Method Article

Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek

DOI:

10.3791/61733

⸱

September 1st, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Disease and Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół kriogenicznego transferu zamrożonych próbek do sondy dynamicznego rezonansu magnetycznego (NMR) dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) z magicznym kątem wirowania (MAS). Protokół zawiera wskazówki dotyczące przechowywania wirnika przed eksperymentem oraz wskazówki dotyczące pomiarów żywotności przed i po eksperymencie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczna polaryzacja jądrowa (DNP) może znacznie zwiększyć czułość spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS). Te przyrosty czułości rosną wraz ze spadkiem temperatury i są wystarczająco duże, aby umożliwić badanie cząsteczek w bardzo niskich stężeniach w temperaturach roboczych (~100 K) większości komercyjnych spektrometrów NMR wyposażonych w DNP. Prowadzi to do możliwości zaobserwowania w komórkach kriokonserwowanych komórek makrocząsteczek na ich endogennych poziomach w ich naturalnym środowisku. Jednak szybkości zamrażania wymagane do kriokonserwacji komórkowej są przekroczone podczas typowego obchodzenia się z próbkami dla DNP MAS NMR, co powoduje utratę integralności komórkowej i żywotności. W artykule opisano szczegółowy protokół przygotowania i kriogenicznego transferu zamrożonej próbki komórek ssaków do spektrometru MAS NMR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzenie dynamicznej polaryzacji jądrowej dla spektroskopii magnetycznego rezonansu magnetycznego z wirowaniem pod magicznym kątem może zwiększyć czułość MAS NMR o kilka rzędów wielkości. Umożliwiło to wykrycie biomolekuł na poziomie lub w pobliżu ich stężeń fizjologicznych. DNP może zapewnić i zapewnia czułość wymaganą do wykrywania izotopowo znakowanego białka w endogennych (~1 μM) stężeniach w złożonym środowisku biologicznym1. Ponieważ istnieją ugruntowane protokoły wprowadzania izotopowo znakowanych cząsteczek do nieznakowanych komórek ssaków bez wpływu na ich żywotność, otwiera to możliwość badania izotopowo wzbogaconych biomolekuł na ich endogennych poziomach w ich naturalnym środowisku. Co więcej, ponieważ ulepszenia DNP są bardziej wydajne w niższych temperaturach2,3,4, temperatury eksperymentalne dla DNP MAS NMR są dokładnie zgodne z tymi, które są wymagane do długotrwałego przechowywania żywotnych komórek ssaków5. Jednak konwencjonalna metoda przenoszenia próbki do spektrometru DNP MAS NMR poddaje ją wahaniom temperatury, które powodują rozerwanie komórek ssaków.

MAS NMR eksperymenty wymagają obrócenia próbki wokół magicznego kąta z częstotliwościami równymi lub większymi niż wielkość oddziaływania anizotropowego, aby można było ją uśrednić do zera, zazwyczaj co najmniej 4 kHz, a często znacznie więcej6,7,8,9. Próbki są zatem pakowane do wirników, które mają żebrowaną końcówkę, która służy do napędzania obrotu wirnika przez strumień gazu i mają znak na drugim końcu, dzięki czemu częstotliwość obrotów może być monitorowana przez obrotomierz. Przenoszenie próbki dla większości przyrządów MAS NMR odbywa się poprzez wstrzyknięcie wirnika z zewnątrz przyrządu do stojana na końcu sondy NMR za pomocą strumienia suchego powietrza lub azotu. Po tym, jak wirnik dotrze do stojana, który utrzymuje wirnik pod magicznym kątem, obrót próbki jest napędzany przez mechanizm turbiny powietrznej. Oddzielne strumienie gazu podtrzymują, napędzają i kontrolują temperaturę wirnika. Wprowadzenie wirnika do spektrometru NMR i uzyskanie stabilnego wirowania MAS wymaga precyzyjnie obrobionych końcówek napędowych oraz ścisłej kontroli temperatury i ciśnienia poszczególnych strumieni gazu. Pomimo tych wymagań technicznych, wprowadzanie i uzyskiwanie stabilnego MAS jest w dużej mierze zautomatyzowane w przypadku komercyjnych sond MAS NMR do zastosowań w temperaturze pokojowej.

