Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Minimalnie inwazyjna metoda dotchawniczego wkraplania leków u nowonarodzonych gryzoni w leczeniu chorób płuc

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61729

⸱

4 sierpnia 2021

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

W tym artykule

Podsumowanie

Ta technika bezpośredniego wstrzykiwania leków do tchawicy noworodków gryzoni jest ważna w badaniu wpływu lokalnie podawanych leków lub leków biologicznych na choroby płuc u noworodków. Dodatkowo metoda ta może być również stosowana do wywoływania uszkodzenia płuc w modelach zwierzęcych.

Streszczenie

Leczenie noworodków gryzoni lekami podawanymi bezpośrednio do tchawicy może służyć jako cenne narzędzie do badania wpływu lokalnie podawanego leku. Ma to bezpośredni wpływ translacyjny, ponieważ środki powierzchniowo czynne i leki są podawane miejscowo do płuc. Chociaż w literaturze znajduje się wiele publikacji opisujących minimalnie inwazyjną intubację przezustną dorosłych myszy i szczurów w eksperymentach terapeutycznych, brakuje tego podejścia u nowonarodzonych szczeniąt szczurów. Mały rozmiar okolicy ustno-tchawiczej/gardła u młodych utrudnia wizualizację światła krtani (strun głosowych), przyczyniając się do zmiennego wskaźnika powodzenia podawania leków do tchawicy. Niniejszym demonstrujemy skuteczną doustną intubację nowonarodzonego szczeniaka szczura - technikę, która jest nietraumatyczna i minimalnie inwazyjna, dzięki czemu może być stosowana do seryjnego podawania leków. Użyliśmy otoskopu operacyjnego z systemem oświetlenia i soczewką powiększającą, aby uwidocznić otwór tchawicy noworodków szczurów. Lek jest następnie wkraplany za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do końcówki pipety. Dokładność metody podawania została zademonstrowana przy użyciu podawania niebieskiego barwnika Evans. Ta metoda jest łatwa do przeszkolenia i może służyć jako skuteczny sposób wkraplania leków do tchawicy. Metoda ta może być również stosowana do podawania inokulum lub środków symulujących stany chorobowe u zwierząt, a także do opartych na komórkach strategii leczenia różnych chorób płuc.

Wprowadzenie

Noworodki urodzone przedwcześnie mają słabo rozwinięte płuca, które wymagają wielu terapii interwencyjnych, takich jak długotrwała wentylacja. Interwencje te narażają noworodki, które przeżyły, na wysokie ryzyko późniejszych następstw e1. Eksperymentalne modele zwierzęce służą jako ważne narzędzie w symulowaniu różnych stanów chorobowych, badaniu patobiologii chorób i ocenie interwencji terapeutycznych. Mimo że dostępna jest szeroka gama modeli zwierzęcych, od myszy, szczurów i królików po wcześniaki i świnie, myszy i szczury są najczęściej używane.

Główną zaletą korzystania z myszy i szczurów jest stosunkowo krótki okres ciąży i niższe koszty. Są również łatwo dostępne, łatwe w utrzymaniu w środowiskach wolnych od chorób, genetycznie jednorodne i mają stosunkowo mniej problemów etycznych2,3. Inną ważną zaletą modelu gryzonia jest to, że w momencie narodzin nowonarodzone szczenię znajduje się w późnym kanalikowym/wczesnym torkowatym stadium rozwoju płuc, co jest morfologicznie równoważne płucom 24-tygodniowego wcześniaka, u którego rozwija się dysplazja oskrzelowo-płucna4. Ponadto, ponieważ rozwój płuc szybko postępuje do zakończenia w ciągu pierwszych 4 tygodni życia, możliwe jest zbadanie dojrzewania płuc po urodzeniu w rozsądnym przedziale czasowym4. Pomimo tych zalet, mały rozmiar myszy i szczeniąt szczurów jest źródłem obaw dla różnych interwencji, co zmusza większość badaczy do używania dorosłych zwierząt, a nie pups5. Płuca noworodków znajdują się w fazie rozwoju, a reakcja noworodka na czynnik podżegający różni się od reakcji osoby dorosłej. To sprawia, że właściwe jest wykorzystanie noworodków na modelach zwierzęcych do badania stanów chorobowych u noworodków.

