Artykuł metodologiczny

Transsekcja nerwu wzrokowego zachowująca osłonkę u szczurów w celu oceny regeneracji aksonów i interwencji ukierunkowanych na akson komórek zwojowych siatkówki

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61748

⸱

6 września 2020

 ,  ,  ,  , 
1Hamilton Glaucoma Center, Viterbi Family Department of Ophthalmology, Shiley Eye Institute, University of California San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje przecięcie nerwu wzrokowego, które zachowuje osłonkę nerwu wzrokowego u szczurów. Ciśnienie hydrostatyczne z mikroiniekcji do nerwu wzrokowego generuje pełną transsekcję, co pozwala na bezszwowe ponowne ułożenie przeciętych końców nerwu wzrokowego i bezpośrednie ukierunkowanie na przedział aksonalny w modelu przecięcia.

Streszczenie

Aksony komórek zwojowych siatkówki (RGC) zbiegają się w głowie nerwu wzrokowego, aby przekazywać informacje wizualne z siatkówki do mózgu. Patologie, takie jak jaskra, urazy i niedokrwienne neuropatie nerwu wzrokowego, uszkadzają aksony RGC, zakłócają przekazywanie bodźców wzrokowych i powodują utratę wzroku. Modele zwierzęce symulujące uszkodzenie aksonów RGC obejmują paradygmaty zmiażdżenia i przecięcia nerwu wzrokowego. Każdy z tych modeli ma nieodłączne zalety i wady. Zmiażdżenie nerwu wzrokowego jest na ogół mniej poważne niż przecięcie i może być wykorzystane do oceny regeneracji aksonów w miejscu zmiany. Jednak różnice w sile i czasie trwania zgniatania mogą wpływać na reakcje tkanek, co skutkuje zmienną odtwarzalnością i kompletnością zmiany. W przypadku przecięcia nerwu wzrokowego dochodzi do poważnego i powtarzalnego urazu, który całkowicie zmienia wszystkie aksony. Jednak przecięcie nerwu wzrokowego dramatycznie zmienia barierę krew-mózg poprzez naruszenie osłonki nerwu wzrokowego, narażając nerw wzrokowy na środowisko obwodowe. Co więcej, regeneracji poza miejscem przecięcia nie można ocenić bez ponownego nałożenia przeciętych zakończeń nerwowych. Co więcej, wyraźne zmiany zwyrodnieniowe i szlaki komórkowe są aktywowane przez uraz zmiażdżenia lub przecięcia.

Opisana tutaj metoda łączy zalety zarówno modeli zmiażdżenia nerwu wzrokowego, jak i przecięcia, jednocześnie łagodząc wady. Ciśnienie hydrostatyczne dostarczane do nerwu wzrokowego przez mikroiniekcję całkowicie przenika nerw wzrokowy, zachowując integralność osłonki nerwu wzrokowego. Przecięte zakończenia nerwu wzrokowego są ponownie nakładane, aby umożliwić testy regeneracji aksonów. Potencjalnym ograniczeniem tej metody jest brak możliwości wizualizacji całego przecięcia, co jest potencjalnym źródłem zmienności. Jednak wizualne potwierdzenie, że widoczna część nerwu wzrokowego została przecięta, wskazuje na całkowitą transsekcję nerwu wzrokowego z 90-95% sukcesem. Metoda ta może być stosowana do oceny strategii promowania regeneracji aksonów w modelu transsekcji lub do badania interwencji ukierunkowanych na przedziały aksonalne.

Wprowadzenie

Uszkodzenia i zwyrodnienia aksonów występują w komórkach zwojowych siatkówki (RGC) po urazach lub w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak jaskra1,2. Utrata RGC i zakłócenie projekcji siatkówki powoduje trwałą utratę wzroku3. Aby zrozumieć szlaki molekularne odpowiedzialne za procesy zwyrodnieniowe i opracować strategie łagodzenia utraty aksonów i RGC lub regeneracji aksonów RGC, wykorzystano eksperymentalne modele zwierzęce do symulacji uszkodzenia nerwu wzrokowego, w tym modele zmiażdżenia nerwu wzrokowego i przecięcia nerwu wzrokowego. Wybierając model eksperymentalny, należy wziąć pod uwagę zalety i wady każdego podejścia, a także szlaki molekularne aktywowane przez injury4.

Uzasadnieniem dla opracowania opisanej tutaj metody jest wykorzystanie zalet modeli nerwu wzrokowego crush5 i transsection6 przy jednoczesnym łagodzeniu wad. Celem tej metody było wygenerowanie powtarzalnego uszkodzenia nerwu wzrokowego, w którym wszystkie aksony są bezsprzecznie i całkowicie przecięte, narażenie na obwodowy układ odpornościowy jest zminimalizowane, a przecięte końce nerwu wzrokowego są łatwo reaktywowane, aby umożliwić ocenę regeneracji RGC. Ponadto metoda została opracowana, aby umożliwić przedziałowy dostęp do aksonalnej części uszkodzonych RGC i dostarczyć interwencje specyficzne dla aksonów (np. czynniki neurotroficzne, przeszczepy komórkowe) lokalnie do zadoczodołowego nerwu wzrokowego.

