Mechaniczna separacja i solubilizacja białek zewnętrznych i wewnętrznych podwarstw perywiteliny z jaj kurzych

Summary

Ten artykuł opisuje prostą metodę izolowania zewnętrznych i wewnętrznych podwarstw perywitelinowych jaj kurzych przy jednoczesnej minimalizacji zmian strukturalnych i optymalizacji solubilizacji białek w każdej podwarstwie do analiz proteomicznych.

Abstract

Warstwa perywiteliny, która otacza żółtko jaja, odgrywa fundamentalną rolę w zapłodnieniu, obronie jaja i rozwoju ptasiego zarodka. Tworzą go dwie podwarstwy białkowe, które są ściśle ze sobą powiązane i tworzą je odrębne żeńskie narządy rozrodcze. Zakłada się, że obie struktury mają swoją własną specyfikę funkcjonalną, która pozostaje do zdefiniowania. Aby scharakteryzować funkcję białek tworzących każdą podwarstwę, pierwszym wyzwaniem jest ustalenie warunków, które pozwoliłyby na mechaniczne oddzielenie tych dwóch skomplikowanych warstw, przy jednoczesnym ograniczeniu wszelkich uszkodzeń strukturalnych. Drugim krokiem jest optymalizacja warunków eksperymentalnych w celu ułatwienia solubilizacji białek z tych dwóch podwarstw do późniejszych analiz biochemicznych. Skuteczność tego podejścia ocenia się, analizując profil białkowy każdej podwarstwy za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE), która powinna być odrębna między tymi dwiema strukturami. Ta dwuetapowa procedura pozostaje prosta; wymaga klasycznego sprzętu biochemicznego i odczynników; i jest kompatybilny z dalszymi szczegółowymi badaniami proteomicznymi. Można go również przetransponować do innych jaj ptaków do celów biologii porównawczej, wiedząc, że wykazano, iż struktura i skład warstwy perywitelinowej mają cechy specyficzne dla gatunku. Ponadto niedenaturacyjne warunki opracowane dla separacji podwarstw (etap 1) umożliwiają ich analizę strukturalną za pomocą skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Może również stanowić pierwszy etap do późniejszego oczyszczania białek w celu analizy ich odpowiedniej aktywności biologicznej i struktury 3D lub przeprowadzenia dalszych analiz immunohistochemicznych lub funkcjonalnych. Takie badania pomogłyby rozszyfrować fizjologiczną funkcję tych dwóch podwarstw, których integralność strukturalna i funkcjonalna jest decydującym kryterium sukcesu reprodukcyjnego.

Introduction

Celem tej metody jest dostarczenie protokołu, który pozwala na późniejszą biochemiczną charakterystykę warstwy perivitelinowej (PL), cienkiej warstwy białkowej otaczającej żółtko jaja i odgrywającej fundamentalną rolę w rozmnażaniu gatunków ptaków. PL, nazywana również w literaturze "błoną witelinową", jest trójwymiarową siecią grubych włókien składającą się z kilku rodzajów glikoprotein. Składa się z wewnętrznej warstwy perywiteliny (IPL) (w kontakcie z żółtkiem), która jest montowana w jajniku, oraz z zewnętrznej warstwy perywiteliny (OPL, w kontakcie z bielą), leżącej na IPL (Rysunek 1) i wytwarzanej przez lejek. Ta ostatnia tkanka jest lejkowatym górnym segmentem jajowodu, który otrzymuje dojrzały pęcherzyk żółtkowy po owulacji oraz miejscem, w którym następuje zapłodnienie. Wydzielanie OPL następuje po tych dwóch zdarzeniach, a po nim następuje kolejne odkładanie się białka jaja i skorupki jaja w innych określonych segmentach jajowodu. Fizjologiczne funkcje PL są związane nie tylko z zapłodnieniem i wczesnymi etapami embriogenezy, ale także z fizyczną i molekularną ochroną zarodka. Analiza proteomiczna jaj kurzych przeprowadzona na całym PL ujawniła obecność 137 różnych białek¹, ale dystrybucja większości tych białek między IPL i OPL pozostaje do wyjaśnienia. Minimalna ilość danych dostępnych w literaturze wskazuje, że IPL i OPL wykazują bardzo różne profile białek^2,3,4, co sugeruje różne właściwości strukturalne i funkcjonalne. Względny niedobór danych na temat rozmieszczenia białek między OPL i IPL jest prawdopodobnie spowodowany trudnością w oddzieleniu obu podwarstw, które są cienkie i osadzone.

Przedstawiona tutaj metoda opisuje warunki, które należy zastosować do rozdzielenia dwóch podwarstw z ograniczonym wpływem na ich strukturę histologiczną, przy jednoczesnym zachowaniu zawartości białka, oraz do dostarczenia protokołu pozwalającego na całkowitą rozpuszczalność białek do późniejszej analizy przez proteomikę. Obejmuje dwa główne etapy: 1) pobieranie próbek PL i separację OPL/IPL oraz 2) obróbkę PL, OPL i IPL w celu solubilizacji białek i elektroforezy do analizy spektrometrii mas. Przepływ pracy jest przedstawiony w Rysunek 2. Warto zauważyć, że chociaż obecny protokół został zoptymalizowany pod kątem analiz proteomicznych (Krok 2.2), można go zatrzymać na niektórych etapach dla histologicznych (np. mikroskopia elektronowa), analiz immunohistochemicznych, badań funkcjonalnych (Krok 1) oraz dla oczyszczania białek rozpuszczalnych w soli w celu scharakteryzowania ich struktury i aktywności biologicznej (Krok 2.1) (Rysunek 2).

