Złożone zadanie polegające na nurkowaniu w poszukiwaniu pożywienia w celu zbadania organizacji społecznej i interakcji u szczurów

Szczury są bardzo towarzyskimi zwierzętami, co czyni je idealnym modelem do zrozumienia zachowań społecznych i ich związku z podejmowaniem decyzji. Szczury dzielą się na grupy hierarchiczne oparte na relacjach dominujących i uległych. Szczury można szkolić do zadań, które wyrażają współpracę, zarządzanie ryzykiem, oszukańcze zachowania i zachowania, które zmieniają się w zależności od decyzji innych szczurów^1,2. Badania z modelami szczurzymi wyrażającymi te zachowania okazują się pomocne w zrozumieniu struktury społecznej i jej związku z podejmowaniem decyzji, co ma znaczenie dla psychologii człowieka.

Jako niezbędny zasób, dostęp do jedzenia jest głównym powodem organizacji społecznej wśród szczurów³. Zaobserwowano, że naiwne szczury angażują się w interakcje społeczne i różnicują się w sytuacjach, gdy dostęp do jedzenia był ograniczony^{1,2,4,5,6,7,8}. W jednym z badań dorosłe szczury musiały przejść przez tunel pod wodą, aby uzyskać dostęp do jedzenia, a następnie przynieść jedzenie z powrotem przez tunel do klatki⁹. Poszczególne szczury w każdej grupie można było sklasyfikować zgodnie z ich metodą pozyskiwania pożywienia. Pojawiły się dwa profile behawioralne: pierwszy to "przewoźnicy", którzy nurkują i pływają pod wodą do karmnika, zdobywają wypluwkę i trzymają ją w pysku, gdy płyną z powrotem do klatki. Drugą grupę stanowią "nie-nosiciele", którzy nie nurkują i zdobywają pożywienie wyłącznie poprzez okradanie nosicieli. W grupach po sześć szczurów, około połowa była nosicielami, a druga połowa nie⁹. Zaobserwowano, że wszystkie szczury są nosicielami, gdy były indywidualnie szkolone w aparacie do nurkowania¹⁰.

Podobne zadania behawioralne zwierząt obejmują rywalizację o jedzenie lub przestrzeń i zostały zastosowane w przypadku kurczaków¹¹, gryzonie^12,13,14,15, oraz pigs¹⁶. W teście probówkowym dwie myszy są wysyłane przez wąską rurkę z przeciwległych końców, przy czym jedna mysz musi ustąpić pierwszeństwa drugiej. Ten test pomaga w pomiarze dominacji społecznej^17,18,19. Test behawioralny określany jako test ciepłego punktu polega na tym, że myszy rywalizują o pozycję w małym ciepłym miejscu w zimnej klatce^19,20.

Kolejne zadanie polegające na nurkowaniu w poszukiwaniu jedzenia, które jest bardziej złożone, pozwala szczurom-nosicielom na dostęp do drugiej klatki, z dala od osób niebędących nosicielami, gdzie mogłyby spożywać swoje jedzenie oddzielnie⁴. W tym protokole przedstawiamy zadanie polegające na nurkowaniu w poszukiwaniu pożywienia jako alternatywny model hierarchii społecznej i zachowania u szczurów. To zadanie polegające na nurkowaniu w poszukiwaniu pożywienia zapewnia szczurom metodę unikania grup społecznych w głównej klatce, a tym samym ucieczki przed agresją i interakcjami społecznymi innych szczurów. To zadanie wprowadza opcję unikających zachowań społecznych u szczurów, która może wyjaśnić nasze zrozumienie agresji społecznej.

Na funkcjonowanie społeczne, które opisuje zdolność do angażowania się w normalne role społeczne, mogą wpływać stany takie jak depresja³. Osoby cierpiące na depresję często zmagają się z bezrobociem, mają niewiele kontaktów społecznych i prawie nie angażują się w spędzanie wolnego czasu³. Skuteczność leczenia depresji jest często mierzona poprawą funkcji społecznych i interpersonalnych²¹. Leki przeciwdepresyjne różnią się jednak skutecznością w leczeniu zaburzeń funkcjonowania społecznego związanych z depresją³.

W tej metodologii wywołaliśmy u szczurów stan podobny do depresji za pomocą testu przewlekłego stresu i oceniliśmy poziom anhedonii u szczurów, jedną z cech stanu podobnego do depresji, za pomocą testu preferencji sacharozy. Szczury anhedoniczne, jak również szczury anhedoniczne, którym podawano leki przeciwdepresyjne, były monitorowane poprzez zadanie nurkowania w poszukiwaniu pożywienia w porównaniu z grupą kontrolną.

