Method Article

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

DOI:

10.3791/61767

⸱

September 15th, 2021

 , 
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sukces wszczepienia tkanki wyhodowanej w laboratorium lub urządzenia medycznego u osoby zależy od odpowiedzi immunologicznej gospodarza biorcy. Uznając implant za ciało obce, wroga i rozregulowana odpowiedź immunologiczna może skutkować odrzuceniem implantu, podczas gdy uregulowana odpowiedź i odzyskanie homeostazy może prowadzić do jego akceptacji. Analiza mikrośrodowisk implantów wypreparowanych w warunkach in vivo lub ex vivo może pomóc w zrozumieniu wzorca odpowiedzi immunologicznej, co ostatecznie może pomóc w opracowaniu nowych generacji biomateriałów. Cytometria przepływowa jest dobrze znaną techniką charakteryzowania komórek odpornościowych i ich podzbiorów na podstawie markerów powierzchni komórek. W niniejszym przeglądzie opisano protokół oparty na ręcznym krojeniu w kostkę, trawieniu enzymatycznym i filtracji przez sitko komórkowe w celu wyizolowania jednolitych zawiesin komórkowych z wypreparowanej tkanki implantu. Ponadto wyjaśniono protokół barwienia wielokolorową cytometrią przepływową, wraz z krokami dotyczącymi początkowych ustawień cytometru w celu scharakteryzowania i ilościowego określenia tych izolowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w dziedzinie medycyny doprowadziły do częstego stosowania materiałów implantacyjnych do wspomagania funkcji lub ponownego wzrostu uszkodzonej tkanki1,2. Należą do nich urządzenia takie jak rozruszniki serca, rekonstrukcyjne implanty kosmetyczne i płytki ortopedyczne używane do mocowania złamań kości3,4. Jednak materiały użyte do wykonania tych implantów i miejsca, w których są one wszczepiane, odgrywają ważną rolę w określaniu sukcesu tych implantów5,6,7. Jako ciała obce, implanty te mogą generować odpowiedź immunologiczną gospodarza, która może prowadzić do odrzucenia lub tolerancji8. Czynnik ten skłonił badania nad biomateriałami do wygenerowania materiałów, które mogą przyciągnąć pożądaną odpowiedź immunologiczną po implantacji9,10,11,12.

Odpowiedź immunologiczna jest podstawowym wymogiem w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, gdzie tkanka lub organ jest hodowany wokół szkieletu biomaterialnego (rusztowania) w laboratorium w celu zastąpienia uszkodzonej tkanki lub organu13,14,15,16. W medycynie regeneracyjnej celem jest zastąpienie brakującej lub uszkodzonej tkanki za pomocą komórek, sygnałów i rusztowań, z których każde może być w znacznym stopniu modulowane przez odpowiedzi immunologiczne17. Co więcej, nawet gdy pożądany jest brak odpowiedzi immunologicznej, bardzo rzadko jest to brak aktywności immunologicznej, a nie obecność profilu regulacyjnego, który jest pożądany18. Techniki takie jak cytometria przepływowa mogą odgrywać znaczącą rolę w charakterystyce wzorca odpowiedzi immunologicznej na różne biomateriały używane do powlekania implantów lub do opracowywania rusztowań dla inżynierii tkankowej19.

Te informacje z kolei ostatecznie pomogą w opracowaniu biomateriałów dla implantów, które mogą być dobrze tolerowane przez układ odpornościowy lub w opracowaniu rusztowań, które mogą odegrać konstruktywną rolę w inżynierii tkankowej. Właściwe przygotowanie próbek do analizy za pomocą cytometrii przepływowej jest ważnym krokiem w celu uniknięcia niedokładnych wyników charakterystyki immunologicznej za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją20,21. W związku z tym w niniejszym przeglądzie przedstawiono szczegółową metodologię, która może być wykorzystana do izolacji komórek z tkanki rusztowania, barwienia zawiesiny komórkowej i analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu cytometrii przepływowej.

