Artykuł metodologiczny

Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

DOI:

10.3791/61749

⸱

6 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę iniekcji doszklistkowej i późniejszej oceny ilościowej bakterii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Protokół ten można rozszerzyć o pomiar odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz ekspresji genów bakteryjnych i gospodarza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wewnątrzgałkowe infekcje bakteryjne stanowią zagrożenie dla wzroku. Naukowcy wykorzystują modele zwierzęce do zbadania czynników gospodarza i bakterii oraz szlaków odpowiedzi immunologicznej związanych z infekcją, aby zidentyfikować realne cele terapeutyczne i przetestować leki zapobiegające ślepocie. Technika iniekcji doszklistkowej służy do wstrzykiwania organizmów, leków lub innych substancji bezpośrednio do jamy ciała szklistego w tylnym segmencie oka. Tutaj zademonstrowaliśmy tę technikę wstrzykiwania w celu zainicjowania infekcji w oku myszy oraz technikę ilościowego oznaczania bakterii wewnątrzgałkowych. Bacillus cereus hodowano w płynnej pożywce do infuzji mózgu serca przez 18 godzin i ponownie zawieszono do stężenia 100 jednostek tworzących kolonie (CFU)/0,5 μl. Mysz C57BL/6J została znieczulona przy użyciu kombinacji ketaminy i ksylazyny. Za pomocą mikrowstrzykiwacza pikolitra i szklanych igieł kapilarnych wstrzyknięto 0,5 μl zawiesiny Bacillus do środkowego ciała szklistego oka myszy. Do przeciwległego oka kontrolnego wstrzykiwano sterylne podłoże (kontrola chirurgiczna) lub nie wstrzykiwano go (kontrola bezwzględna). Po 10 godzinach od zakażenia myszy poddano eutanazji, a oczy pobrano za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej i umieszczono w probówce zawierającej 400 μl sterylnego PBS i sterylne szklane koraliki o średnicy 1 mm. W przypadku testów ELISA lub mieloperoksydazy do probówek dodano inhibitor proteinazy. Do ekstrakcji RNA dodano odpowiedni bufor do lizy. Oczy homogenizowano w homogenizatorze tkankowym przez 1-2 minuty. Homogenaty rozcieńczano seryjnie 10-krotnie w PBS i rozcieńczano torem na płytkach agarowych. Pozostałe homogenaty przechowywano w temperaturze -80 °C do dodatkowych testów. Płytki inkubowano przez 24 godziny, a CFU na oko określono ilościowo. Techniki te skutkują powtarzalnymi infekcjami w oczach myszy i ułatwiają ilościowe określanie liczby żywotnych bakterii, odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz omiki ekspresji genów gospodarza i bakterii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej to wyniszczająca infekcja, która powoduje stan zapalny, a jeśli nie jest odpowiednio leczona, może spowodować utratę wzroku lub ślepotę. Zapalenie wnętrza gałki ocznej wynika z wnikania bakterii do wnętrza oka1,2,3,4,5. W oku bakterie namnażają się, wytwarzają toksyny i inne szkodliwe czynniki i mogą powodować nieodwracalne uszkodzenia delikatnych komórek i tkanek siatkówki. Uszkodzenie oczu może być również spowodowane stanem zapalnym, z powodu aktywacji szlaków zapalnych prowadzących do napływu komórek zapalnych do wnętrza oka1,5,6. Zapalenie wnętrza gałki ocznej może wystąpić po operacji wewnątrzgałkowej (po operacji), penetrującym urazie oka (pourazowym) lub w wyniku przerzutowego rozprzestrzenienia się bakterii do oka z innego miejsca anatomicznego (endogennego)7,8,9,10. Leczenie bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej obejmuje antybiotyki, leki przeciwzapalne lub interwencję chirurgiczną3,4,11. Nawet przy tych zabiegach może dojść do utraty wzroku lub samego oka. Rokowanie wzrokowe po bakteryjnym zapaleniu wnętrza gałki ocznej na ogół różni się w zależności od skuteczności leczenia, ostrości wzroku w momencie prezentacji i zjadliwości organizmu infekującego.

