Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.
Artykuł metodologiczny
Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
jest nieocenionym narzędziem do odkrywania procesu rozwoju embrionalnego u różnych zwierząt. W ciągu ostatnich dziesięcioleci Caenorhabditis elegans stał się jednym z najlepszych modeli badania rozwoju. Z optycznego punktu widzenia jego rozmiar i przezroczysty korpus sprawiają, że nicień ten jest idealnym okazem do mikroskopii DIC (Differential Interference Contrast lub Nomarski). W artykule przedstawiono protokół hodowli nicieni C. elegans, przygotowania i montażu ich zarodków, wykonania mikroskopii 4D i śledzenia linii komórkowych. Metoda opiera się na wieloogniskowych zapisach poklatkowych zdjęć Nomarskiego i analizie za pomocą specjalnego oprogramowania. Technika ta ujawnia dynamikę rozwoju embrionalnego na poziomie komórkowym. Każdy defekt embrionalny u mutantów, taki jak problemy z orientacją wrzeciona, migracją komórek, apoptozą lub specyfikacją losu komórki, może być skutecznie wykryty i oceniony. Praktycznie każda pojedyncza komórka zarodka może być obserwowana aż do momentu, gdy zarodek zaczyna się poruszać. Prześledzenie pełnej linii komórkowej zarodka C. elegans za pomocą mikroskopii 4D DIC jest pracochłonne, ale użycie specjalnego oprogramowania znacznie ułatwia to zadanie. Ponadto technika ta jest łatwa do wdrożenia w laboratorium. Mikroskopia 4D jest wszechstronnym narzędziem i otwiera możliwość wykonania niezrównanej analizy rozwoju embrionalnego.
Wprowadzenie
Mikroskopia 4D to wieloogniskowy system rejestracji poklatkowej, który pozwala badaczom rejestrować i określać ilościowo dynamikę komórki próbki biologicznej zarówno przestrzennie, jak i w czasie. Hodowle komórkowe, drożdże lub żywe tkanki mogą być poddawane analizie 4D, ale ta technika jest szczególnie przydatna do analizy rozwoju żywych zarodków. Rozdzielczość tej analizy osiąga poziom każdej pojedynczej komórki zarodka. Każdy podział komórki może być wykryty, a ruchy komórek można śledzić w czasie. Losy komórek są oceniane w zależności od położenia i kształtu, jaki przybierają komórki. Zastosowanie optyki Nomarskiego zwiększa kontrast niebarwionych przezroczystych próbek za pomocą ortogonalnie spolaryzowanych wiązek światła, które interferują w płaszczyźnie ogniskowej. Powstałe obrazy wydają się trójwymiarowe, oświetlone z jednej strony.
Inne metody oparte na wykorzystaniu mikroskopii konfokalnej i transgenicznych zwierząt GFP do automatycznego wykrywania jąder i generowania linii komórkowych zostały opracowane1,2. Zaleta tych systemów jest oczywista: oprogramowanie znacznie przewyższa potrzebę ręcznego oznaczania każdego jądra przez pewien czas (chociaż w późniejszych fazach wymagany jest pewien ręczny nadzór). Jednak procesy komórkowe obejmujące zmiany kształtu komórki lub dynamiki błony, takie jak te zachodzące podczas różnicowania komórek, migracji, apoptozy lub pochłaniania zwłok, pozostają ukryte jako czarne tło na znakowanych fluorescencyjnie obrazach jąder.
Dla kontrastu, mikroskopia 4D Nomarskiego (zwana również mikroskopią DIC, mikroskopią kontrastową z różnicowymi zakłóceniami) pokazuje zarówno zmiany w kształcie jąder, jak i komórek, które zachodzą podczas rozwoju dzikich lub zmutowanych zwierząt. Pozwala to na śledzenie linii komórkowej przy użyciu standardowych mikroskopów, wykorzystujących wyłącznie światło przechodzące. Nie ma ogólnej potrzeby wykorzystywania zwierząt transgenicznych, z wyjątkiem pokazania określonych wzorców ekspresji, w którym to przypadku skany fluorescencyjne mogą być interkalowane. Dlatego może to być optymalne podejście dla wielu laboratoriów pracujących nad dynamicznymi procesami komórkowymi, takimi jak embriogeneza lub apoptoza, które można wyróżnić w mikroskopii DIC3,4,5,6,7.