Istnieją różne metody podawania leków/czynników biologicznych do płuc. Obejmuje to inflację donosową6,7 lub intratchheal8,9,10 wkraplanie11,12. Każde podejście ma swoje własne wyzwania techniczne, zalety, a także ograniczenia13. Preferowana jest dotchawcza droga podawania środków terapeutycznych w celu zbadania bezpośredniego wpływu terapeutycznego na narząd, z pominięciem skutków ogólnoustrojowych. Ta trasa może być również wykorzystana do badania patologii płuc wywoływanej przez czynniki podżegające. Istnieją zarówno inwazyjne, jak i minimalnie inwazyjne techniki, które można wykonać i są łatwe do wykonania u dorosłych. Jednak u szczeniąt, ze względu na mały rozmiar zwierzęcia, istnieją wyzwania techniczne związane z procesem intubacji. Obecne badanie przedstawia prostą, spójną, niechirurgiczną metodę wkraplania dotchawiczego (ITI) u młodych szczurów, która może być wykorzystana do badania skuteczności różnych interwencji terapeutycznych noworodków, a także do generowania modeli zwierzęcych symulujących choroby układu oddechowego noworodków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (protokół # 2020-0035) na Uniwersytecie Case Western Reserve. Wszystkie zwierzęta były leczone zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Zwierzęta

  1. Pozyskaj komercyjnie ciężarne szczury Sprague Dawley.
  2. Utrzymuj zwierzęta w zatwierdzonej placówce weterynaryjnej z cyklem 14 godzin/10 godzin światła i ciemności 45-60% wilgotności względnej.

2. Przygotowanie badanego związku

  1. Użyj niebieskiego barwnika Evansa jako związku testowego, aby ocenić skuteczność procedury wkraplania dotchawiczego.
  2. Przygotować 0,25% (w/v) roztwór barwnika w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (pH 7,2) i wysterylizować filtrem za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.

3. Podawanie znieczulenia

  1. Znieczulenie szczeniąt szczurów za pomocą znieczulenia gazowego (3% izofluranu w 100% tlenu), przy użyciu zmodyfikowanego systemu dostarczania dostosowanego dla małych noworodków szczurów.
  2. Sprawdź, czy nie doszło do utraty odruchów ogona i pedałów oraz płytkiego oddechu, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia do przeprowadzenia zabiegu.

