Method Article

Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

DOI:

10.3791/61749

⸱

February 6th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę iniekcji doszklistkowej i późniejszej oceny ilościowej bakterii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Protokół ten można rozszerzyć o pomiar odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz ekspresji genów bakteryjnych i gospodarza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wewnątrzgałkowe infekcje bakteryjne stanowią zagrożenie dla wzroku. Naukowcy wykorzystują modele zwierzęce do zbadania czynników gospodarza i bakterii oraz szlaków odpowiedzi immunologicznej związanych z infekcją, aby zidentyfikować realne cele terapeutyczne i przetestować leki zapobiegające ślepocie. Technika iniekcji doszklistkowej służy do wstrzykiwania organizmów, leków lub innych substancji bezpośrednio do jamy ciała szklistego w tylnym segmencie oka. Tutaj zademonstrowaliśmy tę technikę wstrzykiwania w celu zainicjowania infekcji w oku myszy oraz technikę ilościowego oznaczania bakterii wewnątrzgałkowych. Bacillus cereus hodowano w płynnej pożywce do infuzji mózgu serca przez 18 godzin i ponownie zawieszono do stężenia 100 jednostek tworzących kolonie (CFU)/0,5 μl. Mysz C57BL/6J została znieczulona przy użyciu kombinacji ketaminy i ksylazyny. Za pomocą mikrowstrzykiwacza pikolitra i szklanych igieł kapilarnych wstrzyknięto 0,5 μl zawiesiny Bacillus do środkowego ciała szklistego oka myszy. Do przeciwległego oka kontrolnego wstrzykiwano sterylne podłoże (kontrola chirurgiczna) lub nie wstrzykiwano go (kontrola bezwzględna). Po 10 godzinach od zakażenia myszy poddano eutanazji, a oczy pobrano za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej i umieszczono w probówce zawierającej 400 μl sterylnego PBS i sterylne szklane koraliki o średnicy 1 mm. W przypadku testów ELISA lub mieloperoksydazy do probówek dodano inhibitor proteinazy. Do ekstrakcji RNA dodano odpowiedni bufor do lizy. Oczy homogenizowano w homogenizatorze tkankowym przez 1-2 minuty. Homogenaty rozcieńczano seryjnie 10-krotnie w PBS i rozcieńczano torem na płytkach agarowych. Pozostałe homogenaty przechowywano w temperaturze -80 °C do dodatkowych testów. Płytki inkubowano przez 24 godziny, a CFU na oko określono ilościowo. Techniki te skutkują powtarzalnymi infekcjami w oczach myszy i ułatwiają ilościowe określanie liczby żywotnych bakterii, odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz omiki ekspresji genów gospodarza i bakterii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej to wyniszczająca infekcja, która powoduje stan zapalny, a jeśli nie jest odpowiednio leczona, może spowodować utratę wzroku lub ślepotę. Zapalenie wnętrza gałki ocznej wynika z wnikania bakterii do wnętrza oka1,2,3,4,5. W oku bakterie namnażają się, wytwarzają toksyny i inne szkodliwe czynniki i mogą powodować nieodwracalne uszkodzenia delikatnych komórek i tkanek siatkówki. Uszkodzenie oczu może być również spowodowane stanem zapalnym, z powodu aktywacji szlaków za....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych oraz Oświadczeniu Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Oklahomy (numery protokołów 15-103, 18-043 i 18-087).

1. Sterylne igły szklane

  1. Włącz ściągacz do pipet igłowych.
  2. Wyreguluj pokrętło grzałki, aż na wyświetlaczu pojawi się 12.6.
  3. Otw....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie powtarzalnego inokulum i dokładność procedury iniekcji doszklistkowej są kluczowymi krokami w rozwoju modeli mikrobiologicznego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Tutaj zademonstrowaliśmy procedurę iniekcji do ciała szklistego przy użyciu Gram-dodatniego Bacillus cereus. Wstrzyknęliśmy 100 CFU/0,5 μl B. cereus do środkowego ciała szklistego pięciu myszy C57BL6. Po 10 godzinach od zakażenia zaobserwowaliśmy wewnątrzgałkowy wzrost B. cereus do około 1,8 x 105 CFU/oko.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nawet przy dostępności silnych antybiotyków, leków przeciwzapalnych i operacji witrektomii, bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej może oślepić pacjenta. Badania kliniczne były przydatne w badaniu zapalenia wnętrza gałki ocznej; Jednak eksperymentalne modele zapalenia wnętrza gałki ocznej zapewniają szybkie i powtarzalne wyniki, które można przełożyć na postęp w standardowej opiece, co skutkuje lepszymi wynikami wizualnymi dla pacjentów.

Objętość ciała szklistego oka myszy wynosi około 7 μL.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Dr. Feng Li i Markowi Dittmarowi (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) za pomoc. Nasze badania zostały wsparte grantami National Institutes of Health R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 i R01EY024140. Nasze badania zostały również wsparte przez P30EY21725 (grant NIH CORE na obrazowanie i analizę żywych zwierząt, biologię molekularną i obrazowanie komórkowe). Nasze badania były również wspierane przez program stażowy NEI Vision Science Pre-doctoral Trainee 5T32EY023202, grant Presbyterian Health Foundation Research Support oraz nieograniczony grant dla Dean A. McGee Eye Institute z Research to Preve....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-20 i mikro; PipetaL Inkubator RANINL0696003GNA
37oCFisher Scientific11-690-625DNA
Bacto Brain Heart InfusionBD90003-032
Mikrowstrzykiwacz komórekMicroData Instrument, Inc.PM2000NA
Kleszczyki z cienką końcówkąThermo Fisher Scientific12-000-122NA
Koraliki szklane 1,0 mmBioSpec11079110NA
Wytrząsarka do inkubatoraNew Brunswick ScientificNB-I2400NA
Pipety mikrokapilarne 5 mikrolitrówKimble71900-5NA
Mikropipeta BevelerSutter Instrument Co.BV-10NA
Mikroskop Axiostar PlusZeissNA
Mikroskop OPMI LumeraZeissNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607NA
Pipeta wielokanałowa 30-300 µ LPipeta wielokanałowa Biohit15626090NA
5-100 &mikro; LBiohit9143724NA
Ściągacz do igieł/pipetKopf730NA
PBSGIBCOklasy molekularnej
Roche4693159001Klasa molekularna
Kleszcze o odwrotnym działaniuKatenaK5-8228NA
NA 1897315 Koktajl inhibitorów proteazy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intravitreal InjectionBacterial EndophthalmitisMouse ModelCFU QuantitationTissue HomogenizationSerial DilutionAgar Plate IncubationColony Forming UnitsProtease InhibitorGlass Capillary Needle

Related Articles