Akupunktura w szczurzym modelu astmy

Podsumowanie

Wysoka platforma może bez ograniczeń naprawiać szczury i całkowicie odsłaniać punkty akupunkturowe na plecach podczas manipulacji akupunkturą. W artykule opisano metody wytwarzania wysokiej platformy, ustanowiono szczurzy model astmy i zmierzono zmiany w funkcji oddechowej za pomocą nieinwazyjnego systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Wysoka platforma może bez ograniczeń naprawiać szczury i całkowicie odsłaniać punkty akupunkturowe na plecach podczas manipulacji akupunkturą. W artykule opisano metody wytwarzania wysokiej platformy, ustanowiono szczurzy model astmy i zmierzono zmiany w funkcji oddechowej za pomocą nieinwazyjnego systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) w czasie rzeczywistym.

Wprowadzenie

Astma jest przewlekłą chorobą charakteryzującą się zwężeniem oskrzeli i nadreaktywnością dróg oddechowych¹. U około 339,4 miliona ludzi na całym świecie diagnozuje się astmę². Częstość występowania astmy wzrasta na całym świecie, a w ciągu następnej dekady spodziewanych jest 100 milionów nowych przypadków³. Wziewne kortykosteroidy i długo działające_2-agoniści β nie kontrolują skutecznie objawów u wszystkich pacjentów⁴. W związku z tym coraz częściej zwraca się uwagę na stosowanie alternatywnych terapii, takich jak akupunktura, w leczeniu astmy⁵. Skuteczną metodą leczenia astmy jest nakłucie GV14 (Dazhui), obustronne BL12 (Fengmen) i obustronne BL13 (Feishu)⁶. Akupunktura znacznie obniża poziom wydzielniczej immunoglobuliny A (SIgA) w ślinie i wydzielinie z nosa pacjentów z astmą alergiczną oraz zmniejsza liczbę eozynofili we krwi obwodowej z całkowitym skutecznym wskaźnikiem 85%⁶. Akupunktura w BL13 i ST36 (Zusanli) u myszy z przewlekłą astmą obniża poziom IL-17 o 40% i zmniejsza grubość mięśni gładkich o 33% w porównaniu z grupą albuminy jaja kurzego (OVA), a tym samym łagodzi objawy stanu zapalnego^7,8. Jednak mechanizm leczenia astmy akupunkturą nie jest do końca jasny

.

Modele zwierzęce są ważnym narzędziem do badań nad astmą⁹, ponieważ model zwierzęcy może być używany do ciągłego pomiaru funkcji oddechowych w celu oceny skuteczności leczenia astmy¹⁰. Tymczasem badania nad patofizjologią astmy wymagają próbek testowych, w tym próbek z tchawicy, płuc i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, w celu zweryfikowania zmian w poziomach kluczowych czynników¹¹. Szczurze modele astmy są powszechnie używane do oceny patofizjologii astmy, ponieważ wywołują długotrwałe reakcje dróg oddechowych i pokazują natychmiastowe i późne reakcje dróg oddechowych¹². Jednak z powodu wielokrotnej stymulacji eksperymentalnej szczury często stają się drażliwe. Dlatego potrzebna jest odpowiednia metoda naprawy szczurów. Powszechnie stosowane metody unieruchamiania szczurów obejmują znieczulenie i wiązanie¹³. Chociaż metoda znieczulenia zapewnia lepszą ekspozycję punktów akupunkturowych, może wpływać na przewodnictwo nerwowe i ostatecznie wpływać na wyniki eksperymentu¹⁴. Metoda wiązania nie wywołuje takich samych efektów fizjologicznych jak znieczulenie, ale skrępowane szczury doświadczają napięcia mięśni szkieletowych. Ponadto igła nie może łatwo dotrzeć do wyznaczonej pozycji¹⁵. Tutaj wprowadzamy wysoką platformę, która może być używana do mocowania szczurów bez ich ograniczania i pełnego odsłonięcia punktów akupunkturowych na grzbiecie. Szczury mogą być umieszczane na wysokiej platformie podczas podawania akupunktury. Wysoka platforma jest w stanie pomieścić szczura tylko wtedy, gdy stoi, a ponieważ jest umieszczona w pewnej odległości od ziemi, szczury nie będą się ruszać z powodu lęku wysokości¹⁶.

Ten artykuł szczegółowo opisuje produkcję wysokiej platformy, stworzenie szczurzego modelu astmy, operację nakłuwania szczura na wysokiej platformie oraz pomiar funkcji oddechowych za pomocą systemu pletyzmografii całego ciała (WBP).

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju (numer poświadczenia etycznego PZSHUTCM190308020).

