Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na architekturę biofilmu in vitro przy użyciu oprogramowania COMSTAT

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61759

⸱

14 grudnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 3Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

W tym artykule

Podsumowanie

Wywołane przez środki przeciwbakteryjne zmiany w architekturze biofilmu Pseudomonas aeruginosa różnią się między klinicznymi izolatami hodowanymi od pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłą infekcją płuc. Po mikroskopii konfokalnej oprogramowanie COMSTAT może być wykorzystane do ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu (np. powierzchni, grubości, biomasy) dla poszczególnych izolatów w celu oceny skuteczności środków przeciwinfekcyjnych.

Streszczenie

Biofilmy to agregaty mikroorganizmów, które polegają na samodzielnie wyprodukowanej matrycy zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej w celu ochrony i integralności strukturalnej. Wiadomo, że szpitalny patogen, Pseudomonas aeruginosa, przyjmuje sposób wzrostu biofilmu, powodując przewlekłe zakażenie płuc u pacjentów z mukowiscydozą (CF). Program komputerowy COMSTAT jest użytecznym narzędziem do ilościowego określania zmian w architekturze biofilmu P. aeruginosa wywołanych przez środki przeciwdrobnoustrojowe poprzez ekstrakcję danych z trójwymiarowych obrazów konfokalnych. Jednak ustandaryzowane działanie oprogramowania jest rzadziej stosowane, co jest ważne dla optymalnego raportowania zachowania biofilmu i porównania międzyśrodkowego. W związku z tym celem niniejszego protokołu jest zapewnienie prostych i powtarzalnych ram do ilościowego określania struktur biofilmu in vitro w różnych warunkach przeciwdrobnoustrojowych za pomocą COMSTAT. Technika ta jest modelowana przy użyciu izolatu CF P. aeruginosa, hodowanego w postaci powtórzeń biofilmu i poddanego działaniu tobramycyny i przeciwciała monoklonalnego anty-Psl, Psl0096. Podejście krok po kroku ma na celu zmniejszenie niejasności użytkownika i zminimalizowanie ryzyka przeoczenia kluczowych etapów przetwarzania obrazu. W szczególności protokół kładzie nacisk na eliminację subiektywnych zmian związanych z ręczną obsługą COMSTAT, w tym segmentację obrazu i wybór odpowiednich funkcji analizy ilościowej. Chociaż metoda ta wymaga od użytkowników poświęcenia dodatkowego czasu na przetwarzanie obrazów konfokalnych przed uruchomieniem COMSTAT, pomaga zminimalizować błędnie przedstawioną heterogeniczność biofilmu w automatycznych wynikach.

Wprowadzenie

Biofilmy to agregaty mikroorganizmów zorientowane w matrycy samodzielnie wytworzonych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS). Macierz EPS jest bardzo złożona, składa się głównie z komórek bakteryjnych, wody, białek, polisacharydów, lipidów i kwasów nukleinowych1, z których wszystkie tworzą biofilmy wyraźnie różniące się od wolno żyjących komórek planktonowych. Biofilm EPS przylega do siebie i do różnych powierzchni. Macierz EPS ma właściwości, które pośredniczą w wymianie metabolitów, materiału genetycznego i związków używanych do sygnalizacji międzykomórkowej i obrony2. Właściwości te łącznie zapewniają integralność strukturalną biofilmów i ochronę przed zewnętrznymi czynnikami stresogennymi, przyczyniając się do unikania odporności i oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe3.

Pseudomonas aeruginosa jest dobrze rozpoznanym patogenem szpitalnym, znanym z tego, że w odpowiedzi na środki przeciwdrobnoustrojowe stosuje strategię unikania wzrostu biofilmu. Doskonałym tego przykładem jest choroba genetyczna recesywna, mukowiscydoza (CF). Biofilmy odgrywają kluczową rolę w rozwoju opornego na środki przeciwdrobnoustrojowe P. aeruginosa4 i umożliwiają rozwój przewlekłej infekcji płuc u pacjentów z mukowiscydozą, powodując przyspieszone pogorszenie czynności płuc i przedwczesną śmiertelność5. W związku z tym przeprowadza się badania biofilmu in vitro w celu sprawdzenia skuteczności antybiotyków i nowych środków przeciwinfekcyjnych przeciwko izolatom P. aeruginosa uzyskanym od pacjentów z CF6,7. Po utworzeniu biofilmu środki przeciwdrobnoustrojowe są nakładane zewnętrznie na strukturę, a konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) jest wykorzystywana do generowania trójwymiarowych rekonstrukcji segmentów biofilmu o wysokiej rozdzielczości. Powszechną praktyką jest następnie używanie oprogramowania komputerowego COMSTAT jako wtyczki do ImageJ w celu ilościowego określenia zmian w architekturze biofilmu8,9,10,11.

