Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Podsumowanie

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Streszczenie

Mikroskopia sił atomowych - Spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) to nowatorska technika kombinacyjna, umożliwiająca jednoczesną charakterystykę właściwości fizycznych i składu chemicznego próbki z rozdzielczością nanoskali. Dzięki połączeniu AFM z IR przezwyciężono ograniczenia rozdzielczości przestrzennej konwencjonalnej IR, co umożliwiło osiągnięcie rozdzielczości 20–100 nm. Otwiera to drzwi do szerokiego wachlarza nowych zastosowań podczerwieni w kierunku sondowania próbek mniejszych niż kilka mikrometrów, co wcześniej było nieosiągalne za pomocą konwencjonalnej mikroskopii w podczerwieni. AFM-IR doskonale nadaje się do badań nad bakteriami, dostarczając zarówno informacji spektralnych, jak i przestrzennych na poziomie pojedynczej komórki i wewnątrzkomórkowym. Rosnące globalne obawy zdrowotne i niekorzystne prognozy dotyczące infekcji bakteryjnych, a zwłaszcza szybki rozwój oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, stworzyły pilne zapotrzebowanie na narzędzie badawcze zdolne do sondowania fenotypowego na poziomie pojedynczej komórki i subkomórki. AFM-IR oferuje potencjał, aby zaspokoić tę potrzebę, umożliwiając szczegółową charakterystykę składu chemicznego pojedynczej bakterii. W tym miejscu udostępniamy kompletny protokół przygotowania próbek i pozyskiwania danych o pojedynczych widmach i modalności mapowania, w celu zastosowania AFM-IR w badaniach bakteryjnych.

Wprowadzenie

Bakterie to jednokomórkowe organizmy prokariotyczne, występujące w różnych kształtach i rozmiarach, zazwyczaj w zakresie od kilkuset nanometrów do mikrometrów. Występują w różnych siedliskach i są niezbędne do istnienia życia. W ludzkim ciele większość bakterii obecnych w jelitach jest nieszkodliwa, a wiele z nich jest w rzeczywistości korzystnych¹. Jednak kilka gatunków bakterii jest chorobotwórczych i powoduje szereg chorób zakaźnych. Infekcje bakteryjne mogą prowadzić do rozwoju sepsy i wstrząsu septycznego: stanu zagrażającego życiu, wynikającego z reakcji organizmu na infekcję². Sepsa jest poważnym globalnym zagrożeniem dla zdrowia, z wysoką częstością występowania na całym świecie i poważnymi wskaźnikami śmiertelności. Szacuje się, że tylko w 2017 roku na całym świecie zarejestrowano 50 milionów przypadków sepsy, z czego 11 milionów zakończyło się śmiercią (około 20%)². Ponadto wykazano, że zmniejszenie szans pacjenta na przeżycie, spowodowane opóźnioną terapią, występuje w ujęciu godzinowym^3,4.

Infekcje bakteryjne są leczone antybiotykami. Nasilenie potencjalnych konsekwencji bakteryjnych zakażeń krwi (BSI) wraz z wyraźnym znaczeniem szybkiego rozpoczęcia terapii przeciwbakteryjnej skłania do natychmiastowego podania antybiotyków. Jednakże, ponieważ obecne podejścia diagnostyczne stosowane w praktyce klinicznej (np. hodowla krwi) wymagają stosunkowo długiego czasu, podawanie antybiotyków często następuje przed pozytywnym rozpoznaniem BSI⁵. Czynnik ten prowadzi do nadmiernego stosowania antybiotyków, co – wraz z nadmiernym stosowaniem antybiotyków w innych sektorach, takich jak rolnictwo – stwarza poważną presję ewolucyjną w kierunku rozwoju oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR)^6,7. Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe jest obecnie jednym z najpilniejszych globalnych problemów zdrowotnych^7,8 i przewiduje się, że do 2050 roku stanie się główną przyczyną zgonów⁹. Rozwój oporności, wraz z rozprzestrzenianiem się szczepów AMR, zachodzi w zastraszającym tempie^7,8,9 i zdecydowanie przewyższa tempo odkrywania nowych antybiotyków¹⁰. Na całym świecie stale pojawiają się nowe odporne fenotypy, podczas gdy
Badania mające na celu zrozumienie zmian związanych z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe są często powolne i ograniczone dostępnymi podejściami¹¹. Ponadto powszechnie stosowane metody, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i sekwencjonowanie całego genu (WGS), koncentrują się wyłącznie na zmianach genotypowych. Nie są one wystarczające do ujawnienia mechanizmów oporności¹¹, co powoduje pilną potrzebę opracowania narzędzia badawczego umożliwiającego zrozumienie składu chemicznego bakterii.

Spektroskopia w podczerwieni (IR) dostarcza molekularnej charakterystyki próbki i dlatego jest obiecującym kandydatem do fenotypowych badań bakteryjnych. Od wczesnych zastosowań¹², w literaturze zademonstrowano ogromną ilość przykładów jego użycia^13,14. Obejmują one opartą na fenotypach identyfikację bakterii na poziomie genus¹⁵, species¹⁶ i strain^17,18. Jednak rozdzielczość przestrzenna konwencjonalnej podczerwieni jest ograniczona do kilku mikronów ze względu na limit rozdzielczości przestrzennej dyfrakcji długości fali¹⁹. Ponieważ wielkość większości bakterii leży poniżej tej granicy (np. Staphylococcus aureus ≈ średnicy 400 nm), konwencjonalne IR nie ma zastosowania do sondowania na poziomie pojedynczej komórki lub wewnątrzkomórkowym.