Istnieje wiele zalet tej techniki w porównaniu z alternatywnymi metodami. W porównaniu ze zmiażdżeniem nerwu wzrokowego, ta metoda całkowicie i niezawodnie przenika nerw wzrokowy; Rozwiązuje to potencjalny problem z niepożądanym Axon sparing7. Dodatkowo opisana metoda powoduje poważne uszkodzenie aksonów, które nie jest zależne od wielkości i czasu trwania siły przyłożonej przez operatora, jak w przypadku urazu zmiażdżenia, zmniejszając w ten sposób zmienność8. W przeciwieństwie do ustalonych metod transeksji nerwu wzrokowego, podejście szczegółowo opisane w tym protokole utrzymuje integralność osłonki nerwu wzrokowego. Zaletą zachowania osłonki nerwu wzrokowego jest to, że zapobiega ona narażeniu nerwu wzrokowego na obwodowy układ odpornościowy. Co więcej, siły mechaniczne wywierane przez osłonkę nerwu wzrokowego na przecięty nerw wzrokowy przekształcają przecięte zakończenia nerwowe bez konieczności wykonywania trudnych manipulacji mikrochirurgicznych9,10,11. Wreszcie, przy nienaruszonej osłonce nerwu wzrokowego, metoda wytwarza fizyczną przestrzeń między kikutami nerwu wzrokowego, do której komórki macierzyste, czynniki neurotroficzne lub polimery mogą być wprowadzane bezpośrednio do uszkodzonych aksonów RGC.

Zmiażdżenie nerwu wzrokowego jest złotym standardem, w którym oceniane są strategie regeneracji nerwu wzrokowego w celu określenia skuteczności leczenia. Wielkość nerwu wzrokowego gryzonia ogranicza możliwe manipulacje, zwłaszcza przecięcie i ponowną adaptację nerwu. Jednak w dziedzinie urazów i regeneracji rdzenia kręgowego panuje zgoda co do tego, że pełna transsekcja jest idealnym modelem do odróżnienia regeneracji aksonów od oszczędzonych aksonów12. Opisana tutaj metoda zmniejsza bariery techniczne w ocenie strategii regeneracyjnych w modelu przecięcia nerwu wzrokowego. W związku z tym model ten może być wykorzystany do walidacji obiecujących strategii zidentyfikowanych w paradygmatach zmiażdżenia nerwu wzrokowego z transsekcją nerwu wzrokowego. Dodatkowo, ponieważ model ten jest bezpośrednio ukierunkowany na przedział aksonalny, umożliwia badanie interwencji na uszkodzonych dorosłych aksonach RGC oraz mechanizmów odpowiedzialnych za procesy zwyrodnieniowe i regeneracyjne aksonów.

Model przecięcia nerwu wzrokowego opisany w tym badaniu całkowicie przecina nerw wzrokowy, zachowując osłonę nerwu wzrokowego. To nowatorskie podejście jest odpowiednie dla eksperymentów, które mają na celu ocenę regeneracji aksonów w modelu transsekcji bez konieczności przeprowadzania technicznie trudnego procesu ponownego zakładania końców nerwu wzrokowego. Aspekty tej techniki są podobne do wykonywania zmiażdżenia nerwu wzrokowego; Dlatego podejście może być wykonywane przez operatorów doświadczonych ze zmiażdżeniem nerwu wzrokowego. Dostęp chirurgiczny nie wymaga specjalnie zaprojektowanych narzędzi i może być uzupełniony o łatwo dostępne narzędzia chirurgiczne i system mikroiniekcji, dzięki czemu jest dostępny i ekonomiczny.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Systemu Opieki Zdrowotnej dla Weteranów w San Diego. Narzędzia i roztwory chirurgiczne zostały wysterylizowane przed operacją, aby ograniczyć infekcje i powikłania pooperacyjne.

1. Technika chirurgiczna

  1. Przeprowadzaj eksperymenty przy użyciu technik aseptycznych i zgodnie z protokołami wykorzystania zwierząt specyficznymi dla danej instytucji.
  2. Sterylizuj narzędzia i materiały, które mają kontakt z żywymi tkankami, aby zapobiec infekcjom, uniknąć negatywnego wpływu na dobrostan zwierząt i zminimalizować potencjalny negatywny wpływ na badanie. Dokładnie wyczyść narzędzia chirurgiczne wodą i detergentem lub produktami enzymatycznymi, aby usunąć ciała obce i wysterylizuj za pomocą sterylizacji parowej lub błyskawicznej.
  3. Podwielokrotność płynów rozlać do sterylnych pojemników w kapturze do hodowli tkankowych. Wysterylizuj strzykawkę o pojemności mikrolitrów, przepłukując ją 70% etanolem i spłukując sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).

