Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na architekturę biofilmu in vitro przy użyciu oprogramowania COMSTAT

DOI:

10.3791/61759

⸱

14 grudnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 3Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wywołane przez środki przeciwbakteryjne zmiany w architekturze biofilmu Pseudomonas aeruginosa różnią się między klinicznymi izolatami hodowanymi od pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłą infekcją płuc. Po mikroskopii konfokalnej oprogramowanie COMSTAT może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu (np. powierzchni, grubości, biomasy) dla poszczególnych izolatów w celu oceny skuteczności środków przeciwinfekcyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmy to agregaty mikroorganizmów, które polegają na samodzielnie wyprodukowanej matrycy zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej w celu ochrony i integralności strukturalnej. Wiadomo, że szpitalny patogen, Pseudomonas aeruginosa, przyjmuje sposób wzrostu biofilmu, powodując przewlekłe zakażenie płuc u pacjentów z mukowiscydozą (CF). Program komputerowy COMSTAT jest użytecznym narzędziem do ilościowego określania zmian w architekturze biofilmu P. aeruginosa wywołanych przez środki przeciwdrobnoustrojowe poprzez ekstrakcję danych z trójwymiarowych obrazów konfokalnych. Jednak ustandaryzowane działanie oprogramowania jest rzadziej stosowane, co jest ważne dla optymalnego raportowania zachowania biofilmu i porównania międzyśrodkowego. W związku z tym celem niniejszego protokołu jest zapewnienie prostych i powtarzalnych ram do ilościowego określania struktur biofilmu in vitro w różnych warunkach przeciwdrobnoustrojowych za pomocą COMSTAT. Technika ta jest modelowana przy użyciu izolatu CF P. aeruginosa, hodowanego w postaci powtórzeń biofilmu i poddanego działaniu tobramycyny i przeciwciała monoklonalnego anty-Psl, Psl0096. Podejście krok po kroku ma na celu zmniejszenie niejasności użytkownika i zminimalizowanie ryzyka przeoczenia kluczowych etapów przetwarzania obrazu. W szczególności protokół kładzie nacisk na eliminację subiektywnych zmian związanych z ręczną obsługą COMSTAT, w tym segmentację obrazu i wybór odpowiednich funkcji analizy ilościowej. Chociaż metoda ta wymaga od użytkowników poświęcenia dodatkowego czasu na przetwarzanie obrazów konfokalnych przed uruchomieniem COMSTAT, pomaga zminimalizować błędnie przedstawioną heterogeniczność biofilmu w automatycznych wynikach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmy to agregaty mikroorganizmów zorientowane w matrycy samodzielnie wytworzonych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS). Macierz EPS jest bardzo złożona, składa się głównie z komórek bakteryjnych, wody, białek, polisacharydów, lipidów i kwasów nukleinowych1, z których wszystkie tworzą biofilmy wyraźnie różniące się od wolno żyjących komórek planktonowych. Biofilm EPS przylega do siebie i do różnych powierzchni. Macierz EPS ma właściwości, które pośredniczą w wymianie metabolitów, materiału genetycznego i związków używanych do sygnalizacji międzykomórkowej i obrony2. Właściwości te łącznie zapewniają integralność strukturalną biofilmów i ochronę przed zewnętrznymi czynnikami stresogennymi, przyczyniając się do unikania odporności i oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe3.

Pseudomonas aeruginosa jest dobrze rozpoznanym patogenem szpitalnym, znanym z tego, że w odpowiedzi na środki przeciwdrobnoustrojowe stosuje strategię unikania wzrostu biofilmu. Doskonałym tego przykładem jest choroba genetyczna recesywna, mukowiscydoza (CF). Biofilmy odgrywają kluczową rolę w rozwoju opornego na środki przeciwdrobnoustrojowe P. aeruginosa4 i umożliwiają rozwój przewlekłej infekcji płuc u pacjentów z mukowiscydozą, powodując przyspieszone pogorszenie czynności płuc i przedwczesną śmiertelność5. W związku z tym przeprowadza się badania biofilmu in vitro w celu sprawdzenia skuteczności antybiotyków i nowych środków przeciwinfekcyjnych przeciwko izolatom P. aeruginosa uzyskanym od pacjentów z CF6,7. Po utworzeniu biofilmu środki przeciwdrobnoustrojowe są nakładane zewnętrznie na strukturę, a konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) jest wykorzystywana do generowania trójwymiarowych rekonstrukcji segmentów biofilmu o wysokiej rozdzielczości. Powszechną praktyką jest następnie używanie oprogramowania komputerowego COMSTAT jako wtyczki do ImageJ w celu ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu8,9,10,11.