Jednak sytuacja jest bardziej skomplikowana w przypadku zastosowań niskotemperaturowych. Próbki do zastosowań niskotemperaturowych są zwykle wprowadzane do spektrometru w temperaturze pokojowej i zamrażane w stojanie. W pierwszej minucie temperatura próbki szybko spada (> −100 °C/min), a temperatura układu potrzebuje kilku minut, aby się zrównoważyć. Ze względu na wzajemne oddziaływanie temperatury i ciśnienia, wprowadzanie i zbliżanie się do żądanego MAS jest często obsługiwane ręcznie w przypadku zastosowań niskotemperaturowych. Pomimo konieczności ręcznej interwencji, zamrożenie wirnika wewnątrz przyrządu jest korzystne, ponieważ minimalizuje wprowadzanie wody i kondensatu do sondy, co ma kluczowe znaczenie dla udanego wirowania. Nie tylko kondensacja i nagromadzenie lodu z wilgoci otoczenia mogą blokować przewody gazowe, ale kondensacja lub szron na samym wirniku mogą mechanicznie zapobiegać MAS. W związku z tym próbki do niskotemperaturowego MAS NMR są zwykle zamrażane wewnątrz urządzenia z szybkością przekraczającą -100 °C/min.

Komórki ssaków mogą zachować swoją integralność w cyklu zamrażania i rozmrażania, jeśli chłodzenie jest powolne5,10,11,12, z szybkością równą lub wolniejszą niż 1 °C/min. Alternatywnie, komórki zachowują również swoją integralność, jeśli szybkość chłodzenia jest bardzo szybka13,14,15, z szybkością większą niż 104 °C/min. Szybkości pośrednie do tych dwóch skrajności rozrywają i zabijają komórki ssaków z powodu tworzenia się kryształków lodu zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórek, nawet w obecności środków krioprotekcyjnych16. Szybkość chłodzenia próbki dla wirnika o temperaturze pokojowej wewnątrz wstępnie schłodzonej sondy mieści się między tymi dwoma skrajnościami, dlatego w celu zbadania kriogenicznie zachowanych nienaruszonych żywotnych komórek ssaków, próbki muszą zostać zamrożone przed przeniesieniem do instrumentu i przeniesione do instrumentu bez wahań temperatury, które mogłyby uszkodzić próbkę lub nagromadzenie szronu na wirniku, które mogłoby zapobiec obracaniu się wirnika. Protokół opisuje metodę wprowadzania bezmrozowego, wstępnie schłodzonego wirnika do kriogenicznego systemu MAS NMR w celu badania kriogenicznie zachowanych nienaruszonych próbek żywych komórek ssaków. Opisany tutaj transfer próbek kriogenicznych został opracowany w celu scharakteryzowania NMR żywotnych nienaruszonych komórek. Ma jednak zastosowanie do każdego systemu, w którym wahania temperatury mogą zagrozić integralności próbki. Obejmuje to wiele różnych złożonych systemów, takich jak reakcje z chłodzeniem w zamrażaniu do chemicznej i strukturalnej charakterystyki uwięzionych produktów pośrednich reakcji17,18, enzymology19,20 lub składanie białek21,22.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla i krioprotekcja komórek ssaków

