Artykuł metodologiczny

Usuwanie i zastępowanie endogennych ligandów z białek i alergenów związanych z lipidami

DOI:

10.3791/61780

⸱

24 lutego 2021

 ,  , 
1Nuclear Magnetic Resonance Group, National Institute of Environmental Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje usuwanie endogennych lipidów z alergenów i zastępowanie ich określonymi przez użytkownika ligandami poprzez HPLC z odwróconą fazą w połączeniu z wyżarzaniem termicznym. Rozdział 31P-NMR i dichroizm kołowy pozwalają na szybkie potwierdzenie usunięcia/obciążenia liganda i odzyskanie natywnej struktury alergenu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele głównych alergenów wiąże się z hydrofobowymi cząsteczkami podobnymi do lipidów, w tym Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 i Fel d 1. Ligandy te są silnie zatrzymywane i mogą wpływać na proces uczulenia poprzez bezpośrednią stymulację układu odpornościowego lub zmianę właściwości biofizycznych białka alergizującego. W celu kontrolowania tych zmiennych wymagane są techniki usuwania endogennie związanych ligandów i, jeśli to konieczne, zastępowania lipidami o znanym składzie. Alergen karalucha Bla g 1 otacza dużą hydrofobową jamę, która po oczyszczeniu przy użyciu tradycyjnych technik wiąże niejednorodną mieszaninę endogennych lipidów. W tym miejscu opisujemy metodę, za pomocą której te lipidy są usuwane za pomocą HPLC z odwróconą fazą, a następnie wyżarzania termicznego w celu uzyskania Bla g 1 w postaci Apo lub ponownie załadowanej zdefiniowaną przez użytkownika mieszaniną kwasów tłuszczowych lub fosfolipidów. Sprzężenie tego protokołu z testami biochemicznymi ujawnia, że ładunki kwasów tłuszczowych znacząco zmieniają termostabilność i odporność proteolityczną Bla g 1, co ma dalsze implikacje dla szybkości wytwarzania epitopów komórek T i alergenności. Wyniki te podkreślają znaczenie protokołów usuwania/przeładowywania lipidów, takich jak ten opisany w niniejszym dokumencie, podczas badania alergenów pochodzących zarówno ze źródeł rekombinowanych, jak i naturalnych. Protokół można uogólnić na inne rodziny alergenów, w tym lipokaliny (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) i Uteroglobinę (Fel d 1), zapewniając cenne narzędzie do badania roli lipidów w odpowiedzi alergicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie bazy danych alergenów ujawnia, że alergeny występują tylko w 2% wszystkich znanych rodzin białek, co sugeruje, że wspólne właściwości funkcjonalne i biofizyczne przyczyniają się do alergenności1. Spośród tych właściwości, zdolność do wiązania ładunków lipidowych wydaje się być silnie nadreprezentowana wśród alergenów, co sugeruje, że ładunki te mogą wpływać na proces uczulania1. Rzeczywiście, wykazano, że alergen orzechów brazylijskich Ber e 1 wymaga jednoczesnego podawania z jego endogennym lipidem, aby w pełni wykorzystać swój potencjał uczulający2. Lipidy te mogą potencjalnie bezpośrednio stymulować układ odpornościowy, co ilustrują alergeny roztoczy Der p 2 i Der p 7, z których oba mają silną homologię strukturalną z białkami wiążącymi LPS3,4,5. Na podstawie tej obserwacji zaproponowano, że Derp 2 i Der p 7 mogą wiązać lipidy bakteryjne i bezpośrednio stymulować układ odpornościowy gospodarza poprzez sygnalizację za pośrednictwem TLR4, ułatwiając proces uczulania5,6. Możliwe jest również, że endogennie związane lipidy mogą zmieniać właściwości biofizyczne samych białek alergizujących. Na przykład zdolność Sin a 2 (musztarda) i Ara h 1 (orzeszki ziemne) do interakcji z pęcherzykami fosfolipidowymi znacznie zwiększyła ich odporność na degradację żołądkową i endosomalną7, podczas gdy wiązanie ligandu z głównym alergenem pyłku brzozy Bet v 1 zmieniło zarówno szybkość przetwarzania endosomalnego, jak i różnorodność powstałych peptydów8. Jest to szczególnie istotne dla alergenności, biorąc pod uwagę korelację, którą zaobserwowano między stabilnością, wytwarzaniem epitopów limfocytów T i alergennością białek takich jak Bet v 1 i Bla g 1; To ostatnie będzie przedmiotem tej pracy9,10.

