Artykuł metodologiczny

Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym

DOI:

10.3791/61742

⸱

6 stycznia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji przestrzennej korelacji peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) - immunoreaktywnych włókien nerwowych i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki za pomocą immunofluorescencji i histochemii fluorescencyjnej odpowiednio z CGRP i falloidyną. Ponadto pochodzenie tych włókien nerwowych zostało prześledzone wstecznie za pomocą fluorescencyjnego znacznika neuronowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania było zbadanie dystrybucji i pochodzenia immunoreaktywnych czuciowych włókien nerwowych peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w oponie twardej czaszki za pomocą techniki immunofluorescencji, trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji i śledzenia wstecznego. W tym przypadku włókna nerwowe i naczynia krwionośne zostały wybarwione przy użyciu technik immunofluorescencyjnych i histochemicznych odpowiednio CGRP i fluorescencyjnej falloidyny. Korelację przestrzenną CGRP z immunologicznymi włóknami nerwowymi i naczyniami krwionośnymi wykazano za pomocą rekonstrukcji 3D. Tymczasem pochodzenie immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP wykryto za pomocą techniki śledzenia neuronalnego za pomocą fluorogoldu (FG) z obszaru wokół środkowej tętnicy oponowej (MMA) w oponie twardej czaszki do zwoju nerwu trójdzielnego (TG) i zwojów korzenia grzbietowego szyjki macicy (C) (DRG). Ponadto zbadano również charakterystykę chemiczną neuronów znakowanych FG w TG i DRG razem z CGRP przy użyciu podwójnej immunofluorescencji. Korzystając z przezroczystej próbki z całego montażu i rekonstrukcji 3D, wykazano, że immunoreaktywne włókna nerwowe CGRP i tętniczki znakowane falloidyną biegną razem lub oddzielnie, tworząc sieć nerwowo-naczyniową opony twardej w widoku 3D, podczas gdy neurony znakowane FG znaleziono w gałęziach ocznych, szczękowych i żuchwowych TG, a także C2-3 DRG ipsilateralnie po stronie aplikacji znacznika, w której niektóre neurony znakowane FG wykazywały ekspresję immunoreaktywną CGRP. Dzięki tym podejściom wykazaliśmy charakterystykę dystrybucji immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP wokół naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki, a także pochodzenie tych włókien nerwowych z TG i DRG. Z punktu widzenia metodologii może stanowić cenne odniesienie do zrozumienia skomplikowanej struktury nerwowo-naczyniowej opony twardej czaszki w warunkach fizjologicznych lub patologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opona twarda czaszki jest najbardziej zewnętrzną warstwą opon mózgowych chroniącą mózg i zawiera liczne naczynia krwionośne oraz różne rodzaje włókien nerwowych1,2. Wiele badań wykazało, że uwrażliwiona opona twarda czaszki może być kluczowym czynnikiem prowadzącym do wystąpienia bólów głowy, obejmujących nieprawidłowe rozszerzenie naczyń krwionośnych i unerwienie3,4,5. Tak więc wiedza na temat struktury nerwowo-naczyniowej w oponie twardej czaszki jest ważna dla zrozumienia patogenezy bólów głowy, zwłaszcza migreny.

Chociaż unerwienie opony twardej było wcześniej badane za pomocą konwencjonalnej immunohistochemii, korelacja przestrzenna włókien nerwowych i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki była mniej zbadana6,7,8,9. W celu bardziej szczegółowego ujawnienia struktury nerwowo-naczyniowej opony twardej, peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) i falloidyna zostały wybrane jako markery do odpowiedniego barwienia włókien nerwowych opony twardej i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki z całą mocowaną oponą twardą za pomocą immunofluorescencji i histochemii fluorescencyjnej10. Może to być optymalny wybór w celu uzyskania trójwymiarowego (3D) widoku struktury nerwowo-naczyniowej. Dodatkowo fluorogold (FG) nałożono na obszar wokół tętnicy oponowej środkowej (MMA) w oponie twardej czaszki w celu określenia pochodzenia immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP i prześledzono zwoje zwoju nerwu trójdzielnego (TG) i zwoje korzenia grzbietowego szyjki macicy (C) (DRG), podczas gdy neurony znakowane FG były dalej badane razem z CGRP za pomocą immunofluorescencji.

