mogą zostać przetworzone na formę nadającą się do zainfekowania eksperymentalnych pszczół. Istnieje kilka prostych metod, aby to osiągnąć, w tym użycie prymitywnego homogenatu³⁵^,³⁶ lub hemolimfy generowanej przez wirusowe pszczoły jako źródło infekcji³⁷. Metody te są skuteczne, ale napotykają na większą szansę na wprowadzenie nieznanych zmiennych z podłoża tła (np. innych czynników w homogenatach martwych pszczół). Dodatkowo pożądane jest zagęszczenie cząstek, jeśli eksperyment wymaga podania dużej, znanej dawki wirusa w krótkim czasie. Dlatego, aby uzyskać lepszą kontrolę, lepiej jest stosować metody, które pozwalają na pewien poziom oczyszczenia i koncentracji cząsteczek wirusa. Ogólnie rzecz biorąc, seria etapów wytrącania i wirowania spowoduje usunięcie prawie wszystkich możliwych materiałów wirusowych niebędących docelowymi wirusami³³.

Po wyprodukowaniu tego skoncentrowanego inokulum, korzystne jest ilościowe określenie mian wirusa (qPCR) i scharakteryzowanie go za pomocą testów biologicznych in vivo, aby przetestować jego żywotność i zdolność do powodowania śmiertelności, a także potwierdzić, że zwiększone miana wirusa są uzyskiwane po infekcji. Można to osiągnąć poprzez eksperymenty z wstrzykiwaniem (zarówno do poczwarek, jak i osobników dorosłych) lub eksperymenty z karmieniem (do larw lub osobników dorosłych). Chociaż wszystkie te podejścia są możliwe, karmienie grup dorosłych pszczół w klatce jest często najszybsze i najprostsze. Metoda oznaczania klatkowego jest również szeroko stosowana do testowania różnych innych metod leczenia pszczół, w tym toksyczności pestycydów³⁸, rozwoju jajników³⁹ i wpływu odżywiania na zachowanie⁴⁰^,⁴¹ i dlatego może stanowić dobrą podstawę do eksperymentów łączących infekcję wirusową z innymi czynnikami⁴².

Tutaj opisujemy niezawodną metodę produkcji dużych ilości półczystych, wysoko wzbogaconych cząsteczek wirusa bez użycia drogiej ultrawirówki, w tym metodę usuwania poczwarek, która zmniejsza obciążenie pszczół i pracę i mechaniczne oraz wysoce powtarzalny, wysokoprzepustowy test biologiczny do testowania infekcji wirusowych i efektów. Poprzez ścisłą kontrolę czystości inokulacji wirusa, badacze są w stanie zmniejszyć zmienność odpowiedzi wirusa pszczoły miodnej w porównaniu z innymi metodami inokulacji wirusa. Co więcej, test biologiczny może badać skutki wirusowe na poziomie małych grup przy użyciu wysoce powtarzalnych jednostek eksperymentalnych przed skalowaniem do realistycznych warunków w terenie, co jest znacznie bardziej pracochłonne. W połączeniu te dwie metody zapewniają niezbędne narzędzia do badań, które mogą pomóc w lepszym zrozumieniu fizjologicznych interakcji między pszczołą miodną a wirusem pszczoły miodnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Opcja masowego pozyskiwania pszczół 1: samodzielne usuwanie larw