Chociaż COMSTAT jest przydatny do ilościowego określania struktury biofilmu, powtarzalność i standaryzacja analizy obrazu jest rzadziej poruszana. Na przykład procedura przetwarzania obrazu, wykonywana przed uruchomieniem COMSTAT, jest obiektywna, ale zawiera element subiektywności podczas ustawiania progów obrazu12,13. W podobny sposób program COMSTAT pozwala operatorowi na wybór od podstawowych do zaawansowanych warunków i parametrów segmentacji obrazu, a także dziesięciu funkcji analizy ilościowej (np. rozkład grubości, powierzchnia, biomasa, bezwymiarowy współczynnik chropowatości). Mnogość opcji użytkownika, w połączeniu z różnym poziomem wiedzy operatora, może skutkować błędnym raportowaniem zachowania biofilmu.

Tak więc, celem tego protokołu jest przedstawienie stosunkowo prostej metody ilościowego porównywania struktur biofilmu in vitro za pomocą COMSTAT. W tym przypadku trójwymiarowe obrazy segmentów biofilmu z izolatu CF P. aeruginosa są rejestrowane za pomocą CLSM przy użyciu komorowego modelu szkła nakrywkowego14 - uznanej techniki stosowanej do przeprowadzania powtarzalnych eksperymentów na biofilmie in vitro. Wykorzystując COMSTAT jako wtyczkę do ImageJ, metoda ta pozwala naukowcom na ilościową identyfikację zmian w architekturze biofilmu w obecności środków przeciwdrobnoustrojowych w różnych warunkach. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta ma na celu wyeliminowanie subiektywnych różnic związanych z ręczną obsługą COMSTAT, ułatwiając w ten sposób standaryzację protokołów w różnych centrach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Kolekcja izolatów bakteryjnych

  1. Pozyskać izolaty P. aeruginosa od kohorty pacjentów pediatrycznych z CF poddawanych leczeniu eradykacyjnemu wziewną tobramycyną w SickKids (Toronto). Zamrozić izolaty w temperaturze -80 °C w cytrynianie glicerolu i przeprowadzić co najmniej trzy pasażowania przed użyciem.

2. Tworzenie biofilmu in vitro

UWAGA: W celu tworzenia biofilmu in vitro należy zastosować metodę z użyciem szkiełek podstawowych z komorami1 z wprowadzonymi modyfikacjami. Ogólny schemat postępowania dla tego modelu przedstawiono na Rysunku 1.