Bla g 1 reprezentuje prototypowego członka rodziny białek głównych alergenów (MA) owadów i posiada unikalną strukturę złożoną z 12 amfipatycznych helis alfa, które otaczają nienormalnie dużą hydrofobową jamę9,11. Dostępna struktura krystaliczna promieniowania rentgenowskiego Bla g 1 wykazuje gęstość elektronów w tej jamie zgodną ze związanymi ligandami fosfolipidowymi lub kwasami tłuszczowymi; przypuszczenie potwierdzone przez 31P-NMR i spektrometrię mas. Ładunki te miały niejednorodny charakter, a ich skład był silnie zależny od źródła alergenu, przy czym różne profile lipidowe obserwowano dla rekombinowanego Bla g 1 ulegającego ekspresji w E. coli i P. pastoris. Co ciekawe, Bla g 1 oczyszczony ze swojego naturalnego źródła alergenów (frass karalucha) zawierał głównie kwasy tłuszczowe w miejscu wiązania, a mieszanina palmitynianu, oleinianu i stearynianu została zidentyfikowana jako "naturalne" ligandy9,11. Zdolność Bla g 1 do zatrzymywania lipidów i kwasów tłuszczowych po wielu etapach oczyszczania utrudnia badania białka w izolacji. Z drugiej strony, zasugerowano, że naturalne ligandy palmitynianowe, stearynianu i oleinianu Bla g 1 (odtąd określane jako nMix) odgrywają kluczową rolę zarówno w jego alergenności, jak i natywnej funkcji biologicznej9. Ligandy te nie są jednak obecne w Bla g 1 uzyskanym ze źródeł rekombinowanych, co utrudnia ocenę tej hipotezy. Podobne problemy zaobserwowano w przypadku innych alergenów wiążących lipidy, takich jak Bet v 112,13. Aby ułatwić systematyczne badanie interakcji lipid-alergen, opracowaliśmy protokół, dzięki któremu alergeny mogą być ilościowo pozbawione ich endogennie związanych lipidów i odtworzone w postaci Apo lub naładowane określonymi ligandami.

Alergeny są najczęściej oczyszczane ze swoich naturalnych lub rekombinowanych źródeł za pomocą chromatografii powinowactwa i/lub chromatografii wykluczania wielkości. Tutaj wprowadzamy dodatkowy etap oczyszczania w postaci wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) wykorzystującej kolumnę C18 z odwróconą fazą, z której alergen jest eluowany do rozpuszczalnika organicznego, podobnie jak protokoły opracowane dla białek wiążących kwasy tłuszczowe14. Otrzymane białko jest następnie poddawane etapowi wyżarzania termicznego pod nieobecność lub w obecności kwasów tłuszczowych i/lub fosfolipidów. Oprócz odzyskiwania natywnego Bla g 1 krotnie, podwyższone temperatury zwiększają rozpuszczalność i dostępność ładunków lipidowych, dając Bla g 1 w formie Apo lub równomiernie naładowaną pożądanym hydrofobowym ligandem. Rozdział 31Oczyszczone w ten sposób widma P-NMR Bla g 1 potwierdziły całkowite usunięcie endogennie związanych ligandów i równomierne zastąpienie ich pożądanymi związkami, natomiast dichroizm kołowy potwierdził pomyślne odzyskanie fałdy Bla g 1. Użyteczność tej metody została podkreślona w niedawnej pracy, w której stwierdzono, że wiązanie ładunku zwiększa termostabilność Bla g 1 i odporność proteolityczną, zmieniając kinetykę generowania epitopów komórek T, co może mieć wpływ na uczulenie i alergenność9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonowanie Bla g 1