Umieść królową pszczół miodnych w klatce na pustej, rozciągniętej ramie Langstroth i zwróć ją do jej kolonii. Pozwól królowej złożyć jaja na tej ramce przez 24 godziny.
1. Po 24 godzinach sprawdź ramkę, aby upewnić się, że większość komórek plastra zawiera nowo złożone jaja. W zależności od królowej i kolonii, jaja czasami nie są składane zbyt dobrze w ciągu pierwszych 24 godzin. W takim przypadku należy odczekać dodatkowe 24 godziny i w razie potrzeby dostosować czas.
Po 24 godzinnym okresie składania jaj wypuść królową. Wyraźnie zaznacz ramkę i zwróć ją do kolonii.
Dokładnie 192 godziny (8 dni) po umieszczeniu królowej w klatce (zakładając normalne złożenie jaj w ciągu pierwszych 24 godzin; 8 dni oznacza punkt tuż przed przepoczwarzeniem), należy usunąć oznaczoną ramkę z kolonii. Zetrzyj wszystkie dorosłe pszczoły i przenieś ramkę do inkubatora dopasowanego do warunków wewnętrznych ula (34 °C i 50% wilgotności względnej (RH)).
1. Sprawdź, czy większość ramy jest wypełniona larwami 5^th instadium, które można rozpoznać po ich dużych, białych ciałach w kształcie litery C mocno dociśniętych do dolnych krawędzi komórek grzebienia. Prawdopodobnie będzie też kilka komórek już pokrytych woskową nasadką, szczególnie w pobliżu środka ramy.
Przygotuj pojemniki dopasowane do wysokości i szerokości ramy wypełnionej larwami, aby przyjąć larwy w 5. stadium rozwojowym, dokładnie czyszcząc wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię wodą z mydłem, a następnie roztworem wybielacza, a na końcu etanolem. Dokładnie wysusz pojemnik przed kontynuowaniem.
1. Wyłóż dno pojemników kilkoma warstwami ręczników papierowych. Następnie dodaj kilka nakładających się na siebie warstw cieńszych, chłonnych chusteczek czyszczących (np. delikatnych wycieraczek roboczych) lub bibuły filtracyjnej. Materiał musi być chłonny. Unikaj zachodzenia na wierzchnią warstwę, aby ułatwić przyszły transfer larw.
Umieść ramki ekranem do dołu (z larwami ogniskowymi skierowanymi w dół) na wierzchu pojemników, tak aby larwy mogły spaść na warstwę chusteczek czyszczących.
1. Przykryj pojemnik i ramę kawałkiem folii aluminiowej lub innym pokryciem, aby zatrzymać wilgoć i włóż zestaw z powrotem do inkubatora. Pozostaw konfigurację na noc. Naturalne tendencje larw do poszukiwania pożywienia spowodują, że wypełzną one ze swoich komórek i spadną na wyściełaną powierzchnię poniżej.
Przygotować oddzielne tace transferowe, dokładnie je czyszcząc, wykonując te same czynności opisane w ppkt 1.4. Pozostaw tace do wyschnięcia i ułóż na nich chusteczki czyszczące. Tacki nie muszą pasować do żadnych konkretnych wymiarów, ale płytsze tacki pozwolą na łatwiejsze manipulacje larwami.
1. Rozpocznij przenoszenie larw z pojemników na tace, ostrożnie zdejmując pojedyncze chusteczki z wierzchniej warstwy pojemników i delikatnie wylewając larwy na tace. Larwy powinny były wpaść do pojemników w ciągu nocy, tworząc kilka lepkich mas (Ryc. 1A).
2. Użyj miękkich kleszczy, aby oddzielić larwy i ułożyć je na powierzchni tac. Nie muszą być równomiernie rozmieszczone i mogą znajdować się blisko siebie, ale nie powinny się stykać. Zobacz Rysunek 1B dla wizualnego przedstawienia oddzielonych larw.
3. Skorzystaj z okazji, aby usunąć wszelkie uszkodzone (odbarwione) lub poniżej średniej wielkości larwy. Są one bardziej podatne na śmierć podczas procesu dojrzewania i mogą powodować infekcje/rozwój grzybów na całej tacy.