1) Przygotowanie odczynnika

  1. Przygotować pożywkę do rozcieńczania enzymów i do hodowli tkankowej.
    1. Dodać 5 ml roztworu buforowego kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) do 500 ml pożywki RPMI i dobrze wstrząsnąć. Przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Obliczyć objętość roztworu enzymu.
    UWAGA: Objętość roztworu enzymatycznego to objętość pożywki zawierającej enzymy (kolagenazę i DNazę I), które będą potrzebne do trawienia pokrojonej w kostkę tkanki na płytkach 6-dołkowych; To zależy od liczby próbek.
    1. Użyj poniższego równania, aby obliczyć wymaganą objętość:
      (Liczba próbek do wytrawienia) × 5 ml RPMI bez surowicy z 10 mM buforem HEPES
      UWAGA: Na przykład na 0,1 do 0,3 g wypreparowanej śledziony użyj 5 ml pożywki do przygotowania roztworu enzymu. Protokół trawienia enzymatycznego opisany w tym manuskrypcie dotyczy głównie tkanek miękkich (w zakresie od 0,1 do 1 g) wypreparowanych od myszy, które obejmują mózg, nerki, skórę, wątrobę, płuca, śledzionę, mięśnie, a także kapsułki wokół podskórnych implantów wykonanych z materiałów syntetycznych lub białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Trawienie twardych tkanek chrzęstnych może wymagać różnych warunków i objętości enzymów trawiennych, co można ustalić tylko poprzez optymalizację.
    2. Oblicz ilość kolagenazy i DNazy, której potrzebowałem do roztworu enzymu.
      UWAGA: W tym protokole użyto 0,25 mg/ml kolagenazy i 0,2 mg/ml DNazy I. Stężenia robocze wymagane dla kolagenazy i DNazy mogą się różnić dla różnych typów tkanek19.
  3. Przygotować roztwór barwnika o żywotności w stosunku 1:1000, dodając 1 μl barwnika żywotności (patrz tabela materiałów) do 999 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przemieszać roztwór. Przechowywać roztwór w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  4. Przygotować bufor barwiący, dodając 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 100 ml PBS i mieszać roztwór aż do całkowitego rozpuszczenia BSA. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

2) Ustawianie płytek do trawienia enzymatycznego

  1. Ustaw 6-dołkową płytkę z sitkami komórkowymi 70 μm w każdym dołku. Dodać 3 ml przygotowanej pożywki z kroku 1.1.1 do każdej studzienki i inkubować na lodzie.
  2. Pozostałe podłoża (2 ml/studzienkę) należy przechowywać w inkubatorze lub łaźni wodnej w temperaturze 37 °C w celu zawieszenia obliczonej ilości kolagenazy i DNazy I (etap 1.2.2).

3) Izolacja komórek

  1. Umieść wypreparowane implanty/tkanki na płytkach i pokrój w drobną kostkę za pomocą nożyczek. Alternatywnie można zastosować metodę mechanicznego rozerwania za pomocą dysocjatora tkanek lub ręcznego homogenizatora. Ze względu na dużą liczbę leukocytów należy wyciąć śledzionę, aby wykorzystać ją jako kontrolę barwienia w każdym przebiegu.
    UWAGA: Ponieważ niektóre materiały wywołują wyższy poziom zwłóknienia, protokół ten ma zastosowanie zarówno do materiałów silnie zwłóknieniowych, jak i minimalnie zwłóknieniowych. Jednak każda metoda przetwarzania powinna być oceniana zarówno pod kątem wydajności komórek, jak i żywotności po trawieniu przed barwieniem. Unikaj zanieczyszczenia krwi obwodowej podczas sekcji.
  2. Dodać kolagenazę i DNazę I (objętość obliczoną w kroku 1.2.2) do pozostałej liczby RPMI (2 ml), która została podgrzana do 37 °C. Dodać 2 ml kompletnego roztworu enzymatycznego do każdej studzienki.
  3. Umieścić płytki w inkubowanym wytrząsarce na 45 minut w temperaturze 37 °C i 100 obr./min.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas układania płyt w stosy, ponieważ może to utrudnić prawidłowe przenoszenie ciepła.
  4. W międzyczasie przygotuj końcówkę dozującą zawiesinę, siekając nożyczkami 3-4 mm od końca końcówki o pojemności 1000 μl. Po inkubacji odpipetować zawiesinę w studzienkach w górę iw dół, aby dokładnie ją wymieszać za pomocą posiekanej końcówki. Umieść sitko do komórek na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przepuść strawiony roztwór przez sitko do komórek.
    UWAGA: Sitko do komórek o wielkości 70 μm jest wystarczające do oddzielenia komórek od wszczepionego biomateriału, takiego jak alginian. Jeśli wymagana jest większa czystość, należy zastosować procesy, takie jak separacja w gradieniu gęstości, aby uzyskać wzbogaconą populację leukocytów.
  5. Przepłukać studzienki 1x roztworem PBS i przenieść objętość płukania przez sitko, a następnie dodać popłuczyny sitka 1x roztworem PBS, aż objętość w probówce osiągnie 50 ml.
    UWAGA: 1x PBS musi mieć temperaturę pokojową, aby zapobiec jakiemukolwiek wzrostowi lepkości trawienia i umożliwić granulowanie komórek podczas wirowania.
  6. Odwirować probówkę o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety serologicznej, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić osad w 1000 μL 1x PBS i przenieść zawiesinę do probówki mikrowirówkowej.
  7. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego i umieścić zawiesinę na szkiełkach w komorze zliczającej do liczenia komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub na hemocytometrze w celu zliczenia metodą konwencjonalną pod mikroskopem. Alternatywnie użyj kulek do liczenia komórek cytometrii przepływowej.