Dostępnych jest kilka elastycznych i przyjaznych dla użytkownika programów do przechwytywania mikroskopijnych obrazów i rekonstrukcji linii komórkowych, modeli 3D, ścieżek migracji komórek itp. w nagranej próbce. W standardowym eksperymencie obrazy są pozyskiwane w serii płaszczyzn ogniskowych, w stałej odległości, której liczba zależy od grubości próbki. Rozdzielczość czasową analizy można zoptymalizować poprzez zwiększenie częstotliwości skanowania. Nie ma praktycznie żadnych ograniczeń co do czasu trwania nagrania poza pojemnością pamięci komputera. Na przykład, w przypadku analizy rozwoju zarodka C. elegans, rutynowo pozyskujemy obrazy na 30 płaszczyznach ogniskowych (co 1 mikron każda), co 30 sekund przez 12 godzin.
Te systemy zostały zastosowane do analizy kilku zarodków zwierzęcych, takich jak Caenorhabditis elegans8,9,10, Drosophila melanogaster11, inne zarodki nicieni12,13, niesporczaki14,15 a nawet wczesne embriony myszy16. Jedynym wymogiem jest posiadanie przezroczystego zarodka, który może rozwinąć się na preparat szkiełkowy pod mikroskopem.
Podsumowując, mikroskopia 4D oparta na DIC jest szczególnie przydatna do 1) analizy rozwoju embrionalnego małych, przezroczystych zwierząt: śledzenia linii komórkowej, ścieżek migracji komórek, generowania modeli 3D, itp.; 2) definiowanie wzorców ekspresji genów; 3) badanie dynamiki kultur komórkowych, od drożdży do komórek ludzkich; 4) analiza dynamiki tkanek lub fragmentów zarodków; 5) ilościowe określanie kinetyki śmierci komórki i pochłaniania zwłok; oraz 6) przeprowadzanie porównawczej analizy filogenezy w oparciu o cechy rozwojowe zarodka. Jeśli istnieje zainteresowanie którymkolwiek z tych tematów (lub podobnych), można skorzystać z mikroskopii 4D.
Protokół
1. Uprawiaj C. elegans na szalkach Petriego
- Przygotuj płytki NGM i zasiej je E. coli OP50 jako źródłem pożywienia (Rysunek 1). Uprawiaj i utrzymuj C. elegans zgodnie z opisem17. Talerze z nasionami należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
- Dostosuj płytki do żądanej temperatury przed dodaniem robaków.
- Aby przenieść robaki, usuń kawałek agaru ze starego talerza i umieść go na świeżym talerzu.
- Alternatywnie, złap pojedyncze zwierzęta za pomocą sterylnego zbieracza robaków (1-calowy kawałek platynowego drutu o grubości 32 ze spłaszczoną końcówką, zamontowany na końcówce pipety Pasteura) i umieść je na nowej płytce.
- Wyhoduj robaki w żądanej temperaturze.
- Hoduj robaki C. elegans w temperaturze 20 °C, standardowej. Jednakże, aby przeanalizować rozwój mutantów termowrażliwych, należy przeprowadzić inkubację przez noc, zwykle w temperaturze 25 °C. W razie potrzeby należy dostosować czas trwania i temperaturę tej inkubacji, w zależności od konkretnego mutanta.
2. Przygotuj zapis mikroskopii 4D przed zamontowaniem zarodków (Rysunek 2)
- Ustaw mikroskop i kontrolę temperatury przed przygotowaniem zarodka. Zarodki C. elegans dzielą się bardzo szybko. Należy być przygotowanym na rozpoczęcie nagrywania natychmiast po zamontowaniu zarodków.
- Ustaw temperaturę nagrywania na 15 °C, 20 °C lub 25 °C.
- Rutynowo rejestrować zarodki w temperaturze 25 °C. Rejestrować termoczułe mutanty w restrykcyjnej temperaturze, aby pokazać ich fenotypy. Zapisać kontrolę WT (jeśli została wykonana w innym preparacie) w tej samej temperaturze co mutanty.