Pierwszym krokiem jest usunięcie całkowitego PL z żółtka jaja (Rysunek 2, krok 1.1). Wszystkie opublikowane metody rozpoczynają się od ręcznego oddzielenia białka od żółtka lub za pomocą separatora jaj. Następnie usuwa się pozostałe białko jaja kurzego i grubą gradówkę za pomocą kleszczy lub adsorpcji na bibule filtracyjnej⁵ (Rysunek 2A). Następnie, techniki wybrane do próbkowania PL są zmienne w zależności od opublikowanych artykułów. Niektóre prace zawierają kilka przemyć żółtko w wodzie dejonizowanej lub destylowanej^1,5,6, w 0,85 do 1% roztworze soli fizjologicznej^2,7,8, w roztworach buforowych, takich jak 0,15 M Kwas NaCl/N-[Tris(hydroksymetylo)metylo]-2-aminoetanosulfonowy, pH 7,4⁴ lub w 0,01N HCl (pH 2)³. Procedury te zastosowano do jaj kurczaków, kaczek, bażantów obrożnych, kuropatwy szarej, papug nimf, gołębi domowych lub ptaków bezgrzebieniowych^2,6,9. Usuwanie PL, podczas gdy żółtko jaja jest przechowywane na szalce Petriego bez roztworów wodnych, może być bardzo pracochłonne, ponieważ PL jest kruche, a żółtko jaja ma tendencję do przyklejania się do PL^1,5 i dlatego pozostaje trudne do późniejszego wyeliminowania. Stosowanie kwaśnego buforu lub roztworu przez godzinę w temperaturze 37 °C³ również nie jest preferowane, ponieważ takie warunki mogą zmienić strukturę PL i mogą spowodować utratę białka. Ważne jest również, aby usunąć obszar zawierający krążek rozrodczy, ponieważ strefa ta prawdopodobnie ma wyraźny wzór strukturalny i molekularny, który nie odzwierciedla całego PL^4,6,10 (Rysunek 2B). Metoda ta wykorzystuje pomysły podkreślone w niektórych opublikowanych artykułach i proponuje pewne ulepszenia w celu ułatwienia próbkowania PL przy jednoczesnym zachowaniu jego integralności (Rysunek 2C).

Drugi krok polega na rozdzieleniu dwóch podwarstw (Rysunek 2, krok 1.2). Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ OPL i IPL są ze sobą ściśle powiązane. Ten krok należy przeprowadzić ostrożnie za pomocą kleszczy pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym. Publikacje opisujące separację OPL/IPL są dość ograniczone^2,3,7,11, a niektóre z nich wykorzystują specyficzne warunki (kwaśny bufor w temperaturze 37 °C przez 1 h^2,3), które mogą wpływać na strukturę histologiczną podwarstw i/lub przyczyniać się do utraty białka lub zanieczyszczenia żółtka lub bieli. Aby lepiej odróżnić OPL od IPL, niektórzy autorzy poinformowali o użyciu błękitu toluidynowego do lekkiego zabarwienia OPL (wewnętrzna warstwa pozostaje bezbarwna)¹¹. W opracowanej metodzie zoptymalizowaliśmy warunki tak, aby separacja była łatwa do osiągnięcia i nie wymagała użycia żadnego barwnika (Rysunek 2D).

Drugim głównym krokiem jest solubilizacja białek tworzących każdą podwarstwę. Klasycznie osiąga się to poprzez zmieszanie czystego liofilizowanego ¹, dried^2,6, lub świeżo przygotowanego^3,4,11 PL/sublayers bezpośrednio z buforem Laemmli używanym do elektroforezy. Inni autorzy preferowali wstępną solubilizację warstw w 1% NaCl, w 1% roztworze buforującym SDS^2,3,11 lub w roztworze zawierającym inhibitory proteazy i SDS⁶ w temperaturze pokojowej lub Triton, a następnie inkubacja w temperaturze 45 °C¹², pod ciągłym energicznym mieszaniem. Niektórzy autorzy opisali również protokół, w którym PL inkubowano w buforze fosforanowym, soli fizjologicznej lub moczniku i poddawano sonikacji¹³. Po wszystkich tych zabiegach nastąpiło odwirowanie i rozcieńczenie w buforze Laemmli, a wszystkie mają tę wadę, że niepełną rozpuszczalność białek z warstw mają tę zaletę, że nierozpuszczalna substancja (osad otrzymany po odwirowaniu) jest odrzucana z próbki, która ma być poddana analizie.