4) Barwienie do cytometrii przepływowej

  1. Zobacz Rysunek 2 dla przykładowego układu płytki dla 14-kolorowego eksperymentu z 45 próbkami, kontrolami fluorescencji minus jeden (FMO), kontrolami kompensacyjnymi i kontrolą w pełni wybarwionej próbki śledziony. Po oszacowaniu całkowitej liczby komórek należy obliczyć objętość zawiesiny komórek wymaganą do barwienia 1 ×10 6 komórek dla każdej próbki oraz 0,5 × 106 komórek dla każdej kompensacji i kontroli FMO. Dozować wymaganą objętość zawiesiny komórek do studzienek 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i uzupełnić objętość do 100 μl 1x PBS.
    UWAGA: Na przykład, jeśli 1000 μl zawiesiny komórek uzyskanej w kroku 3.6 zawiera 40 × 106 komórek, to dla 1 × 106 komórek wymagane będzie 1000/40 × 106 = 25 μl zawiesiny komórek.
  2. Odwirować płytkę o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w dołkach na próbki i w studzience kontrolnej kompensacji w celu określenia żywotności ze 100 μl roztworu barwnika żywotności w stosunku 1:1000 (patrz tabela materiałów).
  3. W przypadku komórek w innych studzienkach kompensacyjnych, a także w dołkach FMO i niebarwionych, należy je ponownie zawiesić za pomocą 100 μl 1x PBS.
  4. Inkubować komórki w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  5. W międzyczasie należy przygotować powierzchniowy koktajl przeciwciał do barwienia próbki i kontroli FMO: 50 μl na próbkę lub FMO. Patrz Tabela 1 dla przykładu koktajlu przeciwciał.
  6. Po inkubacji dodać 100 μl 1x PBS do każdego dołka, odwirowywać w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl buforu barwiącego (1x PBS + 1% BSA); odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w dołkach kompensacyjnych, FMO i niebarwionych za pomocą 50 μl 1x PBS. Dodać 50 μl koktajlu przeciwciał do odpowiednich dołków na próbki i dołków FMO. Dodaj odpowiednie przeciwciała do różnych studzienek kompensacyjnych.
  9. Inkubować płytkę przez 45 minut w ciemności w temperaturze 4 °C. Po inkubacji dodać 150 μl buforu barwiącego do każdej studzienki i odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki z 200 μl buforu barwiącego i odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  11. W przypadku analizowania próbek bez utrwalania, należy je ponownie zawiesić w 200 μl buforu barwiącego i przejść do sekcji 6 dotyczącej konfiguracji cytometru i analizy próbki. W przypadku mocowania komórek, po umyciu odessać supernatant i dodać 100 μl utrwalacza, takiego jak 4% paraformaldehydu. W przypadku barwienia w poszukiwaniu markerów wewnątrzkomórkowych należy przejść do sekcji 5 dotyczącej barwienia wewnątrzkomórkowego oraz utrwalić i przepuszczalność komórek (patrz Tabela materiałów). Inkubować komórki przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ponieważ fiksacja może wpływać na intensywność fluorescencji niektórych fluoroforów, oceń każdy panel zarówno z fiksacją, jak i bez.
  12. Po inkubacji dodać 100 μl 1x PBS, a następnie odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, ponownie zawiesić w 1 PBS i odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego i przechowywać w temperaturze 4 °C przed analizą metodą cytometrii przepływowej.