2. Znieczulenie

  1. Znieczulenie szczurów za pomocą systemu parownika izofluranu. Odparować izofluran w stężeniu 4,5% przy użyciu tlenu medycznego w ilości 1 l/min do dołączonego pudełka anestezjologicznego. Umieść zwierzę w komorze anestezjologicznej, aż oddech zwolni, a zwierzę zostanie uspokojone.
    UWAGA: Ten początkowy krok z użyciem znieczulenia gazowego nie jest konieczny, jeśli operator czuje się komfortowo i jest zaznajomiony z podawaniem środków znieczulających do wstrzykiwań zwierzętom nieuspokojonym.
  2. Pobrać wystarczającą objętość koktajlu znieczulającego składającego się z ketaminy (50 mg/kg), ksylazyny (2,6 mg/kg) i acepromazyny (0,5 mg/kg) do strzykawki tuberkulinowej 30 g. Wyjmij zwierzę z sedacją z pudełka anestezjologicznego. Podać wstrzyknięcie znieczulenia dootrzewnowo, aby uzyskać stałą głębokość sedacji przez cały zabieg i przywrócić zwierzę do klatki.
  3. Rozpocznij procedurę, gdy uszczypnięcie palca u nogi nie wywoła reakcji. Oceń zwierzę pod kątem głębokości i tempa oddychania oraz ściskaj palec u nogi co 5 minut przez cały zabieg, aby upewnić się, że nie ma bólu.
  4. Po zakończeniu operacji należy usunąć zwierzę z ramy stereotaktycznej. Podaj podskórne wstrzyknięcie soli fizjologicznej (3 ml), ampicyliny (0,15–0,2 mg/kg) i banaminy (2,5–5 mg/kg) w celu złagodzenia objawów i wsparcia płynów. Przenieś zwierzę do podgrzewanego inkubatora, aby utrzymać temperaturę ciała.

3. Podejście chirurgiczne

  1. Umieść szczura (w wieku 7-8 tygodni, szczep Fischer 344) w stereotaktycznej ramie głowy i na podgrzewanej podkładce. Ustaw ramę stereotaktyczną z głową szczura skierowaną w lewo od chirurga i wyśrodkuj lewą orbitę w polu operacyjnym view.
  2. Na lewe oko nałóż kroplę proparakainy i oczyść oko, nakładając 5% jodu powidonu na powiekę i oko. Rozprowadź maść okulistyczną na rogówce obu oczu, aby utrzymać wilgotność rogówki i zapobiec powstawaniu zaćmy.
  3. Przeprowadź szew poliglaktynowy 4-0 przez naskórek górnej powieki do środkowej części brzegu powieki, używając tego szwu do tymczasowego tarsorrhaphy w późniejszych krokach. Użyj szwu, aby odsłonić powiekę i odsłonić sklepienie górne.
  4. Przyklej szew poliglaktynowy do ramy stereotaktycznej, aby zapewnić stałą przyczepność i ekspozycję. Unikaj nadmiernej przyczepności, ponieważ może to ograniczyć narażenie zawartości zaoczodołowej.
  5. Za pomocą kleszczy Colibri podnieś spojówkę górną i naciąć spojówkę wzdłuż rąbka nożyczkami Vannas. Wykonaj perytomię na godzinie 4 wzdłuż górnego rąbka.
  6. Zastosuj lekko gorszą przyczepność do gałki ziemskiej, umieszczając zapętlony szew polipropylenowy wzdłuż górnego rąbka z wolnymi końcami poniżej gałki ziemskiej. Pozostałość tkanki wzdłuż rąbka górnego po peritomii jest wystarczająca, aby zapewnić przyczepność do pętli szwu bez konieczności przechodzenia szwu przez twardówkę lub rąbek.
    1. Zabezpiecz końce pętli za pomocą zacisku buldoga i pozwól zaciskowi swobodnie zwisać w powietrzu. Ciężar zacisku będzie wywierał gorszą przyczepność na kulę ziemską i odsłaniał więcej przestrzeni zaorbitalnej.
  7. rozkrój nożyczkami Vannas wzdłuż twardówki wzdłuż tylnej części kuli ziemskiej i pod mięśniem prostym górnym. Usuń mięśnie proste górne z gałki ziemskiej, przecinając ścięgno mięśnia nożyczkami Vannasa, aby uzyskać dostęp do przestrzeni zaoczodołowej.

