Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61791

⸱

2 listopada 2020

 , 
1Department of Biology, Drexel University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest bezpośrednie biodrukowanie komórek nabłonka piersi jako wielokomórkowych sferoid na wstępnie utworzonych sieciach śródbłonka, aby szybko stworzyć modele 3D kokultury piersi i śródbłonka, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych leków.

Streszczenie

Bioprinting wyłania się jako obiecujące narzędzie do tworzenia 3D modeli ludzkiego raka, które lepiej oddają najważniejsze cechy architektury tkanek in vivo. W obecnym biodruku wytłaczanym warstwa po warstwie, pojedyncze komórki są wytłaczane w biotuszu wraz ze złożonymi wskazówkami przestrzennymi i czasowymi, aby promować hierarchiczną samoorganizację tkanek. Jednak ta technika biofabrykacji opiera się na złożonych interakcjach między komórkami, biotuszami oraz wskazówkami biochemicznymi i biofizycznymi. W związku z tym samoorganizacja może trwać dni, a nawet tygodnie, może wymagać określonych biotuszy i nie zawsze może wystąpić, gdy w grę wchodzi więcej niż jeden typ komórek. W związku z tym opracowaliśmy technikę bezpośredniego biodruku wstępnie uformowanych sferoid nabłonka piersi 3D w różnych biotuszach. Biodrukowane, wstępnie uformowane sferoidy nabłonkowe piersi 3D zachowały swoją żywotność i spolaryzowaną architekturę po wydrukowaniu. Dodatkowo wydrukowaliśmy sferoidy 3D na sieciach komórkowych śródbłonka naczyń krwionośnych, aby stworzyć model wspólnej hodowli. W ten sposób nowatorska technika biodruku szybko tworzy bardziej fizjologicznie istotny model 3D ludzkiej piersi przy niższych kosztach i większej elastyczności niż tradycyjne techniki biodruku. Ta wszechstronna technika biodruku może być ekstrapolowana w celu tworzenia modeli 3D innych tkanek w dodatkowych biotuszach.

Wprowadzenie

3D unaczynione modele guzów in vitro są niezbędnymi narzędziami do mechanistycznego badania wzrostu raka i przerzutów. W szczególności w przypadku raka piersi komórki nabłonka piersi hodowane w Matrigel organizują się w spolaryzowane sferoidy, które bardziej przypominają architekturę acinus sutka in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. Hodowla komórek nabłonka piersi 3D również wpływa na funkcję komórek, przy czym hodowle 3D wykazują różnice w modulacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGF)8,9; funkcja onkogenu, w tym ErbB210; sygnalizacja wzrostu i apoptozy11,12; i oporność na chemioterapię13,14. Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych podobnie inaczej reagują na bodźce środowiskowe w 3D w porównaniu z tradycyjną hodowlą 2D15,16,17,18. Jednak wiele wiedzy na temat interakcji śródbłonka naczyń krwionośnych i nabłonka piersi pochodzi z hodowli 2D przy użyciu kondycjonowanej pożywki lub wkładek Transwell lub modeli 3D, w których te dwa typy komórek są fizycznie oddzielone19,20,21,22,23. Te modele kohodowli zapewniają ograniczony wgląd fizjologiczny, ponieważ zarówno hodowla 3D, jak i kontakt komórka-komórka mają kluczowe znaczenie dla interakcji śródbłonka naczyniowego z komórkami nabłonka piersi24,25,26.

3D modele raka zostały stworzone przy użyciu różnych technik, w tym formowania sferoidów w wiszących kroplach, biodruku, montażu magnetycznego i hodowli w hydrożelach lub na rusztowaniach inżynieryjnych5,27,28,29. Niedawno stworzono modele 3D guzów z wieloma typami komórek ułożonymi w odpowiednich strukturach 3D. W jednym z przykładów platformy guza na chipie, komórki rakowe, śródbłonka i zrębu zostały zmieszane w matrycę, a następnie wstrzyknięte do trzech centralnych komór tkankowych w urządzeniu z polidimetylosiloksanu (PDMS). Komory tkankowe były otoczone dwoma zewnętrznymi kanałami, które reprezentowały tętnicę i żyłkę. Po 5-7 dniach hodowli komórki śródbłonka utworzyły sieć mikronaczyniową, a komórki rakowe namnażały się, tworząc małe guzy w pobliżu układu naczyniowego. Platforma ta została następnie wykorzystana do badań przesiewowych narkotyków i ich kombinacji30. Stworzono dodatkowe platformy typu tum-on-a-chip do badania przerzutów i typów nowotworów z określonymi bodźcami mechanicznymi (np. mechanicznym obciążeniem w płucach)31,32. Jednak platformy te na ogół nie obejmują zarówno układu krwionośnego, jak i raka w ich odpowiednich strukturach 3D.