  1. Hodowla P. aeruginosa izolować przez noc w temperaturze 37 °C na agarze krwi przygotowanym z agaru sojowego z trypsyną i 5% krwi owczej (patrz Tabela materiałów).
  2. Zaszczep 1–2 kolonie bakterii z agaru krwi do 4 ml bulionu LB. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C na wytrząsarce ustawionej na 225 obr./min.
  3. Przygotować rozcieńczenie 1:100 nocnego inokulum poprzez dodanie 40 μL kultury w 4 ml świeżej pożywki LB. Inkubować przez 3–4 h w temperaturze 37 °C na inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 225 obr./min, aby uzyskać gęstość optyczną wynoszącą około 0,1 przy 600 nm (OD600) (wczesna faza logarytmiczna).
  4. Transfer 220 μL inakulatu do każdej studni 8-komorowego szkiełka podstawowego z nakrywekmi. Inkubować bez zakłóceń w 37 °C przez 24 h.
  5. Powoli usuń medium z każdego dołka, aby zapobiec odklejeniu się biofilmu od dna.
    UWAGA: Przechyl prześlizg do przodu pod kątem 45° przechylić naczynie i odessać medium z dolnych narożników każdej studni komory, uważając, aby końcówka pipety nie dotknęła dna.
  6. Przygotować i powoli dodać 100 μL z 56 μg/mL fluorescencyjny znakowane przeciwciało monoklonalne (mAb) (patrz Tabela materiałów) z boku wyznaczonych dożkowych komór. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 h, aby umożliwić przyłączenie przeciwciała do epitopu antygenu bakteryjnego.
    UWAGA: Przed użyciem rozcieńczyć barwnik fluorescencyjny oznaczony (na czerwono) przeciwciało monoklonalne (mAb) Psl0096 w pożywce LB, aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące 56 μg/mLPsl0096 jest przeciwciałem mAb przeciwko Psl (pochodna o zoptymalizowanym powinowactwie przeciwciała Cam003), które wiąże się z epitopem Psl klasy I — kluczowym składnikiem macierzy EPS o P. aeruginosa biofilmy zaangażowane w początkowe przyleganie komórek i integralność strukturalną15.
  7. Przygotować i powoli dodać 100 μL z 1000 μg/mL roztwór antybiotyku (patrz Tabela materiałów) z boku wyznaczonych dołków komorowych. Inkubować bez zakłóceń w 37 °C przez 24 h.
    UWAGA: Przed użyciem należy rozcieńczyć roztwór stokowy antybiotyku tobramycyny o stężeniu 50 mg/mL w pożywce LB, aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące 1000 μg/mL.

3. Fluorescencyjne barwienie biofilmu

  1. Przygotować 0,01 mM roztwór fluorescencyjnego barwnika do barwienia żywych komórek. Powoli usunąć medium z dołków komory i dodać 200 μL mieszaniny barwnika do każdego dołka. Inkubować w RT w ciemności przez 45 min.
    UWAGA: Przed użyciem przygotować fluorescencyjny barwnik do barwienia żywych komórek (zielony), dodając 4 μL stoku 5 mM do 2 mL LB.
  2. Powoli usunąć medium z każdego dołka i przemyć 2x 200 μL świeżego LB.
  3. Dodać 200 μL świeżego LB do każdego dołka i przystąpić do badania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

4. Pozyskiwanie obrazów za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Procedura przetwarzania obrazów i analizy COMSTAT jest przedstawiona na Ryc. 2. Należy pozyskać obrazy dołków w tym samym dniu, w którym wykonano barwienie biofilmu. Jeśli opóźnienie w wizualizacji przekroczy 1 h, należy przechowywać szkiełko podstawowe z komorami w lodówce w ciemności do czasu dalszego przetwarzania.

  1. Należy obrazować dołki przy użyciu konfokalnego systemu mikroskopowego (patrz Tabela materiałów) z odpowiednimi długościami fal wzbudzenia lasera i zestawami filtrów do akwizycji.
    UWAGA: W tym miejscu wzbudź fluorescencję oznaczone (czerwone) przeciwciała monoklonalne (mAb) oraz barwnik do żywych komórek (zielony) przy użyciu długości fal wzbudzenia odpowiednio 561 i 491 nm.
  2. Należy wykonać obrazy w stosie z (z-stack) od podłoża do górnej części każdego segmentu biofilmu, w odstępach wynoszących 0.3 μm za pomocą obiektywu imersyjnego 20–25x. Należy wykonać co najmniej 6 stosów obrazów na każdą studzienkę.
    UWAGA: W tym kroku obrazy należy zarejestrować przy użyciu kamery o wysokiej rozdzielczości z obiektywem imersyjnym 25x, a następnie przetworzyć za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów). Zachować konfigurację oprogramowania oraz parametry obrazowania cyfrowego (t. j., jasność i czułość) stałe dla wszystkich akwizycji w obrębie jednego eksperymentu.
  3. Zapisz obrazy w formacie OME-TIFF w celu przeprowadzenia analizy w programie COMSTAT.
    UWAGA: Należy upewnić się, że pliki OME-TIFF są zapisywane oddzielnie dla każdego kanału (t. j., czerwony i zielony). Ten etap różni się w zależności od zastosowanego oprogramowania do analizy obrazu.
  4. Powtórz kroki 2.1–4.3 aby uzyskać obrazy z łącznie 3 powtórzeń biologicznych (t.j., 3 niezależne eksperymenty) na izolat bakteryjny.