5) Barwienie wewnątrzkomórkowe

  1. Kontynuując od kroku 4.11 dla utrwalenia i przepuszczalności markerów wewnątrzkomórkowych, dodaj 100 μl odpowiedniego buforu. Odwirować komórki w temperaturze 350 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki w 200 μl roztworu środka utrwalającego przepuszczającego; Odwirować komórki w temperaturze 350 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki z wewnątrzkomórkowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w odpowiednim buforze.
    UWAGA: Typy przeciwciał i rozcieńczenia będą zależeć od komórek docelowych. Na przykład jednym z powszechnych markerów wewnątrzkomórkowych jest skrzynka widłowa P3 dla regulatorowych komórek T, która jest często stosowana w rozcieńczeniu 1:100.
  2. Inkubować zawiesinę komórkową w ciemności przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Po inkubacji dodać 150 μl odpowiedniego buforu i odwirować zawiesinę o stężeniu 350 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego, a następnie odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego do analizy metodą cytometrii przepływowej.

6) Cytometr i konfiguracja kompensacji

  1. Bezpośrednio przed uruchomieniem próbek należy przygotować kulki kompensacyjne (patrz Tabela materiałów), jeśli wykorzystuje się kompensację opartą na kulkach, a nie na kompensacji opartej na komórkach.
    1. Oznaczyć oddzielne probówki do mikrowirówek dla każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem i dodać 100 μl 1x PBS, a następnie jedną pełną kroplę koralików kompensacyjnych kontroli negatywnej przeciwko myszom i jedną kroplę kulek kompensacyjnych kontroli dodatniej do każdej probówki. Dodać 1 μl odpowiedniego przeciwciała do każdej oddzielnej probówki. Wirować i inkubować przez 5 minut przed akwizycją.
      UWAGA: Ponieważ niektóre barwniki, takie jak BUV737, nie mogą być związane z kulkami, należy użyć kontroli opartej na komórkach.
  2. Skalibruj cytometr przepływowy przed każdym eksperymentem, uruchamiając konfigurację cytometru z kulkami śledzącymi, i utrzymuj ustawienia cytometru przepływowego dla każdego eksperymentu.
  3. Przed analizą próbki należy wyregulować cytometr przepływowy, uruchamiając niebarwioną próbkę, aby dostosować populację komórek na wykresie rozrzutu bocznego (SSC) w stosunku do rozproszenia do przodu (FSC) tak, aby populacja komórek znajdowała się w środku wykresu i nie znajdowała się poza skalą.
  4. Uruchom na krótko barwioną próbkę, aby dostosować napięcia dla FSC i SSC oraz dla każdego kanału, aby upewnić się, że żadne zdarzenia nie wykraczają poza skalę logarytmiczną każdego kanału. Rejestruj 5 000 zdarzeń dla każdej kontroli kompensacji, a następnie bramkowanie populacji pozytywnych i ujemnych. Oblicz macierz kompensacji, a następnie uruchom próbki, zbierając co najmniej 1 000 zdarzeń dla populacji będących przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: Kompensacja na panelach o większych kolorach powinna być zweryfikowana, ponieważ automatyczna kompensacja może być podatna na nadmierną lub niedostateczną kompensację. Każdy parametr powinien być przedstawiany na wykresie w stosunku do każdego innego parametru, aby monitorować oznaki nadmiernej lub niedostatecznej kompensacji, a każda kontrola jednokolorowa powinna być oceniana. Złożona kompensacja eksperymentów z większymi kolorami powinna być przeprowadzana z pomocą współpracownika lub głównej placówki z dużym doświadczeniem w cytometrii przepływowej. Nowsze typy cytometrów przepływowych, takie jak cytometry spektralne, wykorzystują pełne spektrum fluoroforu w procesie znanym jako unmixing spektralny, który może zapewnić czystsze rozróżnienie nakładania się fluorescencji w porównaniu z samą standardową kompensacją22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces rozwoju paneli cytometrii przepływowej do analizy immunologicznej często opiera się na porównaniu wyników z istniejącymi danymi i literaturą w tej dziedzinie. Wiedza o tym, jak populacje mogą prezentować się w cytometrii przepływowej, ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji danych. Niezależnie od tego, populacje i typy komórek mogą wyglądać różnie w różnych tkankach, więc należy spodziewać się pewnej zmienności. W kontekście dobrze zdefiniowanych tkanek kontrolnych, tak...