  1. Otrzymaj gen dla alergenu karalucha Bla g 1.0101 (reszty 34-216), reprezentujący pojedyncze powtórzenie domeny MA. Dla uproszczenia, Bla g 1 będzie używane w całej pracy do reprezentowania tego pojedynczego powtórzenia, a nie całego transkrypcji Bla g 1.0101.
  2. Subklonuj gen Bla g 1 do pożądanego wektora. W tym badaniu gen zawierający N-końcowy znacznik S-transferazy glutationowej (GST) sprzężony z miejscem cięcia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) został wstawiony do wektora pGEX w celu ekspresji, jak opisano wcześniej11.
  3. Przekształć wektor Bla g 1 pGEX w komórki BL21 DE3 E. coli.
    1. Przygotuj zapas 10 ng/μl żądanego wektora.
    2. Połącz 1 μl 10 ng/μl DNA z 50 μl komórek BL21 DE3 zgodnie z zaleceniami producenta.
    3. Inkubować mieszaninę BL21 DE3-DNA przez 30 minut na lodzie. Przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 1 minutę, a następnie natychmiast przenieść z powrotem na lód na dodatkowy 1 minutę inkubacji.
    4. Dodać 200 μl pożywki LB do komórek i inkubować przez dodatkowy 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    5. Ułożyć przekształcone komórki na płytkach LB-Agar zawierających 100 mg/l ampicyliny i hodować w temperaturze 37 °C przez noc.

2. Początkowe wyrażenie i oczyszczenie

  1. Zaszczepić 1 l pożywki LB zawierającej 100 mg/l ampicyliny pojedynczą kolonią komórek BL21 DE3 przekształconych za pomocą wektora Bla g 1, jak opisano w ppkt 1.3. Rośnie w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Następnego dnia zebrać komórki (OD600 ~ 1,5) przez wirowanie przy 6,000 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić w 2 L pożywki 2x YT zawierającej 100 mg/L ampicyliny. Pozostawić komórki do wzrostu przez dodatkowy 1 godzinę w temperaturze 37 °C do OD600 > 0,6.
  3. Indukuj ekspresję białka poprzez dodanie 0,5 mM IPTG. Przenieść komórki do temperatury 18 °C i inkubować przez noc.
  4. Następnego dnia pobrać komórki zgodnie z opisem w ppkt 2.2. Otrzymany osad komórkowy można zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Zawiesić osad otrzymany z 1 l kultury w 50 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl) zawierającego 1 tabletkę inhibitora proteazy (lub równoważną) i 1 μl nukleazy benzonazy.
  6. Lizuj ogniwa za pomocą sonografa sonicznego z sondą (500 W, 20 kHz) ustawionego na 30–50% mocy przez 4 minuty z 50% cyklem pracy. Utrzymuj lizat w łaźni lodowej podczas sonikacji
  7. Odwirować lizat przy 45 000 x g przez 20 minut. Wyrzucić nierozpuszczalną frakcję (osad).
    1. Usuń 28 μl rozpuszczalnego białka. Połącz z 7 μL 5-krotnego bufora SDS-PAGE i przechowuj do analizy SDS-PAGE. Powtórz ten krok dla frakcji przepływowych, płuczących i elucyjnych kolumny GST przed i po inkubacji z TEV.
  8. Umieścić rozpuszczalne białka (supernatant) w kolumnie z żywicą glutationową (~10 ml całkowitej objętości złoża) w równowadze PBS pH 7,4.
  9. Wypłukać wszelkie niezwiązane białka za pomocą 50 ml PBS.
  10. Elute GST-Bla g 1 przy użyciu 50 ml PBS zawierającego 10 mM zredukowanego glutationu.
  11. Inkubować eluowane białko z proteazą TEV o stężeniu 0,2 kU przez noc w temperaturze 4 °C lub pokojowej przez 6 godzin w celu usunięcia znacznika GST.