1. Wykonanie wysokiej platformy

1. Ustaw długość i szerokość urządzenia nośnego na 86 cm x 17 cm (Rysunek 1).
2. Zamocuj urządzenie łączące pionowo z urządzeniem nośnym. Urządzenie łączące powinno mieć około 30 cm długości, aby zapobiec bieganiu szczura na górną powierzchnię wysokiej platformy i mieć szerokość 14 cm.
3. Przymocuj pedał poziomy (5 cm x 5 cm) do urządzenia łączącego. Wysokość zawieszenia u dołu pedału poziomego powinna być większa lub równa 50 cm.
   UWAGA: W zależności od liczby szczurów doświadczalnych można użyć wielu poziomych pedałów, z jednym szczurem umieszczonym na każdym pedale.

2. Stworzenie szczurzego modelu astmy

1. Uczulanie szczurów za pomocą OVA
   1. Przygotować roztwór uczulający w dniu 0. Przygotować każdy 1 ml roztworu uczulającego z 1 mg OVA i 10 mg wodorotlenku glinu, z solą fizjologiczną jako rozpuszczalnikiem.
   2. Wstrzyknąć dootrzewnowo każdemu szczurowi 1 ml roztworu uczulającego w dniu 0. Narysuj roztwór uczulający za pomocą odpowiedniej strzykawki do późniejszego użycia.
   3. Chwyć ogon i podnieś szczura, połóż go na szorstkiej powierzchni i delikatnie pociągnij ogon do tyłu. Chwyć skórę obu uszu i szyi lewym kciukiem i palcem wskazującym, mocno przytrzymując tylną skórę pozostałymi trzema palcami i dłońmi (uważaj, aby nie przykładać nadmiernej siły, która może udusić szczura).
   4. Prawą ręką wykonać wstrzyknięcie dootrzewnowe u szczura za pomocą przygotowanej strzykawki z 1 ml roztworu uczulającego.
2. Trudne szczury z OVA
   1. Wybierz pudełko z pokrywką (długość, szerokość i wysokość to 39 cm x 28 cm x 23 cm) i wywierć mały otwór z boku. Połączyć szczelnie zamknięte pudełko, miseczkę nebulizacyjną i nebulizator uciskowy za pomocą gumowej rurki (rysunek uzupełniający 1).
      UWAGA: Wielkość cząstek nebulizowanych w sprężonym nebulizatorze wynosi 1 - 5 μm, szybkość nebulizacji jest większa niż 0,2 ml/min, a ciśnienie końcowe wynosi 205 kPa.
   2. Czternastego dnia po uczuleniu otwórz wieczko domowego szczelnego pudełka i umieść szczura w pudełku (pudełko może pomieścić 5 szczurów), a następnie umieść zapieczętowane pudełko w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   3. Przygotuj rozwiązanie wyzwania. Dokładnie wymieszaj 300 mg OVA z 30 ml soli fizjologicznej.
   4. Włącz nebulizator ultradźwiękowy i dodaj 30 ml roztworu prowokacyjnego do kubka nebulizującego. Dostosuj dawkę roztworu prowokacyjnego i liczbę szczurów w zależności od objętości domowego zapieczętowanego pudełka.
   5. Powtórz nebulizację kilka razy (raz dziennie) lub dostosuj procedurę w zależności od nasilenia objawów astmy.

3. Leczenie akupunkturą

1. Wybierz punkty akupunkturowe, w tym GV14, obustronne BL12 i obustronne BL13, zgodnie z teorią tradycyjnej medycyny chińskiej w leczeniu astmy (rysunek uzupełniający 2). Zastosuj akupunkturę manualną w drugim dniu i wykonuj raz na drugi dzień, w sumie przez 7 sesji (Rysunek 2).
   1. Akupunktura GV14 znajduje się między siódmym kręgiem szyjnym a pierwszym kręgiem piersiowym (zagłębienie łopatki), na linii środkowej pleców (Ryc. 3).
   2. Akupunktura BL13 znajduje się poniżej trzeciego kręgu piersiowego, po obu stronach przestrzeni międzyżebrowych (dolna krawędź łopatki).
   3. Akupunktura BL12 znajduje się poniżej drugiego kręgu piersiowego, po obu stronach przestrzeni międzyżebrowych (poniżej łopatki, pozycja zidentyfikowana zgodnie z BL13).
2. Chwyć szczury i umieść je na wysokiej platformie.
3. Przytrzymaj jednorazową igłę ze stali nierdzewnej (0.3 mm x 13.0 mm, Rysunek Uzupełniający 3) kciukiem i palcem wskazującym prawej ręki i naciśnij grzbiet szczura dłonią prawej ręki.
   UWAGA: Igły jednorazowe mogą być jednorazowego użytku. Ponieważ wielokrotne użycie spowoduje stępienie igły, co prowadzi do zwiększonego bólu u szczurów.
4. Dotknij wgłębienia na środku górnej krawędzi (GV14) lub dolnej krawędzi łopatki (BL12 i BL13), a następnie delikatnie nakłuj skórę szczura końcówką igły, aby zlokalizować punkty akupunkturowe.
5. Szybko włóż igłę po ustaleniu konkretnego położenia punktu akupunkturowego i szybko wyjmij prawą rękę.
6. Równomiernie skręć igły o około 360° z prędkością 60 razy/min przez 10 - 20 s, manipuluj nimi co 5 minut, a następnie wyjmij je po 20 - 30 minutach (rysunek uzupełniający 4).