  1. Hodowla i pobieranie komórek ssaków
    1. Rozmrozić podwielokrotność zamrożonych ludzkich embrionalnych komórek nerkowych (HEK 293).
    2. Hodowla komórek HEK 293 w pożywkach wzrostowych (np. DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% Pen-Strep) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w 100 mm płytkach przez dwa do trzech pasaży (7-10 dni).
    3. Podziel komórki i kulturę na płytce o średnicy 150 mm, aż komórki osiągną 90-95% zbieżności.
      UWAGA: Płyta 150 mm przy > 90% zbiegu wystarczy do wypełnienia dwóch szafirowych wirników o średnicy 3,2 mm.
    4. Zebrać komórki za pomocą 4 ml trypsyny (patrz tabela materiałów) i 10 ml pożywki. Przenieść zawiesinę do sterylnego stożka o pojemności 15 ml i odwirować przy 673 x g (1000 obr./min) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.
    5. Przepłukać osad komórkowy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (pH 7,4, −CaCl2, −MgCl2).
  2. Krioprotekcja komórek
    1. Zebrać 50 μl osadu komórkowego w probówce do mikrowirówki. Przygotować mieszaninę 50 μl PBS i 18 μl glicerolu w osobnej probówce.
    2. Delikatnie wymieszaj 50 μl osadu komórkowego z 68 μl mieszaniny glicerolu-PBS, dodając mieszaninę glicerolu-PBS do górnej części osadu i ponownie zawieszając osad, delikatnie stukając w bok probówki, aż nie pozostaną żadne grudki.
      UWAGA: Delikatne pipetowanie może być również stosowane do ponownego zawieszenia ogniwa, jednak należy upewnić się, że integralność komórkowa nie jest naruszona.

2. Kriokonserwacja komórek ssaków w wirniku NMR

  1. Przeniesienie komórek do szafirowego wirnika o średnicy 3,2 mm.
    1. Aby wykonać lejek, odetnij końcówkę pipety o pojemności 200 μl i włóż wąską końcówkę odciętej końcówki pipety do wirnika o średnicy 3,2 mm.
    2. Przenieś komórki do lejka znajdującego się na wirniku. Umieścić rotor wraz z lejkiem w probówce do mikrowirówki i osadzać komórki na dnie wirnika przez odwirowanie przy 673 x g przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.
    3. Usunąć supernatant i nadmiar próbki z wirnika. Powtarzaj te dwa kroki, aż wirnik zostanie całkowicie wypełniony komórkami.
      UWAGA: Opcjonalnie należy określić żywotność komórkową próbki przed zamrożeniem. Zawiesić 10 μl nadmiaru osadu komórkowego w 100 μl DMEM wolnego od FBS. Zmieszać 10 μl zawiesiny z 0,4% roztworem błękitu trypanowego i natychmiast ocenić żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek. Do rozcieńczania komórek należy używać wyłącznie pożywki wolnej od FBS, ponieważ surowica zakłóca barwienie błękitem trypanowym.
    4. Uszczelnij wirnik silikonową zatyczką za pomocą dostępnego w handlu narzędzia do pakowania.
    5. Zamknij wirnik za pomocą ceramicznej końcówki napędowej, dociskając ją pionowo w dół. Unikaj dotykania delikatnych żeber z boku końcówki napędu.
    6. Zaznacz połowę dolnej krawędzi wirnika szafirowego srebrnym markerem permanentnym, a drugą połowę dolnej krawędzi wirnika czarnym markerem permanentnym, aby umożliwić dokładne monitorowanie wirowania wirnika wewnątrz spektrometru.
      UWAGA: Niedoskonałości w oznaczeniu wirnika uniemożliwią dokładne zliczenie częstotliwości wirowania, skutkując nieuzyskaniem stabilnego wirowania. Ponieważ znaczniki nie będą pisać na zamarzniętym wirniku, a ocieplenie wirnika narusza integralność próbki, oznaczenie wirnika przed zamrożeniem jest krytycznym krokiem.
  2. Kriokonserwacja komórek wewnątrz szafirowego wirnika o średnicy 3,2 mm.
    1. Umieść poduszkę wykonaną z kawałka chusteczki higienicznej lub ręcznika papierowego pod pokrywką i na dnie fiolki kriogenicznej (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Bibułka chroni oznakowanie wirnika przed uszkodzeniami powstałymi w wyniku uderzenia o boki fiolek kriogenicznych.
    2. Umieść rotor szafirowy o średnicy 3,2 mm w fiolce kriogenicznej wyściełanej bibułką z zaznaczonym końcem skierowanym w stronę dna fiolki kriogenicznej.
    3. Powoli zamrażać rotor, umieszczając fiolkę kriogeniczną w pojemniku chłodzącym o kontrolowanej szybkości (-1 °C/min) i umieścić pojemnik w zamrażarce o temperaturze -80 °C na co najmniej 3 godziny.
    4. Przenieść fiolkę kriogeniczną zawierającą zamrożony wirnik do przechowywania ciekłego azotu.