4. Dostęp do nerwu wzrokowego

  1. sekcję za pomocą kleszczy Dumont # 5/45 wzdłuż skroniowego aspektu tylnej kuli ziemskiej i zidentyfikuj górną boczną żyłę wirową. Dalej tępo wyciąć nos do górnej bocznej żyły wirowej, aby odsłonić stożek mięśnia oczodołu wokół nerwu wzrokowego i uniknąć przedwczesnego uszkodzenia nerwu wzrokowego. Unikaj uszkodzenia żyły wirowej, ponieważ może to spowodować znaczne krwawienie. Jeśli wystąpi krwawienie, można nałożyć aplikator z bawełnianą końcówką, aż krwawienie ustanie.
  2. Za pomocą kleszczyków Dumont #5/45 ostrożnie włóż końcówkę w skroniowy aspekt stożka mięśnia oczodołu i otwórz kleszcze równolegle do przebiegu włókien mięśniowych, aby odsłonić nerw wzrokowy. Użyj kleszczy, aby bocznie przemieścić włókna mięśniowe pokrywające nerw wzrokowy i całkowicie odsłonić nerw. Upewnij się, że tylko osłona nerwu wzrokowego zakrywa nerw wzrokowy, ponieważ resztki włókien mięśniowych uniemożliwią łatwemu wbiciu się wyciągniętej szklanej pipety kapilarnej w nerw wzrokowy.
  3. Utrzymuj odsłonięcie nerwu, umieszczając dwa kleszcze Dumont # 5/45 wzdłuż obu bocznych aspektów nerwu i otwierając kleszcze. Stopień ekspozycji powinien pozwolić na zmiażdżenie nerwu wzrokowego 1,5–2,0 mm za gałką oczną i wprowadzenie wyciągniętej szklanej pipety kapilarnej do nerwu wzrokowego od strony grzbietowej.

5. Przenikanie nerwu wzrokowego wewnątrz osłonki nerwu wzrokowego

  1. Za pomocą kleszczy Dumont #5/45 umieść końcówki po obu stronach nerwu wzrokowego co najmniej 1,5–2,0 mm za gałką oczną. Upewnij się, że końcówki kleszczy obejmują średnicę nerwu. Całkowicie zamknij kleszcze na 5 sekund, aby zmiażdżyć nerw wzrokowy i zanotuj położenie miejsca zgniatania.
  2. Za pomocą strzykawki o pojemności mikrolitrów napełnij szklaną pipetę kapilarną 1–2 μl PBS i umieść pipetę w uchwycie na pipety. Zamontuj uchwyt pipety na mikromanipulatorze i przymocuj mikromanipulator do ramy stereotaktycznej.
  3. Dostosuj system mikroiniekcji tak, aby dostarczał pojedynczy impuls o czasie trwania 4 ms pod ciśnieniem 20 psi przy każdym naciśnięciu przycisku. Umieścić pipetę w polu operacyjnym.
  4. Pod lunetą chirurgiczną użyj pary kleszczyków #55, aby złamać i ukosować końcówkę pipety do rozmiaru (średnica ~20–30 μm), który jest w stanie dostarczyć niewielką objętość, ale wystarczająco dużą, aby zapewnić wystarczającą sztywność, aby przeniknąć przez osłonę nerwu wzrokowego. Potwierdź drożność końcówki pipety, podając pojedynczy impuls i obserwując, czy na końcówce pipety znajduje się płyn
    5. .
  5. Uściślij położenie końcówki pipety tuż nad miejscem zgniecenia nerwu wzrokowego w środku nerwu wzrokowego i w kontakcie z osłonką nerwu wzrokowego. Zwróć uwagę na pionowe położenie pipety na mikromanipulatorze, aby później określić głębokość 200 μm.
  6. Opuść pipetę, obserwując końcówkę pod lunetą chirurgiczną, aż pipeta wejdzie do nerwu wzrokowego. Jeśli końcówka pipety wygina się i nie jest wystarczająco sztywna, aby przebić osłonę nerwu wzrokowego, schuj pipetę i użyj pary kleszczyków #55, aby zmniejszyć długość i zwiększyć średnicę końcówki pipety. Po wyregulowaniu końcówki pipety spróbuj ponownie przebić pipetą osłonę nerwu wzrokowego.
  7. Po wejściu końcówki pipety do nerwu wzrokowego, w razie potrzeby należy ją schować. Położenie końcówki pipety, wskazywane przez stereotaktyczny mikromanipulator, powinno znajdować się 200 μm poniżej powierzchni nerwu wzrokowego od pozycji początkowej zanotowanej w kroku 5.5.
  8. Obserwując nerw wzrokowy pod lunetą chirurgiczną, należy zastosować impulsy ciśnienia hydrostatycznego za pomocą systemu mikroiniekcyjnego. Podczas stosowania impulsów należy zwrócić uwagę na liniową separację między dystalnym i bliższym końcem nerwu wzrokowego, aby zweryfikować przecięcie nerwu wzrokowego.
    UWAGA: Objętość wstrzyknięcia wynosząca 250–500 nL jest na ogół wystarczająca, aby zapewnić siłę niezbędną do przecięcia nerwu wzrokowego. Wstrzyknięcia wymagające więcej niż 1 μl mogą wskazywać na konieczność zmiany położenia miejsca wstrzyknięcia. Większe objętości wstrzyknięte do nienaruszonego miąższu mogą nie powodować dodatkowych uszkodzeń RGC, biorąc pod uwagę, że metoda całkowicie przecina nerw wzrokowy, ale jest bardziej prawdopodobne, że będzie śledzić wzdłuż pęczków nerwu wzrokowego. Niezaobserwowanie liniowego przecięcia nerwu wzrokowego pomimo wstrzyknięcia wystarczającej ilości płynu prawdopodobnie wskazuje na nieprawidłowe ustawienie pipety w miejscu zgniecenia i konieczność zmiany położenia. Konieczny może być również wzrost ciśnienia wtrysku o 50%.