Ponadto, stosowanie warunków denaturacji (mocznik, detergent, wysoka temperatura, itp.) przez niektórych autorów do solubilizacji białek nie jest zgodne z późniejszym oczyszczaniem białek w celu ich charakteryzacji, ponieważ mogą one nieodwracalnie dezaktywować białka, zakłócać ich aktywność biologiczną, a także pogarszać ich strukturę 3D. Dla tego konkretnego kroku 2 protokół zawiera pierwszy podkrok pozwalający na solubilizację najliczniejszych białek w warunkach niedenaturujących po mechanicznej destrukturyzacji PL/OPL/IPL, która nie będzie kolidować z dalszymi badaniami białek, jeśli zajdzie taka potrzeba (Rysunek 2, krok 2.1), oraz drugi podkrok, który pozwala na całkowitą rozpuszczalność białek do elektroforezy i dogłębnej proteomiki (Rysunek 2, krok 2.2). Łączy w sobie sugestie zaczerpnięte z różnych opublikowanych prac i korekty wynikające z nowych pomysłów potwierdzonych badaniami eksperymentalnymi.

Protocol

1. PL, IPL i OPL

1. Pobieranie próbek PL
   1. Świeżo zniesione, niezapłodnione jajo należy rozbić ręcznie i za pomocą separatora do jaj leżącego na szklanej zlewce, aby oddzielić żółtko od białka. Usuń gradówkę małymi nożyczkami i rozwałkuj żółtko na bibule filtracyjnej, aby usunąć przylegające białko, które wygląda jak przezroczysta i widoczna struktura (Rysunek 2A).
      UWAGA: Uważaj, aby nie przebić PL nożyczkami. Użycie pęsety zamiast nożyczek do usuwania gradówek może spowodować pęknięcie PL, a następnie wyciek żółtka. Etap zwijania bibuły filtracyjnej ma kluczowe znaczenie i powinien być wykonany bardzo szybko ze względu na właściwości absorpcyjne filtra bibułowego, które mogą spowodować pęknięcie PL. Bardzo ważne jest również, aby używać niezapłodnionej komórki jajowej od dnia zniesienia, aby zoptymalizować sukces tego pierwszego kroku i wszystkich kolejnych kroków. Alternatywnie można użyć jaj, które były przechowywane krócej niż 10 dni w chłodnym środowisku, ale eksperymentatorzy muszą wziąć pod uwagę potencjalne ryzyko zmian PL.
   2. Zanurzyć żółtko w krystalizatorze zawierającym 10 mM Tris-HCl pH 8, który został wcześniej schłodzony do 4 °C i usunąć obszar PL nad krążkiem kiełkowym w strefie 1 cm za pomocą nożyczek (Rysunek 2B).
      UWAGA: Początkowo PL był zanurzany w wodzie dejonizowanej, ale takie podejście ma pewne wady, takie jak brak kontroli pH i trudności z późniejszym oddzieleniem podwarstw (krok 1.2). W związku z tym przetestowano kilka warunków, w tym stężenie Tris (Rysunek 3A) i pH (Rysunek 3B). Stosowanie buforu o pH 8, zamiast wody dejonizowanej lub demineralizowanej, jest zgodne z fizjologią jaj (pH białka jaja wynosi około 7,8 w dniu zniesienia)¹⁴ i minimalizuje utratę białka. W przeciwieństwie do tego, podejrzewa się, że kwaśne lub bardzo zasadowe pH powoduje destrukturację PL i wczesną solubilizację białek (Rysunek 3B). Stwierdzono, że bufor złożony z 10 mM Tris-HCl pH 8 jest optymalny, ponieważ szanuje fizjologię jaj i nie powoduje znaczącej solubilizacji białek (stężenie białka w buforze roboczym pozostaje minimalne, Rysunek 3A,B).
   3. Rozerwij PL małymi nożyczkami w buforze. Przytrzymaj dwie krawędzie pękniętego PL kleszczami i oderwij PL od żółtka.
   4. Utrzymuj PL za pomocą kleszczy i przepłucz PL kilka razy w kilku kąpielach 10 mM Tris-HCl, pH 8, aż nie będzie widoczny ślad żółtka. Na tym etapie upewnij się, że PL jest czysta, biała i unosi się w buforze. Można go przetworzyć w kroku 1.2 w celu separacji podwarstw lub bezpośrednio w kroku 2.1 w przypadku analiz biochemicznych.
2. Próbkowanie OPL i IPL
   1. Rozłóż całą próbkę PL, umieszczając OPL w górę na plastikowej szalce Petriego i utrzymując ją płaską z jak najmniejszą liczbą zmarszczek. Przykryj próbkę 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. Użyj plastikowej szalki Petriego (a nie szkła), aby ograniczyć ruchy PL, ponieważ PL lepiej przylega do plastiku.
      1. Aby zlokalizować stronę OPL, spójrz na lokalizację pozostałych gradówek, które są przyczepione do OPL, a nie IPL. Ten etap wymaga małego stężenia NaCl (50 mM), aby ułatwić separację podwarstw.
         UWAGA: Na podstawie wykresu przedstawionego w Rysunek 3C i literature¹¹, stężenie to nie powinno prowadzić do znacznej utraty białka. Początkowo do oddzielenia podwarstw używano wody dejonizowanej, jak opisano wcześniej^1,5,6, ale technika ta okazała się bardzo pracochłonna i doprowadziła do zmiany integralności strukturalnej PL. W związku z tym przetestowano różne stężenia NaCl (Rysunek 3C), ponieważ sól ułatwiła oddzielenie dwóch podwarstw. Warto jednak zauważyć, że zastosowanie stężenia NaCl >100 mM zwiększa solubilizację/uwalnianie białka z PL, co nie jest tutaj celem (będzie to celem w kroku 2) (Rysunek 3C). Dodanie 50 mM NaCl do 10 mM buforu Tris-HCl pH 8 ułatwia oddzielenie dwóch podwarstw i minimalizuje utratę białka.
   2. Pokrój cały PL na kawałki o wymiarach około 2 cm x 3 cm małymi nożyczkami. Mechanicznie oddziel dwie warstwy każdego elementu PL za pomocą ultraprecyzyjnych kleszczyków z końcówką pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym (Rysunek 4). Otrzymane próbki IPL i OPL należy przechowywać pojedynczo w mikroprobówkach w temperaturze -80 °C, aż do dalszego użycia.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Należy zauważyć, że wydajność i łatwość oddzielenia dwóch warstw w dużej mierze zależy od świeżości jaja. Rzeczywiście, przechowywane jaja wykazują drastyczne modyfikacje wewnętrzne spowodowane szybkim wzrostem pH białka jaja i późniejszą zmianą indeksu żółtkowego z powodu rozluźnienia (i osłabienia) PL. IPL jest bardziej kruchy w porównaniu z OPL. Dlatego lepiej jest umieścić czoło OPL powyżej i oddzielić dwie podwarstwy, ciągnąc OPL za pomocą kleszczy. Z obydwoma podwarstwami należy obchodzić się z najwyższą ostrożnością.

