Method Article

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

DOI:

10.3791/61767

⸱

September 15th, 2021

 , 
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sukces wszczepienia tkanki wyhodowanej w laboratorium lub urządzenia medycznego u osoby zależy od odpowiedzi immunologicznej gospodarza biorcy. Uznając implant za ciało obce, wroga i rozregulowana odpowiedź immunologiczna może skutkować odrzuceniem implantu, podczas gdy uregulowana odpowiedź i odzyskanie homeostazy może prowadzić do jego akceptacji. Analiza mikrośrodowisk implantów wypreparowanych w warunkach in vivo lub ex vivo może pomóc w zrozumieniu wzorca odpowiedzi immunologicznej, co ostatecznie może pomóc w opracowaniu nowych generacji biomateriałów. Cytometria przepływowa jest dobrze znaną techniką charakteryzowania komórek odpornościowych i ich podzbiorów na podstawie markerów powierzchni komórek. W niniejszym przeglądzie opisano protokół oparty na ręcznym krojeniu w kostkę, trawieniu enzymatycznym i filtracji przez sitko komórkowe w celu wyizolowania jednolitych zawiesin komórkowych z wypreparowanej tkanki implantu. Ponadto wyjaśniono protokół barwienia wielokolorową cytometrią przepływową, wraz z krokami dotyczącymi początkowych ustawień cytometru w celu scharakteryzowania i ilościowego określenia tych izolowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w dziedzinie medycyny doprowadziły do częstego stosowania materiałów implantacyjnych do wspomagania funkcji lub ponownego wzrostu uszkodzonej tkanki1,2. Należą do nich urządzenia takie jak rozruszniki serca, rekonstrukcyjne implanty kosmetyczne i płytki ortopedyczne używane do mocowania złamań kości3,4. Jednak materiały użyte do wykonania tych implantów i miejsca, w których są one wszczepiane, odgrywają ważną rolę w określaniu sukcesu tych implantów5,6,7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu cytometrii przepływowej.

1) Przygotowanie odczynnika

  1. Przygotować pożywkę do rozcieńczania enzymów i do hodowli tkankowej.
    1. Dodać 5 ml roztworu buforowego kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) do 500 ml pożywki RPMI i dobrze wstrząsnąć. Przechowywać pożywkę w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Obliczyć objętość roztworu enzymu.
    UWAGA: Objętość roztworu enzymatycznego to objętość pożywki zawierającej enzymy (kolagenazę i DNazę I), które będą potrzebne do trawienia pokrojonej w ko....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces rozwoju paneli cytometrii przepływowej do analizy immunologicznej często opiera się na porównaniu wyników z istniejącymi danymi i literaturą w tej dziedzinie. Wiedza o tym, jak populacje mogą prezentować się w cytometrii przepływowej, ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji danych. Niezależnie od tego, populacje i typy komórek mogą wyglądać różnie w różnych tkankach, więc należy spodziewać się pewnej zmienności. W kontekście dobrze zdefiniowanych tkanek kontrolnych, tak.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym przeglądzie opisano szczegółową metodologię izolowania komórek z implantów biomateriałowych w celu uzyskania jednolitej zawiesiny komórek. Ponadto udostępniono szczegółowy protokół barwienia zawiesiny komórek do wielokolorowej cytometrii przepływowej, wraz z krokami konfiguracji cytometru przepływowego w celu uzyskania optymalnych wyników. Metody izolacji komórek mogą obejmować wiele etapów, często wykorzystujących ręczne rozwarstwienie tkanek, a następnie trawienie enzymatyczne za pomocą enzymów proteolityc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program NIH, w tym National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Zastrzeżenie: NIH, jego urzędnicy i pracownicy nie polecają ani nie popierają żadnej firmy, produktu ani usługi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki stożkowe 50 mlFisher Scientific14-432-22
Płytka 6-dołkowaFisher Scientific07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer PlusBD Biosciences566385
Tylko do utrwalania komórek
Albumina surowicy bydlęcejMillipore SigmaA7906Do przygotowania FACS Bufor do barwienia
CD11b AF700Biolegend101222Klon: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5117325 BiolegendKlon: N418
CD197 PE/Dazzle594Biolegend120121Klon: 4B12
CD200R3 142207 APCBiolegendKlon: Ba13
CD206 PEBiolegend141705Klon: C068C2
CD45 BUV737BD Biosciences612778Klon: 104/A20
CD86 BUV395BD Biosciences564199Klon: GL1
CD8a BV421Biolegend100737Klon: 53-6.7
Comp Bead anty-myszBD Biosciences552843Do kontroli kompensacji
DNaza IMillipore Sigma11284932001Deoksyrybonukleaza trzustkowa bydła I (DNaza I)
F4/80 PE/Cy7Biolegend123113Klon: BM8
Fc BlockBiolegend101301Klon: 93
Zestaw roztworów do utrwalania/przepuszczalnościBD Biosciences554714Do utrwalania i przepuszczalności komórek.
Bufor HEPESThermo Fisher15630080Bufor uzupełniający pożywkę komórkową
LiberaseMillipore Sigma5401127001Mieszanka oczyszczonej kolagenazy I i kolagenazy
II LIVE/DEAD Zestaw do naprawy niebieskich martwych komórekThermo FisherL23105Barwnik żywotności
Ly6c AF488Biolegend128015Klon: HK1.4
Ly6g BV510Biolegend127633Klon: 1A8
MHCII BV786BD Biosciences742894Klon: M5/114.15.2
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaThermo FisherD8537
RPMIThermo Fisher11875176Pożywka do hodowli komórkowych
Siglec F BV605BD Biosciences740388Klon: E50-2440
96-dołkowa płytkaz dnem V
BD Cytofix BD Biosciences 554655

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
  2. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryImmune Function AnalysisImplant Tissue DissectionCell Isolation ProtocolEnzymatic DigestionMulticolor StainingCell Surface MarkersImmune Cell CharacterizationBiomaterial Immune ResponseSpectral Unmixing

Related Articles