Przykryj tacę folią aluminiową w namiocie, aby zatrzymać wilgoć i włóż zestaw z powrotem do inkubatora.
Codziennie sprawdzaj larwy i usuwaj te, które są przebarwione (ciemnobrązowe lub czarne).
UWAGA: Larwy/poczwarki wypróżniają się na chusteczki czyszczące, objawiając się małymi brązowymi plamami. Mogą również wytwarzać niewielkie ilości białej, delikatnej taśmy w ramach procesu zamykania. Żadne z tych zdarzeń nie wymaga wymiany chusteczek czyszczących, o ile są one chłonne.
Pozwól larwom przepoczwarzyć się i dojrzeć do stadium białych oczu, które można rozpoznać po ich ogólnym kształcie pasującym do dorosłej pszczoły, przy jednoczesnym braku pigmentacji w oczach i większości reszty ciała. Powinno to nastąpić między 14 a 15 dniem po umieszczeniu królowej w klatkach. Poczwarki są teraz gotowe do wstrzyknięcia wirusa. Rysunek 1C, 1D dla przykładów poczwarek białookich.

2. Opcja masowego pozyskiwania pszczół 2: ręczne wycinanie poczwarki

UWAGA: Chociaż opcja 2 (wycięcie poczwarki) jest opłacalną metodą ekstrakcji pszczół, ma również kilka wad w porównaniu z opcją 1 (samousuwanie larw). Opcja 2 jest znacznie bardziej pracochłonna, trudniejsza do kontrolowania ze względu na wiek poczwarki i ogólnie bardziej stresująca dla samych pszczół. Opcja 1 jest zalecana, gdy tylko jest to możliwe.

Wybrać ramkę czerwiu pszczoły miodnej z czapeczką zawierającą poczwarki w stadium białych oczu lub w pobliżu stadium bielenia oczu (opis patrz 1.9) z odpowiedniej kolonii. Usuń nasadkę z komórek grzebienia znajdujących się w pobliżu środka i krawędzi ramy, aby potwierdzić obecność odpowiedniego etapu rozwojowego.
Przenieś ramę do inkubatora ustawionego na 34 °C i 50% wilgotności względnej. Ramkę należy zawsze wkładać do inkubatora, gdy nie jest używana od razu.
Przygotować i oczyścić tacki transferowe identyczne z tymi opisanymi w ppkt 1.6.
Wyjmij ramę z inkubatora i umieść na kątowym stojaku pod źródłem światła. Zwilż mały stos ręczników papierowych wodą.
Oczyść parę, twardych kleszczy za pomocą etanolu. Za pomocą czystych kleszczy usuń pokrywę z komórek zawierających poczwarki o białych oczach, uważając, aby nie uszkodzić poczwarek w tym procesie.
Jeden po drugim delikatnie wycinaj poczwarki z komórek grzebienia. Najbezpieczniej jest chwycić poczwarki wokół klatki piersiowej i brzucha za pomocą końcówek kleszczy, jeśli jest wystarczająco dużo miejsca. Jeśli jednak nie, poczwarki można również usunąć, chwytając głowę i powoli poruszając nią na tyle daleko, aby następnie chwycić ją wokół ciała.
1. Przykryj części ramy, do których nie masz natychmiastowego dostępu, mokrymi ręcznikami papierowymi, aby zatrzymać wilgoć. Usuń i wymień w razie potrzeby podczas procesu wycinania.
Rozmieść wycięte poczwarki wzdłuż chusteczek czyszczących na tacach transferowych, upewniając się, że żadna z nich się nie styka. Wszelkie zniekształcone lub odbarwione poczwarki należy wyrzucić. Poczwarki są teraz gotowe do wstrzyknięcia wirusa.
1. Wyrzuć poczwarki, które uwalniają płyn w kontakcie z chusteczkami; prawdopodobnie zostały przebite. Czasami poczwarki wykazują małe ciemne plamki melanizacji w pobliżu punktów styku z kleszczami w ciągu 1 godziny po usunięciu. Nie powinno to mieć wpływu na przeżywalność. Jeśli pojawią się duże plamy melanizacji, dotknięte poczwarki należy wyrzucić.