UWAGA: Zarodki WT rozwijają się szybciej w temperaturze 25 °C i wolniej w temperaturze 15 °C bez dodatkowych różnic w linii komórkowej. Umieść mikroskopy w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze. Dodatkowa kontrola poprzez chłodzenie lub podgrzewanie zjeżdżalni jest wysoce pożądana. Można to osiągnąć poprzez cyrkulację wody o określonej temperaturze przez metalowy pierścień wokół obiektywu mikroskopu i kondensatora. Obiektyw i preparat mają bezpośredni kontakt z olejkiem immersyjnym, a przenoszenie temperatury jest wydajne. System ten pozwala na precyzyjną kontrolę temperatury zapisu oraz na dokonywanie zmian temperatury w trakcie rozwoju zarodka.
- Rutynowo rejestrować zarodki w temperaturze 25 °C. Rejestrować termoczułe mutanty w restrykcyjnej temperaturze, aby pokazać ich fenotypy. Zapisać kontrolę WT (jeśli została wykonana w innym preparacie) w tej samej temperaturze co mutanty.
- Zdefiniuj parametry zapisu w oprogramowaniu do mikroskopii.
- Aby uzyskać standardowe nagranie C. elegans (bez skanów fluorescencyjnych), wybierz:
Stosy Z po 30 płaszczyzn ogniskowych, w odległości 1 mikrona każdy.
30-sekundowe odstępy między początkiem każdego stosu z.
1500 stosów Z (12,5 godziny nagrywania).
UWAGA: Do zdefiniowania tego przepływu pracy dla przechwytywania obrazów można użyć zarówno komercyjnych, jak i otwartych programów sterujących mikroskopem. Teraz mikroskop jest gotowy do nagrywania.
- Aby uzyskać standardowe nagranie C. elegans (bez skanów fluorescencyjnych), wybierz:
3. Przygotuj i zamontuj zarodki
- Przygotuj cienką, jednorodną podkładkę agarową jako pierwszy krok do uzyskania ładnego obrazu (Rysunek 3).
- Przygotuj 50 ml 4,5% roztworu agaru w wodzie dejonizowanej. Podgrzej do wrzenia w kuchence mikrofalowej i wlej 0,5 – 1 ml do szklanych probówek o pojemności 3 ml.
- Ostrożnie uszczelnij probówki folią woskową, aby uniknąć wysuszenia. Szczelnie zamknięte probówki agarowe można przechowywać w temperaturze pokojowej do dwóch miesięcy.
- Na stole laboratoryjnym umieść blok grzewczy o temperaturze 80 °C z:
probówka z czystej wazeliny (stopionej), z drobnym pędzlem w środku.
probówka z wodą destylowaną zawierająca pipetę Pasteura.
UWAGA: Gwarantuje to, że wszystkie wymagane materiały będą gorące, a agar nie zestale się w procesie wytwarzania podkładki. - Usuń film woskowy z górnej części jednej z probówek agarowych i ostrożnie podgrzej go nad palnikiem alkoholowym, aby stopić agar. Zachowaj ostrożność, ponieważ gorący agar wyrzucony ze szklanej rurki może spowodować oparzenia.
- Gdy agar się rozpuści, umieść probówkę w bloku grzewczym, aby utrzymać agar w postaci płynnej.
- Alternatywnie, umieść probówki agarowe w bloku grzewczym na 1 godzinę przed eksperymentem, aby je stopić bez użycia palnika. Stopiony agar należy wyrzucić po jednym dniu.
- Umieść szkiełko mikroskopowe (szkiełko A) między dwoma innymi na kawałku plastiku.
- Weź kolejny slajd (slajd B) i przytrzymaj go palcami w jednej ręce.
- Drugą ręką umieść małą kroplę stopionego agaru na środku szkiełka A za pomocą ciepłej pipety Pasteura.
- Natychmiast dociśnij szkiełko B do kropli agaru, aby utworzyć bardzo cienką podkładkę między szkiełkami A i B. Trzymaj te szkiełka ułożone razem do kroku 3.2.3.