6. Zamknięcie i odzyskanie

  1. Cofnij pipetę i wyjmij chowane kleszczyki Dumont #5/45. Przywróć oko do neutralnej pozycji, zdejmując zacisk buldoga i zapętlony szew polipropylenowy z kuli ziemskiej.
  2. Zmień położenie spojówki na rąbek rogówki, zapewniając uwolnienie spojówki, która się odwróciła, aby umożliwić prawidłowe przyleganie tkanki i gojenie. Nałóż okulistyczną miejscową maść z antybiotykiem na oko.
  3. Usuń taśmę z powieki 4–0 poliglaktyny i utrzymuj szew na miejscu, aby użyć go do tymczasowej tarsorrhaphy. Przeprowadź szew przez brzeg powieki dolnej powieki, przez obszar podskórny poniżej i wychodząc przez naskórek. Zawiąż szew z naciskiem wystarczającym do zamknięcia oka.
  4. Podawaj pooperacyjne leki przeciwbólowe zgodnie z protokołami instytucjonalnymi i wytycznymi organu ds. opieki nad zwierzętami. Trzymaj zwierzę niezależnie w ogrzewanej klatce, aby dojść do siebie po operacji. Nie umieszczaj ściółki w klatce rekonwalescencyjnej, aby zapobiec przypadkowemu zachwyceniu.

Wyniki

Przecięcie nerwu wzrokowego zazwyczaj prowadzi do apoptycznej utraty 80–90% uszkodzonych RGC w ciągu 14 dni po urazie. Opisana technika umożliwia przecięcie nerwu wzrokowego przy zachowaniu integralności osłonki nerwu wzrokowego (Rycina 1). Stopień utraty RGC jest porównywalny z tradycyjnymi modelami przecinania i zmiażdżenia nerwu wzrokowego, z tą przewagą, że przy zastosowaniu opisanej tutaj metody przecięte końce nerwu są bez wysiłku sąsiadujące po przecięciu (Rycina 2). Ponowne połączenie przeciętych końców nerwu wzrokowego w ten sposób umożliwia ocenę regeneracji aksonów RGC w modelu przecięcia, zapewniając podłoże, na którym aksony mogą rosnąć, bez konieczności stosowania manipulacji mikrochirurgicznych w celu ponownego połączenia przeciętych końców nerwu (Rycina 3). Anterogradne śledzenie aksonów RGC z użyciem podjednostki B toksyny cholerycznej (CTB) wykazuje, że aksony pozytywne pod kątem CTB są całkowicie przecięte po wykonaniu przecinania nerwu wzrokowego z zachowaniem osłonki (Rycina 4). Zachowanie osłonki nerwu wzrokowego podczas jego przecinania tworzy również zamkniętą przestrzeń, do której można dostarczyć i utrzymać w odpowiedniej pozycji materiały badawcze, takie jak czynniki neurotroficzne lub komórki, do uszkodzonych aksonów RGC (Rycina 5). W początkowych fazach szkolenia oczekiwana skuteczność całkowitego przecięcia wynosi 60-70%. Wraz z nabyciem doświadczenia skuteczność całkowitego przecięcia wynosi około 90-95%.