Wspomniane wcześniej zadania związane z nurkowaniem w poszukiwaniu jedzenia przypominają testy konkurencji żywnościowej, które często wykorzystują tylko jedną parę zwierząt lub jedną dychotomię jako punkt porównania, takie jak nosiciele i nie-nosiciele oraz pojedyncza analiza, która porównuje uległość do dominacji^15,17,22. Nasza metoda definiuje bardziej złożone interakcje między szczurami poprzez podział na wiele typów zachowań, w tym: nosiciele i nie-nosiciele, ci, którzy walczą o pożywienie i ci, którzy tego nie robią, oraz szczury, które dzielą się jedzeniem lub chodzą do oddzielnych klatek. Uważamy, że ten protokół jest jedynym typem, który wykorzystuje hierarchię do oceny złożonej struktury interakcji społecznych w grupie zwierząt, a nie w parach. Będzie to pomocne w badaniach, które testują dominację w oparciu o preferencje żywieniowe, a także w badaniach, które mają na celu wyjaśnienie bardziej hierarchicznych relacji, które nie ograniczają się do modelu dominująco-uległego.

W tym protokole szczegółowo opisujemy skomplikowane zadanie polegające na poszukiwaniu pożywienia, aby zbadać organizację społeczną i interakcje u szczurów ze zmianami w zachowaniu osobniczym, szczególnie po rozwoju anhedonii. Ten model zwierzęcy może być również wykorzystany do badania innych schorzeń psychicznych związanych ze zmianami w zachowaniu społecznym i hierarchii.

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Deklaracji z Helsinek i Tokio oraz Wytycznych Wspólnoty Europejskiej dotyczących wykorzystania zwierząt doświadczalnych. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Ben-Guriona w Negev. Kodem autoryzacyjnym dla tego eksperymentu była IL-55-8-12.

1. Przygotowanie szczura

1. Uzyskanie zgody na eksperymenty od Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC).
2. Wybierz dorosłe szczury Sprague Dawley. Wyklucz zwierzęta, które wykazują nieprawidłowe cechy fizyczne, takie jak drgawki lub inne deficyty motoryczne.
   UWAGA: Do tego protokołu użyliśmy dorosłych samców szczurów o wadze 300-350 g, w wieku 4-8 miesięcy. Można również wykorzystać samice szczurów.
3. Utrzymuj szczury w temperaturze pokojowej (22 °C ± 1 °C), z 12 godzinnymi cyklami światła i 12 godzinami ciemności. Zapewnij karmę dla szczurów i wodę ad libitum. Dom 3 szczury w klatce.
   UWAGA: Wszystkie szczury trzymane w tej samej klatce muszą należeć do tej samej grupy doświadczalnej.
4. Losowo umieść 120 szczurów w jednej z trzech grup eksperymentalnych. Użyj grupy 1 (n=60) w jako grupy kontrolnej. Indukuj grupę eksperymentalną, grupę 2 (n = 30), za pomocą stresorów, jak opisano poniżej. Wywołać grupę 3, grupę eksperymentalną leczeniem (n = 30), anhedonią, a następnie podać leczenie przeciwdepresyjne. Oś czasu dla protokołu eksperymentalnego można znaleźć w Rysunek 1.
5. Oznacz szczury kolorowymi długopisami na początku eksperymentu, aby umożliwić indywidualną identyfikację.
6. Wszystkie eksperymenty wykonuj w godzinach od 6:00 do 12:00.
7. Waż szczury codziennie przez cały zabieg pod kątem możliwej utraty wagi. Utrata masy ciała powyżej 20% wykluczy szczury z badania. Patrz sekcja 3.1.3.