Biofabrykacja jest bardzo obiecująca w rozwoju 3D unaczynionych modeli nowotworów in vitro, ponieważ umożliwia ścisłą kontrolę przestrzenną nad lokalizacją komórek. Pomimo rozwoju biodruku w ciągu ostatniej dekady, niewiele badań koncentruje się konkretnie na nowotworach33,34. W jednym z przykładów, druk 3D komórek HeLa w hydrożelu żelatyny/alginianu/fibrynogenu został wykorzystany do stworzenia modelu raka szyjki macicy in vitro. Komórki nowotworowe zostały poddrukowane biologicznie jako pojedyncze komórki, a następnie pozwolono im utworzyć sferoidy, które wykazały wyższy wskaźnik proliferacji, zwiększoną ekspresję metaloproteinazy macierzy i wyższą chemooporność niż komórki w kulturze 2D35. W tych badaniach, podobnie jak w wielu innych36,37, zdysocjowane zawiesiny komórek zostały poddane biodrukowaniu, a następnie hodowle komórkowe zostały wyposażone w wymagane mechaniczne i biochemiczne wskazówki, aby umożliwić komórkom utworzenie struktury 3D. Jednak samoorganizacja komórkowa może trwać dni lub tygodnie, może wymagać złożonych sygnałów przestrzennych i czasowych środowiskowych lub może nie wystąpić, gdy dwa typy komórek są jednocześnie hodowane. Na przykład komórki nabłonka piersi indukowały śmierć komórek w komórkach śródbłonka w kokulturze 2D, a zdysocjowane komórki nabłonka piersi nie tworzyły sferoid 3D po biodrukowaniu w hydrożelach alginianowych/żelatynowych38. Zdysocjowane komórki nabłonka piersi lub raka tworzyły sferoidy w biotuszach na bazie alginianów tylko wtedy, gdy były uwięzione w okrągłych formach PDMS. W innych przypadkach sferoidy zostały uformowane za pomocą zawieszonych kropelek w okrągłych płytkach studzienkowych o bardzo niskim mocowaniu, a następnie zmieszane z biotuszami na bazie alginianu39,40.

Teraz opisujemy alternatywną metodę bioprodukcji tkanek 3D w tym protokole. Zamiast zasiewać zdysocjowane komórki i czekać, aż te komórki utworzą struktury 3D, opisujemy, jak tworzyć i biodrukować sferoidy guza 3D w sieci rurki naczyniowej, aby stworzyć model wspólnej hodowli guza, który można wykorzystać niemal natychmiast. Sferoidy nowotworowe mogą być hodowane in vitro lub pozyskiwane z tkanek ludzkich (organoidów). Podobnie rurki naczyniowe mogą być hodowane lub mogą być pozyskiwane z fragmentów mikronaczyniowych tkanki tłuszczowej. Biotusze mogą obejmować zarówno biologicznie nieaktywny alginian, jak i wysoce aktywny biologicznie Matrigel41. Ponieważ ten model kohodowli guza 3D można stworzyć z różnymi strukturami komórkowymi i biotuszami, może on zawierać wiele typów komórek, matryc zewnątrzkomórkowych i gradientów chemokin15,42. Podczas gdy w obecnej formule sieci śródbłonka nie mogą być perfundowane, przyszłe iteracje mogą zintegrować tę metodę z mikropłynami lub systemami -on-chip. Biodrukowanie sferoid nabłonka piersi w 3D na sieciach śródbłonka umożliwia szybką biofabrykację modeli ludzkich piersi do testowania leków i spersonalizowanej medycyny precyzyjnej27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wzrost komórek nabłonka piersi i pożywka testowa