2. Obróbka próbki do solubilizacji białek i analizy SDS-PAGE

1. Solubilizacja białek pierwotnych
   1. Liofilizowane próbki IPL i OPL pojedynczo. Po zakończeniu liofilizacji należy pokroić około 1 mg z każdej próbki do czystych mikroprobówek z szczelną nakrętką. Pozostałe próbki należy przechowywać w szczelnie zamkniętych probówkach do dłuższego przechowywania w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Zastosowanie mikroprobówek z szczelną nakrętką zapewnia hermetyczne i szczelne zamknięcie, aby zapobiec ponownemu nawodnieniu próbki i zabezpieczyć próbki.
   2. Zmieszać 1 mg każdej liofilizowanej podwarstwy z 400 μl 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl. Użyj mieszalnika-młyna 2 razy przez 5 minut przy 30 Hz, aby rozbić struktury OPL i OPL w mikrocząstkach i ułatwić solubilizację białek. Zebrać 400 μl próbek zawierających OPL i IPL w dwóch czystych mikroprobówkach.
      UWAGA: Zastosowany tutaj bufor został wybrany w celu zwiększenia solubilizacji białek (w przeciwieństwie do kroku 1). Bufor ten został oparty na wynikach przedstawionych w Rysunek 3, które pokazują wzrost solubilizacji białek przy pH 7 (Rysunek 3B) i przy użyciu 0,5 M NaCl (Rysunek 3C). W tym miejscu protokół można wstrzymać. Na tym etapie próbki mogą być wykorzystane do oczyszczania białek z głównych białek PL lub przetworzone do kroku 2.2.
2. Solubilizacja białek do elektroforezy
   1. Dodać 5 razy bufor próbki SDS-PAGE (100 μL, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% błękitu bromofenolowego, 50% glicerolu, 5% SDS, 5% beta-merkaptoetanolu, pH 6,8) do każdych 400 μL próbki i podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 5 min.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C. Na tym etapie protokołu OPL i IPL są całkowicie rozwiązane. Wydajność solubilizacji próbki można ocenić, odwirowując próbki przez 5 minut przy 10 000 x g. Całkowita solubilizacja charakteryzuje się brakiem widocznego osadu po odwirowaniu. Tak więc po całkowitej sorozpuśnieniu przyjmuje się, że 1 mg liofilizowanej podwarstwy odpowiada 1 mg białek (stężenie białka w próbce 500 μL wynosi 2 mg/ml). Rzeczywiście, PL składa się w ponad 80% z białka^2,15. Użycie 5-krotnego buforu próbki ogranicza rozcieńczenie próbki, ale można również zastosować 1-krotny lub 2-krotny bufor próbki.
   2. Załadować maksymalnie 20 μg białek/linię na żel poliakrylamidowy SDS (żel o gradiacji 4%–20%) i przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 120 V przy użyciu pionowego systemu elektroforezy.
      UWAGA: Stosowanie żelu o gradiach 4%–20% nie jest obowiązkowe, ale jest preferowane w tym przypadku, ponieważ OPL i IPL wykazują białka o masie cząsteczkowej w zakresie od <10 kDa do >250 kDa. Przydatne może być również przechowywanie żelu do układania w stosy (który zwykle jest usuwany), ponieważ obecność nierozpuszczalnych białek lub agregatów białkowych na dnie studzienek wskazywałaby na słabą rozpuszczalność i możliwy brakujący etap podczas przygotowywania próbki.
   3. Po elektroforezie usuń żele ze szklanych płytek i zabarwij roztworem Coomassie Brilliant Blue (50%_H2O, 40% EtOH, 10% kwas octowy i R250 Coomassie Brilliant Blue) przez 30 min.
   4. Odbarwić roztworem składającym się z 50%_H2O, 40% EtOH, 10% roztworu kwasu octowego, aż tło żelu stanie się jasnoniebieskie.
   5. Na koniec przenieś żel na szalki Petriego zawierające wodę dejonizowaną, aby uzyskać odbarwienie i ponowne uwodnienie żeli poliakrylamidowych. Białka powinny wyglądać jak niebieskie paski na przezroczystym tle.