3. Wstrzyknięcie wirusa poczwarki

UWAGA: Jeśli wykonujesz ten protokół po raz pierwszy (tj. bez wcześniejszych zapasów inokulacji wirusowych), najpierw wyekstrahuj i zagęść cząstki za pomocą dorosłych, poczwarek lub larw z kolonii z podejrzeniem infekcji. Zmierz miana wirusa w otrzymanym inokularze, jak opisano w kroku 5 i określ, które cząstki mają się dalej rozprzestrzeniać.

Wysterylizuj wszystkie powierzchnie robocze za pomocą wybielacza, wody i etanolu przed rozpoczęciem pracy z wirusami pszczół miodnych. Podczas całego procesu należy nosić rękawice nitrylowe.
Przygotować aparat nastrzykujący zdolny do wstrzykiwania płynu w ilościach ~1 μL.
UWAGA: Jednym z niedrogich, ale skutecznych podejść byłoby stworzenie ręcznie robionego urządzenia poprzez przymocowanie igły podskórnej o pojemności 30 G do końcówki końcówki z wieloma dozownikami o pojemności 100 μl (patrz Tabela materiałów) za pomocą elastycznego kleju epoksydowego lub innego płynnego kleju. Upewnij się, że krawędzie nasadki igły są szczelnie przylegające do końcówki dozownika wielofunkcyjnego i poczekaj, aż urządzenie wyschnie. Zobacz Rysunek 2 dla wizualnego przedstawienia przykładowego urządzenia do wtryskiwania.
Przygotować roztwór do wstrzykiwań wirusa, mieszając pożądany rodzaj cząstek wirusa ze sterylizowanym 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Całkowita potrzebna ilość będzie zależeć od liczby poczwarek, które należy wstrzyknąć, przy czym każda poczwarka wymaga wstrzyknięcia 1 μl (np. 500 poczwarek = 5 μl cząstek wirusa + 495 μl PBS).
Podłączyć aparat nastrzykujący do ręcznej pipety wielofunkcyjnej i przetestować skuteczność, pobierając 100 μl wody z oddzielnej zlewki i dozując ją w dawkach 1 μl. Upewnij się, że każda dozowana ilość jest równa, w razie potrzeby wymieniając aparaturę wtryskiwacza. Usuń pozostałą wodę z wtryskiwacza.
Pobrać z inkubatora tacki z poczwarkami wytworzonymi w kroku 1 lub 2 i usunąć powłokę z folii aluminiowej.
Oczyść parę, twardych kleszczy za pomocą etanolu. Delikatnie chwyć pojedynczą poczwarkę wzdłuż klatki piersiowej, wywierając nacisk wystarczający, aby wymusić przepływ płynów wewnętrznych do brzucha. To powinno sprawić, że podziały tergitów będą bardziej widoczne.
Pobrać 100 μl roztworu cząstek wirusa za pomocą pipety wielofunkcyjnej, wprowadzić igłę między trzeci i czwarty tergit brzuszny i wstrzyknąć 1 μl roztworu wirusa. Powtórzyć te czynności dla każdej poczwarki ułożonej na tacach, uważając, aby uniknąć powtórnych wstrzyknięć. Wszelkie poczwarki uszkodzone podczas tego procesu należy wyrzucić.
UWAGA: Wszystkie materiały związane z preparatami wirusowymi są oznaczone jako zagrożenia biologiczne i powinny być sterylizowane w autoklawie i utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucji. Igły należy również utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.
Przykryj tace z poczwarkami, do których wstrzyknięto folię aluminiową i wróć do inkubatora. Pozwól cząsteczkom wirusa rozprzestrzeniać się w poczwarkach przez 3-5 dni.
1. Wykonuj codzienne inspekcje poczwarek i usuwaj wszelkie martwe lub gnijące okazy, aby zapobiec gromadzeniu się bakterii lub grzybów. Małe punkty melanizacji mogą pojawić się w miejscu wstrzyknięcia na brzuchu, ale nie powinny wpływać na przeżycie.
Pobrać próbki poczwarek do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i przetworzyć wir w celu homogenizacji zawartości, zwracając uwagę na pobieranie próbek poczwarek do probówek według źródła kolonii, aby zmniejszyć zanieczyszczenie wirusami niebędącymi przedmiotem zwalczania. Upewnij się, że nie pozostały całe poczwarki i przenieś probówki do zamrażarki o temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do wytrącenia się i zagęszczenia cząstek wirusa.