  1. MCF10A Komórki nabłonka piersi
    UWAGA: Nienowotworowa, unieśmiertelniona linia komórek nabłonka piersi pochodzi od pacjenta z chorobą włóknisto-torbielowatą43. Komórki nie wyrażają receptora estrogenowego.
    1. Aby przygotować 20 μg/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), rozpuść 100 μg liofilizowanego EGF w 500 μl sterylnego dH2O, aby uzyskać 200 μg/ml EGF. Dodać 500 μl 200 μg/ml EGF do 4,5 ml sterylnego 0,1% BSA w dH2O, aby uzyskać roztwór podstawowy EGF o stężeniu 20 μg/mL. Przygotowane porcje EGF należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 12 miesięcy.
    2. Aby przygotować 500 μg/ml hydrokortyzonu, rozcieńczyć 1 mg hydrokortyzonu w 1 ml absolutnego etanolu (200 proof). Dodaj 1 ml sterylnego DMEM F:12 do tej mieszaniny, aby uzyskać roztwór podstawowy hydrokortyzonu o stężeniu 500 μg/ml. Porcje zapasu hydrokortyzonu należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 12 miesięcy.
    3. Aby przygotować 10 μg/ml toksyny, rozpuść 1 mg liofilizowanego proszku toksyny w 1 ml sterylnego dH2O, aby uzyskać 1 mg/ml roztworu podstawowego toksyny. Zapasy toksyny należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 12 miesięcy.
    4. Aby przygotować pożywkę wzrostową, dodać 500 μl EGF (20 μg/ml), 500 μl hydrokortyzonu (500 μg/ml), 5 μl toksyny (1 mg/ml), 500 μl insuliny bydlęcej (10 mg/ml), 10 ml penicyliny i streptomycyny oraz 25 ml surowicy końskiej do 500 ml DMEM F:12 dla końcowego stężenia 20 ng/ml EGF, 500 ng/ml hydrokortyzonu, 10 ng/ml toksyny, 10 ng/ml insuliny bydlęcej, 2% v/v penicyliny i streptomycyny oraz 5% v/v surowicy końskiej. Stężenie antybiotyku zwiększono do 2%, aby uwzględnić zmniejszoną sterylność w procesie biodrukowania; Jednak stężenie antybiotyku można obniżyć do 1%.
    5. W celu przygotowania pożywki oznaczającej dodać 500 μl hydrokortyzonu (500 μg/ml), 5 μl toksyny (1 mg/ml), 500 μl insuliny bydlęcej (10 mg/ml), 10 ml penicyliny i streptomycyny oraz 25 ml surowicy końskiej do 500 ml DMEM F:12 dla końcowego stężenia 500 ng/ml hydrokortyzonu, 10 ng/ml toksyny, 10 ng/ml insuliny bydlęcej, 2% v/v penicyliny i streptomycyny oraz 5% v/v surowicy końskiej.
  2. MDA-MB-231
    UWAGA: Potrójnie ujemna (brak receptora estrogenowego, receptora progesteronu i receptora 2 naskórkowego czynnika wzrostu) linia komórek nabłonkowych raka piersi powstaje z wysięku opłucnowego u pacjentki z przerzutowym gruczolakorakiem sutka44. Komórki reprezentują agresywnego, inwazyjnego i słabo zróżnicowanego raka piersi.
    1. Aby przygotować pożywkę do oznaczania wzrostu i testu, dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 10 ml penicyliny i streptomycyny oraz 25 ml surowicy końskiej do 500 ml DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej, 2% v/v penicyliny i streptomycyny oraz 5% v/v surowicy końskiej.

2. Hodowla komórek nabłonka piersi

  1. Wysiewaj 500 000 komórek MCF10A lub MDA-MB-231 w 10-centymetrowym (P100) naczyniu do hodowli tkankowej z 10 ml pożywki wzrostowej MCF10A lub MDA-MB-231. Komórki MCF10A i MDA-MB-231 osiągają >90% konfluencji w ciągu 48 godzin.
  2. Aby przejść przez komórki nabłonka piersi, najpierw umyj komórki 10 ml ciepłego PBS.
  3. Odłącz komórki nabłonka piersi, dodając do naczynia 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 20-25 minut.
  4. Dodaj 5 ml pożywki wzrostowej MCF10A lub MDA-MB-231 do trypsynizowanych komórek, aby zneutralizować trypsynę. Pipetować mieszaninę komórka-pożywka w górę iw dół, aby ponownie zawiesić komórki i rozbić klastry komórek.
  5. Dodać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 200 x g przez 3 minuty. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki wzrostowej MCF10A lub MDA-MB-231.
  6. Płytka 1 ml zawiesiny komórkowej w 5 nowych 10-centymetrowych szalkach do hodowli tkankowych wraz z pożywką wzrostową MCF10A lub MDA-MB-231. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Komórki będą gotowe do ponownego przejścia za 2-3 dni. Komórki MCF10A mogą być utrzymywane do pasażu numer 35, po czym wykazują zmiany morfologiczne. Komórki MDA-MB-231 mogą być utrzymywane do pasażu numer 24, po czym wykazują zmiany morfologiczne.