Results

OPL i IPL zostały oddzielone od PL świeżo złożonego niezapłodnionego jaja w celu przeanalizowania ich profili białkowych za pomocą SDS-PAGE. Eksperymentalny przebieg całego protokołu jest zilustrowany na Rysunek 2. Rysunek 3 pokazuje uwalnianie białka przy różnych stężeniach Tris (Rycina 3A), różnych pH (Rysunek 3B) i różnych stężeniach NaCl (Rysunek 3C). Powstałe w ten sposób dwie podwarstwy obserwowano pod światłem lornetkowego mikroskopu preparacyjnego i pokazano na Rysunek 4, gdzie IPL jest półprzezroczysty, podczas gdy OPL jest gęsty, mętny i białawy. Cechy te mogą częściowo świadczyć o skuteczności separacji podwarstw.

Po separacji, OPL i IPL zostały liofilizowane niezależnie, a ich zawartość białka została całkowicie rozpuszczona dzięki połączeniu mechanicznego mielenia, użycia anionowego detergentu (SDS) i środka redukującego (beta-merkaptoetanolu), a następnie gotowania. Po migracji w żelu poliakrylamidowym (elektroforeza SDS-PAGE), próbki OPL i IPL wykazują odrębne profile elektroforetyczne (Rysunek 5), zgodnie z oczekiwaniami.

Ryc. 1: Struktura PL świeżo złożonej niezapłodnionej komórki jajowej. Schematyczne przedstawienie i mikrografia transmisyjnej mikroskopii elektronowej całego PL w przekroju (dane osobowe, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, Uniwersytet i CHRU w Tours, Francja, S. Georgeault). Proszę zauważyć, że zdjęcie to uzyskano z PL przygotowanego w sposób przedstawiony w niniejszym protokole. OPL, zewnętrzna warstwa perywitelinowa; IPL, wewnętrzna warstwa perivitelina. grot strzałki wskazuje ciągłą membranę oddzielającą dwie podwarstwy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przepływ pracy podsumowujący dwa główne kroki protokołu i przykłady zastosowań. Protokół został zoptymalizowany pod kątem analizy proteomicznej warstw PL, ale w przypadku innych zastosowań można go zatrzymać na niektórych etapach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Optymalizacja składu bufora dla próbkowania PL. Krótko mówiąc, czysty PL (n = 4) inkubowano w tej samej objętości różnych roztworów buforowych przez 2 h. PL usunięto, a stężenie białka oszacowano, mierząc absorbancję przy 280 nm w pozostałym buforze. (A) Wpływ stężenia Tris-HCl przy pH 8. b) Wpływ pH (7 do 9). (C) Wpływ stężenia NaCl. Na podstawie tych wyników doszliśmy do wniosku, że bufor złożony z 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl jest najbardziej odpowiedni, ponieważ ogranicza utratę białka. Wyniki są wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe czterech różnych próbek PL. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya. Wartość p <0,05 uznano za istotną (ns, nieistotna; * p<0,05, *** p<0,001, **** p<0,0001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Cechy OPL i IPL pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym. Po rozdzieleniu IPL (po prawej) wydawał się półprzezroczysty, a OPL (po lewej) był nieprzezroczysty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Analiza SDS-PAGE oddzielonych OPL i IPL ze świeżo złożonej niezapłodnionej komórki jajowej. 4%-20% żelu akrylowego, a następnie barwienie na błękit Coomassie. Masa pasm wzorca masy cząsteczkowej jest podana w kDa. Profil OPL składa się głównie z białek o masie cząsteczkowej >30 kDa, podczas gdy główne prążki wykryte w profilu IPL mają masę cząsteczkową <30 kDa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Sukces obecnego protokołu opiera się na dwóch krytycznych etapach, które zostały niezależnie zoptymalizowane: mechanicznej separacji OPL i IPL, które muszą być jak najmniej destrukturyzujące, a następnie całkowitej solubilizacji białek każdej podwarstwy, która jest odwrotnie, destrukturalizacją i denaturacją. Podkreślono w nim również kilka konkretnych punktów, które należy wziąć pod uwagę, aby zapewnić pomyślne osiągnięcie każdego kroku.