3. Kriogeniczny transfer zamrożonej próbki do spektrometru NMR

  1. Przetransportować zamrożoną próbkę do urządzenia NMR.
    1. Przenieść fiolkę kriogeniczną zawierającą zamrożony wirnik do małego dewara wypełnionego ciekłym azotem w celu transportu do urządzenia NMR.
  2. Przeniesienie zamrożonego wirnika do kąpieli ciekłego azotu.
    1. Napełnij suchą, izolowaną termicznie piankę dewara o szerokich ustach 500 ml – 1 l ciekłego azotu.
    2. Przenieść wirnik z fiolki kriogenicznej do pianki Dewara o szerokich ustach wypełnionej ciekłym azotem.
      1. Weź kriogeniczną fiolkę z dewara do przenoszenia w dłoni i trzymaj ją tuż nad powierzchnią ciekłego azotu, aby chronić ją przed atmosferą.
      2. Trzymając fiolkę kriogeniczną z ustami skierowanymi lekko w dół, odkręć nakrętkę i pozwól rotorowi wsunąć się do kąpieli ciekłego azotu.
        UWAGA: Po odkręceniu nakrętki wirnik musi szybko wpaść z fiolki kriogenicznej do kąpieli ciekłego azotu (poniżej 1 sekundy), aby zapobiec gromadzeniu się kondensatu na wirniku. Parowanie ciekłego azotu tworzy "chmurę azotu" w pianie Dewara o szerokich ustach i zapobiega kondensacji na wirniku, zanim zostanie on zanurzony w ciekłym azocie. Dłuższa ekspozycja wirnika na działanie powietrza może prowadzić do kondensacji wilgoci na ściankach wirnika, która ponownie skondensuje się w lód.
  3. Kriogeniczny transfer wirnika do łapacza próbek NMR.
    1. Schłodzić wstępnie probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, zanurzając ją w kąpieli ciekłego azotu. Nie zamykaj tuby.
      UWAGA: Sprawdź wirnik przed przeniesieniem do probówki mikrowirówkowej. Za pomocą pęsety przytrzymaj wirnik tuż pod powierzchnią ciekłego azotu i sprawdź, czy oznaczenia wirnika są nienaruszone, czy na jego ściankach nie utworzyły się osady lodu i czy końcówka napędu jest nienaruszona. Osady kryształków lodu na ściankach wirnika mają postać białego proszku. Należy uważać, aby zawsze trzymać wirnik za jego korpus, a nie za końcówkę napędu. Nie zdrapuj oznaczenia z wirnika końcówkami pęsety.
    2. Pod powierzchnią kąpieli ciekłego azotu za pomocą pęsety przenieś wirnik do probówki mikrowirówki z końcówką napędową skierowaną do dolnej części probówki mikrowirówki, a oznaczeniami skierowanymi w stronę otworu probówki.
      UWAGA: Zawsze susz pęsetę przed zanurzeniem w ciekłym azocie lub dotknięciem wirnika.
    3. Za pomocą pęsety przytrzymaj rurkę zawierającą wirnik pod ciekłym azotem za szyjkę.
    4. Trzymając drugą parę pęsety w ręku, przygotuj się do zanurzenia łapacza próbek NMR w kąpieli ciekłego azotu i trzymania go tak, aby był nachylony pod ostrym kątem w stosunku do probówki mikrowirówkowej.
      UWAGA: Zminimalizuj czas, w którym łapacz próbek ma kontakt z ciekłym azotem, aby uniknąć zamarznięcia pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym. Jeśli O-ring zamarznie, bardzo trudno będzie włożyć łapacz do spektrometru.
  4. Transfer wirnika kriogenicznego z łapacza próbek NMR do spektrometru NMR
    UWAGA: Ten krok wymaga dwóch osób, jednej do obsługi krioszafki, a drugiej do przeniesienia próbki z ciekłego azotu do sondy.
    1. Ustaw krioszafkę w trybie wysuwania, naciskając "EJECT" na szafce.
      UWAGA: Tryb wyrzutu usuwa suchy i zimny strumień azotu pod wysokim ciśnieniem z sondy do atmosfery, aby zapobiec przedostawaniu się wilgoci atmosferycznej.
    2. Przenieść wirnik do łapacza próbek NMR.
      1. Włóż otwarty koniec łapacza próbek NMR do probówki mikrowirówki, pozostając jeszcze pod powierzchnią ciekłego azotu.
      2. Podnieś zarówno probówkę mikrowirówki, jak i łapacz próbek NMR, aby wirnik mógł wpaść do łapacza próbek. Potrząśnij chwytaczem próbek NMR i probówką mikrowirówki w przypadku, gdy wirnik utknął na krawędzi łapacza próbek.
      3. Pozostaw pustą probówkę mikrowirówki na górze łapacza próbek NMR, aby osłonić wirnik przed powietrzem.
    3. Wyjmij drugi pusty łapacz próbek NMR z sondy i połóż go na podłodze.
    4. Przenieś łapacz próbek NMR zawierający wirnik do wolnej ręki, wyjmij rurkę mikrowirówki i natychmiast włóż ją do sondy.
      UWAGA: Jeśli pierścień uszczelniający o przekroju okrągłym zamarznie, trudno będzie dokręcić łapacz próbek. Naciskaj siłę, aż wsunie się na swoje miejsce.
    5. Zasygnalizuj osobie obsługującej krioszafkę, aby "STOP WYSUWAĆ" i "WŁÓŻ".
      UWAGA: Tryb wstawiania prowadzi wirnik od łapacza próbek do sondy.
    6. Odwirować próbkę do żądanej prędkości wirowania (np. 12 kHz), regulując łożysko i ciśnienie przepływu sterującego kontrolowane przez krioszafkę. (np. Natychmiast zwiększ gaz łożyskowy do ~200 mBar, a gaz napędowy do 10 mBar. Gdy próbka zacznie się obracać, zwiększ ciśnienie gazu w łożysku do 1000 mBar i napędzaj gaz do 200 mBar. Gdy wirowanie się ustabilizuje, zwiększ łożysko do 2400 mBar, a następnie zwiększ gaz napędowy z 200 mBar do 1700 mBar w ciągu kilku minut. Gaz chłodzący VT jest stały na poziomie ~1070 L/h.)
      UWAGA: Podczas wyjmowania probówki mikrowirówki i łapacza próbek NMR z kąpieli ciekłego azotu należy upewnić się, że w probówce mikrowirówki znajduje się wystarczająca ilość ciekłego azotu, aby otoczyć wirnik. Zminimalizuj czas między przeniesieniem wirnika do łapacza próbek NMR a włożeniem łapacza próbek NMR do spektrometru. Wszystkie kroki opisane w punkcie 3.4 powinny zostać wykonane w ciągu 30 sekund.