3. Formacja sferoidowa nabłonka piersi

  1. Zamrozić końcówki pipet o pojemności 200 μl na 30 minut przed rozpoczęciem testu. Roztwór matrycy o obniżonym współczynniku wzrostu (np. Matrigel) (10 mg/ml) należy przechowywać na lodzie przez cały proces.
  2. Powoli odpipetować 30 μl lodowatego roztworu matrycowego za pomocą lodowatych końcówek pipet o pojemności 200 μl do każdej studzienki szkiełka z 8-dołkową komorą. Zacznij od boków i przeciągnij końcówkę pipety wzdłuż rogów, dodając ostatnią kroplę do środka studzienki, aby zapewnić równomierne pokrycie każdej studzienki. Na tym etapie należy unikać pęcherzyków powietrza, aby zapewnić jednolitą warstwę roztworu matrycy. Używaj nowych końcówek do pipet dla każdego dołka.
  3. Komora inkubacyjna wsuwa się do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 15-20 minut w celu polimeryzacji roztworu matrycy.
  4. Ponownie zawieś trypsynizowane komórki MCF10A w pożywce testowej MCF10A przy 200 000 komórek/ml lub ponownie zawieś trypsynizowane komórki MDA-MB-231 w pożywce wzrostowej MDA-MB-231 przy 200 000 komórek/ml.
  5. W przypadku korzystania z komórek MCF10A należy przygotować świeżą sferoidalną pożywkę wzrostową MCF10A, dodając 5 μl EGF (20 μg/ml) i 100 μl roztworu matrycy do 5 ml pożywki testowej, aby uzyskać końcowe stężenie 2% roztworu matrycy.
  6. Wyjąć z inkubatora szkiełko komorowe wstępnie pokryte roztworem matrycy. Dodaj 50 μl zawiesiny komórek MCF10A lub MDA-MB-231 (10 000 komórek) do każdego dołka. Jeśli używasz komórek MCF10A, dodaj 450 μl sferoidalnej pożywki wzrostowej MCF10A. Jeśli używasz komórek MDA-MB-231, dodaj 450 μl pożywki wzrostowej MDA-MB-231 zmieszanej z 2% roztworem matrycy (9 μl). Natychmiast umieścić szkiełko komorowe w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  7. Wymieniaj pożywkę co 4 cztery dni. Ostrożnie odpipetować 200 μl starych pożywek z jednego rogu każdej studzienki za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Podczas tego procesu należy przechylić suwak komory pod kątem 45°, aby upewnić się, że sferoidy nie zostaną naruszone. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego spekieroidalnego podłoża wzrostowego MCF10A lub pożywki wzrostowej MDA-MB-231 uprzednio zmieszanego z 2% roztworem matrycy do każdej studzienki w rogu kroplami, aby upewnić się, że sferoidy pozostają przyczepione do warstwy matrycy. Tylko ~50% pożywki jest wymieniane, dzięki czemu wszystkie cytokiny wytwarzane przez sferoidy nie są całkowicie wyczerpane.
    UWAGA: Sferoidy nabłonka piersi MCF10A potrzebują do 8 dni, aby spolaryzować i utworzyć puste środki. Sferoidy nabłonkowe piersi MDA-MB-231 tworzą się do 5 dni i nie mają pustych środków.