Protokół nie zależy od koloru skorupki jaja, masy jaja, rodzaju produkcji ani szczepu genetycznego kury. Zależy to jednak od świeżości jajka. Rzeczywiście, jajo ulega głębokim wewnętrznym modyfikacjom fizykochemicznym szybko po złożeniu, chociaż zmiany te mogą być opóźnione, gdy przechowywanie odbywa się w warunkach chłodniczych^14,15. Utrata dwutlenku węgla przez pory skorupki jaja podczas przechowywania powoduje wzrost pH białka jaja (z 7,8 do 9,5), podczas gdy pewna wymiana wody zachodzi między żółtkiem a białkiem w całej PL. Obie modyfikacje negatywnie wpływają na strukturę molekularną i histologiczną PL, która staje się osłabiona i mniej napięta^14,15, prawdopodobnie z powodu fizykochemicznych modyfikacji zawartości białka 16,17,18. Zakłada się, że oddzielenie podwarstw stanie się bardzo trudne w przypadku przechowywanych jaj, zwłaszcza jeśli przechowywanie odbywa się przez długi czas w temperaturze pokojowej. Do tej pory protokół przeprowadzano przy użyciu jaj przechowywanych krócej niż 4 dni w temperaturze 4 °C, a maksymalny czas przechowywania jaja w celu skutecznego pobrania próbek podwarstw PL nie jest jeszcze znany. Ponadto, jeśli celem jest analiza każdej podwarstwy, kluczowe jest użycie niezapłodnionych jaj. W dniu zniesienia zarodek zapłodnionej komórki jajowej ma 23 godziny, a jego rozwój jest bardzo szybki, jeśli jajo jest inkubowane. Rzeczywiście, rozwój embrionalny i wzrost niektórych struktur pozaembrionalnych rozszerza się przy użyciu PL jako podłoża, które w ten sposób ulega szybkiej degradacji i jest zastępowane przez pozaembrionalny woreczek żółtkowy¹⁹.

Po ręcznym oddzieleniu żółtka od białka jaja, żółtko należy oczyścić ze śladów białka jaja oraz z gradówki, która pozostała ściśle związana z PL. Wskazówka polega na tym, aby ostrożnie zwinąć żółtko na bibułę filtracyjną i wykonać obszerne płukanie żółtka w roztworach buforowych (10 mM Tris-HCl pH 8). pH użyte do buforu jest zgodne z fizjologicznym pH białka jaja¹⁴ i wykazano, że minimalizuje utratę białka (ryc. 3). Zastosowanie buforu chłodzonego pomoże następnie usunąć PL z żółtka, ponieważ w temperaturze 4 °C bufor ułatwi usuwanie PL, ponieważ żółtko lipidowe cofa się i staje się mniej płynne w tej temperaturze. Dodatkowe płukania pozwolą na usunięcie resztek żółtka z PL. Ważne jest również, aby wyciąć strefę odpowiadającą krążkowi zarodkowemu, ponieważ ta struktura, która zawiera żeńskie przedjądrze, może nie być reprezentatywna dla PL. Jest to miejsce zapłodnienia i namnażania się komórek zarodkowych po zapłodnieniu komórki jajowej. Ma on mieć określony skład, który może nie być reprezentatywny dla całego PL, co jest powodem, dla którego został usunięty. Ten konkretny krok jest znacznie ułatwiony, gdy żółtko jest zanurzone w zimnym buforze. Chociaż ta struktura dysku rozrodczego została odrzucona w niniejszym protokole (poza celami), szczegółowe analizy tego obszaru w zapłodnionych jajach mogą być bardzo przydatne dla naukowców zainteresowanych badaniem ewolucji zawartości PL (proteomika i aktywność) i struktury (mikroskopia elektronowa) we wczesnych stadiach embriogenezy 19,20,21 . Na tym etapie cała PL jest strukturalnie nienaruszona i może być przetworzona do dalszej analizy strukturalnej za pomocą mikroskopii elektronowej (rysunek 2), do kroku 1.2 lub do kroku 2.1 (jeśli celem jest analiza całego PL).