3. Endogenne usuwanie lipidów za pomocą HPLC z odwróconą fazą

  1. Zebrać rozszczepiony Bla g 1 i zagęścić go do ~2 ml za pomocą odśrodkowego zespołu filtrującego z odciętą masą cząsteczkową <10 kDa.
    1. Dodać próbkę o objętości <12 ml do górnej części koncentratora i wirować z prędkością 5 000 x g przez 10–15 minut w wirniku obrotowym.
      UWAGA: Objętość próbki i prędkość wirowania będą się różnić w zależności od konkretnego filtra i typu zastosowanego wirnika. Przed użyciem zapoznaj się z dokumentacją producenta.
  2. Załadować koncentrat do systemu HPLC o wymiarach 250 x 10 mm wyposażonego w kolumnę chromatografii odwróconych faz C18 zrównoważoną 97% buforem A (woda, 0,1% kwas trifluorooctowy) i 3% buforem B (acetonitryl, 0,1% kwas trifluorooctowy).
    UWAGA: Można stosować mniejsze kolumny, ale może być konieczne ładowanie i elucja białka przy użyciu wielu cykli, aby dostosować się do zmniejszonej zdolności wiązania. Przy wyborze kolumny należy upewnić się, że kulki żywicy mają wielkość cząstek < 5 μm i wielkość porów >200 A, aby umożliwić skuteczne oddzielenie cząsteczek wielkości białka
    UWAGA: Kwas trifluorooctowy jest silnie i powinien być dozowany w wyciągu przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (tj. rękawic nitrylowych, fartucha laboratoryjnego i okularów). Acetonitryl jest zarówno umiarkowanie toksyczny, lotny, jak i wysoce łatwopalny, powinien być używany i dozowany w okapie przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (tj. rękawic nitrylowych, fartucha laboratoryjnego i okularów).
  3. Elute Bla g 1 przy użyciu protokołu przedstawionego w tabeli 1 przy natężeniu przepływu 1,5–4,0 ml/min. Monitorować proces elucji za pomocą absorbancji fluorescencji przy 280 nm.
    1. Zbierz i zbierz Bla g 1 frakcje. Bla g 1 zwykle wymywa się w >74% buforze B, czyli ~34–40 min.
      UWAGA: Czas elucji będzie się nieznacznie różnił w zależności od natężenia przepływu lub wielkości kolumny. Zbieraj ułamki na podstawie A>280, aby uzyskać najlepsze wyniki.
Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział
Czas (min)Bufor A (%)Bufor B (%)
097 Rozdział 973
1097 Rozdział 973
253565
55595 Rozdział 95
65595 Rozdział 95
7097 Rozdział 973

Tabela 1: Protokół elucji dla Bla g 1. Tabela ilustrująca gradient elucji zastosowany w izolacji Bla g 1 przy użyciu kolumny HPLC C18.

  1. Porcjować próbkę do szklanych probówek, nie wypełniając żadnej probówki więcej niż do połowy (~ 4 ml). Przykryj rurki folią parafinową i przedziurawij pokrycie dwoma otworami, aby umożliwić wentylację.
    1. Przygotować oddzielną porcję o objętości 1 ml (podwielokrotność testowaną). Zostanie to wykorzystane do określenia oczekiwanej wydajności.
  2. Zamrażać próbki i badać podwielokrotność, umieszczając je w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 1 godzinę lub zanurzając w ciekłym azocie. W przypadku tego ostatniego probówka musi być obracana w sposób ciągły, aby uniknąć pęknięcia probówki z powodu rozszerzania się fazy ciekłej po zamrożeniu.
  3. Wysuszyć powstałe zdelipidowane próbki białek za pomocą liofilizatora. Suszone białko może być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy w szczelnie zamkniętym pojemniku.