4. Stężenie cząsteczek wirusa

UWAGA: Ten protokół nie został przetestowany pod kątem odzyskiwania wirusów otoczkowych.

Autoklaw wszystkich materiałów i pojemników przed użyciem. Podczas całego tego procesu należy nosić rękawice nitrylowe, fartuchy laboratoryjne i okulary ochronne. Przed rozpoczęciem wysterylizuj wszystkie powierzchnie robocze za pomocą wody wybielającej, etanolu i roztworu inaktywującego RNazę.
1. Przygotuj 1x bufor TES (sól Tris-EDTA): Wymieszaj 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 2 mM EDTA i 150 mM NaCl. Sterylizuj w autoklawie.
Rozmrozić homogenizowane poczwarki i przenieść do butelek wirówkowych. Dodać około trzech objętości 1x PBS (np. dodać pełną probówkę poczwarek o pojemności 50 ml do 150 ml 1x PBS) i wyrównać objętość do objętości najpełniejszej butelki.
Wymieszaj najpierw ręcznie, a następnie umieszczając na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej na 10 minut.
Wirować przy 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Powtórz ten krok w razie potrzeby, jeśli pozostaną resztki komórkowe.
1. Jeśli supernatant ma duże kuleczki tłuszczu unoszące się na powierzchni, przed kontynuowaniem przefiltruj przez gazę do oddzielnych sterylnych butelek wirówek.
Ekstrahować supernatant 0,3 objętości roztworu chloroformu:alkoholu izoamylowego w proporcji 24:1 (np. 190 ml supernatantu + 57 ml chloroformu:alkoholu izoamylowego) i wymieszać przez inwersję. Wirować przy 21 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min.
UWAGA: Unikać bezpośredniego kontaktu z chloroformem na skórze lub oczach. Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej. Wszystkie odpady chloroformu należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
Odzyskać fazę wodną z każdej butelki poprzez dekantację supernatantu do oddzielnych sterylnych zlewek o pojemności 500 ml w łaźni lodowej lub w chłodni o temperaturze 4 °C. Należy uważać, aby nie zanieczyścić supernatantu chloroformem, ponieważ utrudni to proces oczyszczania; Lepiej jest stracić trochę fazy wodnej.
Dodaj wodę wolną od RNaz, aby każda zlewka osiągnęła objętość 200 ml. Umieść zlewki na magnetycznych płytkach mieszających i wrzuć do średniej wielkości mieszadła. Ustaw talerze tak, aby mieszały na średnio-niskim ustawieniu.
Powoli dodawać NaCl do każdej zlewki, stale delikatnie mieszając, doprowadzając każdy do końcowego stężenia 2,3% (np. 4,6 g NaCl na 200 ml supernatantu). Dodać glikol polietylenowy 8000 (PEG) do każdej zlewki do końcowego stężenia 7% (np. 14 g PEG na 200 ml supernatantu).
Przykryj zlewki folią aluminiową i kontynuuj mieszanie ze średnio-niską prędkością na lodzie lub w chłodnym pomieszczeniu przez 1-5 godzin, aby rozpuścić PEG. Im więcej czasu spędzisz na mieszaniu, tym dokładniej PEG się rozpuści.
Wyłącz talerze mieszające. Inkubować przykryte zlewki przez 1-3 dni na lodzie lub w chłodnym pomieszczeniu, aby umożliwić wytrącenie się cząsteczek wirusa i białek. Im więcej czasu spędzi na inkubacji, tym więcej cząstek się wytrąci.
Przenieść zawartość każdej zlewki do oddzielnych czystych butelek wirówkowych i odwirować przy 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut w celu odzyskania osadu z cząstkami PEG. Odrzucić supernatant.
Ostrożnie zeskrob granulkę cząstek PEG z boków butelki i umieść je ponownie w minimalnych objętościach 1x bufor TES w czystych zlewkach, powoli dodając niewielkie ilości TES do granulek (około 10 ml na 100 oryginalnych pszczół).
Przepuścić zawieszony osad przez igłę o sile 18 G co najmniej dziesięć razy przed podaniem do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml. Trzymaj wszystkie probówki na lodzie, aż będą gotowe na 4.14.
Odwirować probówki o pojemności 2 ml przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut, aby usunąć dodatkowy PEG. Przenieść supernatant do innej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i powtórzyć etap wirowania, aby zapewnić całkowite usunięcie wszystkich PEG.
Skoncentrować pozostałe cząstki w supernatance w nowych probówkach wirówkowych za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących (odcięcie 100 kDa) poprzez kilka rund wirowania przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut każdy, aż do osiągnięcia około jednej piątej pierwotnego stężenia (10 ml roztworu cząstek-TES na około 2 ml skoncentrowanych cząstek). Jednostki filtrujące są dostępne w różnych rozmiarach; wybrać najbardziej odpowiednią do liczby przetwarzanych próbek. Jednostki, które mieszczą się w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml, są zwykle najbardziej odpowiednie.
Ponownie zawiesić skoncentrowane cząstki, przechodząc przez igłę podskórną o sile 26 G i odwirować przy 14 000 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby wykonać ostatnią rundę usuwania PEG. Jeśli płyn jest nadal mętny, powtarzaj, aż cały osad PEG zostanie usunięty.
Podwielokrotnić lepki supernatant na żądane ilości i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do użycia.