2. Indukcja anhedonii u szczurów

1. Model przewlekłego nieprzewidywalnego stresu
   1. Indukuj szczury z grupy eksperymentalnej i grupy eksperymentalnej leczeniem z cechami stanu depresyjnego za pomocą modelu przewlekłego nieprzewidywalnego stresu, jak wcześniej szczegółowo opisano²³.
2. Model przewlekłego nieprzewidywalnego stresu
   1. Indukuj szczury z dwóch grup eksperymentalnych z zachowaniami podobnymi do depresji za pomocą modelu przewlekłego nieprzewidywalnego stresu, jak wcześniej szczegółowo opisano²³.
      UWAGA: Szczury są codziennie narażone na 2 z 7 stresorów w losowej kolejności; jeden w ciągu dnia, a drugi w nocy przez 5 tygodni^24,25.
   2. Wprowadź następujące stresory w losowej kolejności:
      1. Szczury domowe z 6 zwierzętami w klatce zamiast 3 przez 18 godzin.
      2. Ustawienie klatki przechylnej pod kątem 45° wzdłuż osi pionowej na 3 godziny.
      3. Pozbawić zwierzęta jedzenia przez 18 godzin.
      4. Pozbawij zwierzęta wody na 18 godzin, a następnie wprowadź pustą butelkę z wodą.
      5. Utrzymuj zabrudzoną klatkę przez 8 godzin z 300 ml wody rozlanej do ściółki.
      6. Utrzymuj ciągłe oświetlenie i odwróć cykl światła/ciemności przez 48 godzin tygodniowo.
      7. Podgrzewać otoczenie do temperatury 40 °C przez 5 min.
   3. Potwierdź rozwój anhedonii, jednej z cech stanu podobnego do depresji, wykonując test preferencji sacharozy. Patrz punkt 4.
3. Terapia antydepresyjna
   1. Podawać 20 mg/kg chlorowodorku imipraminy (trójpierścieniowy lek przeciwdepresyjny) dootrzewnowo raz dziennie przez 3 tygodnie szczurom z grupy eksperymentalnej^26,27,28.
      UWAGA: Podgrupie (n = 3 w każdej grupie szczurów) grupy eksperymentalnej podaje się 0,9% soli fizjologicznej (placebo) dootrzewnowo raz dziennie przez okres 3 tygodni, w tej samej objętości, co w grupie leczenia przeciwdepresyjnego.

3. Test organizacji społecznej (skomplikowane zadanie polegające na nurkowaniu w poszukiwaniu jedzenia)

UWAGA: Eksperymentalna aparatura została opisana w poprzednich badaniach^9,29,30 z niewielkimi modyfikacjami. Wszystkie części aparatu powinny być wykonane z przezroczystej pleksi.

1. Przygotuj aparaturę i zaaklimatyzuj szczury.
   1. Połącz dwie klatki (50 cm x 50 cm x 50 cm) z akwarium (130 cm x 35 cm x 50 cm) za pomocą tuneli (45 cm x 15 cm x 15 cm) (Rysunek 2). Upewnij się, że nie ma dostępu z jednej klatki do drugiej bez zanurzenia się w akwarium²⁵. Utrzymuj temperaturę wody na poziomie 25 °C.
   2. Umieść probówki z granulkami pokarmu (po jednym granulku spożywczym w każdej probówce) na jednym końcu akwarium.
      UWAGA: Zmniejszenie dostępności granulek pokarmowych w klatce ucieczki powinno stopniowo zachęcać szczura, który w przeciwnym razie rozwinąłby nawyk kradzieży, do nurkowania w celu dotarcia do jedzenia.
   3. W pierwszym dniu eksperymentu należy zapoznać każdą grupę 6 szczurów z aparaturą eksperymentalną bez wody na 3-godzinne sesje. Po sesji szczury wracają do standardowej klatki.
      1. Ogranicz dostęp szczurów do karmy dla szczurów podczas 3-godzinnych sesji, bez innego dostępu do jedzenia przez resztę dnia.
      2. Usuń szczury, które straciły więcej niż 20% swojej wyjściowej masy ciała z eksperymentu wraz z ich grupą społeczną i podawaj im ad libitum jedzenie i wodę.
      3. Ręcznie osusz szczury ręcznikiem lub zapewnij dostęp do źródła ciepła do czasu wyschnięcia i przed umieszczeniem ich z powrotem w zwykłym pomieszczeniu, aby uniknąć hipotermii.
      4. Powtórz te sesje przez dni 2-3.
         UWAGA: Nagrywaj szczury w aparacie w sposób ciągły przez 3-godzinne sesje. Upewnij się, że aparat jest ustawiony na wysoką rozdzielczość (720p), a autofokus jest wyłączony.
2. Wykonaj zadanie nurkowania w poszukiwaniu jedzenia
   1. W dniach 4-17 dodawaj wodę stopniowo, aż do osiągnięcia maksymalnego poziomu wody, jak opisano wcześniej⁴. W dniach 17-21 utrzymuj maksymalny poziom wody.
   2. Obserwuj szczury nurkujące w poszukiwaniu dostępu do granulek.
   3. Zapisz następujące parametry dla każdego szczura:
      1. Oceń częstotliwość wjazdu do tunelu.
      2. Policz każdą próbę nurkowania w poszukiwaniu jedzenia.
         UWAGA: Podróż z klatki do akwarium z powrotem do klatki nie powinna przekraczać 5-6 sekund, co zapewni, że granulat pozostanie jadalny.
      3. Oceń, ile razy pożywienie jest zdobywane przez atak między szczurami, które pływają w poszukiwaniu pożywienia, a szczurami, które tego nie robią.
      4. Zapisz, ile razy zwierzę pływa niosące pokarm
      .
      5. Zapisz czas, jaki szczury spędziły w oddzielnych klatkach w porównaniu z czasem spędzonym w oryginalnej klatce.
         UWAGA: Wszystkie dane uzyskano poprzez ciągłą obserwację wzrokową.