4. Odtworzenie Apo i załadowanych ładunkiem Bla g 1

  1. Określ przewidywany plon Bla g 1.
    1. Zawiesić liofilizowaną, zdelipidowaną (po HPLC) porcję testową w 5 ml buforu do ponownego fałdowania (50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
    2. Podgrzać mieszaninę w łaźni wodnej (500 ml zlewki z 250 ml wody i mieszać batonik na płycie grzejnej) do temperatury 95 °C. Roztwory wirować z przerwami i inkubować w temperaturze 95 °C przez 0,5–1 godzinę.
    3. Usuń ogień i powoli pozwól, aby łaźnia wodna wyrównała się do temperatury pokojowej (~1 h). W razie potrzeby wyżarzone białko można przechowywać w tej postaci przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Przepuścić wyżarzoną mieszaninę 1-lipidów Bla g przez filtr strzykawkowy 0,22 μM w celu usunięcia cząstek stałych.
    5. Bufor wymienia przefiltrowane białko 3x na PBS pH 7,4 za pomocą filtra odśrodkowego z odcięciem 10 kDa, jak omówiono w ppkt 3.1 w celu usunięcia pozostałości wolnych kwasów tłuszczowych i rozpuszczalnika organicznego.
    6. Oceń stężenie białka za pomocą testu BCA lub innej preferowanej metody, takiej jak absorbancja UV. Na tej podstawie można określić przewidywany plon dla pozostałych podwielokrotności Bla g 1.
  2. Odtworzenie Bla g g 1 załadowanego apo lub ładunkiem
    1. Ponownie zawiesić podwielokrotności Bla g 1 w buforze ponownego składania, jak opisano w 4.1.1.
    2. Aby wyprodukować Apo-Bla g 1, powtórz kroki 4.1.2–4.1.6, aby uzyskać pożądany plon.
    3. Aby załadować Bla g 1 kwasami tłuszczowymi, przygotuj 20 mM roztworów podstawowych żądanego ładunku kwasów tłuszczowych w metanolu lub DMSO. Następnie przejdź do kroku 4.2.5.
    4. Aby załadować Bla g 1 fosfolipidami, należy przygotować zapas 10 mg/ml żądanego ładunku w chloroformie w szklanej probówce.
      1. Odparować chloroform, aby wytworzyć film lipidowy. Dodaj PBS do probówki, aby uzyskać końcowe stężenie fosfolipidów 20 mM.
        UWAGA: Chloroform jest szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia. Stosować w dygestorium chemicznym lub stosować respirator, jeśli dostępna jest nieodpowiednia wentylacja. Podczas obsługi należy używać rękawic nitrylowych, fartucha laboratoryjnego i okularów. Przed użyciem skonsultuj się z kartą charakterystyki.
      2. Uwodnić film lipidowy, podgrzewając go powyżej temperatury przemiany fazowej ładunku lipidowego i wirując, aż roztwór stanie się mętny. Należy pamiętać, że sonikacja może być wymagana do pełnego zawieszenia i ponownego nawodnienia niektórych ładunków.
      3. Jeśli wymagana jest sonikacja, umieść probówkę w soniku kąpielowym (100 W, 42 kHz) i poddaj sonifikacji z maksymalną mocą, aż ładunek zostanie ponownie zawieszony. Alternatywnie, sonikator sondy (opisany w 2.6) może być używany z mocą 10-20% i 50% cyklem pracy.
        UWAGA: Sonikacja wykorzystuje fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości, które mogą uszkodzić słuch. Stosować środki ochrony indywidualnej tłumiące hałas (zatyczki do uszu lub tłumiki). Jeśli to możliwe, umieść sonikator w obudowie lub komorze tłumiącej dźwięk.
    5. Dodać pożądany ładunek kwasów tłuszczowych lub fosfolipidów, aby uzyskać 20-krotny molowy nadmiar ligandów w stosunku do Bla g 1 w oparciu o przewidywaną wydajność określoną w ppkt 4.1. Całkowita objętość rozpuszczalnika organicznego dodanego na tym etapie nie powinna przekraczać 2%. Wir do mieszania.
      UWAGA: 1 l komórek Bl 21 DE3 zwykle daje ~ 0,25–0,4 nmol białka, co odpowiada ~ 400 μM ligandowi na probówkę.
    6. Wyżarzać białko zgodnie z opisem w ppkt 4.1.