Chociaż COMSTAT jest przydatny do ilościowego określania struktury biofilmu, powtarzalność i standaryzacja analizy obrazu jest rzadziej poruszana. Na przykład procedura przetwarzania obrazu, wykonywana przed uruchomieniem COMSTAT, jest obiektywna, ale zawiera element subiektywności podczas ustawiania progów obrazu12,13. W podobny sposób program COMSTAT pozwala operatorowi na wybór od podstawowych do zaawansowanych warunków i parametrów segmentacji obrazu, a także dziesięciu funkcji analizy ilościowej (np. rozkład grubości, powierzchnia, biomasa, bezwymiarowy współczynnik chropowatości). Mnogość opcji użytkownika, w połączeniu z różnym poziomem wiedzy operatora, może skutkować błędnym raportowaniem zachowania biofilmu.

Tak więc, celem tego protokołu jest przedstawienie stosunkowo prostej metody ilościowego porównywania struktur biofilmu in vitro za pomocą COMSTAT. W tym przypadku trójwymiarowe obrazy segmentów biofilmu z izolatu CF P. aeruginosa są rejestrowane za pomocą CLSM przy użyciu komorowego modelu szkła nakrywkowego14 - uznanej techniki stosowanej do przeprowadzania powtarzalnych eksperymentów na biofilmie in vitro. Wykorzystując COMSTAT jako wtyczkę do ImageJ, metoda ta pozwala naukowcom na ilościową identyfikację zmian w architekturze biofilmu w obecności środków przeciwdrobnoustrojowych w różnych warunkach. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta ma na celu wyeliminowanie subiektywnych różnic związanych z ręczną obsługą COMSTAT, ułatwiając w ten sposób standaryzację protokołów w różnych centrach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kolekcja izolatów bakteryjnych

  1. Uzyskanie izolatów P. aeruginosa z kohorty pacjentów pediatrycznych z mukowiscydozą poddawanych leczeniu eradykacyjnemu wziewną tobramycyną w SickKids (Toronto). Przed użyciem zamrozić izolaty w temperaturze -80 °C w roztworze cytrynianu glicerolu i subkulturze co najmniej trzy razy.

2. Tworzenie biofilmu in vitro

UWAGA: Użyj metody z komorowym szkłem nakrywkowym1 do tworzenia biofilmu in vitro z modyfikacjami. Ogólny przebieg pracy tego modelu jest pokazany w Rysunek 1.

  1. Hodować izolat P. aeruginosa przez noc w temperaturze 37 °C na agarze z krwią przygotowanym z tryptycznego agaru sojowego i 5% krwi owczej (patrz Tabela Materiałów).
  2. Zaszczepić 1-2 kolonie bakteryjne z agaru z krwią w 4 ml bulionu lizogennego (LB). Uprawiać przez noc w temperaturze 37 °C na wytrząsarce ustawionej na 225 obr./min.
  3. Przygotować inokulum na noc w stosunku 1:100, dodając 40 μl kultury w 4 ml świeżego LB. Hodować przez 3–4 godziny w temperaturze 37 °C na wytrząsarce ustawionej na 225 obr./min, aby osiągnąć gęstość optyczną około 0,1 przy 600 nm (OD600) (wczesna faza logarytmiczna).
  4. Przenieść 220 μl inokulum do każdej studzienki 8-komorowego szkiełka nakrywkowego. Inkubować w spokoju w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  5. Powoli usuwaj podłoże z każdej studzienki, aby zapobiec odklejaniu się biofilmów u podstawy.
    UWAGA: Przechyl szkiełko do przodu pod kątem 45° i zassaj pożywkę z dolnych rogów każdej studzienki komorowej, nie dotykając podstawy końcówką pipety.
  6. Przygotować i powoli dodać 100 μl 56 μg/ml fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała monoklonalnego (mAb) (patrz Tabela materiałów) na bok wyznaczonych studzienek komorowych. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę, aby umożliwić przyłączenie przeciwciał do epitopu antygenu bakteryjnego.
    UWAGA: Przed użyciem rozcieńczyć znakowany fluorescencyjnie (czerwony) mAb, Psl0096, w LB, aby uzyskać końcowe stężenie 56 μg/ml. Psl0096 jest anty-Psl mAb (zoptymalizowana pochodna powinowactwa Cam003), która wiąże się z epitopem Psl klasy I - kluczowym składnikiem macierzy EPS biofilmów P. aeruginosa zaangażowanych w początkowe przyczepianie komórek i integralność strukturalną15.
  7. Przygotuj i powoli dodaj 100 μl roztworu antybiotyku o stężeniu 1000 μg/ml (patrz tabela materiałów) na bok wyznaczonych studzienek komorowych. Inkubować w spokoju w temperaturze 37 °C przez 24 h.
    UWAGA: Przed użyciem należy rozcieńczyć 50 mg/ml antybiotyku tobramycyny w LB, aby uzyskać końcowe stężenie 1000 μg/ml.