- Zamontuj zarodki.
- Zbierz 5-10 grawitacyjnych hermafrodytów za pomocą pickera i umieść je w szklance zegarmistrzowskiej wypełnionej wodą.
- Za pomocą skalpela rozciąć nicienie hermafrodytyczne i wyekstrahować wczesne jaja (1-4 komórki) z macicy pod mikroskopem stereoskopowym.
- Weź szkiełko z kroku 3.1.10 i delikatnie zsuń szkiełko B, aby odsłonić podkładkę agarową na szkiełku A.
- Umieść wczesne jajko na środku wacika agarowego, pipetując za pomocą rurki kapilarnej.
- Alternatywnie, należy odpipetować kroplę zawierającą zestaw zarodków na podkładkę agarową, a następnie poszukać zarodków we wczesnym stadium. Wykonaj ten krok pod mikroskopem stereoskopowym.
- W razie potrzeby przesuń jajko, trącając je rzęsą przyklejoną do końca wykałaczki.
- Usuń nadmiar wody za pomocą pipety kapilarnej.
UWAGA: Pipetę kapilarną można łatwo przygotować, podgrzewając pipetę Pasteura nad palnikiem alkoholowym i ciągnąc ją z obu końców. - Ostrożnie przykryj preparat szkiełkiem nakrywkowym. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i delikatnie przesuń skalpel wzdłuż sąsiedniej krawędzi, aby powoli i ukośnie ułożyć szkiełko nakrywkowe na preparacie.
- Za pomocą pipety wypełnij wodą 3/4 przestrzeni otaczającej podkładkę agarową. Pozostaw 1/4 przestrzeni z powietrzem.
- Uszczelnić szkiełko nakrywkowe wazeliną, aby uniknąć wysuszenia podczas długich okresów nagrywania.
- Za pomocą cienkiego pędzla rozciągnij cienką warstwę stopionej wazeliny wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego.
UWAGA: Teraz przygotowanie jest gotowe do nagrywania.
4. Dostosuj DIC i rozpocznij zapis mikroskopowy 4D
- Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Ustaw ostrość zarodka za pomocą obiektywu o małym powiększeniu (5x lub 10x).
- Zmień obiektyw na 100-krotne zanurzenie.
- Wyreguluj elementy optyczne mikroskopu, aby uzyskać obraz Nomarskiego.
- Ustaw ostrość skraplacza.
- Całkowicie otwórz aperturę kondensatora i zamknij przysłonę polową (zapewni to wyższą aperturę numeryczną, a tym samym większą rozdzielczość).
- Sprawdź, czy oba polaryzatory w mikroskopie są zorientowane tak, aby spowodować maksymalne wygaszenie światła.
- Obróć pryzmat Wollaston, aby uzyskać ładny trójwymiarowy obraz zarodka, oświetlony z jednej strony. Obróć pryzmat w drugą stronę, aby uzyskać efekt oświetlenia zarodka po drugiej stronie.
UWAGA: Czynności te można wykonać na próbce testowej przed zapisem, tak aby wymagane było tylko precyzyjne dostrojenie analizowanej próbki.
- Uruchom przechwytywanie obrazu w mikroskopie.
5. Przeanalizuj film 4D (Rysunek 4).
UWAGA: Po zakończeniu zapisu, użyj oprogramowania do śledzenia linii komórek, aby zrekonstruować i przeanalizować linię komórkową.