Bacillus cereus (B. cereus) jest jednym z głównych patogenów bakteryjnych, które powoduje pourazowe zapalenie wnętrza gałki ocznej7,12. Większość przypadków zapalenia wnętrza gałki ocznej B. cereus ma szybki przebieg, który może prowadzić do ślepoty w ciągu kilku dni. Cechy charakterystyczne zapalenia wnętrza gałki ocznej B. cereus obejmują szybko rozwijające się zapalenie wewnątrzgałkowe, ból oka, szybką utratę ostrości wzroku i gorączkę. B. cereus rośnie szybko w oku w porównaniu z innymi bakteriami, które często powodują infekcje oczu2,4,12 i posiada wiele czynników wirulencji. W związku z tym okno na skuteczną interwencję terapeutyczną jest stosunkowo krótkie1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Leczenie tej infekcji jest zwykle skuteczne w leczeniu zapalenia wnętrza gałki ocznej wywołanego przez inne, mniej zjadliwe patogeny, ale zapalenie wnętrza gałki ocznej B. cereus zwykle powoduje u ponad 70% pacjentów cierpiących na znaczną utratę wzroku. Około 50% tych pacjentów przechodzi patroszenie lub enukleację zakażonego oka7,16,22,23. Destrukcyjny i szybki charakter B. cereus endophthalmitis wymaga natychmiastowego i odpowiedniego leczenia. Niedawny postęp w rozpoznawaniu mechanizmów leżących u podstaw rozwoju choroby pozwolił zidentyfikować potencjalne cele interwencji19,26,27. Eksperymentalne mysie modele zapalenia wnętrza gałki ocznej B. cereus są nadal przydatne w rozpoznawaniu mechanizmów infekcji i testowaniu potencjalnych środków terapeutycznych, które mogą zapobiegać utracie wzroku.

Eksperymentalne zakażenie wewnątrzgałkowe myszy B. cereus było instrumentalnym modelem do zrozumienia czynników bakteryjnych i gospodarza, a także ich interakcji, podczas zapalenia wnętrza gałki ocznej28. Model ten naśladuje zdarzenie pourazowe lub pooperacyjne, w którym bakterie są wprowadzane do oka podczas urazu. Model ten jest wysoce powtarzalny i okazał się przydatny do testowania eksperymentalnych terapii i dostarczania danych dotyczących poprawy standardu opieki1,6,19,29,30. Podobnie jak wiele innych modeli infekcji, model ten pozwala na niezależną kontrolę wielu parametrów infekcji oraz umożliwia skuteczne i powtarzalne badanie wyników infekcji. Badania przeprowadzone w podobnym modelu na królikach w ciągu ostatnich kilku dekad dotyczyły wpływu czynników wirulencji B. cereus na oko2,4,13,14,31. Poprzez wstrzyknięcie zmutowanych szczepów B. cereus pozbawionych indywidualnych lub wielu czynników wirulencji, udział tych czynników wirulencji w nasileniu choroby można zmierzyć za pomocą takich wyników, jak stężenie bakterii w różnych godzinach po zakażeniu lub utrata funkcji wzrokowych13,14,27,31,32. Ponadto w tym modelu zbadano czynniki gospodarza poprzez zakażenie nokautujących szczepów myszy pozbawionych specyficznych czynników zapalnych gospodarza26,29,33,34,35. Model jest również przydatny do testowania potencjalnych metod leczenia tej choroby poprzez wstrzykiwanie nowych związków do oka po zakażeniu30,36. W tym manuskrypcie opisujemy szczegółowy protokół, który obejmuje zakażenie oka myszy B. cereus, pobranie oka po infekcji, ilościowe określenie wewnątrzgałkowego obciążenia bakteryjnego i zachowanie próbek w celu oznaczenia dodatkowych parametrów ciężkości choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych oraz Oświadczeniu Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Oklahomy (numery protokołów 15-103, 18-043 i 18-087).

