Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji przestrzennej korelacji peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) - immunoreaktywnych włókien nerwowych i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki za pomocą immunofluorescencji i histochemii fluorescencyjnej odpowiednio z CGRP i falloidyną. Ponadto pochodzenie tych włókien nerwowych zostało prześledzone wstecznie za pomocą fluorescencyjnego znacznika neuronowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem tego badania było zbadanie dystrybucji i pochodzenia immunoreaktywnych czuciowych włókien nerwowych peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w oponie twardej czaszki za pomocą techniki immunofluorescencji, trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji i śledzenia wstecznego. W tym przypadku włókna nerwowe i naczynia krwionośne zostały wybarwione przy użyciu technik immunofluorescencyjnych i histochemicznych odpowiednio CGRP i fluorescencyjnej falloidyny. Korelację przestrzenną CGRP z immunologicznymi włóknami nerwowymi i naczyniami krwionośnymi wykazano za pomocą rekonstrukcji 3D. Tymczasem pochodzenie immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP wykryto za pomocą techniki śledzenia neuronalnego za pomocą fluorogoldu (FG) z obszaru wokół środkowej tętnicy oponowej (MMA) w oponie twardej czaszki do zwoju nerwu trójdzielnego (TG) i zwojów korzenia grzbietowego szyjki macicy (C) (DRG). Ponadto zbadano również charakterystykę chemiczną neuronów znakowanych FG w TG i DRG razem z CGRP przy użyciu podwójnej immunofluorescencji. Korzystając z przezroczystej próbki z całego montażu i rekonstrukcji 3D, wykazano, że immunoreaktywne włókna nerwowe CGRP i tętniczki znakowane falloidyną biegną razem lub oddzielnie, tworząc sieć nerwowo-naczyniową opony twardej w widoku 3D, podczas gdy neurony znakowane FG znaleziono w gałęziach ocznych, szczękowych i żuchwowych TG, a także C2-3 DRG ipsilateralnie po stronie aplikacji znacznika, w której niektóre neurony znakowane FG wykazywały ekspresję immunoreaktywną CGRP. Dzięki tym podejściom wykazaliśmy charakterystykę dystrybucji immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP wokół naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki, a także pochodzenie tych włókien nerwowych z TG i DRG. Z punktu widzenia metodologii może stanowić cenne odniesienie do zrozumienia skomplikowanej struktury nerwowo-naczyniowej opony twardej czaszki w warunkach fizjologicznych lub patologicznych.
Wprowadzenie
Opona twarda czaszki jest najbardziej zewnętrzną warstwą opon mózgowych chroniącą mózg i zawiera liczne naczynia krwionośne oraz różne rodzaje włókien nerwowych1,2. Wiele badań wykazało, że uwrażliwiona opona twarda czaszki może być kluczowym czynnikiem prowadzącym do wystąpienia bólów głowy, obejmujących nieprawidłowe rozszerzenie naczyń krwionośnych i unerwienie3,4,5. Tak więc wiedza na temat struktury nerwowo-naczyniowej w oponie twardej czaszki jest ważna dla zrozumienia patogenezy bólów głowy, zwłaszcza migreny.<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Instytutu Akupunktury i Moxibustion, Chińskiej Akademii Chińskich Nauk Medycznych (numer referencyjny D2018-09-29-1). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996). W badaniu wykorzystano dwanaście dorosłych samców szczurów rasy Sprague-Dawley (masa ciała 220 ± 20 g). Zwierzęta [numer licencji SCXK (JING) 2017-0005] zostały dostarczone przez National Institutes for Food and Drug Control.
1. Unerwienie opony twardej czaszki szczura
- ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Struktura naczyniowo-nerwowa opony twardej czaszki
Po barwieniu immunofluorescencyjnym i fluorescencyjnym histochemicznym z użyciem CGRP i falloidyny, CGRP-immunoreaktywne włókna nerwowe oraz oznakowane falloidyną tętniczki oponowe i tkanki łączące zostały wyraźnie wykazane w całej preparacie opony twardej czaszki w układzie 3D (Rysunek 2C,D,E,F). Wykazano, że zarówno grube, jak i cienkie CGRP-immunoreaktywne włókna nerwo.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu udało nam się wykazać rozmieszczenie i pochodzenie immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP w oponie twardej czaszki przy użyciu immunofluorescencji, rekonstrukcji 3D i metod śledzenia neuronalnego za pomocą przeciwciała CGRP i znacznika neuronalnego FG, dostarczając dowodów histologicznych i chemicznych w celu lepszego zrozumienia sieci nerwowo-naczyniowej opony twardej.
Jak wiadomo, CGRP odgrywa kluczową rolę w patogenezie migreny 4,17
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez projekt National Key R&D Program of China (kod projektu nr 2019YFC1709103; nr 2018YFC1707804) oraz National Natural Science Foundation of China (kod projektu nr 81774211; nr 81774432; nr 81801561).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 osł anty-mysi IgG (H+L) | Invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific | A21202 | Chronić przed światłem; RRID: AB_141607 |
| Instrument do stereotaksji mózgu | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Wersja 1.1 | Oprogramowanie mikroskopu fluorescencyjnego |
| System obrazowania konfokalnego | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Chronić przed światłem |
| System obrazowania fluorescencyjnego | Olympus | BX53 | |
| Mikrotom do zamrażania | Thermo | Microm International | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Konfokalny system oprogramowania do przetwarzania obrazu |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mysz anty-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normalna surowica osła | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Falloidyna 568 | Molekularny& nbsp; Sondy | A12380 | Chronić przed światłem |
| Photoshop i Ilustracja | Adobe | CS6 | Oprogramowanie do edycji zdjęć |
| Królik anty-Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | Narodowe Instytuty Kontroli Żywności i Leków | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost plus | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
Bibliografia
- Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
- Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-9....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