4. Tworzenie sieci komórek śródbłonka

  1. Posiew komórek śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej (HUVEC)
    1. Dodaj zawartość pojedynczego zestawu Endothelial Growth Medium-2 zawierającego insulinowy czynnik wzrostu, czynnik wzrostu fibroblastów, czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, kwas askorbinowy, naskórkowy czynnik wzrostu, heparynę i gentamycynę-amfoterycynę B, wraz z 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml penicyliny-streptomycyny i 5 ml 200 mM glutaminy do 500 ml Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2), aby uzyskać kompletne podłoże do wzrostu śródbłonka (EGM-2).
    2. Wysiewaj 500 000 komórek śródbłonka w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w 10 ml EGM-2. Umieść komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do momentu, aż osiągną konfluencję >80% (około 48 godzin).
    3. Aby przejść komórki, przemyj komórki śródbłonka 10 ml ciepłego PBS. Odłącz HUVEC, dodając 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej. Ściśle monitoruj komórki za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Komórki są gotowe, gdy są zwinięte w kulkę, ale pozostają przyczepione do naczynia.
    4. Ostrożnie odessaj trypsynę z naczynia. Dodaj 8 ml EGM-2 do naczynia. Zmyj komórki z naczynia, pipetując EGM-2 w górę iw dół po całej powierzchni naczynia.
    5. Alternatywnie dodaj 5 ml EGM-2 do trypsynizowanych komórek, aby zneutralizować trypsynę. Pipetować mieszaninę komórka-pożywka w górę iw dół, aby ponownie zawiesić komórki i rozbić klastry komórek. Dodać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 200 x g przez 3 minuty. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml EGM-2.
    6. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do 9 ml EGM-2 w 10 cm naczyniu do hodowli tkankowych. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Wymieniać 2/3 podłoża na świeże NWZ-2 co 2 dni. Komórki będą gotowe do przejścia w ciągu 3-5 dni. HUVEC może być utrzymywany do przejścia 8, po którym nie udaje im się utworzyć sieci.
  2. Tworzenie sieci komórek śródbłonka (HUVEC)
  3. Zamrozić końcówki pipet o pojemności 200 μl na 30 minut przed rozpoczęciem testu. Roztwór matrycy o obniżonym współczynniku wzrostu (10 mg/ml) należy przechowywać na lodzie przez cały proces.
  4. Powoli odpipetować 30 μl lodowatego roztworu matrycowego za pomocą lodowatych końcówek pipet o pojemności 200 μl do każdej studzienki szkiełka z 8-dołkową komorą. Zacznij od boków i przeciągnij końcówkę pipety wzdłuż rogów, dodając ostatnią kroplę do środka studzienki, aby zapewnić równomierne pokrycie każdej studzienki. Na tym etapie należy unikać pęcherzyków powietrza, aby zapewnić jednolitą warstwę roztworu matrycy. Używaj nowych końcówek do pipet dla każdego dołka.
  5. Komora inkubacyjna ślizga się w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 15-20 minut w celu polimeryzacji Matrigel.
    1. Wstępnie zabarwić 10-centymetrowe naczynie HUVEC 10 μl urządzenia do śledzenia krwinek czerwonych (1:1000) przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Umyj komórki śródbłonka 10 ml ciepłego PBS. Odłącz HUVEC, dodając 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej. Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 5 minut, aby całkowicie odłączyć komórki.
    3. Dodaj 5 ml EGM-2 do naczynia, aby zneutralizować trypsynę. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 25 ml. Wirować HUVEC przy 1 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml EBM-2 bez surowicy.
    4. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego, aby określić żywe komórki. Utwórz roztwór 1 x 106 komórek/ml.
    5. Dodaj 100 000 HUVEC do każdej studzienki z 200 μl wolnego EBM-2 w surowicy. Jeśli dodasz więcej komórek, utworzą one monowarstwę powierzchniową, a nie sieć rur.
    6. Inkubować HUVEC w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 6 godzinach zobrazuj sieci HUVEC za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego. Sieci są teraz gotowe do kohodowli z sferoidami piersi.

5. Bioprinting Sferoidy nabłonkowe piersi na wstępnie utworzonych sieciach HUVEC

UWAGA: Do procesu biofabrykacji powinien być używany system biodepozycji z dwiema dyszami. W tym przypadku system posiadał trzy ruchome ramiona, które umożliwiały przestrzenną kontrolę osadzania materiału w skali mikronów, a także dwa silniki napędzane do nanoszenia biotuszu ze strzykawek o pojemności 10 ml. System powinien być wyposażony w wysokowydajny system filtracji cząstek stałych, a także możliwość sterylizacji UV w celu utrzymania sterylnego środowiska podczas biodrukowania. Biodrukarka jest sterylizowana promieniami UV przez godzinę przed procesem drukowania.