1. Sterylne igły szklane

  1. Włącz ściągacz do pipet igłowych.
  2. Wyreguluj pokrętło grzałki, aż na wyświetlaczu pojawi się 12.6.
  3. Otwórz drzwi i ręcznie przeprowadź rurkę kapilarną o pojemności 5 μl przez górny zacisk i żarnik grzałki, aż połowa rurki wysunie się poniżej żarnika (Rysunek 1A).
  4. Upewnij się, że rurka kapilarna znajduje się w rowku "V" w górnym zacisku. Dokręcić górny clamp.
  5. Gdy dolny zacisk otwarty, ręcznie wyreguluj suwak pionowy w górę, aż dolny clamp osiągnie górną granicę. Upewnij się, że rurka znajduje się w rowku "V" w dolnym zacisku. Dokręcić dolny zacisk.
  6. Zamknij drzwi i upewnij się, że świeci się kontrolka "Gotowy". Naciśnij przycisk Start, aby zainicjować sekwencję grzałki i ciągnięcia ( Rysunek 1B).
  7. Upewnij się, że grzejnik wyłącza się automatycznie po tym, jak ciepło i grawitacja rozsuną rurkę kapilarną (Rysunek 1C), a suwak przesuwa się w dół.
  8. Otwórz drzwi. Trzymając górną część rurki kapilarnej, odkręć górny zacisk. Wyjmij górną rurkę kapilarną i odłóż ją na bok.
  9. Przytrzymaj rurkę kapilarną w dolnym suwaku i odkręć dolny zacisk. Wyjmij dolną rurkę kapilarną i odłóż ją na bok.
  10. Użyj ukosowarki mikroelektrodowej z płytą szlifierską ze ścierniwa z tlenku glinu 0,05 μm, aby ukosować ciągniętą rurkę kapilarną w celu wytworzenia igieł iniekcyjnych.
  11. Na płytę mielącą nanieść pipetą odpowiednią ilość wody, aby pokryła powierzchnię (Rysunek 1D).
  12. Włącz ukosowarkę tak, aby zaczęła się obracać z prędkością 60 obr./min. Umieść wyciągniętą rurkę kapilarną w pipecie clamp w rowku "V". Dokręć zacisk i wyreguluj kąt zacisku pipety na 30°.
  13. Wyreguluj końcówkę spiczastej krawędzi rurki kapilarnej w odległości około dwóch trzecich od środka obrotu płyty szlifierskiej.
  14. Opuść zaciśniętą rurkę kapilarną, regulując zgrubne pokrętło sterujące w górnej części manipulatora. Kontynuuj opuszczanie rurki kapilarnej, aż końcówka rurki kapilarnej wysunie się poniżej powierzchni wody i zetknie się z powierzchnią ścierną płyty szlifierskiej.
  15. Monitoruj postęp ukosowania za pomocą mikroskopu dołączonego do ukosowarki. Po 5 minutach wyreguluj precyzyjną kontrolę, aby podnieść szklaną igłę z płyty mielącej.
  16. Wyjmij szklaną igłę i umieść ją pod 10-krotnym powiększeniem, aby sprawdzić końcówkę rurki kapilarnej (Rysunek 1E,F).
  17. Aby upewnić się, że nie ma zatorów, włóż szklaną igłę do uchwytu na pipety na strzykawce i wepchnij powietrze do probówki o pojemności 1 ml zawierającej 99% etanol. Jeśli na końcu igły tworzą się pęcherzyki powietrza, oznacza to, że igła nie ma zatorów i może być używana do mikroiniekcji. Proces ten zapewnia również sterylność szklanych igieł.
  18. Jedna rurka kapilarna może pomieścić do 5 μl płynu. Oznacz rurkę kapilarną na 10 sekcji, aby obliczyć odległości na igle do oznaczenia objętości 0,5 μl. Zaznacz wagę z tą odległością, która mieści 0,5 μl do przyszłego przygotowania. W przypadku igły o pojemności 5 μl odległości od siebie wynoszące 0,7 mm wynoszą 0,5 μl (Rysunek 1G).