Celem tego badania było dostarczenie skutecznego narzędzia do badania struktury nerwowo-naczyniowej w oponie twardej czaszki pod kątem unerwienia CGRP-immunoreaktywnego i jego pochodzenia. Wykorzystując przezroczystą oponę twardą z całym mocowaniem i łącząc immunofluorescencję, śledzenie wsteczne, techniki konfokalne i rekonstrukcję 3D, spodziewaliśmy się przedstawić nowatorski widok 3D struktury nerwowo-naczyniowej w oponie twardej czaszki. Te podejścia metodologiczne mogą być dalej wykorzystywane do badania patogenezy różnych bólów głowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Instytutu Akupunktury i Moxibustion, Chińskiej Akademii Chińskich Nauk Medycznych (numer referencyjny D2018-09-29-1). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996). W badaniu wykorzystano dwanaście dorosłych samców szczurów rasy Sprague-Dawley (masa ciała 220 ± 20 g). Zwierzęta [numer licencji SCXK (JING) 2017-0005] zostały dostarczone przez National Institutes for Food and Drug Control.

1. Unerwienie opony twardej czaszki szczura

  1. Perfuzje
    1. Dootrzewnowo wstrzyknąć szczurowi nadmierną dawkę roztworu tribromoetanolu (250 mg/kg) w celu wywołania eutanazji.
    2. Gdy oddech ustaje, perfuzję przezsercową ze 100 ml 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 250-300 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB, pH 7,4).
    3. Po perfuzji usuń skórę głowy i otwórz czaszkę, aby odsłonić oponę twardą i grzbietową stronę mózgu. Następnie wypreparuj oponę twardą czaszki wzdłuż pnia mózgu do opuszki węchowej we wzorze całego montażu (Ryc. 1). Wykonać utrwalenie w 4% paraformaldehydzie przez 2 godziny, a następnie krioprotekcję w 25% sacharozie w 0,1 M PB przez ponad 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  2. Immunohistochemia fluorescencyjna do znakowania CGRP i falloidyny
    UWAGA: Zastosowano kombinację barwienia fluorescencyjnego CGRP i falloidyny, aby ujawnić przestrzenną korelację włókien nerwowych opony twardej i naczyń krwionośnych w oponie twardej czaszki szczura we wzorze całego mocowania.
    1. Płucz oponę twardą czaszki w 0,1 M PB przez około 1 minutę.
    2. Inkubować oponę twardą w roztworze blokującym zawierającym 3% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 w 0,1 M PB przez 30 minut.
    3. Przenieść oponę twardą do mysiego przeciwciała anty-CGRP (1:1000) w 0,1 M PB zawierającego 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 °C11.
    4. Następnego dnia umyć oponę twardą trzykrotnie w 0,1 M PB.
    5. Inkubować oponę twardą w mieszanym roztworze przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszom Alexa Fluor 488 (1:500) i falloidyny 568 (1:1000) w 0,1 M PB zawierającym 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (26 °C).
    6. Umyć oponę twardą trzy razy w 0,1 M PB.
    7. Przytnij krawędzie i zamontuj go na szkiełkach mikroskopowych (patrz Tabela materiałów).
    8. Przed obserwacją nałóż szkiełka nakrywkowe z 50% gliceryną.
  3. Obserwacja i rejestracja
    1. Obserwuj próbki fluorescencyjne pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym systemem obrazowania.
    2. Wykonaj zdjęcia opony twardej w całości za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową (4x, NA: 0,13) i użyj czasu naświetlania 500 ms. Mozaiki obrazowe opony twardej uzupełniono za pomocą oprogramowania mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów).
    3. Wykonaj zdjęcia immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP i naczyń krwionośnych znakowanych falloidyną w oponie twardej za pomocą mikroskopu konfokalnego. Długości fal wzbudzenia i emisji wynosiły 488 nm (kolor zielony) i 594 nm (kolor czerwony). Otworek konfokalny wynosi 110 (20x) i 105 μm (40x). Rozdzielczość przechwytywania obrazu wynosi 640 x 640 pikseli.
    4. Uchwyć 20 obrazów w klatkach 2 μm z każdego przekroju o grubości 40 μm i wykonaj pojedynczą integrację obrazu w ostrości z systemem oprogramowania powiązanego z konfokalnym przetwarzaniem obrazu do analizy 3D w następujący sposób: Ustaw początkową płaszczyznę ogniskową | Ustaw końcową płaszczyznę ogniskowej | Ustawianie rozmiaru kroku | Wybierz wzór głębokości | Przechwytywanie obrazu | Seria Z.
    5. Użyj oprogramowania do edycji zdjęć, aby dostosować jasność i kontrast obrazów w celu optymalizacji wizualizacji. Zwróć uwagę, aby nie usuwać żadnych danych z obrazów.