Oprogramowanie do śledzenia linii komórkowych jest potężnym narzędziem do przeprowadzania szczegółowych analiz rozwoju embrionalnego lub dynamiki w kulturach komórkowych lub fragmentach tkanek. Program wyodrębnia i określa ilościowo kilka zestawów danych dotyczących dynamiki komórkowej próbki, które obejmują generowanie pełnej linii komórkowej każdej zarejestrowanej komórki, w tym podziały komórkowe, długość cyklu komórkowego, migrację lub apoptozę, a także jej kinetykę. Ponadto różnicowanie komórek można ocenić na podstawie zmian morfologicznych komórki lub ekspresji określonych markerów. Zasadniczo ekran oprogramowania wyświetla dwa okna: w lewym oknie film 4D może być odtwarzany do przodu i do tyłu lub w górę i w dół do górnego lub dolnego poziomu, dzięki czemu każdą komórkę można śledzić w czasie i przestrzeni przez całe nagranie. Na prawej wdowie generowana jest linia komórkowa. Kliknięcie jądra komórkowego w filmie 4D generuje punkt w oknie pochodzenia, w którym przechowywane są informacje o nazwie komórki, losie i współrzędnych przestrzennych. Linia komórkowa określonej komórki jest generowana przez odtwarzanie filmu 4D do przodu i okresowe klikanie jądra, aby zaznaczyć mitozę tej konkretnej komórki w czasie. Powtórzenie tego procesu dla każdej z zarejestrowanych komórek generuje pełną linię komórkową zarodka lub próbki. Przechowywane informacje o współrzędnych przestrzennych każdej komórki są później wykorzystywane do rekonstrukcji modeli 3D zarodków i ścieżek migracji komórek.
- Otwórz oprogramowanie do śledzenia pochodzenia i utwórz nowy projekt, przechodząc do menu górnego paska i wybierając:
Plik | Nowy projekt. - Wybierz szablon pochodzenia komórki w zależności od temperatury nagrywania: DB08 do nagrywania w temperaturze 25 °C, DB10 do nagrywania w temperaturze 20 °C i DB12 do nagrywania w temperaturze 15 °C.
- Ustaw parametry nagrywania w pojawiającym się oknie: liczbę skanów (zwykle 1500), czas między skanami (30 sekund), liczbę poziomów (30) i odległość między poziomami (1 mikron).
- Wybierz plik obrazu i format.
- Wybierz katalog obrazów, w którym obrazy zostały zapisane.
- Wybierz, czy obrazy mają być zapisywane jako pojedyncze obrazy (jeden obraz na poziom i czas), czy jako stosy z wieloma obrazami.
- Określ nazewnictwo plików i format obrazu. Zazwyczaj pojedyncze obrazy są zapisywane pod następującymi nazwami:
X0000L00C1 (dla skanowania 0, poziom 0, kanał 1)
X0000L01C1 (dla skanowania 0, poziom 1, kanał 1)
X0000L02C1 (dla skanowania 0, poziom 2, kanał 1)
...
X0001L00C1 (dla skanowania 1, poziom 0, kanał 1)
X0001L01C1 (dla skanowania 1, poziom 1, kanał 1)
...
X0300L04C1 (dla Scan 300, poziom 4, kanał 1)
...
UWAGA: Zapisanie obrazów w formacie skompresowanym pozwala zaoszczędzić miejsce na dysku twardym.
- Zdefiniuj kanały świetlne: 1 dla optyki DIC, 2 dla GFP, 3 dla RFP itd. Dodaj te, które zostały użyte w nagraniu 4D. Kliknij "przetwarzanie kanałów włączone", aby je wykryć.
- Zacznij śledzić linię komórkową zarodka. Ekran zawiera teraz dwa główne okna: okno wideo i okno pochodzenia komórki.
- W oknie pochodzenia wybierz gałąź pochodzenia i użyj myszy, aby kliknąć jądro komórki odpowiadające tej komórce w oknie wideo.
- Podążaj za komórką przestrzennie i w czasie, odtwarzając film 4D do przodu, do tyłu lub w górę lub w dół o jeden poziom, używając kursora.
- Okresowo klikaj jądro komórkowe. Spowoduje to wygenerowanie punktu w gałęzi linii i zarejestrowanie współrzędnych przestrzennych komórki w tym momencie. W rezultacie linia komórkowa postępuje i możliwe są rekonstrukcje 3D zarodka.
- Zaznacz mitozę, klikając powrotu. Następnie wybierz jedną z komórek potomnych i postępuj zgodnie z nią jak poprzednio.
- Powtórzyć proces (kroki 5.6.1 do 5.6.4) dla pozostałych komórek embrionalnych, aby prześledzić całą linię komórkową lub podążać za określonymi komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania, takimi jak te przechodzące apoptozę.