2. Kultura Bacillus cereus

  1. Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
  2. Zapas B. cereus ATCC 14579 do izolacji pojedynczej kolonii na 5% płytce z agarem z krwią owczą i inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C (Rysunek 2A).
  3. Odpipetować 5 ml sterylnego bulionu Brain Heart Infusion (BHI) do sterylnej probówki z zatrzaskiem o pojemności 10 ml (Rysunek 2B). Za pomocą sterylnej pętli lub igły wybierz pojedynczą kolonię B. cereus ATCC 14579 z płytki agarowej i zaszczepij płynny BHI.
  4. Krótko wymieszać próbkę. Umieść rurkę z zatrzaskiem w obrotowym inkubatorze. Ustaw temperaturę na 37 °C i prędkość na 200 obr./min. Po 18 godzinach wyjmij kulturę z inkubatora (Rysunek 2B).

3. Rozcieńczenie bakteryjne do iniekcji doszklistkowej

  1. Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
  2. Obliczyć objętość nocnej kultury B. cereus, aby dodać do 10 ml świeżego BHI, aby uzyskać 200 jednostek tworzących kolonie na mikrolitr (jtk/μl). Na przykład, nocna hodowla B. cereus w BHI replikuje się do około 2 x 108 CFU/ml, które następnie można rozcieńczyć do 200 CFU/μL przez pipetowanie 10 μl nocnej hodowli do 10 ml świeżego BHI.
  3. Odpipetować 1 ml świeżo rozcieńczonej kultury do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj tę rurkę na lodzie do momentu wstrzyknięcia do ciała szklistego. Wykonać iniekcję doszklistkową w ciągu 60 minut od rozcieńczenia kultury bakteryjnej.

4. Wstrzyknięcie doszklistkowe myszy

  1. Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
  2. Przygotuj miejsce zabiegu, umieszczając podkładki medyczne na stole operacyjnym.
  3. Włącz mikrowtryskiwacz i otwórz zawór gazu na zbiorniku sprężonego powietrza podłączonym do mikrowtryskiwacza. Wyreguluj regulator zbiornika, aż dopływ gazu wyniesie około 60 psi.
  4. Na mikrowtryskiwaczu naciskaj Mode, aż na ekranie pojawi się Balance. Naciśnij przycisk Balance i umieść mysz komputerową na stole operacyjnym. Podłącz uchwyt na pipety ze stali nierdzewnej do rurki podłączonej do "Napełniania/Wyprowadzenia" wtryskiwacza. Ta rurka jest zawsze podłączona do wtryskiwacza.
  5. Włóż igłę kapilarną do drugiego końca uchwytu pipety, dokręcając mocno łącznik uchwytu pipety wokół igły.
  6. Włącz mikroskop okulistyczny i włącz jego światło o natężeniu 50%. Ustaw mikroskop nad miejscem zabiegu na stole operacyjnym i ustaw mikroskop na żądaną ostrość.
  7. Przed rozpoczęciem zabiegu upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, testując odruch wycofania pedału. Pamiętaj, aby postępować zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem znieczulenia.
  8. Umieść znieczuloną mysz na podkładkach medycznych z nosem skierowanym w prawo i opartym na lewym boku.
  9. Spójrz na prawe oko myszy przez mikroskop okulistyczny i otwórz powieki, otwierając szczypce kleszczy o odwrotnym działaniu po obu stronach oka, aby odsłonić miejsce wstrzyknięcia (Rysunek 3C).
  10. Napełnij igłę kapilarną rozcieńczeniem 200 jtk/μl, klikając lewym przyciskiem myszy podkładkę pod mysz podłączoną do mikrowtryskiwacza (Rysunek 3D).
  11. Zabezpiecz głowę zwierzęcia lewą ręką i umieść końcówkę igły na rąbku oka. Trzymając igłę w pozycji skośnej do góry i pod kątem 45°, nakłuć oko myszy, ale upewnić się, że podczas wstrzykiwania wkłada się tylko ostrą końcówkę igły (~0,5 mm).
  12. Po wkłuciu końcówki igły przesuń lewą rękę od główki myszy do podkładki myszy i kliknij prawym przyciskiem myszy na podkładkę pod mysz, aby wstrzyknąć 0,5 μl rozcieńczenia B. cereus. Aby zapobiec wyciekom, pozostaw końcówkę igły w oku myszy na 2-3 sekundy przed wyjęciem (Rysunek 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Zwolnij kleszcze i umieść mysz w klatce, która znajduje się na podkładce rozgrzewającej. Monitoruj te myszy, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia (Ryc. 3F).
  14. Gdy myszy wyjdą ze znieczulenia, umieść klatkę z powrotem na właściwym stojaku. Jeśli myszy zostaną poddane analizie funkcji siatkówki za pomocą elektroretinografii, klatki powinny zostać przeniesione z powrotem do ciemnego pomieszczenia w celu prawidłowej adaptacji do ciemności.