  1. Utwórz sferoidy nabłonka piersi i sieci HUVEC, jak opisano wcześniej. Oszacuj liczbę sferoid nabłonka piersi w każdym dołku, licząc sferoidy na reprezentatywnych obrazach mikroskopii kontrastowej fazowej.
  2. Odetnij 0,5 cm od końca końcówki pipety o pojemności 1000 μl. Użyj odciętej końcówki pipety, aby ostrożnie odpipetować wszystkie sferoidy z szkiełka 8-dołkowej komory do probówki o pojemności 50 ml. Ponownie zawiesić sferoidy w wybranym biotuszu przy 100 sferoidach/100 μl.
    UWAGA: Wyższe stężenia sferoidów mogą powodować grupowanie sferoidów i uniemożliwiać wizualizację interakcji między sferoidami a sieciami śródbłonka.
  3. Przepuść mieszaninę sferoidów przez sitko do komórek o wielkości 70 μm, aby usunąć wszelkie duże lub skupione sferoidy.
  4. Załaduj zebrane sferoidy do sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml i zakryj ją sterylną igłą o rozmiarze 25G. Podłączyć strzykawkę do systemu biodepozycji.
  5. Odessać pożywkę z sieci HUVEC w 8-dołkowym szkiełku komorowym.
  6. Wyciśnij 100 μl sferoid nabłonka piersi do 6 studzienek sieci HUVEC z natężeniem przepływu 1 ml/min. Utrzymuj 2 studzienki sieci HUVEC jako kontrole.
  7. Dodać 400 μl sferoidalnej pożywki wzrostowej MCF10A, jeśli używasz sferoidów MCF10A wydrukowanych w sieciach HUVEC lub dodać 400 μl pożywki wzrostowej MDA-MB-231 uprzednio zmieszanej z 2% roztworem matrycy, jeśli używasz sferoid MDA-MB-231 wydrukowanych w sieciach HUVEC. W studzienkach kontrolnych HUVEC należy stosować odpowiednią sferoidalną pożywkę wzrostową.
  8. Inkubować kokultury w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 – 96 godzin bez zmiany pożywki. Kokultury pozostaną żywotne w oryginalnym pożywce przez okres do czterech dni.

