Method Article

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

DOI:

10.3791/61735

⸱

April 17th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cultivation Base for Photoelectric Technology and Functional Materials, State Key Laboratory of Photon-Technology in Western China Energy, Institute of Photonics and Photon-Technology, Northwest University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naśladowanie warunków środowiskowych in vivo jest kluczowe dla badań in vitro nad złożonymi maszyneriami życia. Jednak obecne techniki ukierunkowane na żywe komórki i narządy są albo bardzo drogie, jak robotyka, albo brakuje im dokładności w nanolitrach i milisekundach w manipulacji cieczami. Przedstawiamy projekt i wykonanie systemu mikroprzepływowego, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Aby zademonstrować możliwości urządzenia mikroprzepływowego, w proponowanym systemie utrzymywane są sfery nerwowych komórek macierzystych (NSC). Zaobserwowaliśmy, że gdy sfera NSC jest wystawiona na działanie CXCL w dniu 1 i EGF w dniu 2, okrągła konformacja jest dobrze zachowana. Zmienność kolejności wprowadzania 6 leków powoduje zmiany morfologiczne w sferze NSC i reprezentatywnym dla poziomu ekspresji markera pnia NSC (tj. Hes5 i Dcx). Wyniki te wskazują, że dynamiczne i złożone warunki środowiskowe mają ogromny wpływ na różnicowanie i samoodnawianie się NSC, a proponowane urządzenie mikroprzepływowe jest odpowiednią platformą do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki o wysokiej przepustowości są kluczowe dla badań biomedycznych i klinicznych. Przeprowadzając równolegle miliony testów chemicznych, genetycznych lub testów żywych komórek i organoidów, naukowcy mogą szybko zidentyfikować geny, które modulują szlak biomolekularny i dostosować sekwencyjne wprowadzanie leków do konkretnych potrzeb. Robotics1 i chipy mikroprzepływowe w połączeniu z programem do sterowania urządzeniami pozwalają na automatyzację złożonych procedur eksperymentalnych, obejmujących manipulację komórkami/tkankami, obsługę cieczy, obrazowanie i przetwarzanie danych/kontrolę2,3. W związku z tym setki i tysiące warunków eksperymentalnych mogą być utrzymywane na jednym chipie, zgodnie z pożądaną przepustowością4,5.

W tym protokole opisaliśmy proces projektowania i produkcji urządzenia mikroprzepływowego, które składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. 2-poziomowa komora do hodowli komórkowych zapobiega niepotrzebnemu ścinaniu podczas wymiany pożywki, co zapewnia niezakłócone środowisko hodowli do długotrwałego obrazowania żywych komórek. Badania wykazują, że proponowane urządzenie mikroprzepływowe jest odpowiednią platformą do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi mechanizmami życia. Co więcej, zaawansowane funkcje chipa mikroprzepływowego umożliwiają automatyczne odtwarzanie wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo, takich jak ciągle zmieniające się kompozycje cytokin i ligandów6,7, których ukończenie zajmuje miesiące w przypadku konwencjonalnych platform, takich jak płytka 96-dołkowa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie układów mikroprzepływowych

  1. Zaprojektuj multiplekser mikroprzepływowy składający się z 18 wlotów, z których każdy jest sterowany przez indywidualny zawór i pompę perystaltyczną. Aby zwiększyć objętość cieczy napędzaną na cykl pompowania, pompa perystaltyczna powinna składać się z 3 kanałów sterujących, które zostały celowo poszerzone do 200 μm, oraz 10 połączonych przewodów przepływowych.
  2. Zaprojektuj komorę hodowlaną bez ścinania. Replikacja 2-poziomowej jednostki hodowli składa się z dolnej komory hodowli komórkowej (400 μm x 400 μm x 150 μm) i wyższej warstwy buforowej (400 μm x 400 μm x 75 μm), która zapobiega niepożądanym naprężeniom ścinającym na komórkach podczas wymiany pożywki (Rysunek 1).
  3. Projektowanie funkcji o wysokiej przepływności. Zduplikuj jednostkę hodowli, aby utworzyć układ matrycy 30 x 50, zajmujący powierzchnię o wymiarach około 7 cm na 5 cm.