5. Przygotowanie rurki do zbioru

  1. Umieść sterylne szklane koraliki o średnicy 1 mm w probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml.
  2. Wysterylizuj te probówki w autoklawie na sucho. Przed użyciem pozwól rurkom ostygnąć do temperatury pokojowej.
  3. Dodaj 10 ml 1x sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  4. Dodać 1 tabletkę koktajlu inhibitorów proteazy do probówki. Mieszaj przez vortexing19,27,29,34,35.
  5. Odpipetować 400 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej inhibitor proteazy do każdej autoklawizowanej probówki do zbioru. Oznacz probówki i umieść na lodzie. (Rysunek 4A).

6. Zbieranie oczu

  1. Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
  2. Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 . Użyj metody wtórnej, aby potwierdzić eutanazję.
  3. Trzymaj uśpioną głowę myszy bezpiecznie i otwórz kleszcze z cienką końcówką po obu stronach zainfekowanego oka. Popchnij w dół w kierunku głowy, aby podeprzeć oko. Gdy szczypce znajdą się za gałką oka, ściśnij szczypce razem. Odciągnij kleszcze od głowy, aby odłączyć gałkę oczną (Rysunek 4B).
  4. Natychmiast umieść gałkę oczną w oznakowanej tubie do zbioru. Umieść probówki na lodzie na nie dłużej niż 60 minut (Rysunek 4C).

7. Liczba bakterii wewnątrzgałkowych

  1. Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
  2. Upewnij się, że wszystkie probówki do pobierania są szczelnie zamknięte i wyważone, gdy znajdują się w homogenizatorze tkankowym (Rysunek 5A). Włącz homogenizator tkankowy na 1 minutę, aby homogenizować próbki. Odczekaj 30 sekund, a następnie włącz na kolejną minutę. Umieść rurki na lodzie (Rysunek 5B,C).
  3. Seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę 10-krotnie, przenosząc kolejno 20 μl homogenatu do 180 μl sterylnego 1x PBS. Rozcieńczać aż do osiągnięcia współczynnika 10-7 (Rysunek 5D).
  4. Oznacz każdy rząd ciepłej, kwadratowej płytki BHI odpowiednimi współczynnikami rozcieńczenia. Przenieść 10 μl każdego rozcieńczenia z rzędu na górną płytkę BHI, która jest nachylona pod kątem około 45°. Pozwól próbce płynąć, aż prawie dotrze do dna płytki, a następnie połóż płytkę płasko (Rysunek 5E)39.
  5. Gdy próbka zostanie wchłonięta przez agar BHI, przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C. Kolonie powinny zacząć być widoczne po 8 godzinach od umieszczenia w inkubatorze.
  6. Wyjmij płytkę z inkubatora, zanim wzrost kolonii B. cereus zakłóci identyfikację poszczególnych kolonii (Rysunek 5F).
  7. Aby uzyskać dokładne odwzorowanie stężenia w próbce, policz wiersz, który ma od 10 do 100 kolonii. Na przykład rząd o frakcji rozcieńczenia 10-4, który ma 45 kolonii, będzie miał stężenie 4,5 x 105 CFU/ml.
  8. Aby obliczyć całkowitą liczbę bakterii na oko, pomnóż stężenie przez 0,4, co odpowiada mililitrowej objętości 1x PBS użytej do homogenizacji oka. Na przykład stężenie 4,5 x 105 CFU/ml przełożyłoby się na 1,8 x 105 CFU B. cereus na oko.