Schemat chirurgii oka, przecięcie gałki ocznej i nerwu wzrokowego, pipeta szklana, miejsce zawiesiny komórkowej.
Rysunek 1: Przecinanie nerwu wzrokowego przy zachowaniu osłonki nerwu wzrokowego. (A) Zdjęcie pola operacyjnego przedstawiające odsłonięcie nienaruszonego nerwu wzrokowego przed przecięciem. (B) Zdjęcie nerwu wzrokowego po prz przecięciu. Cienka pipeta szklana przebiła osłonkę nerwu wzrokowego w miejscu przecięcia i wprowadziła zawiesinę komórkową (mętny roztwór) w przestrzeń między końcami nerwu wzrokowego. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej wykazujące regenerację nerwów przy zastosowaniu różnych metod przecięcia; porównanie na wykresie słupkowym.
Rysunek 2: Utrata komórek zwojowych siatkówki po przecięciu nerwu wzrokowego z zachowaniem pochewki nerwu wzrokowego. Reprezentatywne preparaty płaskie całej siatkówki z oczu z (A) nienaruszony nerw wzrokowy, (B) przezcięcie nerwu wzrokowego z zachowaniem pochewki nerwu wzrokowego, (C) tradycyjna transekcja nerwu wzrokowego, lub (D) w 14 dni po zmiażdżeniu nerwu wzrokowego poddano immunomarkowaniu pod kątem gama-synukleiny (SNCG). Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 10x, skorygowano pod kątem cieniowania i połączono w celu wygenerowania pojedynczego obrazu. W oczach z uszkodzeniem widoczny był ubytek ciał komórek zwojowych siatkówki (RGC) w całej siatkówce. Wstawki przedstawiają obrazy siatkówki przy większym powiększeniu i wykazują znaczną utratę komórek RGC po urazach nerwu wzrokowego. (EIlościowa ocena przeżywalności RGC wykazuje znaczną utratę RGC po uszkodzeniach nerwu wzrokowego w porównaniu z kontrolnymi, nienaruszonymi nerwami wzrokowymi. *p< 0,05 w porównaniu do grupy nienaruszonej; jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Tukeya. n = 3 zwierzęta na grupę; słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe (SD). SP-ONT, przecinanie nerwu wzrokowego z zachowaniem osłonki; ONT, przecinanie nerwu wzrokowego; ONC, zmiażdżenie nerwu wzrokowego. Paski skali = 1,000 µmPaski skali na powiększeniach = 100 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Mikroskopia fluorescencyjna GFAP i DAPI w modelach uszkodzeń nerwów; z zachowaniem osłonki, przezcięcie, zmiażdżenie.
Rysunek 3: Przekroje nerwów wzrokowych po uszkodzeniach nerwu wzrokowego. Reprezentatywne obrazy przekrojów podłużnych nerwów wzrokowych 14 dni po (A-C) przekrojenie z zachowaniem pochewki nerwu wzrokowego, (D-F) tradycyjne przecięcie nerwu wzrokowego, lub (G-I) zmiażdżenie nerwu wzrokowego. (A,D,G) Immunomarkowanie białka kwaśnego gliazalnego włókienkastego (GFAP) wyznacza zasięg uszkodzenia, podczas gdy (B, E, HBarwienie DNA przy użyciu 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) wykazuje ciągłość obecności komórek wzdłuż nerwu wzrokowego oraz w obrębie miejsca uszkodzenia.C,F,I) Nałożone obrazy wykazujące lokalizację tkanki neuronalnej dodatniej pod kątem GFAP oraz komórkowość w miejscu uszkodzenia. Paski skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat znakowania fluorescencyjnego przedstawiający CTB, GFAP, DAPI oraz obraz scalony w tkance nerwowej.
Rysunek 4: Przekrój nerwu wzrokowego po przecięciu nerwu wzrokowego z zachowaniem jego pochewki. Reprezentatywne obrazy przekroju podłużnego nerwu wzrokowego 14 dni po przecięciu z zachowaniem pochewki nerwu wzrokowego, z anterogradnym śledzeniem aksonów po dokrwieniowym wstrzyknięciu podjednostki B toksyny cholerycznej (CTB).A) Można zaobserwować całkowite przerwanie aksonów komórek zwojowych siatkówki (RGC) znakowanych CTB, przebiegających od gałki ocznej (lewo) w stronę mózgu (prawo). (BImmunomarkowanie białka kwaśnego włókienstwa glejowego (GFAP) wykazuje rozległą zmianę obejmującą całą średnicę nerwu wzrokowego.C) Barwienie DNA przy użyciu 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) wykazuje obecność komórek w obrębie zmiany. (D) Obraz złożony przedstawiający lokalizację aksonów znakowanych CTB, tkanki nerwowej pozytywnej pod kątem GFAP oraz komórkowość w miejscu uszkodzenia. Paski skali = 200 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Mikroskopia fluorescencyjna, GFAP, tdTomato, obrazowanie komórek, ekspresja białek, analiza nakładania obrazów.
Rysunek 5: Przekrój podłużny przeciętego nerwu wzrokowego, w który wszczepiono graft komórkowy. Reprezentatywne obrazy przekroju podłużnego nerwu wzrokowego 14 dni po przeprowadzeniu transekcji z zachowaniem osłonki nerwu wzrokowego oraz transplantacji komórek macierzystych neuronów (NSCs) wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego tdTomato. (AImmunomarkowanie białka kwaśnego gliofibrylarnego (GFAP) wykazało całkowite oddzielenie końców przeciętego nerwu wzrokowego.BNSC wykazujące ekspresję tdTomato znajdowały się w przestrzeni utworzonej za pomocą opisanego sposobu i przeżyły po transplantacji.CPrzeszczepione komórki NSC zostały bezpośrednio przyłożone do obu przeciętych końców przerwanego nerwu wzrokowego. Paski skali, 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Dyskusja

Zabiegi chirurgiczne opisujące model przecięcia nerwu wzrokowego zostały opublikowane wcześniej6. Techniki wyszczególnione w tych protokołach obejmują jednak nacięcie osłonki opony mózgowej w celu przecięcia nerwu wzrokowego. Ponadto, aby ocenić regenerację aksonów RGC w poprzednich modelach transsekcji, konieczne były trudne manipulacje mikrochirurgiczne w celu przystosowania przeciętych końców nerwu wzrokowego lub przeszczepu nerwu obwodowego do bliższego kikuta nerwu wzrokowego10,13. Opisany tutaj protokół w minimalnym stopniu zaburza osłonkę nerwu wzrokowego podczas transeksji nerwu wzrokowego i pozwala na ocenę regeneracji aksonów RGC w modelu transsekcji bez konieczności wykonywania trudnych technicznie manipulacji mikrochirurgicznych.