4. Wkraplanie dotchawicze (ITI)

  1. Do ITI należy użyć młodych szczurów w 5. dniu po urodzeniu (PN 5). Średnia waga szczeniaka szczura PN 5 wynosi 12 gramów.
  2. Unieruchomić znieczulone szczenię szczura na pochyłej płaskiej platformie za pomocą laboratoryjnej taśmy do etykietowania. Szczenię jest unieruchomione pod kątem około 45° w pozycji leżącej.
  3. Otwórz usta noworodka i delikatnie wyciągnij język na bok za pomocą kleszczy.
  4. Użyj małego wziernika otoskopowego o średnicy 2 mm połączonego z otoskopem, aby delikatnie przytrzymać język i zapewnić prawidłową wizualizację krtani.
  5. Użyj systemu oświetlacza gardła, tj. otoskopu operacyjnego i soczewki powiększającej, aby prawidłowo uwidocznić struny głosowe (Rysunek 1).
  6. Ustaw zwierzęta pod kątem 45° w nachylonej płaszczyźnie. Używane są druciane pokrywy klatek dla myszy (Rysunek 2).
    UWAGA: Ustawienie zwierzęcia pod kątem 45° zapewnia lepszą wizualizację otworu tchawicy bez ingerencji nagłośni
    7. .
  7. Weź długokątną końcówkę do pipety, która służy do ładowania żeli Western blot. Odciąć podstawę końcówki pipety za pomocą ostrza chirurgicznego tak, aby dobrze pasowała do końcówki strzykawki o pojemności 1 cm3.
  8. Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml umieszczonej w końcówce pipety o długim kącie nachylenia, aby wprowadzić 30-50 μl substancji do płuc. Odwrócić strzykawkę i zassać prawie 0,9 ml powietrza do strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do końcówki pipety, a następnie barwnika lub substancji, która ma być podawana. Pozwala to na wepchnięcie powietrza za barwnikiem do tchawicy po podaniu barwnika, jak pokazano na Rysunek 3. Podanie dotchawicze uzyskuje się poprzez uwidocznienie światła krtani (strun głosowych) i wprowadzenie końcówki pipety dopasowanej do strzykawki do światła tchawicy.
  9. Użyj wziernika otoskopu, aby przytrzymać język i odsłonić struny głosowe. Wziernik pełni rolę ostrza laryngoskopu. Zegnij końcówkę pipety pod kątem 30°, aby ułatwić wprowadzenie środka przez wziernik w kształcie stożka do otworu tchawicy.
  10. Wprowadzić końcówkę pipety do otworu tchawicy w odległości około 2 mm poza struny głosowe. Popchnij tłok strzykawki, aby podać barwnik lub lek przez wziernik otoskopu operacyjnego, jak pokazano na Rysunek 3. Wprowadzenie powietrza do płuc wkrótce po podaniu środka zapobiega powrotowi substancji do jamy krtaniowej.
  11. Po podaniu szczeniakowi barwnika lub soli fizjologicznej, umieść szczenięta na zintegrowanej poduszce grzewczej z płynem krążącym (38°C), aż ich ruchy oddechowe będą regularne. Po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia połącz młode z matką.

5. Charakterystyka dostarczania ITI

  1. Po ITI należy poddać eutanazji młode szczurów, podając im nadmierne znieczulenie (ketamina 100 mg/kg i ksylazyna 10 mg/kg) / tiopenton, a następnie wykrwawienie w odpowiednim czasie po podaniu. Eutanazja została przeprowadzona w ramach eksperymentu mającego na celu pobranie tkanki płucnej w celu wykazania skuteczności.
  2. Zabezpiecz uśpione szczenię szczura na desce sekcyjnej i przetrzyj klatkę piersiową i brzuch 70% alkoholem etylowym.
  3. Aby ocenić rozmieszczenie barwnika w płucach, należy usunąć płuca zwierzęcia za pomocą sterylnej techniki i wyświetlić płuca zgodnie z odpowiednimi do obrazowania (Rysunek 4A,B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Instylacja błękitu Evansa ujawniła wieloogniskowy rozkład barwnika obejmujący wszystkie płaty płuc (Rycina 4A,B). Wynik przedstawiony na Rycini 4 wykazuje skuteczność dystrybucji do wszystkich płatów. Zdjęcie wykonano bezpośrednio po ITI barwnika do tchawicy. Osiągnięto 100% skuteczności w instylacji barwnika do tchawicy, po której nastąpiło jego rozprzestrzenienie się na wszystkie płaty po obu stronach. Przewiduje się, że barwnik rozprzestrzeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wkraplanie dotchawicze jest doskonałą metodą, która ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami interwencji w chorobach układu oddechowego, a także opracowywaniem modelu choroby. Jest to szybka metoda i przy doświadczeniu może być wykonywana ze średnią prędkością 2-3 minut na zwierzę. Kluczowymi czynnikami wpływającymi na udaną intubację są prawidłowe uspokojenie zwierzęcia, jego prawidłowe ułożenie, zwłaszcza głowy, a także dokładna głębokość umieszczenia/rozmiar wzierników w jamie ustnej gardła. Właściwa sedacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez R01HD090887-01A1 od NICHD do AH. Autorzy doceniają również udogodnienia zapewnione przez laboratorium dr Petera Mc Farlane'a, takie jak znieczulenie wziewne / system poduszek grzewczych. Doceniamy cenną pomoc Pani Catherine Mayer w tworzeniu systemu. Organ finansujący nie odegrał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu, analizie i interpretacji danych ani w pisaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Evans Blue dyeSigma-Aldrich, St Louis, MO, USA314-13-6Potwierdzenie podania leku do płuc
Chlorowodorek ketaminyHospira. Inc, Lake Forest, IL, USAWydawane z placówki opieki nad zwierzętamiDo sedacji
Otoskop operacyjnyWelch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA21770-3.5VDo wizualizacji strun głosowych
Otoskop Uchwyt akumulatorowyWelch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA71050-C
Końcówka do pipety (ładowanie żelu)Fisherbrand02-707-139Podawanie leku
Platforma do krępowania (płaszczyzna nachylona)Placówka opieki nadzwierzętami Wydawana z placówki opieki nad zwierzętamiMożna użyć przewodowego dachu klatki dla myszy
Biała księga chirurgiczna 3M Micropore (taśma klejąca)3M, St. Paul, MN, USA1530-2
Strzykawka Luer Lock (1 ml)BD Franklin Lakes, NJ, USANBD2515Podawanie leku
XylazineHospira. Inc, Lake Forest, IL, USADo sedacji