4. Ocena anhedonii: Test preferencji sacharozy

1. Oceń anhedonię za pomocą testu preferencji sacharozy z niewielkimi modyfikacjami, jak opisano wcześniej^{23,25,31,32,33}. Wykonaj ten test w dniach -6, 0, 35, 41, 62 i 68 procedury (zobacz Rysunek 1 dla osi czasu protokołu).
   1. Pozwolić szczurom na spożywanie roztworu sacharozy przez 24 godziny, zapewniając swobodny dostęp do dwóch butelek w każdej klatce, zawierających 100 ml roztworu sacharozy (1%, w/v).
   2. Po 24 godzinach wymień jedną z butelek na wodę na dodatkowe 24 godziny.
   3. Pozbawij szczury wody na 12 godzin³⁴.
   4. Daj szczurom obie butelki (jedną z wodą i jedną z sacharozą). Po 4 godzinach zapisz objętość zarówno spożytego roztworu sacharozy, jak i wody.
   5. Obliczać preferencję sacharozy jako preferencję sacharozy (%) = spożycie sacharozy (ml)/(spożycie sacharozy (ml) + zużycie wody (ml)) × 100%.
      UWAGA: Korzystając z modelu chronicznego nieprzewidywalnego stresu w połączeniu z testem organizacji społecznej, zalecamy nie tylko rejestrowanie średniego spożycia sacharozy i wody, ale także odnotowanie zmian w zachowaniu każdego szczura z osobna. Pozwoli to na bardziej szczegółowe zrozumienie zmian behawioralnych w obrębie jednostki, a nie w grupie, w konfrontacji z modelem hierarchicznym, takim jak zadanie nurkowania w poszukiwaniu jedzenia.

5. Analiza statystyczna

1. Określ porównania między grupami, używając metody Kruskala-Wallisa, a następnie Manna-Whitneya dla danych nieparametrycznych lub jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Bonferroniego lub testu t Studenta dla danych parametrycznych.
   UWAGA: Wyniki są uważane za statystycznie istotne, gdy p < 0,05 i bardzo istotne, gdy p < 0,01.

Zmiany masy ciała
Jednoczynnikowa ANOVA nie wykazała żadnych różnic w zmianach masy ciała między grupami eksperymentalnymi w ciągu 21 dni nurkowania w poszukiwaniu pożywienia. Od 2 do 21 dnia zaobserwowano zmiany masy ciała we wszystkich 3 grupach (p<0,01, Tabela 1).

Test preferencji sacharozy
Na początku eksperymentu (dzień 0) nie było różnicy w procentowym usposobieniu sacharozy między grupą eksperymentalną szczurów z indukowaną anhedonią (85,6% ± 18,6), grupą eksperymentalną leczoną terapią przeciwdepresyjną (85,1% ± 18,8) i grupą kontrolną (85,7% ± 9,9). W dniu 35, w porównaniu z grupą kontrolną (84,13% ± 12,3), w grupie eksperymentalnej (62,69% ± 17,7, p<0,01) oraz w grupie eksperymentalnej z leczeniem (68,48% ± 13,9, p<0,01, Rysunek 3A). Nie stwierdzono jeszcze żadnych różnic między grupą eksperymentalną a grupą eksperymentalną leczoną. W dniu 62 szczury eksperymentalne miały niższą preferencję procentową sacharozy (68% ± 15) niż grupa kontrolna (78,5% ± 16) i grupa eksperymentalna z leczeniem (77% ± 16, p<0,05, Figura 3B). W tym czasie nie stwierdzono różnic między grupą leczoną a grupą kontrolną. Dane przedstawiono jako procentową preferencję sacharozy ± odchylenie standardowe.