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym przeglądzie opisano szczegółową metodologię izolowania komórek z implantów biomateriałowych w celu uzyskania jednolitej zawiesiny komórek. Ponadto udostępniono szczegółowy protokół barwienia zawiesiny komórek do wielokolorowej cytometrii przepływowej, wraz z krokami konfiguracji cytometru przepływowego w celu uzyskania optymalnych wyników. Metody izolacji komórek mogą obejmować wiele etapów, często wykorzystujących ręczne rozwarstwienie tkanek, a następnie trawienie enzymatyczne za pomocą enzymów proteolityc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program NIH, w tym National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Zastrzeżenie: NIH, jego urzędnicy i pracownicy nie polecają ani nie popierają żadnej firmy, produktu ani usługi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki stożkowe 50 mlFisher Scientific14-432-22
Płytka 6-dołkowaFisher Scientific07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer PlusBD Biosciences566385
Tylko do utrwalania komórek
Albumina surowicy bydlęcejMillipore SigmaA7906Do przygotowania FACS Bufor do barwienia
CD11b AF700Biolegend101222Klon: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5117325 BiolegendKlon: N418
CD197 PE/Dazzle594Biolegend120121Klon: 4B12
CD200R3 142207 APCBiolegendKlon: Ba13
CD206 PEBiolegend141705Klon: C068C2
CD45 BUV737BD Biosciences612778Klon: 104/A20
CD86 BUV395BD Biosciences564199Klon: GL1
CD8a BV421Biolegend100737Klon: 53-6.7
Comp Bead anty-myszBD Biosciences552843Do kontroli kompensacji
DNaza IMillipore Sigma11284932001Deoksyrybonukleaza trzustkowa bydła I (DNaza I)
F4/80 PE/Cy7Biolegend123113Klon: BM8
Fc BlockBiolegend101301Klon: 93
Zestaw roztworów do utrwalania/przepuszczalnościBD Biosciences554714Do utrwalania i przepuszczalności komórek.
Bufor HEPESThermo Fisher15630080Bufor uzupełniający pożywkę komórkową
LiberaseMillipore Sigma5401127001Mieszanka oczyszczonej kolagenazy I i kolagenazy
II LIVE/DEAD Zestaw do naprawy niebieskich martwych komórekThermo FisherL23105Barwnik żywotności
Ly6c AF488Biolegend128015Klon: HK1.4
Ly6g BV510Biolegend127633Klon: 1A8
MHCII BV786BD Biosciences742894Klon: M5/114.15.2
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaThermo FisherD8537
RPMIThermo Fisher11875176Pożywka do hodowli komórkowych
Siglec F BV605BD Biosciences740388Klon: E50-2440
96-dołkowa płytkaz dnem V
BD Cytofix BD Biosciences 554655

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
  2. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
  3. Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
  4. Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
  5. Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
  6. Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
  7. Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040(2016).
  8. Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).
  9. Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
  10. Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
  11. Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
  12. Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
  13. Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
  14. Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861(2019).
  15. Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
  16. Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
  17. Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
  18. Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. Engineering antigen-specific immunological tolerance. Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).
  19. Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  21. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
  22. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
  23. Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
  24. Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
  25. Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933(2015).
  26. Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
  27. Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryImmune Function AnalysisImplant Tissue DissectionCell Isolation ProtocolEnzymatic DigestionMulticolor StainingCell Surface MarkersImmune Cell CharacterizationBiomaterial Immune ResponseSpectral Unmixing

Related Articles