- Porównaj linię mutacji ze stereotypową linią komórkową WT C. elegans.
Wyniki
Aby scharakteryzować rozwój embrionalny mutanta C. elegans z mutacją w genie gsr-1, który koduje enzym reduktazę glutationową, niezbędną do regeneracji zredukowanego glutationu (GSH) i uczestniczącą w utrzymywaniu homeostazy redox u nicieni, przeprowadziliśmy mikroskopię 4D mutanta z delecją gsr-1 (tm3574), będącej allelem utraty funkcji powodującym fenotyp wczesnego zatrzymania rozwoju embrionalnego18. Zarówno WT, jak i zbilansowane mutanty gsr-1 (tm3574) nicieni C. elegans były hodowane na płytkach NGM z wysiewem E. coli OP50 jako źródłem pożywienia17. Robaki gsr-1 (tm3574) hodowano w formie heterozygotycznej w temperaturze 20 °C przez dwa pokolenia, a następnie segregowane robaki homozygotyczne (które są w stanie rozwinąć się do wieku dorosłego dzięki zapasom matczynym) przeniesiono do temperatury 25 °C na inkubację przez noc przed analizą embrionów. Płytki z robakami inkubowano w kartonowych pudełkach, aby uniknąć kondensacji (Rysunek 1). Ciążne nicienie przecięto w celu wyekstrahowania młodych embrionów.
Aby porównać rozwój zarodkowy mutanta z typowym WT w identycznych warunkach, zarodek WT (jako kontrolę) oraz zarodek gsr-1 (tm3574) umieszczono obok siebie na tym samym preparacie. Procedurę mikroskopii 4D przeprowadzono na standardowym zmotoryzowanym mikroskopie odwróconym wyposażonym w optykę DIC. Wybrane parametry rejestracji w programie sterującym mikroskopem obejmowały: serie obrazów z-stack składające się z 30 płaszczyzn ogniskowych w odstępach 1 micron każda, 30-sekundowe odstępy między początkami kolejnych serii z-stack oraz 1500 serii z-stack (12,5 godziny rejestracji). Temperaturę podczas rejestracji ustawiono na 25 °C (zarówno w pomieszczeniu, jak i na stoliku mikroskopu) (Rysunek 2).
Po zakończeniu rejestracji otwarto plik z obrazami, a następnie zrekonstruowano linie komórkowe przy użyciu oprogramowania do śledzenia linii komórkowych, klikając w jądra komórkowe widoczne w oknie wideo (Rycina 4). Prześledzoną linię komórkową embrionów mutantów gsr-1 (tm3574) porównano z linią komórkową WT C. elegans przedstawioną w tle. Głównym wynikiem było wykrycie postępującego opóźnienia cyklu komórkowego podczas rozwoju embrionalnego. W konsekwencji embriony mutantów zatrzymały się na etapach pośrednich, podczas gdy embriony WT rozwijały się i ostatecznie wykluwały jako larwy.
Przygotowanie i bezpośrednia obserwacja embrionów pod mikroskopem lub immunobarwienie przeciwciałami przeciwko późnym markerom embrionalnym mogłyby wykazać obecność wysokiego odsetka młodych embrionów u mutantów w porównaniu do WT. Wówczas za najbardziej prawdopodobne wyjaśnienie można by uznać zatrzymanie rozwoju embrionów. Jednakże bezpośredni dowód i dokładna kwantyfikacja opóźnienia cyklu komórkowego mogą zostać w sposób elegancki i prosty wykazane i zmierzone jedynie za pomocą eksperymentu z mikroskopii 4D. Inne ważne cechy rozwoju embrionalnego, takie jak różnicowanie komórek lub apoptoza (Rysunek 5), mogą być również wizualizowane w sposób dynamiczny przy użyciu mikroskopii 4D, która umożliwia szczegółową analizę wielu aspektów rozwoju w ramach jednego eksperymentu.