4. Kriogeniczne usuwanie próbki ze spektrometru NMR

  1. Przygotowanie kąpieli z ciekłym azotem i fiolki kriogenicznej
    1. Wlej 500 ml - 1 l ciekłego azotu do piany dewara o szerokich ustach i umieść kąpiel pod spektrometrem.
    2. Wstępnie schłodzić fiolkę kriogeniczną. Zanurzyć pustą fiolkę kriogeniczną zawierającą kawałek bibułki w kąpieli z ciekłym azotem.
  2. Kriogeniczny transfer wirnika z sondy do fiolki kriogenicznej
    1. Zmniejsz prędkość wirowania do 0 kHz, zmniejszając przepływ gazu napędowego i łożyskowego, a następnie wyrzuć wirnik, przełączając się w tryb wyrzutu.
    2. Pozostaw włączony tryb wyrzutu, wyjmij łapacz próbki z sondy, wrzuć wirnik bezpośrednio do pianki Dewara o szerokich ustach zawierającej ciekły azot.
    3. Za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety przenieś wirnik do wstępnie schłodzonej fiolki kriogenicznej pod powierzchnią ciekłego azotu.
    4. Zakręć fiolkę kriogeniczną. Wstępnie schłodzić nasadkę fiolki kriogenicznej, zanurzając ją w ciekłym azocie. Wyjąć fiolkę kriogeniczną zawierającą rotor i ciekły azot z kąpieli i zakryć probówkę wstępnie schłodzoną nasadką. Nie dokręcaj nakrętki, aby można było bezpiecznie uwolnić odparowujący azot.
    5. Ponownie zanurz fiolkę kriogeniczną w ciekłym azocie. Próbkę można przenieść do długoterminowego przechowywania ciekłego azotu lub natychmiast rozpakować w celu dalszej analizy.