6. Mikroskopia konfokalna

  1. Preparat immunofluorescencyjny i bufor płuczący PBS-glicyna
    1. Przygotuj bufor immunofluorescencyjny (IF) 10x roztwór podstawowy, dodając 2,5 g azydku sodu, 5 g albuminy surowicy bydlęcej, 10 ml Triton X-100 i 2,05 ml Tween-20 w 500 ml 10x PBS. Dostosuj pH do 7,4. Roztwór podstawowy należy przechowywać przez okres do roku w temperaturze 4 °C, aby uniknąć sedymentacji.
    2. Utwórz działający bufor IF, rozcieńczając 50 ml 10x buforu IF w 450 ml sterylnej wody dejonizowanej. Roztwór roboczy należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez okres do jednego tygodnia.
    3. Przygotować 10x PBS-Glycine roztwór podstawowy buforowy, dodając 37,5 g glicyny do 500 ml 10x PBS. Dostosuj pH do 7,4. Roztwór podstawowy należy przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C, aby uniknąć sedymentacji.
    4. Stwórz działający roztwór PBS-Glycine, rozcieńczając 50 ml 10x buforu PBS-Glycine w 450 ml sterylnej wody dejonizowanej. Roztwór roboczy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
  2. Oznaczanie próbek biodrukowanych i obrazu za pomocą mikroskopii konfokalnej
    1. Odessać pożywkę z biodrukowanych kokultur 3D i spłukać 3 razy ciepłym PBS. Utrwal biodrukowane kokultury 3D z 4% paraformaldehydem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płukać próbki 3 razy przez 20 minut 1x PBS-Glycine.
    2. Próbki blokowe z buforem IF zmieszanym z 10% surowicą kozią przez 90 minut (blok pierwotny), a następnie 40 minut z buforem IF plus 10% surowicą kozią i fragmentem Affinipure Fab (1:100, blok wtórny).
    3. W przypadku stosowania sferoidów MCF10A należy oznaczyć próbki pierwszorzędowym przeciwciałem dla integryny α6 (1:100) w wtórnym buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488 (1:200) i Hoescht 33342 (1:1000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Linie komórkowe MCF10A wyrażają wysoki poziom integryny α6, która jest niezbędna do wykazania polaryzacji sferoidalnej i morfologii.
    4. W przypadku stosowania sferoid MDA-MB-231, które wyrażają niskie poziomy integryny α6, należy oznaczyć próbki falloidyną Alexa Fluor 488 (1:100) i Hoescht 33342 (1:1000) w wtórnym buforze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Falloidyna umożliwia wizualizację filamentu aktynowego, dzięki czemu można ocenić sferoidalną, amorficzną i inwazyjną morfologię.
    5. Umyj próbki 1X PBS-glicyną 3 razy przez 20 minut.
    6. Przygotuj próbki do montażu, wyjmując szkiełko studzienki za pomocą narzędzia producenta. Dodaj małą kroplę roztworu zapobiegającego blaknięciu do każdej studzienki. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 60 mm na każdym szkiełku komorowym i ostrożnie uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci.
    7. Obrazuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego jako stosy Z po ~10 warstw w krokach co 5 μm. W razie potrzeby skompresuj płaszczyzny Z do jednej płaszczyzny za pomocą polecenia Extended Focus w oprogramowaniu do obrazowania komórek.
    8. Określ ilościowo adhezję sferoidalną do sieci śródbłonka za pomocą obrazu J. Liczbę przylegających sferoid można określić ilościowo za pomocą wtyczki analitycznej z odpowiednią wielkością cząstek i kołowością. Normalizuje liczbę sferoid dołączonych do obszaru obrazu.
    9. Aby zapewnić odtwarzalność, określ ilościowo liczbę przylegających sferoid na kafelkowych obrazach 4 x 4 kokultur. Jeśli liczba sferoidalna jest statystycznie istotnie niższa niż w innych doświadczeniach, eksperyment należy powtórzyć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki nabłonka piersi powinny samoorganizować się w sferoidy 3D po 5-8 dniach hodowli na roztworze macierzy i w pożywce hodowlanej z 2% roztworem macierzy. Nietumorogenne sferoidy nabłonka piersi MCF10A powinny mieć okrągły kształt i pusty środek, z integryną α6 spolaryzowaną ku zewnętrznej krawędzi sferoidu (Rycina 1, wstawka pokazuje puste środki). Silnie inwazyjne komórki nabłonka raka piersi MDA-MB-231 tworzą nieregularne sferoidy. Sferoidy należy wykorzystać, gdy ich średnica wynosi o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten jest pierwszym w swoim rodzaju, który biodrukuje sferoidy w ich architekturze 3D w celu kohodowli z komórkami śródbłonka również w ich architekturze 3D. Krytyczne kroki protokołu obejmują początkowe tworzenie sferoid nabłonka piersi i sieci HUVEC. Należy zachować szczególną ostrożność podczas karmienia sferoidami nabłonkowymi piersi, ponieważ łatwo można je oderwać od roztworu matrycowego. Podobnie, sferoidy nabłonka piersi muszą być traktowane ostrożnie, gdy są pipetowane z roztworu matrycy i mieszane z sie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez NIH 1R01HL140239-01 dla AMC. Chcielibyśmy podziękować Centrum Obrazowania Komórkowego Uniwersytetu Drexel.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
37&stopnie; Inkubator C, 5% CO2 i 95% wilgotnościSanyoMCO-20AICInkubacja komórek
3D Biodrukarka na zamówienieBrakSłuży do biodruku
8-dołkowe szkiełka komoroweVWR, Radnor, PA53106-306do wysiewu sferoid
igła o rozmiarze 25 Sigma, St. Louis, MOZ192406-100EAigła do biodruku strzykawka do biodruku
Absolutny etanol (200 proof)Sigma, St.Louis, MOE7023-500MLrekonstrukcja składników podłoża
Affinipure F(ab′)2 fragmenty kozy anty-mysie IgGJackson ImmunoResearch, West Grove, PA115006020blok wtórny - Immunofluorescencja
Alexa Fluor 488 (1:200)Thermo Fisher, Waltham, MAA-11006Przeciwciało wtórne-immunofluorescencyjna
insulina bydlęcaSigma, St.Louis, MOI-035-0,5MLMCF10A Dodatek do podłoża
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma, St.Louis, MOA2153-500GŚrodek blokujący -Immunofluorescence
Falcon 70 µ m Sitko do komórekCorning, Corning, NY352350Usuń duże lub zgrupowane sferoidy
CellTracker™ Czerwony barwnik CMTPX ThermoFisher, Waltham, MAC34552wstępne barwienie do probówek HUVEC
Wirówka kompaktowaHermle- Labnet, Edison, NJZ206ADo wirowania komórek