5. Analiza COMSTAT

UWAGA: Obrazy należy analizować ilościowo za pomocą bezpłatnego programu komputerowego COMSTAT16,17, który został przeredagowany jako wtyczka (Comstat2) do programu ImageJ. Ogólne instrukcje dotyczące analizy stosów obrazów biofilmu znajdują się w pobranym pakiecie. Niniejszy wkład zawiera skrócony protokół z wybranymi krokami przetwarzania w programie ImageJ oraz funkcjami COMSTAT zalecanymi do ilościowego określania wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na tworzenie biofilmu.

  1. Pobierz pakiet Comstat2 ze strony http://www.comstat.dk/. W zainstalowanym folderze odnajdź program ImageJ i uruchom go.
  2. Utwórz folder źródłowy na pulpicie i dodaj do niego jeden plik OME-TIFF.
  3. Otwórz plik OME-TIFF z folderu źródłowego i usuń wszystkie puste warstwy, które nie zawierają biomasy. Warstwy te będą stanowić pierwsze lub ostatnie kilka warstw stosu z (z-stack).
    UWAGA: Granice stosu z (z-stack) zdefiniowane przez mikroskop są czasami przeszacowywane przez użytkowników. Usunięcie tych pustych warstw pozwala na ustalenie bardziej precyzyjnych granic stosu z dla analizy w programie COMSTAT.
  4. Importuj plik OME-TIFF w programie ImageJ, wybierając Plik | Importuj | Sekwencja obrazówZlokalizuj folder źródłowy, zaznacz go bez otwierania i kliknij WybierzPojawi się okno „Opcje sekwencjonowania” (Sequence Options). Wybierz Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
    UWAGA: Aby zaimportować dodatkowe obrazy do programu ImageJ, należy najpierw usunąć poprzedni plik OME-TIFF z folderu źródłowego, następnie dodać do folderu nowy plik OME-TIFF i powtórzyć kroki 5.3 oraz 5.4.
  5. Zmień orientację biofilmu, wybierając Obraz | Transformacja | Odbicie Z aby umieścić podłoże jako pierwszą (najwyższą) warstwę stosu.
    UWAGA: Algorytmy COMSTAT odczytują biofilmy w kierunku osi z, od góry (stos 1) do dołu. W zależności od zastosowanego systemu mikroskopu konfokalnego, plik wyjściowy OME-TIFF może być odwrócony. W związku z tym, jest on Ważne jest, aby odwrócić kolejność przekrojów, ustawiając substrat jako stos obrazów 1, aby zapobiec wystąpieniu błędów w danych wyjściowych.
  6. Zdefiniuj właściwości obrazu, wybierając Obraz | WłaściwościPojawi się okno „Źródło”.
    1. Ustaw „Jednostkę długości” na „mikron”.
    2. Wyznacz matematycznie „Szerokość piksela” oraz „Wysokość piksela”, korzystając z poniższego równania:
      figure-protocol-1 (1)
      Tutaj „Szerokość piksela” i „Wysokość piksela” zdefiniowano jako 0,427, gdzie fizyczna długość piksela na urządzeniu sprzężonych ładunków (CCD) wynosi 16 μm; całkowite powiększenie wynosi 25x; a ustawienie powiększalnika to 1,5x.
      UWAGA: Równanie stosowane do obliczania wielkości komórki na piksel może się różnić w zależności od producenta kamery mikroskopowej. Alternatywnie „Szerokość piksela” (Pixel width) i „Wysokość piksela” (Pixel height) można zdefiniować poprzez kalibrację przestrzenną (patrz https://imagej.net/Spatial_Calibration).
    3. Zdefiniuj „Głębokość woksela” jako 0,3 (tj. odstęp inkrementalny między poszczególnymi warstwami stosu z). Wybierz Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. w oknie „Źródło”.
  7. Dostosuj próg obrazu, wybierając Obraz | Dopasuj | PrógPojawi się okno „Threshold” (Próg).
    UWAGA: Obiekty na obrazie będą widoczne w kolorze czerwonym na skali szarości w tle. Alternatywnie, próg można dostosować w trybie czarno-białym, korzystając z menu rozwijane w oknie „Threshold”, aby zmienić „Red” na „B&W’.
    1. W oknie obrazu przesuń suwak maksymalnie w prawo (t. j., najwyższą warstwę biofilmu). Aby usunąć szum tła, należy użyć okna „Threshold”, w którym wyświetla się histogram obrazu, aby ręcznie ustawić maksymalną i minimalną wartość progu. Najpierw należy ustawić maksymalną wartość progu, przesuwając dolny suwak tak daleko w prawo, jak to możliwe. Następnie, za pomocą górnego suwaka, należy ustawić minimalną wartość progu, co podzieli obraz na dwie oddzielne fazy: czerwoną biomasę oraz skalę szarości Wstęp (Rycina 3).