5. Rozpakowywanie rotora i pomiary żywotności

  1. Rozpakowanie wirnika i pomiar żywotności
    1. Wstępnie podgrzej pożywkę wolną od surowicy (DMEM) lub PBS do 37 °C.
    2. Usuń wirnik z ciekłego azotu. Usuń końcówkę napędu i silikonową wtyczkę.
      UWAGA: Szafir jest doskonałym przewodnikiem ciepła. Unikaj dotykania wirnika palcami, ponieważ wymiana ciepła może powodować lokalne zamarzanie i rozmrażanie, które zagrażają żywotności komórek.
  2. Pomiar żywotności
    1. Dodać 20 μl ciepłej pożywki do zamrożonych osadów komórkowych w wirniku i ponownie zawiesić komórki. Usunąć zawiesinę pipetą i wymieszać zawiesinę ze 100 μl pożywki.
    2. Usunąć 10 μl zawiesiny komórek i wymieszać z równą objętością 0,4% roztworu błękitu trypanowego (v/v). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s do 1 minuty.
    3. Mierz żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriogeniczne wprowadzanie wstępnie zamrożonych próbek komórek ssaków do spektrometru NMR wspiera żywotność przez cały czas trwania eksperymentu NMR. Schemat kriogenicznego transferu zamrożonej próbki do wstępnie schłodzonej sondy NMR pokazano na rysunku Rysunek 1. Żywotność i nienaruszalność komórek można ocenić przy użyciu różnych metod. W tym przypadku użyliśmy standardowej miary integralności membrany opartej na barwniku, która dobrze pokrywa się z innymi metodami23. Nienaruszone komórki są nieprzepuszczalne dla błękitu trypanowego, podczas gdy komórki z naruszoną integralnością błony są przepuszczalne. Liczbę przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych komórek w kolorze błękitu trypanowego można szybko ocenić za pomocą automatycznego licznika komórek. Stosując opisany tutaj protokół, przepuszczalność błękitu trypanowego komórek ssaków po MAS NMR (tj. w ppkt 5.2.3) jest podobna do przepuszczalności błękitu trypanowego komórek ssaków przed jakąkolwiek zmianą temperatury (tj. w ppkt 2.1.3). Jeśli jednak komórki są powoli zamrażane, a następnie ogrzewane do temperatury pokojowej przed włożeniem (tj. zgodnie z protokołem do punktu 3 przed ogrzaniem wirnika do temperatury pokojowej przed włożeniem do schłodzonej sondy), żywotność komórkowa oceniana za pomocą błękitu trypanowego spada do mniej niż 10% komórek (Rysunek 2). Tak więc zamrażanie komórek wewnątrz spektrometru powoduje utratę integralności błony komórkowej, podczas gdy kriogeniczne wprowadzanie zamrożonych próbek komórek ssaków wspiera żywotność komórek przez cały eksperyment NMR.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat kriogenicznego transferu zamrożonej próbki do wstępnie schłodzonej sondy NMR. (A) Zbliżyć się do powierzchni ciekłego azotu i odkręcić górną część fiolki kriogenicznej. (B) Wsuń wirnik do kąpieli z ciekłym azotem. (C) Zanurz probówkę mikrowirówki za pomocą pęsety i przytrzymaj ją na miejscu, aż całkowicie ostygnie. (D) Włóż wirnik do mikrowirówki z końcówką napędową skierowaną do dolnej części probówki. Pych, a nie chwytaj, pęsetą. (E) Trzymaj probówkę mikrowirówki tuż pod powierzchnią kąpieli z ciekłym azotem i sprawdź wzrokowo wirnik, aby upewnić się, że jest wolny od szronu i dobrze oznaczony. (F) Trzymać łapacz próbek pod kątem nad powierzchnią. (G) Wyjmij łapacz próbki i rurkę z ciekłego azotu, gdy tylko łapacz próbki znajdzie się w probówce do mikrowirówki. (H) Potrząśnij chwytaczem próbek, jeśli wirnik zaczepi się o krawędź. (I) Wyjmij pusty łapacz próbek z sondy i połóż go na ziemi. (J) Wyjmij rurkę mikrowirówki z chwytacza próbek z wirnikiem w środku, włoż, dokręć łapacz próbki w sondzie i naciśnij "INSERT" na pulpicie sterowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Kriogeniczne wprowadzenie wstępnie zamrożonej próbki komórek ssaków skutkuje pomiarami nienaruszoności komórek, które są podobne do próbek komórek ssaków, które nigdy nie zostały zamrożone. Odsetek komórek nieprzepuszczalnych dla błękitu trypanowego w próbkach, które nigdy nie zostały zamrożone (np. etap 2.1.3) jest podobny do procentu komórek w próbkach po MAS NMR (np. etap 5.2.3 z 12 kHz MAS). Wolno zamrożone komórki (np. krok 3), które zostały podgrzane do temperatury pokojowej przed włożeniem do instrumentu NMR, który został wstępnie schłodzony do 100 K, miały znacznie niższy odsetek nienaruszonych komórek po MAS NMR z 12 kHz MAS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriogeniczny transfer zamrożonych próbek do spektrometru NMR z powodzeniem pozwala zachować żywotność zamrożonych komórek ssaków poprzez akwizycję danych NMR. Sukces tej metodologii został wykazany w pomiarach żywotności przed i po MAS NMR. Takie podejście jest skuteczne i można je uogólnić na każdy system, w którym wahania temperatury mogą zagrozić integralności próbki. Obecnie prezentowany protokół wykonywany jest na linii komórkowej HEK 293. Ponieważ warunki kriokonserwacji dla wielu linii komórkowych ssaków są bardzo podobne, jest prawdopodobne, że opisane tutaj warunki można przełożyć na inne systemy komórkowe; Mogą jednak wymagać dalszej optymalizacji krioprotektantów, objętości próbek i szybkości zamrażania, aby osiągnąć te same wyniki.