Ograniczenie rozdzielczości przestrzennej zostało niedawno przezwyciężone przez połączenie spektroskopii IR z mikroskopią sił atomowych (AFM-IR). W tym przypadku absorpcja podczerwieni jest wykrywana pośrednio, poprzez rozszerzalność cieplną materiału^19,20,21,22. Krótko mówiąc, absorpcja promieniowania podczerwonego powoduje miejscowy wzrost temperatury. Można to zmierzyć bezpośrednio²³ lub poprzez pomiar oscylacji sondy wspornikowej AFM, wynikającej z impulsu siły wytworzonego przez absorpcję podczerwieni^20,21. Kombinowana technika AFM-IR pozwala na osiągnięcie rozdzielczości przestrzennej zbliżonej do 20 nm, dostarczając jednocześnie informacji o lokalnych właściwościach fizycznych próbki (AFM) i jej składzie chemicznym (AFM-IR). Możliwe jest zarówno zbieranie pojedynczych widm z wybranych miejsc, jak i mapowanie natężenia wybranych wartości liczb falowych w obrębie wybranego obszaru.

Biorąc pod uwagę osiągalną rozdzielczość przestrzenną AFM-IR, oczywiste jest, że technika ta otwiera możliwość chemicznego/fenotypowego badania pojedynczej komórki bakterium i jej składu wewnątrzkomórkowego²⁴. Do tej pory w literaturze przedstawiono kilka przykładów zastosowania AFM-IR dla pojedynczych bakterii^{19,20,21,22,25,26,27,28}. Obejmują one pojedynczą analizę spektralną^19,21,22 i mapowanie na poziomie subkomórkowym^{19,22,25,26,27,28}. Na przykład, opisano zdolność do wykrywania wewnątrzkomórkowych pęcherzyków lipidowych²⁷ i wirusów²⁸ w obrębie pojedynczej bakterii. Wyniki te pokazują przydatność AFM-IR do badań w nanoskali pojedynczych bakterii i klinicznie istotnych patogenów¹⁹.

Dlatego przedstawiamy metodę przygotowania i zbierania próbek dla danych AFM-IR z wielowarstwowych, jednowarstwowych i jednokomórkowych próbek bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół został zastosowany do badania różnych gatunków bakterii²² i zmian w ich składzie chemicznym. W szczególności badano in vivo rozwój oporności na wankomycynę i niewrażliwości na daptomycynę w parach klinicznych S. aureus¹⁹. Zarówno okresowa oporność na wankomycynę, jak i niewrażliwość na daptomycynę u S. aureus (VISA i DpR) pojawiły się stosunkowo niedawno, w następstwie zwiększonego stosowania i wprowadzenia tych antybiotyków do klinik, stanowiąc poważny problem medyczny. Ponadto, w szczególności, mechanizm braku wrażliwości na daptomycynę nadal pozostaje nieuchwytny, co utrudnia opracowywanie alternatywnych leków^19,29. Prezentowany protokół koncentruje się na zapewnieniu wiarygodnych widm AFM-IR pojedynczych bakterii, które mogą być dalej analizowane przy użyciu różnych podejść chemometrycznych, zgodnie z celami eksperymentalnymi. Dodatkowo obejmuje podejście mapowania, które ma zastosowanie w badaniach wewnątrzkomórkowych.

Protokół

Wszystkie prace prowadzone z bakteriami chorobotwórczymi powinny być podejmowane z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa. Należą do nich praca w laboratorium o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa biologicznego oraz w kabinie bezpieczeństwa biologicznego (PC2), a także staranne odkażanie miejsca pracy odpowiednim środkiem dezynfekującym, np. 80% roztworem etanolu. Przez cały czas należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej.

1. Przygotowanie rozpuszczalników i materiałów

1. Rozpuszczalniki: Użyj ultraczystej wody jako rozpuszczalnika. Używaj oczyszczonej wody, autoklawizowanej przed eksperymentem, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia krzyżowego.
2. Podłoże: Użyj dowolnego z tych podłoży dla AFM-IR, np. ZnSe, CaF₂, BaF₂ itp. Ponieważ AFM-IR jest w zasadzie techniką nieniszczącą, po analizie AFM-IR można zastosować wiele innych narzędzi badawczych do tej samej próbki. Na przykład korelację wyników ze spektroskopią Ramana można przeprowadzić, jeśli stosuje się szkiełka CaF₂ lub BaF₂ stopnia Ramanowskiego.
3. Używaj szklanych fiolek zamiast plastikowych probówek, ponieważ plastik może zanieczyścić próbkę.