3. Barwienie fluorescencyjne biofilmu

  1. Przygotować 0,01 mM roztwór barwnika fluorescencyjnego barwiącego żywe komórki. Powoli wyjmij pożywkę z dołków komorowych i dodaj 200 μl mieszaniny barwników do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 45 min.
    UWAGA: Przed użyciem przygotuj barwnik fluorescencyjny do barwienia żywych komórek (zielony), dodając 4 μl bulionu o pojemności 5 mM do 2 ml LB.
  2. Powoli wyjmij podłoże z każdej studzienki i przemyj 2x 200 μl świeżego LB.
  3. Dodaj 200 μl świeżego LB do każdej studzienki i przystąp do badania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

4. Akwizycja obrazu za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Procedura przetwarzania obrazu i analizy COMSTAT jest przedstawiona w Rysunek 2. Uzyskaj obrazy studzienek w tym samym dniu, w którym odbywa się barwienie biofilmu. Jeśli opóźnienie w wizualizacji przekracza 1 godzinę, wstaw komorę nakrywkową do lodówki w ciemności do czasu dalszej obróbki.

  1. Pozyskiwanie obrazów studni za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów) z odpowiednimi długościami fal wzbudzenia laserowego i zestawami filtrów do akwizycji.
    UWAGA: Tutaj wzbudz znakowany fluorescencyjnie (czerwony) mAb i barwienie żywych komórek (zielony), używając odpowiednio długości fal wzbudzenia 561 i 491 nm.
  2. Rejestruj warstwowe obrazy stosu z (od podłoża do góry każdego segmentu biofilmu) w krokach co 0,3 μm za pomocą soczewki zanurzonej w wodzie 20–25x. Weź co najmniej 6 stosów obrazów na studzienkę.
    UWAGA: Tutaj wizualizuj obrazy za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości z soczewką 25-krotnego zanurzenia w wodzie i przetworzone za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Utrzymuj konfigurację oprogramowania i parametry obrazowania cyfrowego (tj. jasność i czułość) na stałym poziomie dla wszystkich akwizycji w jednym eksperymencie.
  3. Zapisywanie obrazów w formacie OME-TIFF do analizy COMSTAT.
    UWAGA: Upewnij się, że pliki OME-TIFF są zapisane osobno dla każdego kanału (tj. czerwonego i zielonego). Ten krok różni się w zależności od używanego oprogramowania do analizy obrazu.
  4. Powtórz kroki 2.1–4.3, aby uchwycić obrazy z łącznie 3 powtórzeń biologicznych (tj. 3 niezależnych eksperymentów) na izolat bakteryjny.

5. Analiza COMSTAT

UWAGA: Analizuj obrazy ilościowo za pomocą ogólnodostępnego programu komputerowego, COMSTAT16,17, przepisanego jako wtyczka (Comstat2) do ImageJ. Zapoznaj się z ogólnymi instrukcjami dotyczącymi analizy stosów obrazów biofilmów w pobranym pakiecie. Niniejszy wkład zawiera skrócony protokół, z wybranymi etapami przetwarzania ImageJ i funkcjami COMSTAT zalecanymi do ilościowego określania wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na tworzenie biofilmu.