Metodologię tę można ulepszyć, rozpakowując wirnik szybciej po eksperymencie NMR. Ten krok jest obecnie nieoptymalny, a jego wykonanie wpływa na żywotność komórek. Zanim ogniwa będą mogły zostać ponownie zawieszone w mediach, końcówka napędowa i silikonowa wtyczka muszą zostać usunięte z wirnika. Próbka rozmraża się nierównomiernie, gdy wirnik jest przytrzymywany podczas wyjmowania końcówki napędowej i korka silikonowego, dzięki czemu krótszy czas obsługi wirnika skutkuje wyższą żywotnością. Opracowanie uchwytów wirników lub innych narzędzi ułatwiających równomierne rozmrażanie i szybkie usuwanie końcówki napędowej i korka silikonowego pomogłoby w dokładniejszej ocenie żywotności po NMR.

Podejście do kriogenicznego ładowania próbek opisane w tym artykule ogranicza się do sond NMR, które obsługują wkładanie i wyrzucanie próbki z sondą umieszczoną w otworze magnesu NMR. Podczas gdy wprowadzanie i wyrzucanie próbek zewnętrznych jest standardem w komercyjnych systemach DNP, sondy niestandardowe nie zawsze mają tę opcję. Ponadto takie podejście do ładowania próbek kriogenicznych może wymagać pewnych modyfikacji dla sond NMR zbudowanych tak, aby były kompatybilne z wirnikami o różnych rozmiarach. Protokół ten został zoptymalizowany dla wirników o średnicy 3,2 mm i może wymagać modyfikacji, jeśli zewnętrzna średnica łapacza próbki przekracza wewnętrzną średnicę probówki do mikrowirówki (np. krok 3.4.2).