2. Badanie śledzenia wstecznego z FG

  1. Zabiegi chirurgiczne
    1. Określ obszar współrzędnych zainteresowania w oponie twardej czaszki szczura.
    2. Przygotuj mikrostrzykawkę o pojemności 10 μl i przetestuj ją z płynną parafiną.
    3. Znieczulić szczury roztworem tribromoetanolu (150 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
    4. Ogol głowę szczura elektryczną maszynką do golenia.
    5. Przyłóż pręty do uszu szczura i umieść je na urządzeniu stereotaktycznym. Następnie załóż uchwyt na usta i nałóż maść okulistyczną na oczy.
    6. Oczyść miejsce operacji skóry głowy za pomocą 10% jodu powidonu, a następnie 75% etanolu.
    7. Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy.
    8. Tępo usuń okostną i tkanki mięśniowe z czaszki za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką (Ryc. 1A).
    9. Wywierć mały otwór (~5-7 mm) za pomocą wiertła do zadziorów z wiertłem z okrągłą końcówką (#106) na lewej kości ciemieniowej i skroniowej powyżej MMA12, i upewnij się, że opona twarda czaszki pozostała nienaruszona (Rysunek 1B).
    10. Zbuduj bank wokół otworu z dentystycznym cementem krzemianowym, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się znacznika (Rysunek 1C).
    11. Dodaj 2 μl 2% FG do otworu wokół MMA za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl (Rysunek 1D).
    12. Przykryj otwór małym kawałkiem gąbki hemostatycznej.
    13. Połóż kawałek folii parafinowej na otworze i uszczelnij krawędzie woskiem kostnym, aby zapobiec wyciekowi znacznika i uniknąć zanieczyszczenia otaczających tkanek.
    14. Zszyj ranę sterylną nicią.
    15. Trzymaj szczury w ciepłym miejscu, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
    16. Wróć szczury z powrotem do ich klatek i dodaj antybiotyk i środek przeciwbólowy do wody pitnej.
  2. Perfuzje i sekcje
    1. Po 7 dniach przeżycia należy przeprowadzić perfuzję u tych szczurów, jak wspomniano powyżej w procedurach w punkcie 1.1.
    2. Wypreparuj DRG TG i C1-4, a następnie wykonaj je po naprawie i zabezpiecz kriogenicznie, jak wspomniano powyżej w sekcji 1.1.3 (Rysunek 1F).
    3. Wyciąć TG i DRG o grubości 30 μm na mikrotomie kriostatu w kierunku strzałkowym i zamontować na szkiełkach pokrytych silanem.
  3. Podwójne immunofluorescencje do znakowania FG i CGRP w TG i DRGs
    UWAGA: Chociaż znakowanie FG można bezpośrednio zaobserwować przy oświetleniu UV pod lampą rtęciową bez dodatkowego barwienia13,14,15,16, znakowane neurony z FG były dalej badane w TG i szyjkach macicy DRG przy użyciu podwójnych immunofluorescencji z FG i CGRP w celu ujawnienia pochodzenia opornych CGRP-immunoreaktywnych włókien nerwowych w TG i DRG.
    1. Zakreśl sekcje pisakiem histochemicznym.
    2. Inkubować skrawki przez 30 minut w roztworze blokującym zawierającym 3% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 w 0,1 M PB.
    3. Przenieść próbki do roztworu króliczego przeciwciała antyfluorozłotego (1:1000) i mysiego przeciwciała anty-CGRP (1:1000) w 0,1 M PB zawierającym 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Następnego dnia umyć skrawki trzykrotnie w 0,1 M PB.
    5. Inkubować w mieszanym roztworze przeciwciała anty-królika Alexa Fluor 594 (1:500) (1:500) i przeciwciała anty-myszego osła Alexa Fluor 488 (1:500) w 0,1 M PB zawierającym 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
    6. Umyć i nałożyć szkiełka nakrywkowe na skrawki, jak to opisano w krokach 1.2.6 i 1.2.8.
  4. Obserwacja i rejestracja
    1. Wykonaj zdjęcia neuronów znakowanych FG w TG i DRG w świetle UV za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową.
    2. Uchwyć obrazy neuronów znakowanych FG i CGRP w TG i DRG pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową.
    3. Użyj oprogramowania do edycji, aby dostosować jasność i kontrast obrazów oraz dodać etykiety na zdjęciach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktura nerwowo-naczyniowa opony twardej czaszki
Po immunofluorescencyjnym i fluorescencyjnym barwieniu histochemicznym CGRP i falloidyną, immunoreaktywne włókna nerwowe CGRP oraz tętniczki oponowe i tkanki łączne znakowane falloidyną zostały wyraźnie pokazane w całej oponie twardej czaszki we wzorze 3D (Rysunek 2C, D, E, F). Wykazano, że zarówno grube, jak i cienkie immunoreaktywne włókna nerwowe CGRP biegną równolegle do tętnic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu udało nam się wykazać rozmieszczenie i pochodzenie immunoreaktywnych włókien nerwowych CGRP w oponie twardej czaszki przy użyciu immunofluorescencji, rekonstrukcji 3D i metod śledzenia neuronalnego za pomocą przeciwciała CGRP i znacznika neuronalnego FG, dostarczając dowodów histologicznych i chemicznych w celu lepszego zrozumienia sieci nerwowo-naczyniowej opony twardej.