  1. Pobierz pakiet Comstat2 z http://www.comstat.dk/. W zainstalowanym folderze zlokalizuj ImageJ i uruchom go.
  2. Utwórz folder źródłowy na pulpicie i dodaj do niego pojedynczy plik OME-TIFF.
  3. Otwórz plik OME-TIFF z folderu źródłowego i usuń wszystkie puste warstwy niezawierające biomasy. Te warstwy będą albo pierwszymi, albo ostatnimi warstwami z-stack.
    UWAGA: Zdefiniowane przez mikroskop granice stosu z są czasami przeceniane przez użytkowników. Usunięcie tych pustych warstw ustanawia bardziej doprecyzowaną granicę stosu z dla analizy COMSTAT.
  4. Zaimportuj plik OME-TIFF do pliku ImageJ, wybierając pozycję Plik | Import | Sekwencja obrazów. Zlokalizuj folder źródłowy, zaznacz go bez otwierania i kliknij przycisk Wybierz. Pojawi się okno "Opcje sekwencji". Wybierz pozycję OK.
    UWAGA: Aby zaimportować dodatkowe obrazy do formatu ImageJ, najpierw usuń poprzedni plik OME-TIFF z folderu źródłowego, a następnie dodaj nowy plik OME-TIFF do folderu i powtórz kroki 5.3 i 5.4.
  5. Odwróć orientację biofilmu, wybierając Obraz | Przekształcanie | Odwróć Z, aby ustawić podłoże jako pierwszy (najwyższy) stos.
    UWAGA: Algorytmy COMSTAT odczytują biofilmy w kierunku z od góry (stos 1) do dołu. W zależności od zastosowanego systemu mikroskopu konfokalnego, wyjście OME-TIFF może być odwrócone. Dlatego ważne jest, aby odwrócić kolejność plasterków, umieszczając podłoże jako stos obrazów 1, aby zapobiec błędom danych wyjściowych.
  6. Zdefiniuj właściwości obrazu, wybierając punkt menu Obraz | Właściwości. Pojawi się okno "Źródło".
    1. Określ "jednostkę długości" jako "mikron".
    2. Matematycznie określ "Szerokość piksela" i "Wysokość piksela" za pomocą następującego równania:
      figure-protocol-1 (1)
      W tym przypadku "szerokość piksela" i "wysokość piksela" są zdefiniowane jako 0,427, gdzie fizyczna długość piksela na urządzeniu sprzężonym z ładunkiem (CCD) wynosi 16 μm; całkowite powiększenie wynosi 25x; a pozycja lupy wynosi 1,5x,
      UWAGA: Równanie używane do obliczania rozmiaru komórki na piksel może się różnić w zależności od producenta kamery mikroskopowej. Alternatywnie "Szerokość w pikselach" i "Wysokość w pikselach" można zdefiniować za pomocą kalibracji przestrzennej (patrz https://imagej.net/Spatial_Calibration).
    3. Zdefiniuj "głębokość woksela" jako 0,3 (tj. przyrostową przestrzeń między każdą warstwą z-stack). Wybierz OK w oknie "Źródło".
  7. Dostosuj próg obrazu, wybierając punkt menu Obraz | Dostosuj | Próg. Pojawi się okno 'Próg'.
    UWAGA: Obiekty na obrazie będą wyświetlane na czerwono z tłem w skali szarości. Alternatywnie próg można dostosować w czerni i bieli, korzystając z menu rozwijanego w oknie "Próg", aby zmienić "Czerwony" na "Czarno-biały".
    1. W oknie obrazu przesuń suwak maksymalnie w prawo (tj. najbardziej górna warstwa biofilmu). Aby usunąć szum tła, użyj okna "Próg", w którym wyświetlany jest histogram obrazu, aby ręcznie ustawić maksymalne i minimalne wartości progowe. Najpierw ustaw maksymalną wartość progową, przesuwając dolny suwak tak daleko w prawo, jak to możliwe. Po drugie, użyj górnego suwaka, aby dostosować minimalną wartość progową, która dzieli obraz na dwie oddzielne fazy: czerwoną biomasę i tło w skali szarości (Rysunek 3).
      UWAGA: Opisana tutaj procedura tworzenia biofilmu in vitro i mikroskopii fluorescencyjnej pozwala w idealnym przypadku generować OME-TIFF, umożliwiając segmentację obrazów na dwie odrębne fazy za pomocą prostej metody progu histogramu. Jednak w niektórych przypadkach rozróżnienie histogramu między różnymi fazami nie jest tak wyraźne. Może to być spowodowane obecnością rozległego szumu tła, różnej intensywności tła lub kontrastu o niskiej intensywności między biomasą a tłem. W takich przypadkach użytkownicy powinni zastosować ulepszoną procedurę segmentacji18,19.
      1. Możesz też dostosować progi algorytmicznie dla poszczególnych obrazów, korzystając z menu rozwijanego po lewej stronie ustawionego jako "Domyślne" w oknie "Próg". Ta funkcja zapewnia 17 różnych opcji progów algorytmicznych do wyboru (patrz https://imagej.net/Auto_Threshold). Wybierz najbardziej odpowiednią opcję, a następnie "Auto", aby ustawić próg.
    2. Po dostosowaniu wartości progowych użyj suwaka w oknie obrazu, aby przewinąć każdą warstwę, aby upewnić się, że szum tła jest wystarczająco usunięty w całym tekście.
    3. Wybierz Ustaw w oknie "Próg", aby najpierw ustalić dolną wartość progową. Pojawi się okno "Ustaw poziomy progowe". Wybierz przycisk OK. Wybierz ponownie pozycję Ustaw i powtórz ten krok, aby ustalić maksymalną wartość progową.