Dzięki zastosowaniu DNP do MAS NMR możliwe jest teraz wykrywanie białek i innych biomolekuł w endogennych stężeniach fizjologicznych 24,25,26. Otwiera to możliwość badania biomolekuł w ich naturalnym środowisku. Utrzymanie integralności i żywotności komórek przez cały czas trwania eksperymentu może mieć kluczowe znaczenie dla powiązania wyników eksperymentalnych spektroskopii ze zjawiskami biologicznymi. Niekontrolowane zamrażanie próbek zawierających oczyszczone białka lub lizaty komórkowe zazwyczaj nie wpływa negatywnie na jakość próbki 7,27, chociaż istnieją pewne przesłanki, że szybkość zamarzania może być ważną zmienną nawet w systemach oczyszczonych28. Jednak próbki komórek ssaków muszą być zamrażane w kontrolowanej szybkości, jeśli zachowanie nienaruszonej i żywotności komórek jest ważne dla interpretacji. W tym miejscu przedstawiamy protokół zamrażania i przenoszenia zamrożonych próbek komórek ssaków do wstępnie schłodzonego instrumentu DNP MAS NMR, który pozwala uniknąć potencjalnie szkodliwych wahań temperatury i wspomaga pomiary na żywotnych komórkach.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Cancer Research Prevention & Research Institute of Texas [RR150076], National Science Foundation [1751174]; National Institutes of Health [NS-111236], Welch Foundation [1-1923-20170325]; Lupe Murchison Foundation, Ted Nash Long Life Foundation i Kinship Foundation (Searle Scholars Program) dla K.K.F.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,4% Barwienie błękitem trypanowymInvitrogenT10282
Naczynie do hodowli komórkowych 100 mmThomas Scientific 430167
Naczynie do hodowli komórkowych 150 mmNunc157150
Rotor szafirowy 3,2 mmKleszcze kątowe Bruker
45 & deg.Hampton ResearchHR4-859
AMUPolCortecnet
Czarno-srebrny markerNarzędzie do usuwania Sharpie
CapBrukerHZ16913
Woda klasy hodowli komórkowejHyCloneSH30529.03
Nasadka ceramicznaCortecnetHZ12372
CoolCellCorning/ BiocisionUX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)
Szkiełka komory do liczenia komórek CountessInvitrogenC10288
Automatyczny licznik komórek Countess IIInvitrogenAMQAF1000
Probówki kriogeniczneNalgene03-337-7Y
d8-glicerolAldrich447498
Tlenek deuteru, 99,8 % atom DAldrich756822-1
DMEMGibco10569-010
System DNP NMR z żyrotronem z dopasowaną częstotliwościąBruker
Foam dewarSpearlabFD-800
KimwipesKimwipes
Narzędzie do pakowaniaBruker
Pen-StrepGibco15140-122
Sproszkowany PBSVWRVWRRV0780
Protonowany PBSGibco10010-023
Wtyczka silikonowaBrukerB7089
Standard Kleszcze
Tryp-LGibco12605010
C010P005do naczyń

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
  2. Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
  3. Akbey, Ü, Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
  4. Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
  5. Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
  6. Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
  7. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  8. Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
  9. Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
  10. Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
  11. Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
  12. Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
  13. Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
  14. Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
  15. Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928(2015).
  16. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 1257, 3-19 (2015).
  17. Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).
  18. Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717(2019).
  19. Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
  20. Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
  21. Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
  22. Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
  23. Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D. Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry. 64 (1), 1-26 (2013).
  24. Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
  25. Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).
  26. Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
  27. Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
  28. Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryogenic Sample LoadingMagic Angle Spinning NMRDynamic Nuclear PolarizationCellular Viability PreservationLiquid Nitrogen TransferSapphire Rotor HandlingControlled Rate CoolingNMR Spectrometer OperationMammalian Cell CryopreservationSample Integrity Maintenance

Related Articles