Różne modele zwierzęce wrodzonej przepukliny przeponowej i niedrożności tchawicy płodu prezentują zalety i wady dotyczące kwestii etycznych, kosztów, trudności chirurgicznych, rozmiaru, wskaźników przeżycia i dostępności narzędzi genetycznych. Model ten zapewnia nowe narzędzie do badania wpływu zarówno niedrożności tchawicy, jak i zwiększonego ciśnienia świetlnego na rozwój płuc.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przezmaciczny model niedrożności tchawicy płodu u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niedrożność tchawicy płodu (TO), uznana metoda leczenia, wspomaga wzrost płuc płodu i przeżycie w ciężkiej wrodzonej przepuklinie przeponowej (CDH). Po TO zatrzymanie wydzielanego płynu nabłonkowego zwiększa ciśnienie świetlne i indukuje wzrost płuc. Zdefiniowano różne modele zwierzęce, aby zrozumieć patofizjologię CDH i TO. Wszystkie mają swoje zalety i wady, takie jak trudność techniki, wielkość zwierzęcia, koszt, wysoka śmiertelność i dostępność narzędzi genetycznych. W tym artykule opisano nowy przezmaciczny model TO mysiego płodu. Ciężarne myszy znieczulono, a macica została odsłonięta za pomocą laparotomii w linii środkowej. Tchawicę wybranych płodów podwiązano pojedynczym szwem przezmacicznym umieszczonym za tchawicą, jedną tętnicą szyjną i jedną żyłą szyjną. Zapora została zamknięta i pozwolono jej się zregenerować. Płody pobrano tuż przed porodem. Stosunek płuc do masy ciała u płodów TO był wyższy niż u płodów kontrolnych. Model ten zapewnia naukowcom nowe narzędzie do badania wpływu zarówno OT, jak i zwiększonego ciśnienia świetlnego na rozwój płuc.
Wprowadzenie
Wrodzona przepuklina przeponowa (CDH) występuje w 1:2500 ciążach i skutkuje hipoplazją płuc oraz nadciśnieniem płucnym u noworodków1,2,3,4,5,6. Niedrożność tchawicy płodu (TO) jest uznaną terapią prenatalną u pacjentek z ciężkim CDH, obejmującą fetoskopię w 26-30tygodniu ciąży, w której balon umieszcza się tuż nad cariną, a następnie usuwa w 32.tygodniu ciąży. Ten tymczasowy TO indukuje wzrost płuc płodu i poprawia przeżywalność. Zespół wrodzonej niedrożności dróg oddechowych jest śmiertelnym stanem związanym z przerostem płuc, który zainspirował chirurgów do wykonania sztucznej okluzji tchawicy w celu ułatwienia zatrzymywania wydzielanego płynu nabłonkowego. Ta okluzja zwiększyła ciśnienie świetlne i indukowała wzrost płuc7. Jednak okluzja powinna zostać odwrócona, aby umożliwić dojrzewanie komórek nabłonka.
Różne modele zwierzęce CDH i TO - owiec, królika, szczura i myszy - zostały opracowane w celu zrozumienia patofizjologii CDH i TO. Wszystkie mają swoje zalety i wady, takie jak trudność techniki, wielkość zwierzęcia, koszt, wysoka śmiertelność i dostępność narzędzi genetycznych. Chociaż technika chirurgiczna zastosowana w modelu owczym jest bardzo podobna do tej stosowanej u ludzi i można ją odwrócić, głównymi wadami tego modelu są koszt zwierzęcia, długi okres ciąży i ograniczona liczba możliwych operacji. Model królika ma krótszy okres ciąży i jest tańszy niż model owiec. Jednak model królika jest nieodwracalny8,9. Model mysi charakteryzuje się najniższymi kosztami, największą liczbą płodów w jednej ciąży, najlepiej scharakteryzowanym genomem i szeroko dostępnymi narzędziami do analiz komórkowych i molekularnych. Jednak kluczową wadą jest brak odwracalności OT, co uniemożliwia pełne zrozumienie wpływu OT. W niniejszym artykule przedstawiono metodę, która łączy w sobie wszystkie zalety wcześniej wymienionych modeli i tworzy łatwy, potencjalnie odwracalny i minimalnie inwazyjny model TO gryzonia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (NIH Publications No. 80023, wersja z 1978 r.). Procedura została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Fundacji Badawczej Cincinnati Children's zgodnie z protokołem IACUC nr 2016-0068.
1. Przygotowanie
- Aby skrzyżować myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego (WT) w tym samym wieku, umieść je w jednej klatce o godzinie 18:00 i rozdziel następnego dnia o godzinie 9:00.