2. Przygotowanie próbki do AFM-IR

1. Wzrost/inkubacja próbki
   1. Hoduj bakterie w płynnych podłożach lub na solidnych płytkach. Należy wybrać rodzaj pożywki, warunki wzrostu (np. temperatura, dostępność tlenu) i czas wzrostu zgodnie ze specyficznymi wymaganiami badanych gatunków bakterii. Na przykład w przypadku S. aureus Heart Infusion (HI) można użyć płytek agarowych, ze wzrostem przez 16 godzin w 37 °C w warunkach tlenowych.
      UWAGA: Aby osiągnąć najlepsze wyniki, wzrost/inkubacja powinna dać wystarczającą ilość bakterii, która pozwoliłaby na pobranie mikrogranulki próbki. Określona liczba jednostek tworzących kolonie lub komórek bakteryjnych zależy od rodzaju i wielkości bakterii.
2. Osadzanie próbki
   1. Za pomocą sterylnej pętli ostrożnie zbierz bakterie z kolonii na płytce agarowej i przenieś je do szklanej probówki. Zbieraj bakterie tylko z wierzchu kolonii. W przypadku pobierania próbek z płynnej kultury za pomocą pipety przenieść około 1 ml zawiesiny bakteryjnej do szklanej probówki. Objętość można modyfikować w zależności od obciążenia bakteryjnego.
      UWAGA: Ważne jest, aby starać się nie zbierać (lub w miarę możliwości minimalizować zbieranie) żadnego podłoża spod kolonii. Kolejne etapy przygotowania próbki mają na celu usunięcie wszelkich potencjalnych pozostałości pożywki. Minimalizacja potencjalnej pozostałości pożywki od początku umożliwia spektralne pozyskiwanie danych z oczyszczonych komórek bakteryjnych. Kroki 2.2.2 i 2.2.3 stosuje się do próbek przygotowanych z płytek agarowych. W przypadku próbek przygotowanych z pożywki ciekłej należy przejść do kroku 2.2.4.
   2. Dodaj 1 ml ultraczystej wody do probówki. Wiruj, aż zebrane osady bakteryjne przestaną być widoczne na dnie probówki (zwykle 1-2 min).
   3. Oszacuj przybliżoną mętność roztworu za pomocą np. wzorców McFarlanda przez wizualne porównanie³⁰ między przygotowanym roztworem a wzorcami McFarlanda. Jeśli zmętnienie zawiesiny bakteryjnej wydaje się być bardzo niskie, dodaj więcej bakterii z płytki za pomocą sterylnej pętli i ponownie odwiruj. Powtarzaj tę czynność, aż szorstkie zmętnienie roztworu będzie porównywalne z normami McFarlanda 0,5 i 1. Na ogół daje to dużą ilość osadów bakteryjnych.
   4. Odwirować zawiesinę bakteryjną o sile 3 000 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad.
      UWAGA: Parametry wirowania można modyfikować w celu uzyskania osadu bakteryjnego. Należy zachować ostrożność przy zwiększaniu siły g, aby nie wywołać pękania bakterii (szczególnie w przypadku bakterii Gram-ujemnych).
   5. Za pomocą pipety delikatnie usunąć supernatant znad osadu. Dodaj 1 ml ultraczystej wody do probówki i przekręć wir, aby ponownie zawiesić granulkę. Następnie odwirować próbkę, tak jak to zrobiono w kroku 2.2.4.
   6. Powtórzyć procedurę prania (kroki 2.2.2 i 2.2.4) co najmniej trzy razy. W przypadku pobierania próbki początkowej z podłoża płynnego należy powtórzyć procedurę co najmniej cztery razy (usunięcie pożywki, a następnie trzy przemycia).
   7. Po ostatnim umyciu usuń supernatant, dodaj ultraczystą wodę i wiruj przez co najmniej 2 minuty. Następnie należy umieścić 5 μl próbki na podłożu (np. CaF₂ klasy ramanowskiej).
   8. Jeśli pożądana grubość próbki to wielowarstwowa warstwa bakterii, pozostaw próbkę do wyschnięcia na powietrzu.
   9. Jeśli pożądana grubość to monowarstwa lub pojedyncze bakterie, natychmiast po osadzeniu próbki (krok 2.2.7) dodaj od 20 do 100 μl ultraczystej wody i delikatnie wymieszaj końcówką pipety. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: Dokładna objętość wody może się różnić w zależności od eksperymentów, ponieważ zależy od wielu czynników (np. wielkości organizmu, gęstości osadu itp.) i dlatego najlepiej określić ją empirycznie. Przygotowanie serii próbek z dodatkiem różnej objętości wody ultraczystej pozwala na wybór próbki o pożądanej grubości/gęstości bakterii. Grubość/gęstość bakterii można łatwo zobrazować za pomocą AFM w kolejnych etapach. Przykłady obrazów AFM z próbek jednowarstwowych i pojedynczych komórek są pokazane w Rysunek 1A–H.
   10. Zamontuj podłoże na metalowym krążku próbki AFM za pomocą dwustronnej taśmy klejącej.

3. Przygotowanie instrumentu

UWAGA: Opisane tutaj procedury instrumentalne dotyczą instrumentu wymienionego w Tabeli Materiałów. Szczegółowa procedura instrumentalna może nieznacznie różnić się od opisanej tutaj w przypadku korzystania z nowszego modelu instrumentu AFM-IR.

1. Włącz i zainicjuj instrument, naciskając przycisk Inicjalizuj. Upewnij się, że migawka lasera znajduje się w pozycji otwartej dla testu laserowego.
2. Jeśli skonfigurowany jest system przedmuchiwania, przepłucz przyrząd za pomocą N₂, włączając przepływ N₂. Dostosuj przedmuchiwanie azotem, aby osiągnąć stabilny poziom wilgotności (na przykład 20%). Upewnij się, że wilgotność nie ulega wahaniom podczas pomiarów oraz między tłem a zbieraniem danych próbki. Zaleca się odczekanie około 20 minut, aby poziom wilgotności się ustabilizował.
3. Załaduj próbkę do komory na próbkę, naciskając przycisk Załaduj. Wczytywanie próbki odbywa się za pomocą kreatora oprogramowania. Podczas obsługi kreatora oprogramowania najpierw skup się na końcówce, używając strzałek, aby przesunąć stolik mikroskopu w kierunku Z i kliknij Dalej. Po drugie, wyreguluj miejsce zbierania danych za pomocą strzałek kierujących ruchem w płaszczyźnie i wyrównaj laser AFM i detektor AFM za pomocą pokręteł na górze głowicy AFM. Następnie skoncentruj się na powierzchni próbki, przesuwając stolik mikroskopu w kierunku Z.
   UWAGA: Szczegółowe ilustracje każdego etapu ładowania próbki znajdują się w instrukcji oprogramowania³¹. Skupienie się na próbce powinno być przeprowadzone ostrożnie. Zbliżając się do powierzchni próbki w kierunku Z, należy używać niskiej prędkości silnika.
4. Podejdź do próbki bez angażowania się, klikając przycisk Podejdź.