Zadanie związane z nurkowaniem dla jedzenia
Aktywność społeczna szczurów w sytuacji ograniczonego dostępu do pożywienia zilustrowana jest na rysunku Rysunek 4. Szczury w grupie eksperymentalnej wykazały wzrost częstotliwości wchodzenia do tunelu (113% ± 3,7, p<0,01, Ryc. 4A), nurkowanie w poszukiwaniu pożywienia (141% ± 7, p<0,01, Ryc. 4B), pokarm uzyskany przez noszenie (168% ± 12, p<0,01, Rysunek 4C), czas spędzony w oddzielnych klatkach (123% ± 7,9, p<0,01, Rysunek 4D) oraz żywność uzyskana w wyniku ataku (232% ± 26, p<0.01, Ryc. 4E) w porównaniu z grupą eksperymentalną z leczeniem (odpowiednio 44% ± 7, 53% ± 6, 54% ± 5, 55% ± 4,7, 67% ± 3,4). Różnice między grupą doświadczalną szczurów a szczurami eksperymentalnymi leczonymi lekami przeciwdepresyjnymi były statystycznie większe niż różnica między grupą eksperymentalną a grupą kontrolną we wszystkich 5 parametrach testu nurkowania w poszukiwaniu żywności (p<0,05). Dane są prezentowane jako średnia wartość procentowa w porównaniu z kontrolami ± błąd standardowy średniej.

Rysunek 1. Kalendarium protokołu eksperymentalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Ilustracja aparatury do nurkowania w poszukiwaniu żywności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Test preferencji sacharozy (A) po 35 dniach i (B) po 62 dniach. Na początku eksperymentu nie było różnicy w spożyciu sacharozy. (A) Do 35 dnia eksperymentu, grupa anhedoniczna (p<0,01) i grupa anhedoniczna leczona terapią przeciwdepresyjną (p<0,01) miała znacznie niższą procentową preferencję sacharozy niż grupa kontrolna. (B) W dniu 62 szczury z anhedonią miały niższą procentową preferencję sacharozy w porównaniu zarówno z grupą kontrolną, jak i anhedoniczną leczoną lekiem przeciwdepresyjnym (p<0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Aktywność społeczna szczurów w sytuacji ograniczonego dostępu do pożywienia. (A) Częstotliwość wjazdów do tunelu. (B) Nurkowanie w poszukiwaniu pożywienia. (C) Żywność uzyskana przez przewóz. (D) Czas spędzony w oddzielnych klatkach. (E) Żywność zdobyta przez atak. Dane prezentowane są jako średni procent w porównaniu ze średnimi wartościami kontrolnymi + błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Zmiana masy ciała szczurów
Dni	1	cyfra arabska	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	Rozdział 18	Rozdział 19	20	21
Grupa kontrolna
Aver.	0	-0,02	-0,04	-0,04	-0,06	-0,06	-0,07	-0,08	-0,09	-0,1	-0,11	-0,12	-0,12	-0,13	-0,14	-0,15	-0,16	-0,18	-0,19	-0,2	-0,21
Sd	0	0,01	0,01	0,02	0,01	0,02	0,02	0,01	0,01	0,02	0,02	0,01	0,01	0,01	0,02	0,02	0,02	0,02	0,02	0,02	0,03
Grupa eksperymentalna z leczeniem
Aver.	0	-0,02	-0,03	-0,04	-0,05	-0,06	-0,07	-0,08	-0,09	-0,1	-0,1	-0,12	-0,12	-0,14	-0,14	-0,15	-0,16	-0,17	-0,18	-0,19	-0,2
Sd	0	0,02	0,02	0,02	0,02	0,03	0,03	0,02	0,03	0,03	0,03	0,02	0,03	0,03	0,03	0,04	0,03	0,03	0,03	0,02	0,02
Grupa eksperymentalna
Aver.	0	-0,01	-0,03	-0,04	-0,05	-0,05	-0,07	-0,07	-0,08	-0,1	-0,11	-0,12	-0,13	-0,14	-0,15	-0,15	-0,17	-0,18	-0,19	-0,2	-0,21
Sd	0	0,01	0,02	0,02	0,02	0,02	0,02	0,02	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,03	0,02	0,02	0,02

Tabela 1. Zmiany masy ciała (w procentach) podczas zadania nurkowania w poszukiwaniu pożywienia. Nie stwierdzono różnic między 3 grupami eksperymentalnymi pod względem zmian masy ciała w ciągu 21 dni wykonywania zadania. Od 2 do 21 dnia zaobserwowano ogólny efekt między dniami wyrażony jako zmiana masy ciała (p<0,01).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.