      UWAGA: Za każdym razem, gdy wybrana jest opcja "Ustaw", dolny suwak może dostosować się automatycznie. W takich przypadkach ręcznie ponownie wyreguluj suwak (lub wybierz opcję "Auto", jeśli używasz jednego z progów algorytmicznych) i powtórz kroki 5.6.2–5.6.3. Główną ideą jest to, że za każdym razem, gdy suwaki są ponownie regulowane automatycznie, należy następnie wybrać "Set" dodatkowe dwa razy, aby upewnić się, że zarówno górny, jak i dolny próg są stałe.
    4. Wybierz Zastosuj, a pojawi się okno "Konwertuj stos na binarny". Wybierz przycisk OK, a następnie zamknij okno "Próg".
    5. Zapisz nowo dostosowany plik OME-TIFF, wybierając Wtyczki | Formaty biologiczne | Eksporter formatów biologicznych|. Wprowadź nową nazwę pliku i zapisz go jako OME-TIFF w folderze źródłowym. Pojawi się okno "Eksporter formatów biologicznych – wiele plików". Wybierz przycisk OK. Pojawi się okno "Opcje eksportera formatów biologicznych". Wybierz pozycję OK.
      UWAGA: Przed przystąpieniem do analizy COMSTAT należy upewnić się, że w folderze źródłowym zapisane są tylko nowo wyregulowane, czarno-białe pliki OME-TIFF. Usuń wszystkie oryginalne pliki OME-TIFF z folderu.
  8. Uruchom COMSTAT, wybierając Wtyczki | Comstat2 |. Pojawi się okno "Informacje". Wybierz przycisk OK. Pojawią się trzy okna.
    1. W oknie "Obserwowane katalogi" (w prawym górnym rogu) wybierz Dodaj. Znajdź folder źródłowy, podświetl go bez otwierania i wybierz pozycję Wybierz. Pojawi się okno "Obrazy w katalogach" (w lewym górnym rogu) z listą plików OME-TIFF do analizy za pomocą narzędzia COMSTAT.
    2. W oknie "Comstat 2.1" (prawy dolny róg) usuń zaznaczenie opcji "Automatyczne progowanie (metoda Otsu)", aby upewnić się, że oprogramowanie używa wartości progowych wcześniej ustawionych dla poszczególnych OME-TIFF. Należy również odznaczyć Filtr Connected Volume Filtering (CVF), aby upewnić się, że w analizie uwzględniono bardzo cienkie części biofilmu, a także swobodnie pływające komórki lub biomasę znajdujące się w pustych przestrzeniach struktury biofilmu.
      UWAGA: W tym przypadku należy odznaczyć CVF, ponieważ analiza COMSTAT jest przeprowadzana na bardzo wczesnych biofilmach (24-godzinny początkowy wzrost) i pozostałych komórkach/koloniach planktonu po leczeniu przeciwdrobnoustrojowym. W przypadku dojrzałych biofilmów należy wybrać CVF, aby upewnić się, że tylko biomasa związana ze strukturą biofilmu jest określana ilościowo.
    3. W oknie "Comstat 2.1" (prawy dolny róg) wybierz żądane funkcje do analizy ilościowej. Tutaj wybierz Masę biologiczną, Rozkład grubości i Pole powierzchni. Wybierz pozycję Przejdź, aby uruchomić program. W oknie "Dziennik" (w lewym dolnym rogu) dane wyjściowe są wyświetlane podczas przetwarzania, aż pojawi się komunikat "Gotowe z wybranymi funkcjami/obrazami!". Zapisz pomiary COMSTAT. Pomiary te są również automatycznie zapisywane jako pliki TXT w folderze źródłowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A Izolat P. aeruginosa wyhodowany od zakażonego pacjenta z mukowiscydozą jest używany do zademonstrowania mocnych stron tego podejścia w dokładnym ilościowym określaniu zmian w architekturze biofilmu in vitro wywołanych przez środki przeciwdrobnoustrojowe. Ogólny przebieg pracy tego modelu jest reprezentowany przez Rysunek 1. Procedura przetwarzania obrazu i analizy COMSTAT w ImageJ jest pokazana na Rysunek 2. Proste podejście do progowania his...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma zalecanej metody ilościowego porównywania trójwymiarowych obrazów struktur biofilmu in vitro , a procedury opisane w tym kontekście są często trudne do standaryzacji ze względu na zmienność między operatorami20. W związku z tym protokół ten oferuje proste i powtarzalne ramy dla aplikacji COMSTAT mających na celu ilościowe określenie zmian w architekturze biofilmu in vitro w różnych warunkach przeciwdrobnoustrojowych. Mocne strony tej techniki są modelowane przy użyciu izol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Fundacji Mukowiscydozy za finansowanie tych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MAb anty-Psl, Psl0096Medimmune
(TSA z 5% krwią owczą) ŚredniFisher ScientificR01200
Ośmiodołkowa komorowa szklana osłona z nieusuwalnymi studzienkamiThermo Fisher Scientific155411
Invitrogen SYTO 9 Zielona fluorescencyjna plama kwasu nukleinowegoThermo Fisher ScientificS34854
LB BROTH (LENNOX), Płynny autoklaw sterylizowanyBioShop CanadaLBL666
Tobramycyna, 900 i mikro; g/mgAlfa Aesar firmy Thermo Fisher ScientificJ66040Zaleca się wykonanie testu minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla każdej wyprodukowanej partii, aby zapewnić kontrolę jakości działania przeciwdrobnoustrojowego
Quorum Volocity 6.3Oprogramowanie do analizy obrazuQuorum Technologies
Agar z krwią