5. Ekstrakcja i kwantyfikacja RNA wirusa

Ekstrahować RNA z całych pszczół lub skoncentrowanych cząstek wirusa przy użyciu dowolnej odpowiedniej metody ekstrakcji RNA (np. odczynnika do ekstrakcji RNA TRIzol, a następnie leczenia DNazą).
Określ ilościowo miana wirusa w inokulum wygenerowanym w kroku 5.1 za pomocą RT-qPCR, najlepiej przy użyciu metody opartej na krzywej standardowej, która nie opiera się na ekspresji genów gospodarza¹⁸, chociaż inne metody mogą również pozwalać na oszacowania.

6. Test biologiczny na karmienie wirusami

Przygotować wszystkie niezbędne materiały do testu biologicznego przed etapem pobierania ramek (6.2) lub podczas 24-godzinnego okresu wschodów pszczół (6.3).
1. Przygotuj czyste klatki lub inne pomieszczenia zdolne do pomieszczenia liczby pszczół niezbędnej do przeprowadzenia testu biologicznego (np. akrylowe klatki o wymiarach 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm), zatykając wszystkie otwory karmnika probówką wirówkową o odpowiedniej wielkości (Rysunek 3). Określ i zrandomizuj leczenie między klatkami i oznacz każdą z nich wyznaczonym leczeniem, aby łatwo odnieść się do nich w przyszłości.
2. Przygotuj tacki z inokulum, oznaczając poszczególne średniej wielkości łodzie wagowe odpowiednią klatką i obróbką.
3. Przygotuj roztwór do karmienia, mieszając odpowiednią ilość sacharozy z wodą dejonizowaną (np. 300 g sacharozy na 1 l wody na 30% roztwór sacharozy), upewniając się, że woda została wysterylizowana przed i po dodaniu sacharozy. Sterylny roztwór sacharozy można przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C przez kilka tygodni, ale w przypadku wystąpienia zmętnienia należy go wyrzucić.
4. Przygotować probówki do karmienia, częściowo napełniając probówki wirówkowe o pojemności 15 ml roztworami do karmienia wytworzonymi w ppkt 6.1.3, odwracając je i robiąc pinezką 1-2 otwory wokół końcówki probówki. Otwory można również stopić za pomocą igły podskórnej 18G podgrzanej nad płomieniem. Upewnij się, że zaślepki rurki zasilającej są bardzo mocno przykręcone, ponieważ luźno pasujące zaślepki mogą powodować powolne wycieki, które utopią mieszkańców klatki z dnia na dzień.
  UWAGA: Roztwory do karmienia i objętość rurki zasilającej można w razie potrzeby dostosować do potrzeb eksperymentalnych.
5. Przygotuj kolekcję pojemną dla nowo powstałych pszczół, lekko pokrywając brzegi dużej wanny olejem roślinnym lub podobną tłustą substancją. Osobno przygotuj kilka małych filiżanek przy użyciu tej samej metody powlekania.
Wybierz i usuń ramki czerwiu pszczoły miodnej na skraju eklozji, pochodzące z co najmniej trzech oddzielnych uli. Odpowiednio wiekowe pszczoły przypominają w pełni pigmentowane dorosłe osobniki pod czapeczką komórkową. Pewnym znakiem trwającego wyłaniania się jest obserwacja mieszkańców komórek powoli przeżuwających drogę na zewnątrz i/lub niedawno opróżnionych komórek z charakterystycznymi postrzępionymi śladami żucia wzdłuż woskowej pokrywy.
UWAGA: Dokładna wymagana liczba ramek będzie zależeć od wielkości eksperymentu, ilości pojawiających się czerwiów na ramkę i pory roku. Standardowa głęboka rama Langstroth zawiera ~ 3,000 komórek grzebieniowych z każdej strony; Ramka zawierająca głównie poczwarki w czapeczkach, z niektórymi obserwowanymi pojawiającymi się, może z łatwością wyprodukować 400+ pszczół w ciągu 24 godzin. W razie potrzeby dostosowuj przez cały sezon.
Zetrzyj wszystkie dorosłe pszczoły przed umieszczeniem ramek w skrzynkach wynurzeniowych i przeniesieniem ich do inkubatora odpowiadającego warunkom wewnętrznym ula (34 °C i 50% wilgotności względnej). Pozwól pszczołom wynurzyć się na 24 godziny.
Wyjmij pudełka wynurzające z inkubatora i wyszczotkuj wszystkie nowo powstałe pszczoły do wanny zbiorczej. Upewnij się, że usunąłeś również wszystkie pszczoły z pudełek wynurzających, aby zapobiec włączeniu nieprawidłowo postarzanych pszczół do kolejnych szczotkowań. Każda pszczoła zdolna do latania pojawiła się > 24 godziny temu i powinna zostać wykluczona z testu biologicznego.
Wyprodukuj homogenizowaną mieszankę nowo powstałych pszczół, delikatnie mieszając pszczoły w wannie zbiorczej ręcznie (w tym wieku nie mogą żądlić), aby zminimalizować skutki genetyczne ula z każdej pojedynczej kolonii. W przypadku szczególnych zastosowań pożądane mogą być inne ustalenia dotyczące źródła kolonii.
Policz 35 pojedynczych pszczół, umieszczając każdą z nich w tym samym natłuszczonym kubku przed przeniesieniem zawartości do akrylowej klatki. Alternatywnie, może być łatwiej oddzielić mniejsze wielokrotności pszczół do kilku natłuszczonych kubków (np. 5 filiżanek po 7 pszczół każdy), aby uniknąć błędów błędnego liczenia. Liczba używanych pszczół może być zróżnicowana w zależności od potrzeb i zastosowań.
Przenieś klatki pszczół do inkubatora (34 °C i 50% wilgotności względnej), upewniając się, że postępujesz zgodnie z losową kolejnością rozmieszczenia utworzoną w 6.1.1, aby zminimalizować potencjalne skutki mikroklimatyczne.
Przygotuj miejsce pracy do pracy z wirusami, czyszcząc wszystkie powierzchnie i pipety wodą wybielającą, etanolem i roztworem inaktywującym RNazę przed rozpoczęciem. Pamiętaj, aby nosić rękawice nitrylowe podczas pracy z cząsteczkami wirusa.