Bibliografia

  1. Prakash, Y. S. Pulmonary Cell Biology Lab: Neonatal Lung Disease. Mayo Clinic. , Available from: https://www.mayo.edu/research/labs/pulmonary-cell-biology/projects/neonatal=lung-disease (2020).
  2. Martínez-Burnes, J., López, A., Lemke, K., Dobbin, G. Transoral intratracheal inoculation method for use with neonatal rats. Comparative Medicine. 51 (2), 134-137 (2001).
  3. Pinkerton, K. E., Crapo, J. D. Morphometry of the alveolar region of the lung. Toxicology of Inhaled Materials Handbook of Experimental Pharmacology. Witschi, H., Brain, J. D. 95, Springer, Berlin. 259-285 (1985).
  4. Nardiello, C., Mižíková, I., Morty, R. E. Looking ahead: where to next for animal models of bronchopulmonary dysplasia. Cell and Tissue Research. 367 (3), 457-468 (2017).
  5. Sugimoto, M., Ando, M., Senba, H., Tokuomi, H. Lung defenses in neonates: Effects of bronchial lavage fluids from adult and neonatal rabbits on superoxide production by their alveolar macrophages. Journal of the Reticuloendothelial Society. 27 (6), 595-606 (1980).
  6. Grayson, M. H., et al. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. Journal of Immunology. 179 (3), Baltimore, Md. 1438-1448 (2007).
  7. Moreira, A., et al. Intranasal delivery of human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stromal cells restores lung alveolarization and vascularization in experimental bronchopulmonary dysplasia. Stem Cells Translational Medicine. 9 (2), 221-234 (2020).
  8. Bar-Haim, E., et al. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathogens. 4 (11), 1000211(2008).
  9. Linderholm, A. L., Franzi, L. M., Bein, K. J., Pinkerton, K. E., Last, J. A. A quantitative comparison of intranasal and intratracheal administration of coarse PM in the mouse. Integrative Pharmacology, Toxicology and Genotoxicology. 1 (1), 5-10 (2015).
  10. Guerra, K., et al. Intra-tracheal administration of a naked plasmid expressing stromal derived factor-1 improves lung structure in rodents with experimental bronchopulmonary dysplasia. Respiratory Research. 20 (1), 255(2019).
  11. Thomas, R., et al. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. Journal of Medical Microbiology. 59, Pt 12 1415-1427 (2010).
  12. Sakurai, R., et al. A combination of the aerosolized PPAR-γ agonist pioglitazone and a synthetic surfactant protein B peptide mimic prevents hyperoxia-induced neonatal lung injury in rats. Neonatology. 113 (4), 296-304 (2018).
  13. Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702(2011).
  14. Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environmental Research. 11 (1), 13-33 (1976).
  15. Pritchard, J. N., et al. The distribution of dust in the rat lung following administration by inhalation and by single intratracheal instillation. Environmental Research. 36 (2), 268-297 (1985).
  16. Ruzinski, J. T., Skerrett, S. J., Chi, E. Y., Martin, T. R. Deposition of particles in the lungs of infant and adult rats after direct intratracheal administration. Laboratory Animal Science. 45 (2), 205-210 (1995).
  17. Sun, B., Curstedt, T., Song, G. W., Robertson, B. Surfactant improves lung function and morphology in newborn rabbits with meconium aspiration. Biology of the Neonate. 63 (2), 96-104 (1993).
  18. Nicholson, J. W., Kinkead, E. R. A simple device for intratracheal injections in rats. Laboratory Animal Science. 32 (5), 509-510 (1982).