      UWAGA: Te in vitro Opisana w niniejszym dokumencie procedura tworzenia biofilmu i mikroskopii fluorescencyjnej w idealnym przypadku generuje pliki OME-TIFF, co pozwala na segmentację obrazów na dwie odrębne fazy za pomocą prostej metody progowania histogramu. Jednak w niektórych przypadkach rozróżnienie faz na histogramie nie jest tak wyraźne. Może to wynikać z obecności rozległego szumu tła, zmiennej intensywności tła lub niskiego kontrastu intensywności między biomasą a tłem. W takich sytuacjach użytkownicy powinni zastosować ulepszoną procedurę segmentacji.18,19.
      1. Alternatywnie można dostosować progi algorytmicznie dla poszczególnych obrazów, korzystając z lewego menu rozwijanego ustawionego jako „Default” w oknie „Threshold”. Funkcja ta oferuje 17 różnych opcji progowania algorytmicznego (szczegóły dostępne pod adresem https://imagej.net/Auto_Threshold). Należy wybrać najbardziej odpowiednią opcję, a następnie kliknąć „Auto”, aby ustawić próg.
    2. Podczas dostosowywania wartości progowych należy użyć suwaka w oknie obrazu, aby przejrzeć każdą warstwę i upewnić się, że szum tła został w wystarczającym stopniu usunięty w całym obszarze.
    3. Wybierz Zestaw w oknie „Threshold”, aby najpierw ustalić wartość dolnego progu. Pojawi się okno „Set Threshold Levels”. Wybierz Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Wybierz Zestaw powtórz ten krok, aby ustalić maksymalną wartość progu.
      UWAGA: Przy każdym wyborze opcji „Set” dolny suwak może dostosować się automatycznie. W takich przypadkach należy ręcznie ponownie ustawić suwak (lub wybrać opcję „Auto”, jeśli stosowany jest jeden z progów algorytmicznych) i powtórzyć kroki 5.6.2–5.6.3. Kluczowe jest, aby w każdym przypadku automatycznej korekty suwaków opcja „Set” została wybrana dodatkowo dwa razy, aby upewnić się, że zarówno próg górny, jak i dolny zostały ustalone.
    4. Wybierz Zastosuj i pojawi się okno „Convert Stack to Binary”. Wybierz Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.a następnie zamknij okno „Threshold”.
    5. Zapisz nowo dostosowany plik OME-TIFF, wybierając Wtyczki | Bio-Formats | Eksporter Bio-Formats|Wprowadź nową nazwę pliku i zapisz go w formacie OME-TIFF w folderze źródłowym. Pojawi się okno „Bio-Formats Exporter – Multiple Files”. Wybierz Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Pojawi się okno „Bio-Formats Exporter Options”. Wybierz Proszę przesłać tekst źródłowy do tłumaczenia..
      UWAGA: Przed przystąpieniem do analizy w programie COMSTAT należy upewnić się, że w folderze źródłowym zapisano wyłącznie nowo skorygowane, czarno-białe pliki OME-TIFF. Wszystkie oryginalne pliki OME-TIFF należy usunąć z folderu.
  8. Uruchom program COMSTAT, wybierając Wtyczki | Comstat2 |Pojawi się okno „Informacje”. Wybierz Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Pojawią się trzy okna.
    1. W oknie „Observed Directories” (prawy górny róg) należy wybrać DodajZnajdź folder źródłowy, zaznacz go bez otwierania i wybierz WybierzPojawi się okno „Images in Directories” (w górnym lewym rogu), w którym wyświetlona zostanie lista plików OME-TIFF przeznaczonych do analizy za pomocą programu COMSTAT.
    2. W oknie „Comstat 2.1” (prawy dolny róg) odznacz opcję „Automatic thresholding (Otsu’s method)”, aby upewnić się, że oprogramowanie wykorzystuje wartości progowe ustawione wcześniej dla poszczególnych plików OME-TIFF. Odznacz również Filtrowanie objętości połączonychg (CVF), aby upewnić się, że w analizie uwzględniono zarówno bardzo cienkie fragmenty biofilmu, jak i wolno pływające komórki lub biomasę znajdującą się w pustkach struktury biofilmu.
      UWAGA: W tym przypadku odznacz CVF, ponieważ analiza COMSTAT jest przeprowadzana na bardzo wczesnych biofilmach (24 h wzrostu początkowego) oraz pozostałych komórkach planktonicznych/koloniach po zastosowaniu leku przeciwdrobnoustrojowego. W przypadku dojrzałych biofilmów zaznacz CVF, aby upewnić się, że kwantyfikowana jest wyłącznie biomasa związana ze strukturą biofilmu.
    3. W oknie „Comstat 2.1” (prawy dolny róg) wybierz cechy do analizy ilościowej. W tym miejscu zaznacz Biomasa, rozkład grubości, i Powierzchnia właściwaWybierz Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. aby uruchomić program. W oknie „Log” (lewy dolny róg) wyświetlane są przetwarzane dane wyjściowe, aż do pojawienia się komunikatu „Done with selected functions/images!”. Należy zapisać pomiary COMSTAT. Pomiary te są również automatycznie zapisywane jako pliki TXT w folderze źródłowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