4. Pomiar Penh

1. Przygotowanie metacholiny: Umieścić 100 mg metacholiny w probówce wirówkowej o pojemności 5 ml i dodać PBS do objętości 2 ml (50 mg/ml metacholiny). Następnie rozcieńczyć roztwór metacholiny o stężeniu 50 mg/ml do 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml i 3,125 mg/ml.
2. Inspekcja przyrządów
   1. Włącz wzmacniacz sygnału (system dystrybucji aerozolu i system zasilania polaryzacją gryzoni są wyłączone, a złącze nebulizacji jest zamknięte).
   2. Sprawdź kanały: Kliknij przycisk Kalibruj, przywróć linię bazową regulacji zgrubnej do 0 i przełącz na pozycję prądu stałego (DC). Dostosuj linię bazową do 0 i wstrzyknij 5 ml gazu za pomocą strzykawki. Następnie przełącz się w pozycję prądu przemiennego (AC).
   3. Po sprawdzeniu kanałów upewnij się, że wartość błędu jest mniejsza niż 0,5%.
3. Ustawianie parametrów
   1. Włącz system dystrybucji aerozoli i system zasilania w kierunku odchylenia gryzoni. Dostosuj natężenie przepływu do 4.5 ml w zależności od poziomu cieczy na kuli rtęciowej.
   2. Kliknij przycisk Create Study Options (Utwórz opcje badania) i wybierz Dose Response Study (Badanie odpowiedzi na dawkę), wybierz opcję Szczur gatunku i kliknij przycisk Dalej.
   3. Wybierz opcję Prosta lista dawek, ustaw liczbę dawek na 6 i kliknij przycisk Dalej.
   4. Wybierz parametry Penh i Obszar: Ustaw czas adaptacji zwierzęcia na 5 minut, czas nebulizacji na 2 minuty, czas reakcji na 3 minuty, a czas rekonwalescencji na 2 minuty.
   5. Do nebulizatora należy kolejno dodawać następujące roztwory (200 μl na szczura): metacholina (0 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml i 50 mg/ml). Zmiany w Penh w czasie rzeczywistym można zaobserwować (Rysunek 4).
   6. Po przereagowaniu wszystkich 6 roztworów o różnych stężeniach kliknij Plik i Zakończ sesję, aby zakończyć eksperyment.

Wyniki

Podczas akupunktury w punktach GV14, obustronnie BL12 i obustronnie BL13, szczur pozostaje w pozycji na brzuchu. Szczur może obracać głowę wyłącznie na zewnątrz, a nie do wewnątrz, ponieważ jeden kierunek jest zablokowany drewnianą deską (Rysunek 5).

Wraz ze wzrostem stężenia metacholiny, Penh wykazuje tendencję wzrostową, a tempo wzrostu stopniowo przyspiesza. Przy stężeniach 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL oraz 50 mg/mL, Penh wzrósł odpowiednio o 1...

Dyskusja

Punkty akupunkturowe GV14, obustronne BL12 i obustronne BL13 użyte w tym badaniu znajdują się z tyłu, a zatem wysoka platforma nadaje się do mocowania szczurów. W innych badaniach należy dobrać odpowiednią metodę utrwalania w zależności od pozycji punktów akupunkturowych¹⁵. W przypadku punktów akupunkturowych na brzuchu szczura można umieścić w dół w czarnym stożku (podobnym do torby na ciasto używanej przez piekarzy)¹⁷. Łańcuch jest przymocowany do stożka przytrzymującego ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igła do akupunktury 0,3 mm x 13,0 mm	Chiny Fabryka urządzeń medycznych w Suzhou Al
(OH)3	American Thermo	77161
Nebulizator kompresyjny	Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd.	NB-212C
Fine Pointe V2.0	Buxco
American	Drierite	26800
Metacholina	American Sigma	MKCF6054
Albumina jaja kurzego	American Sigma	A5503-25G
Roztwór buforu fosforanowego (1x)	Gelifesciences	SH30256.01
Skrzynka uszczelniająca	IRIS Corporation of Japan
Pletyzmografia całego ciała system pomiaru funkcji oddechowych	American Buxco

Amerykański laboratoryjny osuszacz gazu