Przygotować inokulum wirusa o pożądanym stężeniu, rozmrażając odpowiednią ilość skoncentrowanych cząstek wirusa (krok 4.17) i dokładnie mieszając z wystarczającą ilością roztworu sacharozy (krok 6.1.3) w sterylnym pojemniku. W przypadku klatek z 35 pszczołami każda wymaga 600 μl inokulum. Seryjne rozcieńczenia są zalecane, jeśli pożądane stężenie wirusa jest równe lub niższe niż 0,1%.
1. Na przykład eksperyment z udziałem 40 klatek, z których każda wymaga 1% inokulum wirusa, będzie wymagał 24 ml roztworu wirusa, który można uzyskać, łącząc 240 μl skoncentrowanych cząstek wirusa z 23,76 ml roztworu sacharozy. Zaleca się uwzględnienie około 15% nadwyżki w początkowej objętości, ponieważ w przypadku lepkich cieczy należy spodziewać się pewnych strat.
Ułożyć tacki z inokulum przygotowane w ppkt 6.1.2 posortowane według rodzaju leczenia i odpipetować 600 μl odpowiedniego inokulum na każdą tackę.
1. Ostrożnie włóż tacki inokulum do odpowiednich klatek, uważając, aby przypadkowo nie wypuścić żadnych pszczół. Skorzystaj z okazji, aby zeskanować pszczoły i wymienić te, które mogły zginąć w procesie przenoszenia.
Odczekać, aż inokulant zostanie całkowicie zużyty (około 12-14 godzin) przed wyjęciem probówek wirówkowych blokujących górny otwór podajnika, wkładając odpowiednie probówki podające przygotowane w ppkt 6.1.4. Pomaga to zapewnić, że pszczoły w klatce równomiernie dzielą inokulum w całej populacji. Roztwór sacharozy podaje się ad libitum, a probówki należy napełniać w razie potrzeby w trakcie trwania eksperymentu.
Rejestruje śmiertelność w każdym sadzu w odstępach 12-godzinnych przez pierwsze 72 godziny każdego eksperymentu, po czym przesuwa zapis do odstępów 24-godzinnych. Usuń martwe pszczoły z klatek, aby ułatwić przyszłe liczenie, przesuwając drzwi klatki na tyle daleko, aby para kleszczy mogła sięgnąć do środka i zgarnąć martwe pszczoły. Upewnij się, że sterylizujesz kleszcze nad lampą alkoholową między klatkami, aby zapobiec wirusowemu zanieczyszczeniu krzyżowemu.
Pobrać próbki pszczół do pomiaru miana wirusa (5.1-5.2) poprzez losowe wybieranie żywych próbek w każdej klatce i umieszczanie ich w probówkach wirówkowych na suchym lodzie. Zazwyczaj trzy pszczoły wystarczą, aby wykonać pomiary miana wirusa w dowolnym punkcie czasowym bez jednoczesnego wyludniania klatki.
Kontynuuj regularne pomiary śmiertelności tak długo, jak to konieczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowe zastosowanie protokołów (Rysunki 1) dotyczących iniekcji poczek oraz ekstrakcji wirusowej powinno pozwolić na uzyskanie dużych ilości cząsteczek wirusa. Jednakże pobieranie próbek i przeprowadzanie iniekcji u poczek pochodzących z różnych kolonii w wielu punktach czasowych maksymalizuje szanse na pozyskanie docelowego wirusa przy niskim poziomie zanieczyszczeń. Dynamika replikacji wirusów i ich wzajemnych interakcji w organizmie pszczoły miodowej nie jest dobrze poznana; w połączeniu z prawdop...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiliśmy metody szczegółowo opisujące każdy etap procesu amplifikacji wirusa i przygotowania inokulum, w tym pobieranie larw i rozmnażanie wirusa, ekstrakcję i koncentrację, a także leczenie wirusów w formie eksperymentów z karmieniem w klatkach. Metody te pozwalają na wytwarzanie półczystych cząstek wirusa (ryc. 4), których skuteczność można konsekwentnie określić ilościowo za pomocą testów śmiertelności dawka-odpowiedź dla wirusów, które są śmiertelne dla dorosłych (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Julii Fine za jej pomysły i dyskusję podczas procesu tworzenia protokołu, a także dr Cassondrze Vernier za jej pomocne komentarze podczas edycji. Materiały te zostały wykorzystane w projektach, które były częściowo wspierane przez Fundację Badań nad Wyżywieniem i Rolnictwem w ramach grantu ID 549025.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% roztwór
24:1 chloroform: alkohol izoamylowy	SigmaAldrich	C0549
70% roztwór
etanolu Klatki do testów			W zależności od konfiguracji eksperymentalnej
Combitips Advanced 0,1 ml	Eppendorf	30089405	Opcjonalnie (jeśli nie jest dostępny aparat do wstrzykiwania)
Pojemniki do samodzielnego usuwania			Powinny mieć wymiary około 19 "x 9-1/8" (wymiary głębokiej ramy Langstrotha)
Kleszcze			, miękkie kleszcze do separacji larw;, twarde kleszcze do wycinania poczwarek
Inkubator
			C i 50% wilgotności względnej
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Każda chusteczka chłonna będzie działać
Średniej wielkości łodzie			Służą jako tacki na inokulum
Microcon-100kDa z membraną Biomax	MiliporeSigma	MPE100025
NaCl
Rękawice
Fosforan buforowana sól fizjologiczna (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Glikol polietylenowy 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Wirówka			Możliwość 15 000 x g
Wirówka			Możliwość 21 000 x g
Multipipeta Repeater M4	Eppendorf	4982000322	Opcjonalnie (jeśli nie ma wtryskiwacza dostępny)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
Woda wolna od RNAse	SigmaAldrich	W4502
Sacharoza
TES	SigmaAldrich	T1375