4. Zbieranie danych

1. tło
   1. Przed pozyskaniem danych zbierz tło. W celu zbierania tła upewnij się, że migawka lasera jest w pozycji otwartej. Wybierz zakres spektralny i rozdzielczość (w zależności od celu analizy) oraz liczbę skanów i liczbę współśrednich tła. Ogólnie zaleca się, aby były one wysokie (np. 1024 skany i 3 współśrednie).
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, zalecana jest rozdzielczość spektralna 4 ^cm-1 lub 8 ^cm-1 oraz zakresy spektralne 3,200 ^cm-1–2,800 ^cm-1 i 1,800 ^cm-1–900 ^cm-1.
   2. Po uzyskaniu tła zapisz plik tła. Plik nie jest zapisywany automatycznie. Zmień położenie migawki lasera na Zamknij.
2. Próbka – pojedyncze widma
   1. Naciśnij przycisk Engage, aby połączyć się z sample. System zacznie zbliżać się do powierzchni próbki, aż do wykrycia bezpośredniego kontaktu.
      UWAGA: Nastawa używana w tej pracy mieściła się w zakresie 0,15–2 V, a wzmocnienia sprzężenia zwrotnego (wzmocnienie I i wzmocnienie P) były zwykle ustawione na 3 i 10. Sondy kontaktowe NIR2 są powszechnie stosowane w układzie nanoIR2 (model: PR-EX-nIR2-10, częstotliwość rezonansowa (kHz): 13 +/−4 kHz, stała sprężystości (N/m): 0,07−0,4 ^Nm-1).
   2. Zbierz obraz AFM, aby zobrazować powierzchnię. W pierwszej kolejności zeskanuj większy obszar (np. 50 x 50 μm) z niższą rozdzielczością przestrzenną (np. 200 x 200 punktów) (Rysunek 1I).
      UWAGA: Dane AFM-IR są zawsze zbierane w trybie kontaktowym, jednak dane AFM mogą być zbierane w trybie kontaktowym lub stukania.
   3. Z obrazu wysokości/odchylenia AFM wybierz konkretny obszar zainteresowania i ponownie zobrazuj go z wyższą rozdzielczością przestrzenną (Rysunek 1J–K). Upewnij się, że szybkość zbierania danych jest odpowiednia, z powolnymi ruchami końcówki (np. częstotliwość skanowania 0,2–0,4 Hz).
   4. Wybierz miejsce pomiaru (np. pojedynczą bakterię) i przesuń końcówkę do tego miejsca.
   5. Wyrównaj laser IR. W tym celu należy użyć liczby falowej, przy której próbka będzie się wchłaniać. W przypadku materiałów biologicznych może to być np. amid I (1655 ^cm-1). Upewnij się, że filtr pasma przepustowego jest wyłączony i kliknij Start IR. Prawy wykres w mierniku nanoIR (FFT ugięcia wyświetlanego jako amplituda w funkcji częstotliwości) powinien pokazywać co najmniej jeden wyraźny pik, a lewy wykres (ugięcie w funkcji czasu) powinien mieć przebieg okresowy. Jeśli tak nie jest, przystąp do optymalizacji punktów IR.
      UWAGA: Nawet jeśli szybka transformata Fouriera (FFT) i ugięcie wykazują oczekiwany profil, zaleca się przeprowadzenie optymalizacji miejsc IR dla co najmniej kilku liczb falowych, w których spodziewane są pasma.
   6. Zoptymalizuj hot spoty do zbierania danych w podczerwieni, używając wybranych wartości liczby falowej. Pomocne może być użycie konwencjonalnego widma podczerwieni bakterii (np. widma ATR osadu bakteryjnego) w celu zidentyfikowania pozycji pasm i wykorzystania ich do optymalizacji gorących punktów. Wybierz różne wartości liczb falowych (np. 8–10) z różnych obszarów widmowych.
      UWAGA: Jeśli konwencjonalne widmo podczerwone badanych bakterii nie mogło zostać zebrane przed zebraniem danych AFM-IR, widma bakteryjne dostępne w literaturze mogą być wykorzystane jako przybliżone wskazówki. Wynikiem optymalizacji plamki w podczerwieni jest obraz, który przedstawia mapę sygnału FFT w każdym miejscu x i y. Lokalizacja z największym sygnałem jest wybierana automatycznie. Przykłady takich obrazów są podane w software manual³¹.
   7. Po zoptymalizowaniu plamek IR dla wybranych wartości liczb falowych, zdefiniuj parametry zbierania danych spektralnych: obszar spektralny, rozdzielczość spektralną, liczbę skanów i przyłożoną moc i wprowadź je do odpowiednich okien w oprogramowaniu. Rozdzielczość spektralna powinna być zgodna z rozdzielczością tła, a obszar widmowy powinien mieścić się w obszarze spektralnym, dla którego zebrano tło.
      UWAGA: Ogólny początkowy zestaw parametrów może być następujący: zakres spektralny: 3200 ^cm-1–2800 ^cm-1 i 1800 ^cm-1–900 ^cm-1, rozdzielczość spektralna: 4 ^cm-1 lub 8 ^cm-1, liczba skanów: 512–2048.
   8. W razie potrzeby dostosuj moc lasera w zależności od sygnału. Ogólnie rzecz biorąc, wartości między 8% a 10% mocy lasera powinny być wystarczające dla dobrej jakości sygnału. Wyższych wartości należy używać ostrożnie, ponieważ mogą one spowodować uszkodzenie próbki.
      UWAGA: Procentowa moc lasera może się różnić w zależności od typu lasera IR. Podane tutaj wartości procentowe dotyczą lasera OPO.
   9. Kliknij Acquire, aby zebrać widmo AFM-IR.
   10. Ponownie zbierz dane AFM z tego samego obszaru po zebraniu widma AFM-IR. Jest to wysoce zalecane, ponieważ ujawni potencjalny dryft i/lub destrukcyjny wpływ na próbkę.
   11. Jeśli widmo AFM-IR jest zadowalające i nie obserwuje się destrukcyjnego wpływu na próbkę, należy przystąpić do zbierania danych. W razie potrzeby zdefiniuj serię punktów do zbierania danych za pomocą opcji Szyk i zebrany obraz wysokości lub odchylenia AFM. Opcja ta pozwala na zbieranie widm kolejno z każdego punktu o tych samych parametrach spektralnych, jakie są zdefiniowane dla pojedynczego widma.
   12. Jeśli obraz AFM pobrany po pobraniu widma AFM-IR wykaże destrukcyjny wpływ na próbkę (zwykle spaloną plamę), zmniejsz moc; wybierz inny punkt i powtórz kroki 4.3.8–4.3.11.
   13. Jeśli sygnał w widmie AFM-IR nie jest zadowalający, sprawdź poprawność optymalizacji punktów IR (krok 4.3.6). Jeśli jest poprawny, nieznacznie zwiększ moc lasera i powtórz kroki 4.3.7–4.3.11. Można to powtarzać aż do uzyskania zadowalającego sygnału.
3. Próbka – podejście do obrazowania
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się zarejestrowanie pojedynczego widma AFM-IR bakterii przed zebraniem obrazu rozkładu intensywności dla wybranej wartości liczby falowej.
   1. Nagraj obraz AFM wybranego obszaru próbki. Aby to zrobić, najpierw zbierz obraz AFM większego obszaru o niższej rozdzielczości przestrzennej (np. 50 x 50 μm, 200 x 200 punktów), a następnie wybierz obszar zainteresowania i zbierz obraz AFM o zwiększonej rozdzielczości przestrzennej (jak pokazano na Rysunek 1I–K).
   2. Wybierz wartości liczby falowej dla obrazowania AFM-IR.
   3. Upewnij się, że plamka IR lasera jest zoptymalizowana dla wybranych wartości liczby falowej (krok 4.3.6). Jeśli plamka IR nie jest zoptymalizowana dla niektórych liczb falowych (brak wyraźnego maksimum), zoptymalizuj ją dla nich.
   4. Zdefiniuj parametry obrazowanego obszaru: szerokość i wysokość, liczbę punktów danych w kierunku X i Y.
      UWAGA: Jeśli zostanie zastosowany kolejny wybór punktów z poprzednich obrazów AFM (jak pokazano na rysunku Rysunek 1I–K), pola szerokości i wysokości zostaną automatycznie wypełnione po zaznaczeniu obszaru.
   5. Zdefiniuj parametry akwizycji sygnału spektralnego: długość fali, liczbę skanów i moc lasera.
      UWAGA: Liczba skanów musi mieścić się w granicach rozsądku. 64 lub 32 skany zazwyczaj pozwalają na wystarczającą ilość sygnału.
   6. Zdefiniuj parametry ruchu końcówki AFM, klikając na Szybkość skanowania. Im większa liczba skanów w poprzednim kroku i liczba punktów danych w kierunku X, tym wolniejsze będą ruchy końcówki. Brak regulacji pomiędzy tymi parametrami będzie skutkował zbyt szybkim ruchem końcówki, uniemożliwiającym faktyczne pobranie określonej liczby skanów z każdego punktu.
      UWAGA: Na przykład, aby uzyskać odpowiednią kolekcję sygnału IR z 64 współdodaniami i 200 punktami, ustaw szybkość skanowania na 0,07 kHz.
   7. Upewnij się, że pole Włącz obrazowanie w podczerwieni jest zaznaczone.
   8. Rozpocznij obrazowanie. AFM-IR natężenia sygnału o wybranej liczbie falowej będzie zbierany jednocześnie z danymi AFM z tego obszaru.
      UWAGA: W przypadku korzystania z lasera OPO możliwe jest dodatkowe zbieranie jednocześnie obrazu o szczytowej częstotliwości rezonansu kontaktowego. Można to wykorzystać do uzyskania informacji o względnej sztywności próbki w różnych miejscach.
   9. Użyj okna Sekwencja przechwytywania, aby ustawić kolejne zbieranie danych AFM-IR z tego samego obszaru o tych samych parametrach, ale dla różnych wartości liczb falowych. Aby to zrobić, otwórz okno Sekwencja przechwytywania, wpisz każdą liczbę falową i zdefiniuj zastosowaną moc lasera (dla każdej liczby falowej).
   10. Eksport zebranych danych (AFM i AFM-IR, pojedyncze widma i obrazowanie) do różnych formatów i analiza przy użyciu metod adekwatnych do konkretnych celów badawczych.