A P. aeruginosa wyizolować hodowlę z zainfekowanego pacjent z CF jest wykorzystany do zademonstrowania zalet tego podejścia w dokładnym ilościowym określaniu zmian wywołanych przez środki przeciwdrobnoustrojowe w in vitro architektura biofilmu. Ogólny schemat działania tego modelu przedstawiono w Rysunek 1Procedura przetwarzania obrazów i analizy COMSTAT w programie ImageJ przedstawiono w Rycina 2Prosta metoda progowania histogra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nie ma zalecanej metody ilościowego porównywania trójwymiarowych obrazów struktur biofilmu in vitro , a procedury opisane w tym kontekście są często trudne do standaryzacji ze względu na zmienność między operatorami20. W związku z tym protokół ten oferuje proste i powtarzalne ramy dla aplikacji COMSTAT mających na celu ilościowe określenie zmian w architekturze biofilmu in vitro w różnych warunkach przeciwdrobnoustrojowych. Mocne strony tej techniki są modelowane przy użyciu izol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Autorzy dziękują Fundacji Mukowiscydozy za finansowanie tych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MAb anty-Psl, Psl0096Medimmune
(TSA z 5% krwią owczą) ŚredniFisher ScientificR01200
Ośmiodołkowa komorowa szklana osłona z nieusuwalnymi studzienkamiThermo Fisher Scientific155411
Invitrogen SYTO 9 Zielona fluorescencyjna plama kwasu nukleinowegoThermo Fisher ScientificS34854
LB BROTH (LENNOX), Płynny autoklaw sterylizowanyBioShop CanadaLBL666
Tobramycyna, 900 i mikro; g/mgAlfa Aesar firmy Thermo Fisher ScientificJ66040Zaleca się wykonanie testu minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla każdej wyprodukowanej partii, aby zapewnić kontrolę jakości działania przeciwdrobnoustrojowego
Quorum Volocity 6.3Oprogramowanie do analizy obrazuQuorum Technologies
Agar z krwią