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  3. Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response. Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).
  4. Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak. Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).
  5. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  6. Powell, L. C., et al. Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides. NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).
  7. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. Ø, Wang, H., Høiby, N. Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients. Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).
  8. Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance. Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).
  9. Beaudoin, T., et al. Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).
  10. Rojo-Molinero, E., et al. Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).
  11. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).
  12. Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).
  13. Luo, T. L., et al. A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms. Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).
  14. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. Journal of Visualized Experiments. (118), e54819(2016).
  15. DiGiandomenico, A., et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).
  16. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
  17. Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling. Technical University of Denmark. , Kongens Lyngby. Denmark. (2008).
  18. Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing. Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).
  19. Rogowska, J. Overview and fundamentals of medical image segmentation. Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).
  20. Webb, D., et al. Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images. Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).
  21. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).
  22. Xavier, J. B., et al. Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images. Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).
  23. Arena, E. T., et al. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260(2017).
  24. Daims, H., Wagner, M. Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).
  25. Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images. Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).
  26. Lee, B., et al. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).
  27. Stapper, A. P., et al. Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation. Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).
  28. Reichhardt, C., Parsek, M. Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization. Frontiers in Microbiology. 10, 677(2019).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).
  30. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Evaluation of biofilm image thresholding methods. Water Research. 35, 1149-1158 (2001).
  31. Ross, S. S., et al. Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces. Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).
  32. Ma, L., et al. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathogens. 5, (2009).
  33. Mah, T. F., et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  34. Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm. Biofouling. 26, 449-459 (2010).
  35. Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales. Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).
  36. Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment. Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dzia anie przeciwdrobnoustrojowePseudomonas aeruginosamikroskopia konfokalnaprzetwarzanie obraz wregulacja progupomiar biomasyrozk ad grubo cianaliza powierzchni

Powiązane artykuły