Wyniki

Opisany protokół umożliwia uzyskanie szeregu typów rozmieszczenia komórek bakterii na podłożu, w zależności od początkowego stężenia próbki i ilości dodanej wody. Rysunek 1 ilustruje przykłady obrazów AFM (wysokość i ugięcie) zarejestrowanych z monowarstw i próbek jednokomórkowych przygotowanych przy użyciu opisanego protokołu z bakterii Gram-dodatnich (S. aureus) i Gram-ujemnych (Escherichia coli).

Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do obrazowania AFM-IR wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych struktur pojedynczych bakterii. Przykład takiego zastosowania jest pokazany na Rysunek 2, który demonstruje wyniki monitorowania przestrzennie zlokalizowanych zmian chemicznych zachodzących podczas podziału komórki S. aureus. Chociaż suszenie powietrzem jest powszechnie uważane za metodę utrwalania preparatu bakteryjnego, bakterie z natury wykazują bardzo wysoką odporność na czynniki zewnętrzne, takie jak temperatura, i doniesiono, że przeżywają odwodnienie³². Przedstawione tutaj wyniki uzyskano z próbki wysuszonej na powietrzu. Tworzenie się przegrody międzywarstwowej, zachodzące przed podziałem komórki, obserwowano i monitorowano za pomocą obrazowania AFM (Ryc. 2A–D) poprzez zebranie 12 obrazów tego samego obszaru kolejno (zbieranie pojedynczego obrazu ≈ 20 minut). Rysunek 2A–D pokazuje 4 wybrane obrazy AFM, z czasem między zebraniem każdego obrazu wynoszącym około 40 minut. Utworzona struktura (przegroda) ma wysokość 45 nm. Utworzona przegroda jest wyraźnie widoczna na zdjęciach wysokości i ugięcia AFM (Rysunek 2E–F). Widma AFM-IR zarejestrowane z obszaru komórki i przegrody ( Rysunek 2G, punkty początkowe oznaczone w Rysunek 2F) zostały znormalizowane do pasma amidu I przed porównaniem, aby zminimalizować wpływ różnic w grubości próbki między punktami zbierania danych. Widmo AFM-IR przegrody charakteryzuje się większą względną intensywnością pasm na wysokości 1240 i 1090 ^cm-1 w porównaniu z widmem AFM-IR pobranym z obszaru komórki. Są one przypisywane grupom węglowodanów i fosfodiestrów składników ściany komórkowej (w tym np. peptydoglikanu i kwasu tejchojowego)²².