8. Przechowywanie próbek

  1. Umieść próbki homogenatu w oznakowanym pudełku do zamrażania i umieść to pudełko w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Próbki te można później wykorzystać do analizy mediatora stanu zapalnego metodą ELISA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie powtarzalnego inokulum i dokładność procedury iniekcji doszklistkowej są kluczowymi krokami w rozwoju modeli mikrobiologicznego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Tutaj zademonstrowaliśmy procedurę iniekcji do ciała szklistego przy użyciu Gram-dodatniego Bacillus cereus. Wstrzyknęliśmy 100 CFU/0,5 μl B. cereus do środkowego ciała szklistego pięciu myszy C57BL6. Po 10 godzinach od zakażenia zaobserwowaliśmy wewnątrzgałkowy wzrost B. cereus do około 1,8 x 105 CFU/oko.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nawet przy dostępności silnych antybiotyków, leków przeciwzapalnych i operacji witrektomii, bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej może oślepić pacjenta. Badania kliniczne były przydatne w badaniu zapalenia wnętrza gałki ocznej; Jednak eksperymentalne modele zapalenia wnętrza gałki ocznej zapewniają szybkie i powtarzalne wyniki, które można przełożyć na postęp w standardowej opiece, co skutkuje lepszymi wynikami wizualnymi dla pacjentów.

Objętość ciała szklistego oka myszy wynosi około 7 μL...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Dr. Feng Li i Markowi Dittmarowi (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) za pomoc. Nasze badania zostały wsparte grantami National Institutes of Health R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 i R01EY024140. Nasze badania zostały również wsparte przez P30EY21725 (grant NIH CORE na obrazowanie i analizę żywych zwierząt, biologię molekularną i obrazowanie komórkowe). Nasze badania były również wspierane przez program stażowy NEI Vision Science Pre-doctoral Trainee 5T32EY023202, grant Presbyterian Health Foundation Research Support oraz nieograniczony grant dla Dean A. McGee Eye Institute z Research to Prevent Blindness.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-20 i mikro; PipetaL Inkubator RANINL0696003GNA
37oCFisher Scientific11-690-625DNA
Bacto Brain Heart InfusionBD90003-032
Mikrowstrzykiwacz komórekMicroData Instrument, Inc.PM2000NA
Kleszczyki z cienką końcówkąThermo Fisher Scientific12-000-122NA
Koraliki szklane 1,0 mmBioSpec11079110NA
Wytrząsarka do inkubatoraNew Brunswick ScientificNB-I2400NA
Pipety mikrokapilarne 5 mikrolitrówKimble71900-5NA
Mikropipeta BevelerSutter Instrument Co.BV-10NA
Mikroskop Axiostar PlusZeissNA
Mikroskop OPMI LumeraZeissNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607NA
Pipeta wielokanałowa 30-300 µ LPipeta wielokanałowa Biohit15626090NA
5-100 &mikro; LBiohit9143724NA
Ściągacz do igieł/pipetKopf730NA
PBSGIBCOklasy molekularnej
Roche4693159001Klasa molekularna
Kleszcze o odwrotnym działaniuKatenaK5-8228NA
NA 1897315 Koktajl inhibitorów proteazy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537(2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560(2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959(2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L. Jr, Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Jr Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96(2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335(2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763(2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543(2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632(2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619(2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O'Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Intravitreal InjectionBacterial EndophthalmitisMouse ModelCFU QuantitationTissue HomogenizationSerial DilutionAgar Plate IncubationColony Forming UnitsProtease InhibitorGlass Capillary Needle

Powiązane artykuły