ToksynaSigma, St.Louis, MOC8052-.5MGMCF10A Dodatek do podłoża Probówki
stożkowe 15 mlVWR, Radnor, PA62406-200Komory zbierające i zawieszające
Hrabina II-FL Licznik komórekThermo Fisher, Waltham, MAAMQAF1000komórek zliczających
Pipety szklane (10 ml)VWR, Radnor, PA76184-746Zawieszenie komórek
DMEM F:12Thermo Fisher, Waltham, MA11320033Pożywka podstawowa MCF10A
DMEM 1XVWR, Radnor, PA10-014-CVMDA-MB-231 podłoże podstawowe
Śródbłonek Basal Medium-2 (EBM-2)Lonza, Durham, NCCC-3156HUVEC podłoże do
pomiaru śródbłonka Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)Lonza, Durham, NCCC-3162W zestawie zestaw pocisków (zawierający czynniki wzrostu)
Alexa Fluor™ 488 PhalloidinThermo Fisher, Waltham, MAEtykietowanie sferoidy MDA-MB-231
Płodowa surowica bydlęcaCytiva, Logan, UTSH30071.03HUVEC/MDA-MB-231 dodatek do pożywki
Surowica koziaThermo Fisher, Waltham, MA16210064Składnik znakujący immunofluorescencję
GlycineSigma, St.Louis, MOG8898-500GImmunofluorescencyjny składnik buforowy
Hoescht 33342Thermo Fisher, Waltham, MA62249Immunofluorescencja plam jąder
Serum końskieThermo Fisher, Waltham, MA16050130MCF10A Dodatek do podłoży
HydrokortyzonSigma, St.Louis, MOH0888-5GMCF10A Dodatek do pożywki
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)Zastosowania komórkowe, San Diego, CA200-05fLinie komórkowe śródbłonka
Integryna i alfa; 6Millipore, Billerica, MAMAB1378Składnik do znakowania sferoidów immunofluorescencyjnych
Test żywych trupówThermo Fisher, Waltham, MAL3224Test barwienia żywych i martwych komórek pod kątem żywotności komórek
LSM 700 Mikroskop konfokalny Zeiss, Thornwood, NYSłuży do wizualizacji komórek
Matrigel - czynnik wzrostu o zmniejszonej 10 mg/mlVWR, Radnor, PA354230Spheroid tworzenie
komórek MCF10AATCCCRL-10317Linia komórek piersi
MDA-MB-231 komórkiATCCHTB-26Linia komórek piersi
ParaformaldehydSigma, St.Louis, MO158127-500Gutrwalacz komórek
Penicylina i streptomycynaThermo Fisher, Waltham, MA15140122MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Dodatek do podłoża
Bufor fosforanowy Saline 1X (PBS)Thermo Fisher, Waltham, MA7001106Bufor do płukania komórek przed trypsynizacją
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna 10XThermo Fisher, Waltham, MAbuforowy immunofluorescencjiAM9625
Prolong gold antifade ThermoFisher, Waltham, MAP36934pożywka do immunofluorescencji
Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu, EGFPeprotech, Rocky Hill, NJAF-100-15MCF10A/ składnik pożywki testowej
Azydek soduSigma, St.Louis, MOS2002-25Gimmunofluorescencyjny
Sterylna strzykawka (10 ml)VWR, Radnor, PA75846-757proces biodruku
Naczynie do hodowli tkankowych (10 cm)VWR, Radnor, PA25382-166jednowarstwowa hodowla komórkowa
Triton X-100Sigma, St.Louis, MOT8787-250MLbuforowy immunofluorescencji
Błękit trypanowy 0,4%Thermo Fisher, Waltham, MA15250061dodatek do licznika komórek
Trypsin-EDTA 0,05%Thermo Fisher, Waltham, MA25300054odwarstwienie komórek
Tween -20Thermo Fisher, Waltham, MA85113składnik buforowy immunofluorescencji
Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF165)Peprotech, Rocky Hill, NJ100-20Dodatek do rurek HUVEC
Oprogramowanie do obrazowania komórek Volocity 6.3PerkinElmer, Hopkinton, MAZ kompresor stosu
Składnik bufor składnik

Bibliografia

  1. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  5. Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19(2016).
  6. Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
  7. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  8. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  9. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  10. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
  11. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
  14. Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
  15. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
  16. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  17. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
  18. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
  19. Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
  20. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
  21. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66(2011).
  22. Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
  23. Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
  24. Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671(2015).
  25. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  26. Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
  27. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
  28. Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).
  29. Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
  30. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589(2016).
  31. Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
  32. Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  33. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  34. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  35. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001(2014).
  36. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
  37. Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101(2015).
  38. Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
  39. Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
  40. Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
  41. Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003(2019).
  42. Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
  43. Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285(2015).
  44. Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
  45. Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
  46. Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145(2018).
  47. Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biodruk 3Dsie naczyniowatechnika biodrukumikroskopia kontrastowamikroskopia konfokalnatworzenie sferoid wsie HUVECst enie biotuszu
Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.