W tym protokole kluczowe znaczenie ma kilka kroków. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy ocznej i układu krwionośnego zaopatrującego głowę nerwu wzrokowego. Dlatego krok 5.1 należy wykonać co najmniej 1,5-2,0 mm za kulą ziemską. Jeśli dojdzie do uszkodzenia tętnicy ocznej i zaburzenia ukrwienia siatkówki, oko powinno zostać wyłączone z dalszych eksperymentów, ponieważ prawdopodobnie dojdzie do ftyzy. Podczas kroków 5.4-5.6 ważne jest, aby zachować integralność osłonki nerwu wzrokowego i zminimalizować rozmiar otworu, przez który szklana pipeta wchodzi do nerwu wzrokowego. W ten sposób tworzy się szczelne uszczelnienie wokół końcówki pipety, aby zmniejszyć refluks płynu i umożliwia wytworzenie wystarczającego ciśnienia hydrostatycznego do przecięcia nerwu wzrokowego. Ukosowanie końcówki szklanych pipet poprawi łatwość, z jaką pipeta wchodzi do nerwu wzrokowego, nie powodując uszkodzeń ubocznych.

Istnieją potencjalne modyfikacje, które operatorzy mogliby wprowadzić, aby poprawić dostępność tej metody. Opisane procedury polegają na minimalnym rozwarstwieniu i usunięciu tkanki oczodołu z zachowaniem nerwu twarzowego i trójdzielnego. Chociaż zmniejsza to zachorowalność i ryzyko krwawienia, tkanki takie jak tłuszcz oczodołowy i gruczoł łzowy mogą ograniczać wizualizację kluczowych struktur. Staranne usunięcie tkanki zasłaniającej pole operacyjne może być konieczne w celu poprawy wizualizacji, szczególnie u starszych zwierząt. Podejście boczne można również zastosować w celu poprawy dostępu do nerwu wzrokowego. Jednak rozwarstwienie boczne grozi uszkodzeniem dodatkowych struktur, w tym nerwu trójdzielnego, jest bardziej skomplikowane i może stanowić własne wyzwanie dla kierowania instrumentami do wstrzykiwań.

Możliwym ograniczeniem tej metody jest brak możliwości bezpośredniego manipulowania nerwem wzrokowym i pełnej wizualizacji całego przecięcia. W związku z tym istnieje możliwość niepełnej transsekcji. Zaobserwowaliśmy jednak, że wizualne potwierdzenie oddzielenia się końców nerwowych podczas kroku 5.8 jest wiarygodnym wskaźnikiem udanej i pełnej transsekcji. Jeśli zakończenia nerwów nie rozdzielą się, zmiana położenia pipety do wstrzykiwań lub zwiększenie ciśnienia iniekcji o 50% powinno zapewnić wystarczającą siłę, aby całkowicie przeciąć nerw.

W odniesieniu do istniejących metod, podejście to zachowuje integralność osłonki nerwu wzrokowego. Zachowując integralność osłonki nerwu wzrokowego, końce przeciętego nerwu wzrokowego nie są narażone na działanie środowiska oczodołowego i obwodowego układu odpornościowego, ograniczając w ten sposób narażenie na czynniki immunologiczne, które mogą potencjalnie wpływać na odpowiedzi RGC. Dodatkowo, zachowanie integralności osłonki nerwu wzrokowego podczas transekcji nerwu wzrokowego tworzy zamkniętą przestrzeń fizyczną ograniczoną końcami nerwu wzrokowego i osłonką nerwu wzrokowego. Miejscowe dostarczanie czynników neurotroficznych, komórek lub polimerów do przedziału aksonalnego uszkodzonych RGC można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie do nowo utworzonej przestrzeni. 14 Alternatywnie, regenerację aksonów RGC można ocenić w modelu transsekcji, umożliwiając zespolenie przeciętych końców nerwu wzrokowego bez konieczności stosowania trudnych technik mikrochirurgicznych.