- Aby wyznaczyć 0. dzień embrionalny (E0), sprawdź obecność czopa pochwowego, który posiada jednorodną strefę zewnętrzną przylegającą do ściany pochwy oraz wewnętrzną strefę włóknistą zawierającą plemniki tworzące splątane masy zmieszane z włóknami materiału czopa.
- Zapisz masę myszy w momencie kryzowania.
- Ponownie zważ myszy w dniu E10, aby potwierdzić trwanie ciąży.
- Przeprowadź zabieg chirurgiczny w dniu E16,5 (wczesny etap kanalikowy).
- Zesterylizuj narzędzia, które będą wykorzystywane podczas operacji: nożyczki, uchwyt igłowy, pęsety, zaciski oraz skalpele i uchwyty do skalpeli.
- Podgrzej platformę operacyjną do 24 °C i przed zabiegiem przygotuj ciepłą sól fizjologiczną (24 °C).
- Przygotuj ciepłe środowisko do rekonwalescencji i pozostaw w klatce mokrą karmę, aby umożliwić szybkie karmienie.
- Pozostań przy operowanych zwierzętach do czasu, aż będą w stanie samodzielnie się karmić.
- Po zabiegu utrzymuj operowane myszy pojedynczo w oddzielnych klatkach.
2. Znieczulenie
- Podaj podskórnie 0,1 mg/kg buprenorfiny ciężarnym samicom 1 h przed zabiegiem.
- Zastosuj izofluran drogą wziewną w dawce 5 mL/h do indukcji oraz 2 mL/h w sposób ciągły podczas zabiegu w celu utrzymania znieczulenia.
- Monitoruj ruchy podbródków ciężarnych myszy.
3. Laparotomia
- Oczyścić powierzchnię brzucha alkoholem i povidone-jodyną. Przez cały czas trwania operacji należy zachować warunki sterylne.
- Wykonać cięcie pionowe w celu przeprowadzenia laparotomii u ciężarnych matek. Wszystkie warstwy należy przeciąć oddzielnie.
- Zidentyfikować rogi macicy po każdej stronie.
- Wyznaczyć płody zakwalifikowane do zabiegu.
UWAGA: Nie operować płodów znajdujących się najbliżej pochwy. - Operować dwa płody w każdym rogu macicy, jeśli po każdej stronie znajduje się parzysta liczba płodów (najczęściej 4), oraz jeden płód w każdym rogu macicy, jeśli w macicy znajduje się nieparzysta liczba płodów (najczęściej 3).
4. Zator tchawkowy
- Do wizualizacji należy użyć okularów powiększających 2,5x.
- Ustawić róg macicy w pozycji poprzecznej.
- Chwyć szczenięta dwoma palcami, ułożone grzbietem do góry, orientując się po ich oczach i ogonach, aby odpowiednio ustawić płód.
- Delikatnie uciśnij głowę szczeniaka, aby umożliwić jej wyprostowanie, a tym samym zapewnić widoczność szyi.
- Użyj szwy polipropylenowej 6.0 z igłą atraumatyczną, aby wykonać TO (Rycina 1). Utrzymać łożysko z boku, z dala od punktów wprowadzenia i wyjęcia igły.
- Wprowadź igłę poprzecznie przez ścianę macicy, z dala od łożyska, na wysokości 1/3rd przednia część szyi.
- Ostrożnie przesuń igłę do linii środkowej szyi i skieruj ją w stronę przedniej części, następnie wyprowadź ją z szyi pomiędzy tchawicą a przeciwległą pochewką szyjną i macicą.
- Zwiąż szew, dbając o zachowanie integralności błon oraz ściany macicy, i chroń pępowinę podczas wiązania węzła.
Rysunek 1: Zamknięcie tchawicy. (A) Szew transmaciczny przechodzący przez szyję. (B) Schematyczne przedstawienie struktur po przejściu szwu i przed zawiązaniem węzła. Skróty: C = tętnica szyjna; J = żyła szyjna; T = tchawica; E = przełyk; V = kręg. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
5. Zamknięcie ściany brzucha
- Umieścić róg macicy z powrotem w jamie brzusznej.
- Przed zamknięciem rany wstrzyknąć do jamy otrzewnowej 2 mL ciepłego, sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
- Zastosować szew ciągły nicią z poliglaktyny 5/0 w celu zamknięcia ściany brzusznej, a skórę zamknąć szwem przerywanym z jedwabiu.
- W celu przeciwbólowczym podać 0,1 mg/kg buprenorfiny drogą otrzewnową, a następnie pozostawić matkę do wybudzenia w ciepłym inkubatorze.