Jak wiadomo, CGRP odgrywa kluczową rolę w patogenezie migreny 4,17

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez projekt National Key R&D Program of China (kod projektu nr 2019YFC1709103; nr 2018YFC1707804) oraz National Natural Science Foundation of China (kod projektu nr 81774211; nr 81774432; nr 81801561).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 488 osł anty-mysi IgG (H+L)Invitrogen firmy Thermo Fisher ScientificA21202Chronić przed światłem; RRID: AB_141607
Instrument do stereotaksji mózguNarishigeSR-50
CellSens DimensionOlympusWersja 1.1Oprogramowanie mikroskopu fluorescencyjnego
System obrazowania konfokalnegoOlympusFV1200
Fluorogold (FG)Fluorochrome52-9400Chronić przed światłem
System obrazowania fluorescencyjnegoOlympusBX53
Mikrotom do zamrażaniaThermoMicrom International 
Olympus FV10-ASW 4.2aOlympusVersion 4.2Konfokalny system oprogramowania do przetwarzania obrazu
Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7
Mysz anty-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411
Normalna surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-121
Falloidyna 568Molekularny& nbsp; SondyA12380Chronić przed światłem
Photoshop i  IlustracjaAdobeCS6Oprogramowanie do edycji zdjęć
Królik anty-FluorogoldAbcamab153RRID: AB_90738
Sprague DawleyNarodowe Instytuty Kontroli Żywności i LekówSCXK (JING) 2014-0013
Szkiełka mikroskopowe Superfrost plusThermo#4951PLUS-00125x75x1mm
GmbH

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
  3. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  4. Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).
  5. Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).
  6. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  7. Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
  8. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  9. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  10. Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
  11. Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
  12. Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
  13. Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
  14. Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
  15. Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
  16. Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
  17. Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
  18. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  19. Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6(2014).
  20. Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861(2018).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
  23. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
  24. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Barwienie immunofluorescencyjnetechnika ledzenia neuron wznakowanie wsteczne fluorogoldemobrazowanie mikroskopem konfokalnymzwoj zwoju tr jdzielnegoszyjne zwoje korzeni grzbietowychrekonstrukcja 3Dpreparatyka ca ego narz du

Powiązane artykuły