Krok 1.2 należy przeprowadzić pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym, ponieważ PL jest bardzo cienki i kruchy (około 10 μm grubości). Rozdzielenie podwarstw jest prawie niemożliwe w wodzie lub w buforze pozbawionym minimalnej ilości soli, a początkowe próby użycia tych opcji doprowadziły do poważnych uszkodzeń PL. Tak więc bufor wybrany do tego etapu pozostaje w fizjologicznym pH (pH 8) i zawiera 50 mM NaCl. Ten krok jest żmudny i musi być wykonywany ostrożnie i delikatnie, aby zapobiec rozdarciu PL. Po rozdzieleniu dwie podwarstwy można łatwo zidentyfikować, ponieważ wykazują one szczególne cechy fizyczne (nieprzezroczyste lub półprzezroczyste). Brak jednorodności IPL w świetle mikroskopu powinien odzwierciedlać niepełną separację, a tym samym obecność pozostałych plamek OPL obecnych na IPL. Ponadto bardzo trudno jest poddać obróbce całą membranę, a użycie kawałków o wymiarach 2 cm x 3 cm znacznie zwiększa szanse na sukces. Otrzymana w ten sposób podwarstwa nadaje się do badania histologicznego za pomocą mikroskopii elektronowej (ryc. 1). Warto zauważyć, że specyficzna struktura liniowa (o grubości od 0,05 do 1 μm) zwana membraną ciągłą (CM) jest widoczna na mikrofotografii (rysunek 1) i pozostaje zwykle przyczepiona do jednej lub drugiej podwarstwy podczas procesu separacji. Wcześniej opublikowano, że przy użyciu stosunkowo wysokiego molomatu soli do separacji (500 mM), CM pozostał przyłączony do OPL⁷, podczas gdy użycie wody⁵ będzie sprzyjać przyłączeniu CM do IPL. W tym protokole do osiągnięcia określonych celów stosuje się niską molowość soli (strukturalnie nienaruszona podwarstwa PL i minimalna utrata białek), co oznacza, że ten CM jest prawdopodobnie związany z IPL. Jednak dodatkowa analiza IPL i OPL za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej jednoznacznie potwierdziłaby tę hipotezę. Warstwy PL, OPL lub IPL uzyskane na końcu etapu 1 mogą być również wykorzystane do testów in vitro do analiz wiązania plemnika z komórką jajową²² lub do analizy wczesnych etapów rozwoju embrionalnego^23,24.

Krok 2 odnosi się do rozpuszczania zawartości białka, częściowo (krok 2.1) lub całkowicie (krok 2.2). PL i/lub OPL są najpierw liofilizowane w celu usunięcia cząsteczek wody i umożliwienia precyzyjnych pomiarów masy. Rzeczywiście, PL składa się głównie z wody (88%)⁷, podczas gdy sucha masa zawiera głównie białka (od 80% do 90% w zależności od badań), węglowodany, tłuszcze i minerały ^2,7,25. Biorąc pod uwagę, że woda zawarta w PL jest usuwana przez liofilizację, że węglowodany są zasadniczo odzyskiwane w glikoproteinach PL oraz że tłuszcz i minerały pochodzące z żółtka są zasadniczo odrzucane przez intensywne płukanie, zakłada się, że otrzymany PL składa się prawie wyłącznie z białek. Zatem wartość wagowa uzyskana po całkowitej liofilizacji powinna odpowiadać głównie białkom. Równa ilość PL, OPL i/lub IPL jest następnie rozcieńczana w buforze zawierającym 0,5 M NaCl. Wysoka molowość soli w połączeniu z mechanicznym niszczeniem sieci włóknistej przez mielenie znacznie ułatwia solubilizację białek w warunkach niedenaturacyjnych. Po tym etapie następuje całkowita rozpuszczalność przy użyciu wrzącego detergentu SDS i środka redukującego beta-merkaptoetanolu (krok 2.2). Rzeczywiście, niektóre białka IPL to glikoproteiny rozpuszczalne w SDS ^25,26,27, a głównymi składnikami OPL są rozpuszczalne w NaCl ^1,11. Korzystając z tego protokołu, nie zaobserwowaliśmy żadnych pozostałych osadów nierozpuszczalnych białek po odwirowaniu, co wskazuje, że solubilizacja była prawdopodobnie zakończona. Białka z PL, OPL i/lub IPL zostały następnie przeanalizowane za pomocą SDS-PAGE. Uzyskane profile białek są zgodne z opublikowaną literaturą 2,4,11,16, ale rozdzielczość i intensywność sygnału jest znacznie lepsza i znacznie bardziej jednorodna między różnymi niezależnymi próbkami IPL i OPL.

Ponadto porównanie ilościowe między OPL i IPL jest możliwe dzięki dokładności masy, którą wywnioskowaliśmy dla odpowiednich podwarstw ^2,7. Co więcej, zarówno profile OPL, jak i IPL są bardzo różne i z wyjątkiem słabego pasma o masie 14 kDa i 75 kDa, obie podwarstwy PL nie mają widocznie wspólnych pasm o tej samej masie cząsteczkowej. Obserwacja ta potwierdza skuteczność separacji podwarstw bez znaczącego zanieczyszczenia krzyżowego. Zgodnie z jedyną opublikowaną analizą proteomiczną PL¹, najintensywniejsze prążki w OPL (<30 kDa) powinny odpowiadać lizozymowi (14 kDa), białku zewnętrznej warstwy błony witeliny 1 (17 kDa), ptasiej beta-defensyny 11 (pozorna masa cząsteczkowa 12 kDa), podczas gdy intensywne pasma IPL (>30 kDa) to prawdopodobnie białko Zona-Pellucida 1 (102 kDa) i białko Zona-Pellucida 3 (47 kDa). Dystrybucja bardzo obfitych białek PL: owotransferyny (78 kDa), białka X związanego z albuminą jaja kurzego (45 kDa), albuminy jaja kurzego (43 kDa)¹ między podwarstwami pozostaje do wyjaśnienia. Rzeczywiście, wysoka masa cząsteczkowa tych białek (>30 kDa) sugeruje, że są to białka IPL w oparciu o profil SDS-PAGE, ale ich specyficzność tkankowa (białka ulegające ekspresji w jajowodach) raczej wiązałaby te białka z OPL ^28,29. Co więcej, niektórzy sugerowali, że potencjalne zanieczyszczenie próbek PL białkiem jaja i białkami żółtka jaja z powodu niewystarczającego płukania¹. Ten brak informacji jest podstawą do opracowania niniejszego protokołu, który będzie dalej wykorzystywany do pogłębionej proteomiki ilościowej PL, OPL i IPL.