Opisany protokół może być również używany do porównywania pojedynczych widm między wieloma różnymi próbkami. Przykład tej aplikacji wraz z wynikami jest pokazany w Rysunek 3 i Rysunek 4. Celem pracy jest określenie zmian chemicznych zachodzących w wyniku rozwoju in vivo przerywanej oporności na wankomycynę u S. aureus (VISA). W tym celu pobrano od pacjentów pary kliniczne próbek, przy czym szczep macierzysty wyizolowano przy przyjęciu do szpitala i przed antybiotykoterapią (wrażliwy na wankomycynę S. aureus, VSSA), a szczep potomny wyizolowano od tego samego pacjenta po przyjęciu antybiotyków i niepowodzeniu klinicznym. Próbki były dalej hodowane na podłożu agarowym i przygotowywane zgodnie z protokołem (Rysunek 3A–B). Widma AFM-IR zostały zebrane z wielu pojedynczych bakterii (i wielu próbek) dla VSSA i VISA, a następnie przeanalizowane przy użyciu kilku podejść chemometrycznych (Rysunek 3C).

Nie zaobserwowano różnic morfologicznych między komórkami VSSA i VISA (Rysunek 4A–C). Jednak widma AFM-IR (Rysunek 4D,F) i ich drugie pochodne (Rysunek 4E,G) wykazały wyraźną różnicę w składzie chemicznym między szczepami odpornymi i podatnymi. Względna intensywność prążków związanych z grupami węglowodanowymi i fosfodiestrowymi ze składników ściany komórkowej (w szczególności pasma na wysokości 1088 ^cm-1) wyraźnie wzrosła w opornym szczepie w porównaniu z podatnym odpowiednikiem. Na uwagę zasługuje fakt, że wszystkie przekodowane widma (VISA: 81, VSSA: 88) wykazują niewielkie odchylenie standardowe. Świadczy to o dobrej odtwarzalności danych zarejestrowanych z różnych próbek przygotowanych z tego samego szczepu, ponieważ nie było możliwe rozróżnienie między widmami zarejestrowanymi z różnych próbek tego samego szczepu. Zaobserwowane różnice wskazywały na zwiększoną grubość ściany komórkowej u szczepów opornych w porównaniu z podatnym odpowiednikiem, co pozostaje zgodne z innymi doniesieniami literaturowymi^33,34.

Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy AFM różnych próbek bakterii do pomiarów AFM-IR. W zależności od rozcieńczenia na podłożu, protokół pozwala na uzyskanie wielowarstwowych i monowarstwowych próbek bakterii oraz jednokomórkowych. Reprezentatywne obrazy AFM: (A–D) próbki jednowarstwowej i (E–H) jednokomórkowej dla (A,B,E,F) Gram-dodatnich (S. aureus) i (C,D,G,H) Gram-ujemnych (E. coli). (A,C,E,G) pokazują obrazy wysokości, a (B,D,F,H) pokazują odpowiadające im obrazy ugięcia. Wielkość obrazowanych obszarów: (A-D,G,H) 20 x 20 μm, (E,F) 50 x 50 μm. (I-K) sekwencyjny wybór obszaru do mapowania AFM-IR. Osiąga się to za pomocą obrazowania AFM z rosnącą rozdzielczością przestrzenną na przykładzie pojedynczej komórki S. aureus. Każdy obraz zbierany jest poprzez próbkowanie 200 x 200 punktów, ze wzrostem rozdzielczości przestrzennej ze względu na zmniejszenie rozmiaru obrazowanego obszaru. Wielkość obrazowanych obszarów: (I) 40 x 40 μm, (J) 20 x 20 μm i (K) 2,24 x 2,24 μm. kwadrat w (I) oznacza obszar sobrazowany w (J). kwadrat w (J) oznacza obszar sobrazowany w (K). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Monitorowanie podziału komórek S. aureus za pomocą AFM-IR. (A-D) Obrazy AFM komórki S. aureus pokazujące tworzenie się przegrody przed podziałem komórki. Rozmiar obrazowanego obszaru: 2 x 2 μm. Obrazy zostały wybrane z większej serii (12 obrazów rejestrowanych co 20 minut) i reprezentują dane rejestrowane co 40 minut. (E–F) obraz wysokości i odchylenia AFM zarejestrowany pod koniec tworzenia się przegrody komórkowej z zaznaczonymi punktami zbierania widm AFM-IR. Wielkość obrazowanego obszaru 1,17 x 1,15 μm. Wysokość nowo powstałej konstrukcji wynosi 45 nm. (G) Widma AFM-IR rejestrowane z obszaru komórki () i obszaru przegrody (czerwony) (oznaczony w (F)), w zakresie 1400–900 ^cm-1. Oba widma zostały znormalizowane do pasma amidu I i wykazują wzrost względnej intensywności składników ściany komórkowej z przegrody. Ten rysunek został zmodyfikowany z K. Kochan et al.²². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Przegląd projektu eksperymentalnego dla badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe AFM-IR. (A) Pochodzenie próbki i wstępne przygotowanie: podatny szczep macierzysty pobrano od pacjenta przed antybiotykoterapią, a szczep pochodny oporny pochodził od tego samego pacjenta po antybiotykoterapii i niepowodzeniu klinicznym (rozwój oporności in vivo). Bakterie wyizolowano i hodowano na agarze do infuzji serca (HI) przez 16 godzin w temperaturze 37 °C. (B) Późniejsze przygotowanie próbki do AFM-IR, w tym pobranie próbki, a następnie mycie palety bakteryjnej (3×) i osadzanie próbki. (C) Gromadzenie i analiza danych AFM-IR: wysokość AFM i widmo AFM-IR (1800–900 ^cm-1). Rozmiar obszaru obrazowania AFM: 1,7 x 1,4 μm. Widmo AFM-IR pobrano ze środka komórki. Dane zostały następnie przeanalizowane przy użyciu podejść chemometrycznych, w tym hierarchicznej analizy skupień. Ten rysunek został zmodyfikowany z K. Kochan et al.¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Wyniki AFM i AFM-IR badania zmian chemicznych w pośrednim S. aureus wankomycyny (VISA) w porównaniu z wrażliwym na wankomycynę S. aureus (VSSA) w parach klinicznych. Obrazy AFM próbek jednokomórkowych (A–B) VISA i (C) VSSA. Wielkość obrazowanych obszarów: (A,C) 40 x 40 μm, (B) 2,56 x 2,45 μm. (D–E) Średnie widma AFM-IR i ich (F-G) drugie pochodne dla: (D,F) komórek VISA i (E,G) VSSA, w zakresie spektralnym 1800–900 ^cm-1. Przedstawione widma są średnimi z 81 (VISA) i 88 (VSSA) indywidualnych widm i są prezentowane razem z odchyleniem standardowym (SD). Uśrednianie przeprowadzono po normalizacji wszystkich indywidualnych widm razem. Główne pasma są oznaczone w (F–G). Ten rysunek został zmodyfikowany z K. Kochan et al.¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Dryft obrazu w wyniku kolejnej rejestracji map AFM-IR przy wybranych wartościach liczby falowej dla komórki S. aureus. (Górny rząd): Obrazy AFM zostały zarejestrowane jednocześnie z odpowiadającymi im (w dolnym rzędzie) mapami AFM-IR w oparciu o intensywność sygnału IR przy wybranych wartościach liczby falowej. Wartości liczb falowych (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 ^cm-1) są oznaczone adnotacjami nad dolnym wierszem. Każdy zestaw (obraz AFM i mapa AFM-IR) był rejestrowany bezpośrednio po poprzednim obrazie (około 40 minut na zestaw). Rozmiar obrazowanego/mapowanego obszaru: 1,54 x 1,57 μm. Między obrazami widoczny jest wyraźny dryf. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przydatność spektroskopii w podczerwieni do charakteryzowania szerokiego zakresu próbek biologicznych w kontekście ich składu chemicznego jest dobrze znana. W ciągu ostatniej dekady spektroskopia w podczerwieni stała się obiecującym narzędziem do badań nad bakteriami 12,13,14,15,16,17. Nadal cieszy się dużym zainteresowaniem w dziedzinie mikrobiologii, jako jedna z niewielu technik umożliwiających charakterystykę fenotypową na podstawie składu chemicznego. W tym kontekście, główną wadą konwencjonalnej mikroskopii FTIR jest ograniczona rozdzielczość przestrzenna, uniemożliwiająca badania pojedynczych komórek i subkomórkowych bakterii. W rzeczywistości mały rozmiar bakterii stanowi przeszkodę nie tylko dla podczerwieni, ale dla zdecydowanej większości technik. W związku z tym dostępne narzędzia badawcze do badań jednokomórkowych i subkomórkowych bakterii są znacznie ograniczone. Połączenie AFM z podczerwienią umożliwia przezwyciężenie ograniczeń rozdzielczości przestrzennej spektroskopii w podczerwieni, zapewniając nowatorskie narzędzie do badań nad bakteriami, zdolne do sondowania składu chemicznego w nanoskali.