  19. Carlon, M., et al. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18 (12), 2130-2138 (2010).
  20. Chen, C. -M., Chen, Y. -J., Huang, Z. -H. Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats. Journal of Visualized Experiments. (159), e61117(2020).
  21. Reynolds, R. D. Preventing maternal cannibalism in rats. Science. 213 (4512), New York, N.Y. 1146(1981).
  22. Park, C. M., Clegg, K. E., Harvey-Clark, C. J., Hollenberg, M. J. Improved techniques for successful neonatal rat surgery. Laboratory Animal Science. 42 (5), 508-513 (1992).
  23. Cleary, G. M., et al. Exudative lung injury is associated with decreased levels of surfactant proteins in a rat model of meconium aspiration. Pediatrics. 100 (6), 998-1003 (1997).
  24. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  25. Oka, Y., et al. A reliable method for intratracheal instillation of materials to the entire lung in rats. Journal of Toxicologic Pathology. 19 (2), 107-109 (2006).
  26. Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice. Laboratory Animals. 43 (4), 399-401 (2009).
  27. Kim, J. -S., et al. An automatic video instillator for intratracheal instillation in the rat. Laboratory Animals. 44 (1), 20-24 (2010).
  28. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261(2014).
  29. Ordodi, V. L., Mic, F. A., Mic, A. A., Sandesc, D., Paunescu, V. A simple device for intubation of rats. Lab Animal. 34 (8), 37-39 (2005).
  30. Cleary, G. M., Wiswell, T. E. Meconium-stained amniotic fluid and the meconium aspiration syndrome. An update. Pediatric Clinics of North America. 45 (3), 511-529 (1998).
  31. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An improved method for rapid intubation of the trachea in mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771(2016).
  32. Litvin, D. G., Dick, T. E., Smith, C. B., Jacono, F. J. Lung-injury depresses glutamatergic synaptic transmission in the nucleus tractus solitarii via discrete age-dependent mechanisms in neonatal rats. Brain, Behavior, and Immunity. 70, 398-422 (2018).
  33. Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
  34. Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80 (3), 415-424 (2016).
  35. Chang, Y. S., et al. Intratracheal transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells dose-dependently attenuate hyperoxia-induced lung injury in neonatal rats. Cell Transplantation. 20 (11-12), 1843-1854 (2011).
  36. Chang, Y. S., et al. Timing of umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells transplantation determines therapeutic efficacy in the neonatal hyperoxic lung injury. PloS One. 8 (1), 52419(2013).
  37. Mowat, V., Alexander, D. J., Pilling, A. M. A comparison of rodent and nonrodent laryngeal and tracheal bifurcation sensitivities in inhalation toxicity studies and their relevance for human exposure. Toxicologic Pathology. 45 (1), 216-222 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Otoskop operacyjnywizualizacja bezpośredniabarwnik błękit ewansadystrybucja w tkance płucnejpodawanie lekudostarczanie przez tchawicęwizualizacja strun głosowychnoworodkowe szczury
Minimalnie inwazyjna metoda dotchawniczego wkraplania leków u nowonarodzonych gryzoni w leczeniu chorób płuc
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.