Rycina 1: Nicienie C. elegans hodowane w warunkach laboratoryjnych. Nicienie są hodowane na płytkach NGM zaszczepionych E. coli, przechowywanych w kartonowych pudełkach i inkubowanych w temperaturze 15 °C, 20 °C lub 25 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Zrzut ekranu oprogramowania do rejestracji mikroskopii 4D. Przykład dwóch różnych programów do sterowania mikroskopem (A i B). Programy te tworzą przepływy pracy służące do sterowania mikroskopem i przechwytywaniem obrazów podczas rejestracji mikroskopii 4D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Seria zdjęć przedstawiająca przygotowanie podłoża agarowego oraz montaż embrionu C. elegans. A. Przygotowane probówki z agarem. B-C. Przygotowanie podłoża agarowego. D. Przedmiot szkiełko częściowo wypełniony wodą. E. Uszczelnianie przedmiotu szkiełka wazeliną. F. Finalne przygotowanie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Kolejne zrzuty ekranu z oprogramowania do śledzenia linii komórkowych. Program umożliwia rekonstrukcję embrionalnej linii komórkowej mutanta z opóźnieniem cyklu komórkowego (po lewej) oraz zarodka C. elegans typu WT (po prawej). A. Wczesny etap rozwoju. B-C. Rozwój obu zarodków postępuje w czasie. D. Zarodek WT rozwija się prawidłowo i rozpoczyna elongację, podczas gdy mutant ulega zatrzymaniu rozwoju. W każdym przypadku program wyświetla okno wideo oraz okno linii komórkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Soczewkowaty, refrakcyjny kształt komórek apoptotycznych w embrionie WT C. elegans. Los komórki, zdefiniowany przez cechy morfologiczne, można ocenić za pomocą mikroskopii 4D. Obraz przedstawia embrion C. elegans w stadium fasoli. Żywe komórki wykazują gładkie jądra otoczone ziarnistą cytoplazmą. W przeciwieństwie do nich, komórki apoptotyczne (żółte strzałki) kondensują i przyjmują soczewkowaty, refrakcyjny kształt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Jednym z głównych wyzwań współczesnej biologii jest zrozumienie rozwoju organizmów wielokomórkowych. C. elegans okazał się jednym z najlepiej nadających się modeli do badania precyzyjnej koordynacji między proliferacją komórek a różnicowaniem komórek w rozwijającym się zarodku. Z optycznego punktu widzenia jego przezroczysty korpus i niewielkie rozmiary sprawiają, że nicień ten jest idealnym okazem do mikroskopii DIC. Inne organizmy o podobnych cechach również zostały poddane analizie mikroskopowej 4D 11,12,13,14,15,16.
W przypadku tych badań rozwojowych inaktywacja genów przez genetykę do przodu lub do tyłu dostarcza wskazówek co do ich udziału w embriogenezie. Po udowodnieniu, że gen odgrywa rolę w rozwoju, następnym krokiem jest określenie jego dokładnej roli w ustaleniu prawidłowego planu ciała. Barwienie immunologiczne jest wybranym podejściem dla większości modeli. Technika ta wyjaśnia problemy związane z różnicowaniem komórek lub ekspresją określonych markerów. Jednak głównym ograniczeniem tego podejścia jest to, że zapewnia ono tylko statyczny widok wyrażenia jednego lub więcej markerów w ustalonym punkcie rozwoju. Dynamiczny obraz tych markerów w trakcie rozwoju można uzyskać tylko poprzez barwienie różnych zarodków w różnych punktach czasowych. Ponadto rekonstrukcja linii komórkowej nie jest możliwa w tak utrwalonych próbkach.
Mikroskopia 4D jest uzupełniającym podejściem do badania rozwoju embrionalnego. Ta technika ujawnia dynamikę rozwoju w rozdzielczości na poziomie komórki. Każda wada zarodka, taka jak problemy z orientacją wrzeciona, migracją komórek, apoptozą, specyfikacją losu komórki itp., pojawi się w filmie 4D, który może być wizualizowany do przodu i do tyłu, określany ilościowo i oceniany przez badacza. Dzięki tej technice praktycznie każda komórka w zarodku może być obserwowana aż do momentu, w którym zarodek zaczyna się poruszać. Zarodki poddane mikroskopii 4D tylko w świetle widzialnym i optyce Nomarskiego nie ulegają fotouszkodzeniom. Skany fluorescencyjne mogą być również interkalowane w nagraniu w celu wykrycia, kiedy i gdzie gen ulega ekspresji. Zarodki, które doznają znacznych fotouszkodzeń, są identyfikowane na podstawie wydłużenia cyklu komórkowego, które powoduje silne promieniowanie UV w porównaniu ze standardowym zarodkiem linii WT. W takim przypadku fotouszkodzenia można zmniejszyć, zmniejszając intensywność lampy UV i zwiększając czułość aparatu lub czas ekspozycji. Cechy morfologiczne i markery molekularne mogą pomóc w wyjaśnieniu rozwoju embrionalnego każdego mutanta.