2. Produkcja i eksploatacja chipów

  1. Wykonanie odlewu repliki z wykorzystaniem litografii UV
    UWAGA: Formowanie repliki zostało wykonane na płytce krzemowej zgodnie ze standardowym protokołem fotolitografii8.
    1. Wykonanie konstrukcji kanałów
      1. Fotorezystor wirujący: Odwiruj 5 ml ujemnego fotorezystu SU-8 3025 na płytce krzemowej z prędkością 500 obr./min przez 10 s i 3000 obr./min przez 30 s.
      2. Miękkie pieczenie: Połóż wafel na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C na 2 minuty, a następnie 95 °C na 10 minut, Schłodzić do temperatury pokojowej.
      3. Wyrównanie i utwardzenie: Zamocuj wafel i maskę na uchwycie nakładki i włącz źródło światła na 18 sekund, aby utwardzić naświetlony fotorezyst
        4. .
      4. Pieczenie przed ekspozycją: Rozgrzej wafel do 95°C przy 110°C/h od temperatury pokojowej i trzymaj go przez co najmniej 40 minut do wyjęcia.
      5. Wywoływanie: Zanurz płytkę w roztworze wywołującym (wywoływacz SU-8) i mieszaj ją przez 2,5 minuty, aby zmyć zbędny fotorezyst i uzyskać strukturę kanału o wysokości 25 μm.
      6. Pieczenie na twardo: Przykryj wafel szklaną szalką Petriego i piecz w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie zwiększ do 160 °C w temperaturze 120 °C/h i przechowuj przez 3 godziny.
    2. Wykonanie komory hodowli komórkowej z warstwą buforową
      1. Użyj parametrów kroku 2.1.1.1, aby odwirować 7 ml ujemnego fotorezystu SU-8 3075 na powyższej płytce.
      2. Upiecz na miękko (opisany w kroku 2.1.1.2) wafel i zmień maskę, aby dobrze wyrównała się z markerami na wafli. Następnie włącz źródło światła na 24 s, aby utwardzić naświetlony fotorezyst.
      3. Zanurz płytkę w roztworze rozwijającym (wywoływacz SU-8) i mieszaj go przez 4 minuty i 40 sekund, aby zmyć zbędny fotorezyst i uzyskać strukturę warstwową o wysokości 75 μm, która wokół struktury kanałowej o wysokości 25 μm została wcześniej wytworzona. Upiecz na twardo (opisany w kroku 2.1.1.6) wafel, aby wzmocnić złożoną strukturę.
      4. Powtórz kroki 2.1.2.1-2.1.2.3, aby wytworzyć strukturę komory o wysokości 75 μm, która układa się na strukturze warstwy.
    3. Wykonanie konstrukcji zaworów
      1. Korzystając z parametru kroku 2.1.1.1, odwirować powłokę 5 ml dodatniego fotorezystu AZ 50x na powyższej płytce.