Bibliografia

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  3. Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pseudomonas aeruginosa biofilm infections: community structure, antimicrobial tolerance and immune response. Journal of Molecular Biology. 427, 3628-3645 (2015).
  4. Wendel, A. F., Ressina, S., Kolbe-Busch, S., Pfeffer, K., MacKenzie, C. R. Species diversity of environmental GIM-1-producing bacteria collected during a long-term outbreak. Applied and Environmental Microbiology. 82, 3605-3610 (2016).
  5. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  6. Powell, L. C., et al. Targeted disruption of the extracellular polymeric network of Pseudomonas aeruginosa biofilms by alginate oligosaccharides. NPJ Biofilms and Microbiomes. 4, 1-10 (2018).
  7. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., Jensen, P. Ø, Wang, H., Høiby, N. Antimicrobial resistance, respiratory tract infections and role of biofilms in lung infections in cystic fibrosis patients. Advanced Drug Delivery Reviews. 85, 7-23 (2015).
  8. Landry, R. M., An, D., Hupp, J. T., Singh, P. K., Parsek, M. R. Mucin-Pseudomonas aeruginosa interactions promote biofilm formation and antibiotic resistance. Molecular Microbiology. 59, 142-151 (2006).
  9. Beaudoin, T., et al. Staphylococcus aureus interaction with Pseudomonas aeruginosa biofilm enhances tobramycin resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 3, 1-9 (2017).
  10. Rojo-Molinero, E., et al. Sequential treatment of biofilms with aztreonam and tobramycin is a novel strategy for combating Pseudomonas aeruginosa chronic respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, 2912-2922 (2016).
  11. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183, 5395-5401 (2001).
  12. Tolker-Nielsen, T., Sternberg, C. Growing and analyzing biofilms in flow chambers. Current Protocols in Microbiology. 21, 1-17 (2011).
  13. Luo, T. L., et al. A Sensitive thresholding method for confocal laser scanning microscope image stacks of microbial biofilms. Scientific Reports. 8, 1-14 (2018).
  14. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. Journal of Visualized Experiments. (118), e54819(2016).
  15. DiGiandomenico, A., et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. Journal of Experimental Medicine. 209, 1273-1287 (2012).
  16. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
  17. Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms, in Informatics and Mathematical Modelling. Technical University of Denmark. , Kongens Lyngby. Denmark. (2008).
  18. Hashemi, M. A., Khaddour, G., François, B., Massart, T. J., Salager, S. A tomographic imagery segmentation methodology for three-phase geomaterials based on simultaneous region growing. Acta Geotechnica. 9, 831-846 (2014).
  19. Rogowska, J. Overview and fundamentals of medical image segmentation. Handbook of Medical Image Processing and Analysis. , 73-90 (2009).
  20. Webb, D., et al. Assessing technician effects when extracting quantities from microscope images. Journal of Microbiological Methods. 53, 97-106 (2003).
  21. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43, 313-351 (2017).
  22. Xavier, J. B., et al. Objective threshold selection procedure (OTS) for segmentation of scanning laser confocal microscope images. Journal of Microbiological Methods. 47, 169-180 (2001).
  23. Arena, E. T., et al. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 6, 260(2017).
  24. Daims, H., Wagner, M. Quantification of uncultured microorganisms by fluorescence microscopy and digital image analysis. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, 237-248 (2007).
  25. Yerly, J., Hu, Y., Jones, S. M., Martinuzzi, R. J. A two-step procedure for automatic and accurate segmentation of volumetric CLSM biofilm images. Journal of Microbiological Methods. 70, 424-433 (2007).
  26. Lee, B., et al. Heterogeneity of biofilms formed by nonmucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5247-5255 (2005).
  27. Stapper, A. P., et al. Alginate production affects Pseudomonas aeruginosa biofilm development and architecture, but is not essential for biofilm formation. Journal of Medical Microbiology. 53, 679-690 (2004).
  28. Reichhardt, C., Parsek, M. Confocal laser scanning microscopy for analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm architecture and matrix localization. Frontiers in Microbiology. 10, 677(2019).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39, 109-119 (2000).
  30. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Evaluation of biofilm image thresholding methods. Water Research. 35, 1149-1158 (2001).
  31. Ross, S. S., et al. Quantification of confocal images of biofilms grown on irregular surfaces. Journal of Microbiological Methods. 100, 111-120 (2014).
  32. Ma, L., et al. Assembly and development of the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. PLoS Pathogens. 5, (2009).
  33. Mah, T. F., et al. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  34. Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm. Biofouling. 26, 449-459 (2010).
  35. Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales. Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).
  36. Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment. Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dzia anie przeciwdrobnoustrojowePseudomonas aeruginosamikroskopia konfokalnaprzetwarzanie obraz wregulacja progupomiar biomasyrozk ad grubo cianaliza powierzchni

Powiązane artykuły