Technika ta nie ogranicza się do badań pojedynczych komórek i pozwala na badanie różnych próbek o różnej grubości. Niewątpliwie czyste i staranne przygotowanie próbki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości obrazów. Niniejszy protokół przedstawia metodę przygotowania wielowarstwowych, jednowarstwowych i/lub jednokomórkowych próbek różnych bakterii (ryc. 1). Przygotowana próbka zależy od kilku czynników, w tym początkowego obciążenia bakteryjnego, rozcieńczenia po myciu, a także dalszego rozcieńczenia na podłożu. Ilość próbki uzyskanej po rozcieńczeniu przemytych granulek i przed osadzeniem na podłożu zazwyczaj pozwala na przygotowanie wielu próbek. Dlatego, aby uzyskać pożądany rozkład próbki na podłożu, często korzystne jest przygotowanie serii próbek, różniących się rozcieńczeniem. W przypadku badań mających na celu zbieranie widm AFM-IR, a nie obrazowanie subkomórkowe, modyfikacja ilości próbki (np. z jednowarstwowej na wielowarstwową) może być korzystna w celu zwiększenia intensywności sygnału.

Kolejnym krytycznym aspektem w przygotowaniu próbki jest odpowiednie usunięcie pozostałości pożywki. W zależności od wybranych metod hodowli próbek, próbkę pobiera się albo z płynnego podłoża, albo z płytki agarowej. W obu przypadkach pozostałość pożywki może być obecna w próbce, chociaż w znacznie mniejszym stopniu po pobraniu z płytek agarowych. Ponieważ pożywki bakteryjne zawierają dużą ilość różnych składników biologicznych, bardzo ważne jest zapewnienie odpowiedniego usunięcia pożywki. Zalecamy trzy przemycia ultraczystą wodą w przypadku próbek z płytek agarowych i co najmniej cztery przemycia w przypadku próbek pobranych z pożywki. W razie potrzeby liczbę prań można zwiększyć; Jednak w przypadku porównania różnych próbek ważne jest, aby zachować spójność między próbkami. Zademonstrowany protokół wykorzystuje wodę, a nie rozpuszczalniki, takie jak bufor fosforanowy (PBS) lub sól fizjologiczna. Zarówno PBS, jak i sól fizjologiczna prowadzą do tworzenia się kryształów po wysuszeniu na powietrzu, które mogą uszkodzić bakterie. Ponadto oba są źródłem intensywnych pasm podczerwieni, przy czym w szczególności PBS zawiera wiele pasm w obszarze odcisków palców. Brak możliwości stosowania soli fizjologicznej lub PBS stanowi obecnie poważne ograniczenie dla tej techniki. Zazwyczaj użycie wody do mycia nie powoduje żadnego destrukcyjnego wpływu na bakterie; Należy jednak zachować ostrożność i jeśli to możliwe, czas ekspozycji na wodę powinien być ograniczony. Jeżeli protokół przygotowania próbki musi zostać wstrzymany na etapie mycia, zaleca się pozostawienie próbki w postaci granulatu po usunięciu wody. Ma to szczególne znaczenie w przypadku bakterii Gram-ujemnych, zawierających cieńszą ścianę komórkową, ponieważ są one bardziej podatne na pękanie.