      2. Miękkie upieczenie (opisane w kroku 2.1.1.2) wafla i wyrównanie maski z markerami na płytce, a następnie pozostawienie źródła światła włączonego przez 20 s i natychmiastowego wyłączenia na 30 s. Powtórz procedurę włączania/wyłączania światła w 5 okręgach, aby utwardzić naświetlony fotorezyst
        3. .
      3. Zanurz wafel w dopasowanym wywoływaczu i mieszaj go przez około 8 minut, aby zmyć zbędny fotorezyst i uzyskać okrągłe zawory, które zachodzą na kanały sterujące, aby zapewnić dobre połączenie. Wypiekamy na twardo (opisaną w kroku 2.1.1.6) wzorzystą wafelkę, aby cały model był mocniejszy.
  2. Produkcja chipów mikroprzepływowych z wykorzystaniem miękkiej litografii
    1. Wzorzyste i puste płytki krzemowe należy traktować rymetylochlorosilanem przez 15 minut.
    2. Przygotować 3 porcje żelu PDMS (stosunek monomeru do katalizatora 10:1) odpowiadające odpowiednio 50 g warstwy płynięcia, 20 g warstwy kontrolnej 2 i 20 g membrany.
    3. Odlej 50 g żelu PDMS na wzorzystą płytkę krzemową i odgazowuj je przez 1-2 godziny w komorze próżniowej przy -0,85 MPa, aby skopiować warstwę przepływu.
    4. Odgazuj 2 porcje 20 g PDMS i obracaj je na wzorzystej płytce i czystej płytce krzemowej z prędkością 2000-2800 obr./min przez 30 s, aby przygotować warstwę kontrolną i warstwę membrany.
    5. Umieścić wafle pokryte PDMS w piecu wentylacyjnym na 60 minut w temperaturze 80 °C w celu inkubacji.
    6. Wyrównaj i połącz ze sobą różne warstwy za pomocą niestandardowego urządzenia optycznego (powiększenie 100x) i maszyny do trawienia plazmowego. Następnie przechowuj go w piekarniku wentylacyjnym przez 2 godziny w temperaturze 80 °C, aby poprawić wiązanie wióra.
    7. Przebić otwory wlotowe w chipie, a następnie przymocować go do szkiełka nakrywkowego pokrytego PDMS i utwardzać przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 80 °C przed użyciem.
  3. Operacja na wiórach
    1. Podłącz miniaturowe pneumatyczne zawory elektromagnetyczne do warstwy sterującej układu scalonego i otwórz niestandardowy graficzny interfejs użytkownika MATLAB8, aby połączyć i sterować przełącznikiem.
    2. Ustawić ciśnienie zamykania zaworów membranowych push-up PDMS na 25 psi.
    3. Dostarczaj dynamicznie zmieniające się kombinatoryczne/sekwencyjne dane wejściowe do wyznaczonych komór (Rysunek 2d) poprzez terminowe włączanie i wyłączanie zaworów.