Zastosowania tej metody obejmują ocenę uszkodzonego przedziału aksonalnego RGC z interwencjami specyficznymi dla aksonów w celu identyfikacji szlaków odpowiedzialnych za zwyrodnienie aksonów i zapobiegania utracie aksonów po urazie przecięcia. Co więcej, metoda ta sprawia, że badania nad regeneracją aksonów RGC w modelu transsekcji są dostępne dla szerszej społeczności naukowej, eliminując potrzebę wykonywania trudnych technicznie zabiegów zespolenia nerwu wzrokowego. Interwencje mające na celu promowanie regeneracji aksonów RGC mogą być oceniane za pomocą tego modelu poważnych uszkodzeń i zapewniają spójne i powtarzalne wyniki bez obaw o oszczędzone aksony.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konkurencyjnych ani sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez grant K12 Career Development (5K12EY024225-04, National Eye Institute), grant podstawowy P30 (P30EY022589, National Eye Institute), nagrodę Mentoring for the Advancement of Physician Scientists (American Glaucoma Society) oraz nieograniczony grant od Research to Prevent Blindness (Nowy Jork, NY).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-0 Szew poliglaktynowyEthiconJ315H
9-0 Szew polipropylenowyEthicon1754G
AcepromazynaButler0038450,5-4 mg / kg
Stężenie podstawowe: 10 mg / ml
Stężenie końcowe: 0,25 mg / ml
AmpicillinSandoz0781-3404-8580-100 mg / kg
Stężenie końcowe: 50 mg / ml
System anestezjologicznyVetEquip901806
Inkubator dla zwierzątInkubatory precyzyjneChick Chalet II
BanamineSchering-Plough0061-0851-032,5-5 mg / kg
Stężenie magazynowe: 50 mg / ml < br / > Stężenie końcowe: 0,5 mg / ml
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision Instruments1B150F-4
Colibri kleszczeKatenaK5-1500
Dumont #5/45 kleszczeFine Science Tools11251-35
Pompa do terapii cieplnejKent ScientificHTP-1500
IsofluraneCovetrus29404
Johns Hopkins BulldogClamp RobozRS-7440
KetaminaPutney26637-411-0140-80 mg / kg
Stężenie podstawowe: 100 mg / ml
Stężenie końcowe: 25 mg / ml
System mikroiniekcji (Picospritzer II)Zawór ogólny, Inc
Strzykawka mikrolitrowa 5 i mikro; LHamilton88000
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.Model P-77 Brązowo-płonąca
neomycyna / siarczany polimyksyny B / Bacytracyna Cynkowa maść okulistycznaBausch + Lomb
PBSMilliporeBSS-1005-B
Powidon-jodHealthpetsBET16OZ
Chlorowodorek proparakainy 0,5%Bausch + Lomb
RingersAbbott04860-04-102-3 ml / wstrzyknięcie
Stereotaktyczny mikroskopKopf
Nożyczki Zeiss
VannasNarzędzia do naukiprecyzyjnej 91500-09
KsylazynaLloyd04102,5-8 mg / kg
Stężenie podstawowe: 100 mg / ml
Końcowe stężenie: 5,8 mg / ml
chirurgiczny z ramą

Bibliografia

  1. Quigley, H. A. Optic Nerve Damage in Human Glaucoma. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635(1981).
  2. Steinsapir, K. D., Goldberg, R. A. Traumatic optic neuropathy: An evolving understanding. American Journal of Ophthalmology. 151 (6), 928-933 (2011).
  3. Kerrigan-Baumrind, L. A., Quigley, H. A., Pease, M. E., Kerrigan, D. F., Mitchell, R. S. Number of ganglion cells in glaucoma eyes compared with threshold visual field tests in the same persons. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 41 (3), 741-748 (2000).
  4. Agudo, M., et al. Time course profiling of the retinal transcriptome after optic nerve transection and optic nerve crush. Molecular Visison. 14, 1050-1063 (2008).
  5. Cameron, E., Xia, X., Galvao, J., Ashouri, M., Kapiloff, M., Goldberg, J. Optic nerve crush in mice to study retinal ganglion cell survival and regeneration. Bio-Protocol. 10 (6), 139-148 (2020).
  6. Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic nerve transection: A model of adult neuron apoptosis in the central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (51), e2241(2011).
  7. Fischer, D., Harvey, A. R., Pernet, V., Lemmon, V. P., Park, K. K. Optic nerve regeneration in mammals: Regenerated or spared axons. Experimental Neurology. 296, 83-88 (2017).
  8. Kim, J., Sajid, M. S., Trakhtenberg, E. F. The extent of extra-axonal tissue damage determines the levels of CSPG upregulation and the success of experimental axon regeneration in the CNS. Science Report. 8 (1), 1-10 (2018).
  9. Inoue, T., Hosokawa, M., Morigiwa, K., Ohashi, Y., Fukuda, Y. Bcl-2 overexpression does not enhance in vivo axonal regeneration of retinal ganglion cells after peripheral nerve transplantation in adult mice. Journal of Neuroscience. 22 (11), 4468-4477 (2002).
  10. Fischer, D., Heiduschka, P., Thanos, S. Lens-injury-stimulated axonal regeneration throughout the optic pathway of adult rats. Experimental Neurology. 172 (2), 257-272 (2001).
  11. Cui, Q., Harvey, A. R. CNTF promotes the regrowth of retinal ganglion cell axons into murine peripheral nerve grafts. Neuroreport. 11 (18), 3999-4002 (2000).
  12. Tuszynski, M. H., Steward, O. Concepts and methods for the study of axonal regeneration in the CNS. Neuron. 74 (5), 777-791 (2012).
  13. You, S. W., et al. Large-scale reconstitution of a retina-to-brain pathway in adult rats using gene therapy and bridging grafts: An anatomical and behavioral analysis. Experimental Neurology. 279, 197-211 (2016).
  14. Wang, D., et al. Localized co-delivery of CNTF and FK506 using a thermosensitive hydrogel for retina ganglion cells protection after traumatic optic nerve injury. Drug Delivery. 27 (1), 556-564 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Os onka nerwu wzrokowegoci nienie hydrostatycznetechnika mikrowstrzykiwaniareappozycja ko c w nerwumodel uszkodzenia aksonutest regeneracjibariera krew m zg

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.