Konfiguracja systemu mikroskopii 4D jest łatwa do wdrożenia w laboratorium i, po pewnym nabraniu wprawy, umożliwia niezrównaną analizę dynamiki komórek i śledzenie linii kultur komórkowych i żywych przezroczystych próbek na poziomie rozdzielczości każdej komórki w polu mikroskopowym. Śledzenie linii komórkowej na obrazach DIC jest nadal przetwarzane ręcznie. Jest to czasochłonne i chociaż oprogramowanie wykrywa błędy pochodzenia, takie jak różne gałęzie pochodzenia oznaczające tę samą komórkę, możliwe są błędy. Podczas gdy automatyczne wykrywanie komórek znakowanych GFP jest dobrze rozwinięte2, uzupełniające oprogramowanie do śledzenia linii oparte na nieoznaczonych komórkach i obrazach w świetle widzialnym jest wciąż na wczesnym etapie i nie jest zbyt przydatne w pełnej analizie zarodków. Bez wątpienia zastosowanie systemów rozpoznawania obrazu w dziedzinie mikroskopii światła widzialnego przyniesie ogromny postęp w tej dziedzinie.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Fundacji Rioja Salud (Fondos FEDER) oraz hiszpańskiego Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda jest finansowana ze stypendium AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans szczep. Można zamówić w GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) Zmutowany szczep C. elegans. Można zamówić w GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Oprogramowanie do śledzenia linii komórkowych | SIMI | Simi BioCell | Jest to oprogramowanie do rekonstrukcji linii komórek zarodka. Aby uzyskać szczegółowe wyjaśnienie, sprawdź pod adresem: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
| Kamera mikroskopowa | Hamamatsu | Orca-R2 | Kamera miskroskopowa zarówno do światła przechodzącego, jak i UV |
| Oprogramowanie sterujące mikroskopem | Caenotec | Czas życia | To oprogramowanie steruje mikroskopem w celu wykonania przechwytywania obrazu 4D. Można zamówić na stronie: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Bö rß um, Niemcy, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
| Oprogramowanie sterujące mikroskopem | Mikromenedżer | Micro-manager To | oprogramowanie steruje mikroskopem w celu wykonania przechwytywania obrazu 4D. Można pobrać ze strony: https://micro-manager.org/ |
| Zmotoryzowany mikroskop | Leica | Leica DM6000 | Zmotoryzowany mikroskop pionowy do wykonywania mikroskopii 4D |
| Standardowe wyposażenie w laboratorium biologii molekularnej. | |||
| Stereomikroskop | Leica | MZ16FA | Steromikroskop do manipulowania nicieniami i przygotowywania zarodków. |
Bibliografia
- Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).
- Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).
- Nieto, C., et al. ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans. Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).
- Cabello, J., et al. PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans. Cell Death & Disease. 5, 1120(2014).
- Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 11 (2), 0149274(2016).
- Sáenz-Narciso, B., Gómez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated. Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).
- Zheleva, A. Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development. PLOS Genetics. 15 (9), 1008338(2019).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. Journal of Visualized Experiments. (49), e2625(2011).
- Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (54), e2852(2011).
- Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila. Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).
- Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata). Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).
- Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina. Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).
- Hejnol, A., Schnabel, R. The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations. Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).
- Hejnol, A., Schnabel, R. What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development. Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).
- Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions. Development. 135 (5), 953-962 (2008).
- WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2020).
- Mora-Lorca, J. A. Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development. Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).
Przedruki i uprawnienia