5. Potwierdzenie usunięcia/załadunku fosfolipidów za pomocą 31P-NMR

  1. Zagęścić próbki Bla g g 1 do >100 μM załadowanych Apo lub ładunkiem, używając odśrodkowego zespołu filtrującego, jak opisano w ppkt 3.1.
  2. Ponownie uwodnić fosfolipid odniesienia w buforze PBS do końcowych stężeń 2, 1,5, 1, 0,5 i 0,25 mM.
  3. Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:1 buforem cholanowym (100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% w/v cholate) do całkowitej objętości ~600 μL.
    UWAGA: Cholate jest stosowany na tym etapie w celu pełnego wyekstrahowania i rozpuszczenia lipidów z hydrofobowej jamy Bla g 1. Gwarantuje to, że środowisko chemiczne otaczające grupy główne fosfolipidów jest spójne między różnymi próbkami, co pozwala na jego ilościową ocenę przy użyciu 31P-NMR. Stosowanie cholanu można zastąpić chloroformem/metanolem, jak opisano wcześniej15.
  4. Uzyskaj widma 1D 31P-NMR próbek Bla g 1 rozpuszczonych w cholanach i wzorców fosfolipidów odniesienia za pomocą sondy szerokopasmowej.
    UWAGA: Przedstawione w niniejszej pracy widma 31P-NMR uzyskano przy użyciu spektrometru 600 MHz. Jednak wcześniejsze badania wykorzystujące podobne techniki sugerują, że akceptowalną czułość można osiągnąć przy natężeniach pól tak niskich, jak 150-200 MHz15.
  5. Przetwarzaj wynikowe dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania16.
  6. Uzyskaj intensywność pików za pomocą preferowanego oprogramowania do przeglądania NMR17.
  7. Porównaj widma Bla g 1 31P-NMR z widmami uzyskanymi dla próbek referencyjnych fosfolipidów, aby potwierdzić usunięcie endogennie związanych ligandów i/lub wiązanie pożądanych ligandów w oparciu o chemiczne przesunięcia widocznych pików (lub ich brak).
    1. Potwierdzić pełną stechiometrię wiązania, porównując szczytową intensywność widma Bla g 1 z intensywnością referencyjnych wzorców fosfolipidów.