Aby zapewnić prawidłowe i wysokiej jakości dane AFM-IR, kilka aspektów protokołu gromadzenia danych ma kluczowe znaczenie. Po pierwsze, prawidłowe zebranie tła jest niezbędne do pozyskania danych. W szczególności konieczne jest utrzymanie stabilnego poziomu wilgotności podczas zbierania tła, jak również między tłem a pobieraniem próbek. Aby to zapewnić, zalecamy przepłukanie instrumentu azotem i utrzymanie poziomu wilgotności nie wyższego niż 25%. Brak oczyszczania może stanowić znaczne ograniczenie, szczególnie w miejscach o dużej wilgotności. Po drugie, należy podkreślić znaczenie właściwej optymalizacji punktów IR. Aby uzyskać najlepsze wyniki, korzystna może być wiedza a priori na temat położenia maksimów pasma. Na przykład konwencjonalne widmo podczerwieni osadu bakteryjnego można wykorzystać do określenia pozycji prążków oczekiwanych od próbki. Jeśli nie jest to możliwe do uzyskania, jako alternatywne podejście, użytkownik może wykorzystać widma IR dostępne w literaturze lub rozpocząć optymalizację przy użyciu pozycji pasma, której można się spodziewać w bakterii (np. amid I i amid II). Po trzecie, przy zbieraniu danych ważne jest, aby podkreślić znaczenie starannego doboru mocy (pozwalającego osiągnąć dobry stosunek sygnału do szumu), ponieważ może to mieć destrukcyjny skutek. Zalecana moc zależy od grubości próbki, przy czym przybliżone wskazówki są dostępne w instrukcji przyrządu³¹. Zalecamy empiryczne przetestowanie stanu próbki po pomiarze poprzez pobranie obrazu AFM, ponieważ ujawni to wszelkie destrukcyjne wpływy. Co więcej, zebranie obrazów AFM z tego samego obszaru przed i po zebraniu widm AFM-IR służy jako dobre potwierdzenie, że nie wystąpił dryf i widma rzeczywiście pochodzą z wybranego punktu w komórce. Możliwość dryftu jest szczególnie istotna przy zastosowaniu metody obrazowania, poprzez sekwencyjne obrazowanie natężenia podczerwieni przy wybranych wartościach liczb falowych. Przykład tego zilustrowano na rysunku 5. Obrazowany obszar został zdefiniowany na początku eksperymentu i ma być spójny dla wszystkich wartości liczb falowych. Widoczny jest jednak wyraźny dryf pomiędzy każdym obrazem o wysokości AFM (i odpowiadającym mu natężeniu liczby falowej w podczerwieni), a czas akwizycji każdej mapy wynosi około 40 minut. Z tego powodu dla użytkowników zbierających dane obrazowe zalecamy, aby zawsze wybierać obszar nieco większy niż próbka będąca przedmiotem zainteresowania, aby mieć pewność, że nawet w przypadku wystąpienia dryfu, próbka będąca przedmiotem zainteresowania pozostanie w obrazowanym obszarze.

Do potencjalnych ograniczeń protokołu należy brak możliwości zbierania danych w stanie uwodnionym w roztworach fizjologicznych (np. soli fizjologicznej lub PBS) opisanych powyżej. Ponadto, szczególnie w obszarach o wysokiej wilgotności, często zachodzi potrzeba przedmuchiwania azotem. Ponadto protokół umożliwia badanie organizmów o wielkości do 100 nm, co wyklucza możliwość jego wykorzystania do mniejszych struktur. Choć można temu zaradzić za pomocą innego lasera (np. kwantowego lasera kaskadowego pozwalającego osiągnąć rozdzielczość przestrzenną 20 nm), wiąże się to również z ograniczonym zakresem spektralnym, a także trudnościami w uzyskaniu dobrego stosunku sygnału do szumu. Wreszcie, sondowanie miękkich powierzchni może stanowić wyzwanie, ponieważ końcówka nie wykrywa prawidłowo powierzchni i wykracza poza punkt kontaktu, aż do pęknięcia. Chociaż zazwyczaj nie stanowi to problemu w przypadku próbek bakteryjnych, może wystąpić po pomiarach bardziej miękkich próbek. W takich przypadkach zaleca się próbę zaczepienia o czystą powierzchnię podłoża w pobliżu próbki.

Opisany protokół może być wykorzystany do wielu rodzajów badań bakteryjnych, w tym do badań porównawczych między różnymi próbkami, a także do badań subkomórkowych. Dane mogą być analizowane przy użyciu podejść chemometrycznych dla pojedynczych widm i modalności obrazowania³⁵, w zależności od celu badań. Co więcej, protokół może być również zmodyfikowany w celu zastosowania do innego materiału biologicznego (takiego jak grzyby, drożdże, komórki itp.), poprzez dodanie utrwalenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Metalowy dysk na próbki AFM	PST ProSciTech Pty Ltd	GA530-15	Zalecane 15 mm
Anasys AFM-IR nanoIR2	Anaysys Instruments		model: nanoIR2
Tryb kontaktowy Sondy NIR2 dla nanoIR 2	Bruker / Anasys		Instruments-Model: Model: PR-EX-NIR2
Mikrowirówka Heraeus Pico 17	Thermo Scientific	-	-
Matlab	Mathworks	Inc-Oprogramowanie	do analizy danych wielowymiarowych
Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml	Heathrow Scientific	HEA4323	Może być zastąpiony dowolnym innym mikroprobówką wirówkową
NanoIR 2 Przyrząd	Bruker / Anasys Instruments	-
Skrzynka narzędziowa PLS	Mathworks	Inc-GUI	dla Matlab
Wybrane podłoże bakteryjne (np. HBA Columbia Plates)	Thermo Fisher	PP2001	Podany rodzaj podłoża jest przykładowy i może być zastąpiony innymi, w zależności od rodzaju eksperymentu
Wybrany szczep bakteryjny	-		źródło zależy od celu badań (izolaty pacjenta, szczepy ATCC itp.)
Podłoże (np. klasa ramanowska CaF2)	Crystran	CAFP13-2R	Zalecany rozmiar: 13 mm i Oslash; x 2,0 mm
Pipeta z końcówką 1000 µ l	Pipeta Axygen	T-1000-B-Tip
200 i mikro; l	Pipeta Axygen	T-200-C-Tip
0,5-10 i mikro; l	Axygen	T-300-R-Ultraczysta
woda	-	-	-