wybielacza biologicznych larw pod wyciągiem Zdolny do utrzymania 34 º wagowe nitrylowe stołowa z chłodzeniem z chłodzeniem

Bibliografia

vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957(2015).
Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: Epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004261(2014).
Natsopoulou, M. E., et al. The virulent, emerging genotype B of Deformed wing virus is closely linked to overwinter honey bee worker loss. Scientific Reports. 7 (1), 5242(2017).
Grozinger, C. M., Flenniken, M. L. Bee viruses: Ecology, pathogenicity, and impacts. Annual Review of Entomology. 64, 205-226 (2019).
Maori, E., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with colony collapse disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), 1001160(2010).
Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
Park, M. G., et al. Development of a Bacillus thuringiensis based dsRNA production platform to control sacbrood virus in Apis cerana. Pest Management Science. 76 (5), 1699-1704 (2020).
Brutscher, L. M., Daughenbaugh, K. F., Flenniken, M. L. Antiviral defense mechanisms in honey bees. Current Opinion in Insect Science. 10, 71-82 (2015).
Dolezal, A. G., et al. Interacting stressors matter: Diet quality and virus infection in honey bee health. Royal Society Open Science. 6 (2), 181803(2019).
Li, J., et al. Pollen reverses decreased lifespan, altered nutritional metabolism and suppressed immunity in honey bees (Apis mellifera) treated with antibiotics. Journal of Experimental Biology. 222 (7), 202077(2019).
Harwood, G. P., Dolezal, A. G. Pesticide - interactions in honey bees: Challenges and opportunities for understanding drivers of bee declines. Viruses. 12 (5), 566(2020).
Locke, B., Forsgren, E., De Miranda, J. R. Increased tolerance and resistance to virus infections: A possible factor in the survival of Varroa destructor-resistant honey bees (Apis mellifera). PLoS ONE. 9 (6), 99998(2014).
Thaduri, S., Stephan, J. G., de Miranda, J. R., Locke, B. Disentangling host-parasite-pathogen interactions in a varroa-resistant honey bee population reveals virus tolerance as an independent, naturally adapted survival mechanism. Scientific Reports. 9 (1), 6221(2019).
Chen, Y., Zhao, Y., Hammond, J., Hsu, H. T., Evans, J., Feldlaufer, M. Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 84-93 (2004).
Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS One. 6 (6), 20656(2011).
Carrillo-Tripp, J., et al. In vivo and in vitro infection dynamics of honey bee viruses. Scientific Reports. 6, 22265(2016).
Di Prisco, G., et al. Neonicotinoid clothianidin adversely affects insect immunity and promotes replication of a viral pathogen in honey bees. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18466-18471 (2013).
Degrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Dejong, E. W., Chambers, M. L., Hidalgo, G. Effects of oral exposure to fungicides on honey bee nutrition and virus levels. Journal of Economic Entomology. 108 (6), 2518-2528 (2015).
Negri, P., et al. Towards precision nutrition: A novel concept linking phytochemicals, immune response and honey bee health. Insects. 10 (11), 10110401(2019).
Fürst, M. A., McMahon, D. P., Osborne, J. L., Paxton, R. J., Brown, M. J. F. Disease associations between honey bees and bumblebees as a threat to wild pollinators. Nature. 506 (7488), 364-366 (2014).
Lamp, B., et al. Construction and rescue of a molecular clone of Deformed wing virus (DWV). PLoS One. 11 (11), 0164639(2016).
Gusachenko, O. N., Woodford, L., Balbirnie-Cumming, K., Ryabov, E. V., Evans, D. J. Deformed wing virus spillover from honey bees to bumble bees: A reverse genetic study. bioRxiv. , (2019).
Ryabov, E. V., et al. Dynamic evolution in the key honey bee pathogen deformed wing virus: Novel insights into virulence and competition using reverse genetics. PLoS Biology. 17 (10), 3000502(2019).
Benjeddou, M., Leat, N., Allsopp, M., Davison, S. Development of infectious transcripts and genome manipulation of Black queen-cell virus of honey bees. Journal of General Virology. 83 (12), 3139-3146 (2002).
Seitz, K., et al. A molecular clone of Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) causes mortality in honey bee pupae (Apis mellifera). Scientific Reports. 9 (1), 16274(2019).
Yang, S., et al. A reverse genetics system for the israeli acute paralysis virus and chronic bee paralysis virus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1742(2020).
Guo, Y., Goodman, C. L., Stanley, D. W., Bonning, B. C. Cell lines for honey bee virus research. Viruses. 12 (2), 1-17 (2020).
Goblirsch, M. J., Spivak, M. S., Kurtti, T. J. A cell line resource derived from honey bee (Apis mellifera) embryonic tissues. PLoS One. 8 (7), 69831(2013).
Azzami, K., Ritter, W., Tautz, J., Beier, H. Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses. Archives of Virology. 157 (4), 689-702 (2012).
Boncristiani, H. F., et al. In vitro infection of pupae with Israeli acute paralysis virus suggests disturbance of transcriptional homeostasis in honey bees (Apis mellifera). PLoS One. 8 (9), 73429(2013).
De Miranda, J. R., et al. Standard methods for virus research in Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-56 (2013).
Posada-Florez, F., et al. Deformed wing virus type A, a major honey bee pathogen, is vectored by the mite Varroa destructor in a non-propagative manner. Scientific Reports. 9 (1), 12445(2019).
Singh, R., et al. RNA viruses in hymenopteran pollinators: Evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on non-Apis hymenopteran species. PLoS One. 5 (12), 14357(2010).
Fine, J. D., Cox-Foster, D. L., Mullin, C. A. An inert pesticide adjuvant synergizes viral pathogenicity and mortality in honey bee larvae. Scientific Reports. 7, 40499(2017).
Palmer-Young, E. C., et al. Nectar and pollen phytochemicals stimulate honey bee (Hymenoptera: Apidae) immunity to viral infection. Journal of Economic Entomology. 110 (5), 1959-1972 (2017).
Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
Hoover, S. E. R., Keeling, C. I., Winston, M. L., Slessor, K. N. The effect of queen pheromones on worker honey bee ovary development. Naturwissenschaften. 90 (10), 477-480 (2003).
Toth, A. L., Kantarovich, S., Meisel, A. F., Robinson, G. E. Nutritional status influences socially regulated foraging ontogeny in honey bees. Journal of Experimental Biology. 208 (24), 4641-4649 (2005).
Walton, A., Dolezal, A. G., Bakken, M. A., Toth, A. L. Hungry for the queen: Honey bee nutritional environment affects worker pheromone response in a life stage-dependent manner. Functional Ecology. 32 (12), 2699-2706 (2018).
Williams, G. R., et al. Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitro laboratory conditions. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-36 (2013).
Robertson, J. L., Olguin, E., Alberts, B., Jones, M. M. Bioassays with arthropods. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
Gauthier, L., et al. The Apis mellifera filamentous virus genome. Viruses. 7 (7), 3798-3815 (2015).
Hsieh, E. M. Ameliorative effects of phytochemical ingestion on viral infection in honey bees. University of Illinois at Urbana-Champaign. , Master's thesis (2020).
Zhang, G., St. Clair, A. L., Dolezal, A., Toth, A. L., O'Neal, M. Honey Bee (Hymenoptera: Apidea) pollen forage in a highly cultivated agroecosystem: Limited diet diversity and its relationship to virus resistance. Journal of Economic Entomology. 113 (3), 1062-1072 (2020).
Geffre, A. C., et al. Honey bee virus causes context-dependent changes in host social behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (19), 10406-10413 (2020).
Rutter, L., et al. Transcriptomic responses to diet quality and viral infection in Apis mellifera. BMC Genomics. 20 (1), 412(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zakażanie pszczół miodnych produkcja cząsteczek wirusowych ekstrakcja poczek pszczelich test biologiczny w klatkach przygotowanie inokulum wirusowego analiza krzywej śmiertelności zakres gospodarzy zapylaczy pomiar miana wirusa karmienie roztworem sacharozy

Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)