Alternatywnie, począwszy od etapu 2.1 i po odwirowaniu w celu usunięcia substancji nierozpuszczalnej, możliwe jest wyekstrahowanie niektórych określonych białek w celu dalszej charakterystyki biochemicznej i biologicznej. Takie podejście zostało ostatnio zastosowane do scharakteryzowania aktywności biologicznej i/lub struktury 3D dwóch głównych składników OPL, białka zewnętrznej warstwy błony witeliny 1 (VMO1) i ptasiej beta-defensyny 11 (AvBD11)^30,31. Dostępność tych białek w postaci oczyszczonych cząsteczek może również pomóc w wytwarzaniu specyficznych przeciwciał do dodatkowych eksperymentów, takich jak immunohistochemia, lub do opracowania testów ilościowych, w tym testów immunoenzymatycznych.

Dwa główne ograniczenia tego protokołu to (1) wyzwanie związane z separacją podwarstw, zwłaszcza jeśli jaja były przechowywane dłużej niż 4 dni w temperaturze 4°C oraz (2) fakt, że całkowita rozpuszczalność białek wymaga redukujących i denaturujących, które pogarszają wewnętrzną aktywność biologiczną otrzymanych próbek. Jeśli chodzi o pierwsze ograniczenie, separacja mechaniczna wymaga umiejętności technicznych, ale jest łatwa do osiągnięcia po 2 lub 3 szkoleniach eksperymentalnych. Niektóre małe kawałki IPL mogą pozostać przymocowane do OPL i odwrotnie, ponieważ obie podwarstwy są ściśle powiązane. Jednak zanieczyszczenie jednej podwarstwy przez drugą powinno być minimalne, jeśli oddzielanie mechaniczne jest wykonywane ostrożnie. Typowe profile IPL i OPL SDS-PAGE po optymalnym rozdzieleniu podwarstw przedstawiono na rysunku 5. Jeśli chodzi o drugie ograniczenie, etapy eksperymentalne przedstawione w tym artykule zostały zoptymalizowane pod kątem analiz proteomicznych, w celu zapewnienia wyczerpującej listy białek tworzących każdą podwarstwę. W celu dalszej charakterystyki aktywności biologicznej każdego białka konieczne jest zatrzymanie się na etapie 2.1.2, przed zastosowaniem warunków denaturacji (etap 2.2.1, użycie buforu z SDS i beta-merkaptoetanolem, a następnie gotowanie). Warto jednak zauważyć, że białka powstałe w kroku 2.1.2 są tylko białkami rozpuszczalnymi w soli, podczas gdy białka nierozpuszczalne w soli tworzą agregaty. Jedną z możliwości dalszej oceny ich aktywności może być produkcja białek nierozpuszczalnych w soli jako białek rekombinowanych przy użyciu systemów heterologicznych (E. coli, bakulowirus, drożdże itp.).

Protokół ten może zostać dostosowany do innych jaj ptasich w celu przeprowadzenia badań porównawczych, aby lepiej docenić oryginalność każdego gatunku. Rzeczywiście, PL wykazuje pewną specyfikę dla ptaków zarówno pod względem strukturalnym, jak i pod względem składu białkowego, prawdopodobnie ze względu na adaptację do nowych środowisk, ale także ze względu na specyfikę rozwojową 2,6,9,32. Opracowanie tego protokołu, który wymaga umiarkowanego poziomu technicznego i klasycznego sprzętu/materiałów, otwiera nowe możliwości badawcze w dziedzinie badań nad rozmnażaniem ptaków i specjacją.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lornetkowy mikroskop preparacyjny	Inżynieria wizyjna, Francja		Model Liofilizator Mantis Elite
	Cryotec, Francja		Model Cosmos 80
Komórka do elektroforezy Mini-Protean II	Biorad, Hercules, USA	1652960	Dowolna aparatura przystosowana do elektroforezy białek
Młyn mieszający MM400	Retsch, Hann, Niemcy	20.745.0001	Młyn mieszający przystosowany do mielenia na sucho, mokro i kriogenicznie małych ilości próbek
Ultra drobne nożyczki preparacyjne ze stali nierdzewnej o długości 12 cm	Dutscher, Brumath	5066
Ultra precyzyjne kleszczyki do końcówek antymagnetyczne ze stali nierdzewnej 9,5 x 109,3 mm	Dutscher, Brumath	327005