6. Potwierdzenie złożenia Bla g 1

  1. Przygotować 0,5 μM próbki Bla g 1 w buforze CD (100 mM KH2PO4, pH buforu 7,5). Załadować 2 ml próbki do kuwety CD o średnicy 10 mm z mieszadłem magnetycznym.
  2. Zmierz widmo CD Bla g 1, aby potwierdzić rekonstrukcję struktury drugorzędowej. Upewnij się, że napięcie fotopowielacza (PMT) nie przekracza zaleceń producenta (zwykle 1 kV).
    1. Pomiar sygnału CD od 260–200 nm w temperaturze 25 °C z odstępem danych 0,2 nm i szybkością skanowania 20 nm/s z czasem integracji danych wynoszącym 1 s.
  3. Zwiększyć temperaturę w kuwecie CD z 25 °C do 95 °C z szybkością 0,5 °C/min. Aktywować mieszadło magnetyczne, aby zapewnić jednolitą temperaturę w całej próbce.
  4. Płyta CD monitora przy długości fali 222 nm, odczyty co 2 °C.
  5. Dopasuj wynikowe dane do 2-stanowej krzywej Boltzmana, aby określić temperaturę topnienia. Ze względu na wysoką stabilność Bla g 1, temperatura topnienia (MT25) została zdefiniowana jako temperatura, w której białko straciło 25% swojego początkowego CD przy 222 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z chromatografii powinowactwa, rekombinowany GST-Bla g 1 został łatwo wyizolowany do wysokiego poziomu czystości (Rysunek 1A), uzyskując wydajność ~2-4 mg/L hodowli komórkowej. Nocna inkubacja z proteazą TEV w temperaturze 4 °C jest wystarczająca do usunięcia znacznika GST, uzyskując produkt końcowy o stężeniu ~24 kDa. Należy zauważyć, że w tym przypadku występuje znaczna ilość GST-Bla g 1 we frakcjach przepływowej i płuczce, co sugeruje, że zdolność wiązania żywicy glutationowej została prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w tej pracy został z powodzeniem zastosowany do systematycznego badania właściwości wiązania lipidów przez Bla g 1. Ujawniło to korelację między wiązaniem ładunku, termostabilnością i przetwarzaniem endosomalnym, z których to ostatnie było skorelowane ze spadkiem wytwarzania znanego epitopu komórek T z potencjalnymi implikacjami dla immunogenności 9,18. Wykazano, że oprócz Bla g 1 inne alergeny, takie jak Pru p 3 i Bet v 1, zachowują swoje endoge...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr. Tomowi Kirby'emu, Scottowi Gabelowi i Dr. Robertowi Londonowi za ich pomoc i wsparcie podczas tej pracy, a także Dr. Bobowi Petrovichowi i Lori Edwards za użycie ich oprzyrządowania i pomoc w generowaniu konstruktów Bla g 1 użytych w tym badaniu. Dziękujemy Andrei Adams za pomoc w spektrometrii mas i dr Eugene'owi DeRose za pomoc w oprzyrządowaniu NMR. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bla g 1 Gen GenescriptN/ANiestandardowa usługa syntezy genów. Akcesja GenBank nr AF072219 Pozostałości 34-216
Powinowactwo oczyszczone naturalne Bla g 1 (nBla g 1)Biotechnologie wewnętrzneNie dotyczyNa zamówienie
System HPLC serii Agilent 1100pompa i odgazowywacz UVAgilentG1315B, G1311A, G1322A
Spektrometr Agilent DD2 600 MHzAgilentN/A
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 AmiconUFC-1008
AmpicillinFisher ScientificBP1760-5
BenzonaseSigma-AldrichE1014-5KU
Szerokopasmowa sonda gradientowa 5 mmVarianN/A
ChemStation dla LC (oprogramowanie)AgilentN/A
cOmplete Mini Protease Inhibitor CocktailRoche11836153001
Distearoylfosfatydylocholina (18:0 PC)Avanti Polar Lipids850365C
E. Coli BL21 DE3 CellsNew England BiolabsC2530H
Freezone 4.5 Freeze Dry SystemLabconco7750000
Żywica glutationowaGenescriptL00206
Glutation, zredukowanyFisher Scientific BP25211
Izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Fisher Scientific34060
Jasco  Spektropolarymetr CDJascoJ-815
Millex Filtr strzykawkowyEMD MilliporeSLGS033SS
NMRPipe (oprogramowanie)Delaglio i wsp. N/aDelaglio, F. et al. Nmrpipe - wielowymiarowy system przetwarzania spektralnego oparty na rurach uniksowych. J. Biomol. NMR 6, 277– 293 (1995).
NMRViewJ (Oprogramowanie)Johnson i wsp. Nie dotyczyJohnsona, B. A. & Blevins, RA. Widok NMR: Program komputerowy do wizualizacji i analizy danych NMR. J. Biomol. NMR 4, 603– 614 (1994).
Kwas oleinowySigma-AldrichO1008
Pierce BCA Test białkaSigma-AldrichBCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10,0 mm Kolumna HPLCAgilentSKU: A2000250X100
Pompa próżniowa SD-200VarianVP-195
Hydrat cholanu soduSigma-AldrichC6445
PalmityniansoduSigma-AldrichP9767
Stearynian soduSigma-AldrichS3381
VnmrJ (oprogramowanie)VarianN/A
Detektor,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
  2. Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
  3. Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
  4. Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
  5. Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556(2019).
  6. Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
  7. Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
  8. Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
  9. Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294(2019).
  10. Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
  11. Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
  12. Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
  13. Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
  14. Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
  15. Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
  16. Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  17. Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
  18. Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
  19. Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
  20. Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
  21. Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279(2016).
  22. Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
  23. Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
  24. Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
  25. Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
  26. Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
  27. Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
  28. Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
  29. Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
  30. Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
  31. Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
  32. Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
  33. de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027(2020).
  34. Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
  35. Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
  36. Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Usuwanie ligandu alergenuodwr cona chromatografia cieczowa RP HPLCwy arzanie termiczneapo forma Bla g 1ponowne adowanie fosfolipid wadunek kwas w t uszczowychNMR fosforu 31dichroizm ko owybadanie termostabilno ci

Powiązane artykuły