6. Zbiór
- Zpodaj znieczulenie ciężarnej samicy i pobierz wszystkie płody w dniu E18.5 poprzez cięcie cesarskie.
- Sprawdź żywotność płodów, obserwując ich ruchy.
- Zastosuj co najmniej dwie różne techniki eutanazji: insuflację dwutlenkiem węgla oraz zwichnięcie stawów szyjnych.
- Usuń zwłoki zgodnie z regulaminem laboratorium weterynaryjnego.
- Zważ wszystkie płody.
- Wykonaj pionowe nacięcie na klatce piersiowej w celu przeprowadzenia torakotomii i usunięcia płuc.
- Wypreparuj płuca embrionów i zważ je, aby obliczyć całkowity stosunek masy płuc do masy ciała (LBWR = (masa lewego płuca + masa prawego płuca)/masa ciała x100).
7. Histologia
- Przymroź tkanki w ciekłym azocie, medium OCT (optimal cutting temperature compound) oraz w suchym lodzie.
- Przygotuj skrawki próbek o grubości 10 µm przy użyciu kriostatu i osadź je na szkiełkach pokrytych poli-lizyną.
- Wysusz szkiełka w temperaturze 60 °C przez noc, a następnie zabarw je hematoksyliną i eozyną przed ich zamocowaniem w celu akwizycji obrazów przy powiększeniu 10-20x przy użyciu mikroskopu szerokopolowego.
8. Obróbka tkanek do analiz białek i DNA
- Wypreparowane płuca płodowe zamrozić gwałtownie i zhomogenizować w 300 µL buforu do testu radioimmunoprecypitacji. Wirować przy 4 °C przez 5 min przy 18,000 × g.
- Wyekstrahować i oznaczyć ilość białka, DNA oraz RNA10,12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W badaniu przeanalizowano 37 płodów: 20 (54,1%) w grupie TO oraz 17 (45,9%) w grupie kontrolnej. W związku z tym, że u 4 płodów z grupy TO nie udało się zamknąć tchawicy, zostały one wykluczone z badania. Nie stwierdzono istotnej różnicy w śmiertelności w obu grupach: 4 płody (25%) w grupie TO i 2 płody (12%) w grupie kontrolnej (p=0,334, iloraz szans (OR) 2,5, 95% przedział ufności (CI) 0,39-16,05). Średnia masa ciała, masa płuc oraz stosunek masy płuc do masy ciała (LBWR) były wyższe w ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda ta opisuje zabieg chirurgiczny niedrożności tchawicy płodu u myszy i jego wpływ na rozwój płuc. W protokole jest kilka krytycznych kroków, które należy dokładnie wykonać, aby zakończyć się sukcesem. Ciepło platformy, na której odbywa się operacja oraz sól fizjologiczna wprowadzana do jamy otrzewnej ma kluczowe znaczenie dla przebiegu ciąży. Ponadto należy lekko docisnąć głowę szczeniąt, aby zapewnić odsłonięcie szyi.
Szew polipropylenowy 6.0 jest jedynym szwem, który można zastosować do...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie nie otrzymało żadnego konkretnego grantu od agencji finansujących w sektorze publicznym, komercyjnym lub non-profit. Wszyscy autorzy wnieśli znaczący wkład w koncepcję i projekt badania, pozyskiwanie, analizę i interpretację danych, przygotowanie artykułu i jego korektę pod kątem ważnych treści intelektualnych oraz ostateczne zatwierdzenie wersji, która ma zostać złożona. Autorzy dziękują Canowi Sabuncuoğlu za jego życzliwy wysiłek włożony w stworzenie dzieła sztuki techniki chirurgicznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Do znieczulenia regionalnego |
| Izofluran | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | Do znieczulenia ogólnego |
| Okulary powiększające | USA Medyczno-chirurgiczna | SLR-250LBLK | Co najmniej 2.5x |
| mikroskop Nikon 90i | Nikon | 3417 | Zmotoryzowany zestaw fluorescencyjnych |
| tkanek nukleospinowych | Macherey-Nagel, Dü ren, Niemcy | 740952.5 | Zestaw |
| do oznaczania białek Pierce BCA do izolacji | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Kwantyfikacja białek |
| Szew poliglaktynowy | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cięcie |
| Szkiełka polilizynowe | Firma VWR | 48382-117 | Szkiełka adhezyjne mikroskopowe |
| Szew polipropylenowy | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Bufor Taperpoint |
| RIPA | Sigma-Aldrich, Missouri, Stany Zjednoczone | R0278-50ml | Izolacja białka |
| Jedwabny szew | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cięcie |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | izolacja RNA |
Bibliografia
- Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452(2019).
- Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
- Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
- Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
- Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
- Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
- Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
- Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
- Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
- Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