3. Generowanie dynamicznych danych wejściowych w mikrośrodowiskach komórkowych

  1. Obróbka wiórów i ładowanie komórek
    1. Utrzymać standardowe warunki hodowli (37 °C, 5% CO2 ) pod mikroskopem przez co najmniej 5 godzin.
    2. Napełnić zrębek pożywką powlekającą (tj. wymienioną w UWAGA) i inkubować go w standardowych warunkach hodowli (opisanych w kroku 3.1.1) przez co najmniej jedną godzinę.
    3. Przepłukać chip solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) lub pożywką do hodowli komórkowych (pożywką Modified Eagle firmy Dulbecco, DMEM), aby zbudować zdrowe środowisko hodowlane.
    4. Zbierz komórki przy 80% zbiegu i ponownie zawieś komórki za pomocą pożywki hodowlanej (DMEM) o gęstości ~ 106/ml. Następnie załaduj ogniwa do chipa, zwiększając ciśnienie w roztworze zawierającym ogniwa.
      UWAGA: Hodowla różnych linii komórkowych na chipie wymaga odpowiedniego podłoża powlekającego do traktowania komory hodowli komórkowej. Zazwyczaj w przypadku eksperymentów na fibroblastach 3T3 i adherentnej hodowli kur wszystkie zawory sterujące komorami hodowlanymi są otwarte, komórki przepływają do wszystkich komór hodowlanych w tej samej kolumnie.
  2. Konfiguracja do obrazowania na żywo o wysokiej przepustowości
    UWAGA: Do akwizycji obrazu użyto odwróconego mikroskopu z automatycznym stolikiem translacyjnym oraz cyfrowej kamery CMOS (Complementary metal-oxide semiconductor). Scena i akwizycja obrazu były kontrolowane za pomocą dostosowanego do potrzeb oprogramowania.
    1. Wizualizuj matrycę komór hodowlanych za pomocą soczewki obiektywowej 10x w jasnym polu, aby potwierdzić i zdefiniować współrzędne lokalizacji każdej komory matrycy komorowej o wymiarach 30 na 50
      2. .
    2. Przekształć soczewkę obiektywu na 20x lub 40x, a następnie wybierz współrzędne lokalizacji żądanej komory, a etap translacyjny przesuwa się do przypisanej pozycji po potwierdzeniu. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej x, y, z, aby uzyskać optymalny obraz.
    3. Optymalne natężenie światła, czas naświetlania i inne parametry obrazowania określano indywidualnie dla każdego kanału (tj. obrazowanie w jasnym polu i fluorescencyjne).
    4. Ustaw interwał i czas trwania cyklu obrazowania, zapisz ścieżkę, a następnie rozpocznij obrazowanie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalna pompa perystaltyczna na chipie została po raz pierwszy opisana przez Stephena Quake'a w 2000 roku, za pomocą której perystaltyka była uruchamiana według wzorca 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Cyfry 0 i 1 oznaczają "otwarty" i "zamknięty" z 3 poziomych linii sterujących. Opisano również badania, w których użyto więcej niż 3 zaworów (np. pięciu)11. Mimo że pompa perystaltyczna składająca się z 3 przewodów sterujących i 3 li...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano różne urządzenia mikroprzepływowe do wykonywania multipleksowanych i złożonych eksperymentów 17,18,19,20. Na przykład mikrostudzienki wykonane z szeregu wgłębień topologicznych mogą uwięzić pojedyncze komórki bez użycia siły zewnętrznej, wykazując korzystne cechy, w tym mały rozmiar próbki, równoległość, niższy koszt materiału, szybszą reakcję, wysoką czułość 21,22,23,24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie techniczne ze strony Zhifeng Cheng z Chansn Instrument (China) LTD. Praca ta była wspierana przez granty (Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych,51927804).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2713 Loker Avenue WestTorrey pines scientific
AZ-50XAZ Electronic Materials, Luksemburg
Inkubator chlorotrimetylosililanu (TMCS) 92360-25 mlSigma
CO2 HP151Heal Force
Desktop Dziurkacz do chipów PDMS WH-CF-14Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM (L-glutamina, wysoka glukoza, czerwień henolowa)Invitrogen
Waga elektroniczna UTP-313 Max: 600 g, e: 0,1 g, d: 0,01 gShanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co., LTD.
FBSSigma
Fibronection 0,25 mg / mlmilipore, Austria
Glutamax 100xGibco
BGG-9240AShanghai bluepard instruments Co., Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-ENikon
Pen/Strep 10 jednostek/ml Penicylina 10 ug/ml StreptomycynaInvitrogen
Środek do czyszczenia plazmy PDC-002Harrick Plasma
polidimetylosiloksan(PDMS)Momentive
polilizyna 0,01%Powlekarka Sigma
Spin ARE-310Awatori Rentaro
Powlekarka wirowa TDZ5-WSPowlekarka Cence
Spin WH-SC-01Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025MicroChem, Westborough, MA, Stany Zjednoczone
SU-8 3075MicroChem, Westborough, MA, Stany Zjednoczone
Inkubator grzewczy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
  2. Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
  3. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
  4. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
  5. Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
  6. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
  7. Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
  8. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  9. Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
  10. Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
  11. Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).
  12. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
  13. Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
  14. Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
  15. Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
  16. Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
  17. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  18. Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
  19. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
  20. Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
  21. Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16(2018).
  22. Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
  23. Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
  24. Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).
  25. Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
  26. Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
  27. Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
  28. Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
  29. Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
  30. Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DeviceHigh Throughput CultureDynamic Environmental ConditionsNeural Stem CellsPeristaltic PumpsSequential Signal InputsCell DifferentiationPDMS MicrofabricationInverted MicroscopyCell Microenvironment

Related Articles