Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wspomaganą transiluminacją mikrodysekcję segmentów kanalików nasiennych dorosłych myszy reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasienia i typy komórek w nim, a następnie barwienie immunologiczne preparatów dyni i nienaruszonych segmentów kanalików.

Streszczenie

Spermatogeneza to unikalny proces różnicowania, który ostatecznie prowadzi do powstania jednego z najbardziej charakterystycznych typów komórek w organizmie, plemników. Różnicowanie komórek rozrodczych zachodzi w kieszeniach cytoplazmatycznych somatycznych komórek Sertoliego, w których jednocześnie znajduje się od 4 do 5 pokoleń komórek rozrodczych oraz koordynują i synchronizują ich rozwój. Dlatego skład typów komórek rozrodczych w przekroju poprzecznym jest stały, a te asocjacje komórkowe są również znane jako etapy (I–XII) cyklu nabłonka nasiennego. Co ważne, stadia można również zidentyfikować na podstawie nienaruszonych kanalików nasiennych na podstawie ich zróżnicowanej charakterystyki absorpcji/rozpraszania światła ujawnionej przez transoświetlenie oraz faktu, że stadia następują po sobie wzdłuż kanalika w kolejności numerycznej. W artykule opisano metodę mikrodysekcji wspomaganą transilluminacją do izolacji segmentów kanalików nasiennych reprezentujących określone etapy cyklu nabłonka nasiennego myszy. Wzór absorpcji światła w kanalikach nasiennych jest najpierw badany pod mikroskopem preparacyjnym, a następnie segmenty kanalików reprezentujące określone etapy są wycinane i wykorzystywane do dalszych zastosowań. W tym miejscu opisujemy protokoły barwienia immunologicznego dla specyficznych dla etapu preparatów do squasha i dla nienaruszonych segmentów kanalików. Metoda ta pozwala badaczowi skupić się na zdarzeniach biologicznych zachodzących w określonych fazach spermatogenezy, zapewniając w ten sposób unikalne narzędzie do rozwojowych, toksykologicznych i cytologicznych badań spermatogenezy i leżących u jej podstaw mechanizmów molekularnych.

Wprowadzenie

Różnicowanie męskich komórek rozrodczych od plemników diploidalnych do dojrzałych plemników haploidalnych, tj. spermatogeneza, to złożony proces, który zachodzi w nabłonku kanalików nasiennych w jądrach dojrzałego płciowo osobnika¹. Mitotyczni potomkowie spermatogonii A1 najpierw dzielą się pięciokrotnie, aby rozszerzyć populację zaangażowaną w różnicowanie, a następnie wchodzą w mejozę jako spermatocyty, które ostatecznie dają początek haploidalnym plemnidom. Różnicowanie okrągłych plemników w plemniki, czyli spermiogeneza, obejmuje złożone zmiany w morfologii komórki, w tym zagęszczenie jąder i budowę struktur specyficznych dla plemników, takich jak akrosom i wici. U myszy cały proces spermatogenezy trwa 35 dni^2,3.

W dowolnym miejscu, nabłonek nasienny zawiera do pięciu kohort różnicujących się komórek rozrodczych plus komórki macierzyste/progenitorowe linii zarodkowej oraz somatyczne komórki Sertoliego¹. Różnicujące się komórki rozrodcze tworzą koncentryczne warstwy, których skład jest przewidywalny, a komórki haploidalne na danym etapie rozwoju zawsze kojarzą się z określonymi typami spermatocytów i spermatogonii^4,5. Dlatego każdy przekrój kanalika zawiera kohorty komórek rozrodczych o stałym składzie. Te specyficzne asocjacje komórkowe definiuje się jako etapy nabłonka nasiennego. Etapy same w sobie nie prezentują stanów przypominających stagnację punktów kontrolnych, ale stale rozwijają się wraz z postępem różnicowania kohort komórek rozrodczych w synchronizacji^1,2,6. U myszy istnieje 12 etapów (I-XII)², które są ułożone w sposób segmentowy wzdłuż osi podłużnej kanalika nasiennego i następują po sobie w logicznej kolejności, tworząc w ten sposób falę nabłonka nasiennego lub falę spermatologiczną7^,8,9 (Rysunek 1). Zakończenie spermatogenezy trwa cztery cykle, a hierarchiczne warstwy lub kohorty różnicujących się komórek rozrodczych w obrębie dowolnego przekroju kanalików nasiennych są czasowo oddalone od siebie o jeden cykl nasienny. Długość cyklu jest zależna od gatunku i u myszy każdy cykl trwa 8,6 dnia¹⁰.

Etapy można zidentyfikować na podstawie składu komórkowego i organizacji nabłonka nasiennego na histologicznych odcinkach jąder⁵ (Rysunek 1 i Rysunek 2). Jednak analiza histologiczna jest pracochłonna, czasochłonna i wymaga utrwalenia i barwienia, dlatego nie można jej zastosować do żywej tkanki. Co ważne, ocenę stopnia zaawansowania można również przeprowadzić na żywej tkance pod mikroskopem preparacyjnym, wykorzystując wyraźne wzorce absorpcji/rozproszenia światła wykazywane na różnych etapach cyklu (Rysunek 2). Zdolność każdego etapu do pochłaniania i rozpraszania światła jest zależna od poziomu kondensacji chromatyny późnych post-mejotycznych spermatydów, które są gospodarzami na danym etapie, oraz od upakowania tych komórek w wiązki^7,11. Różnicowanie spermatydów, tj. spermiogeneza, jest dalej podzielone na 16 etapów rozwoju, w tym 8 etapów różnicowania plemników okrągłych (kroki 1-8) i 8 etapów różnicowania plemników wydłużających (kroki 9-16) (Rysunek 1). Krok 9-11 wydłużające się spermatydy (stadium IX-XI) wykazują tylko niski poziom kondensacji chromatyny, co skutkuje małą ilością pochłaniania światła. Kondensacja chromatyny rozpoczyna się w kroku 11 spermatydy (etap XI), a w kroku 15-16 wydłużające się spermatydy (stadium IV-VIII) zawierają w pełni skondensowaną chromatynę, a zatem wykazują maksymalną absorpcję światła (Rysunek 3). Chromatyna musi zostać skondensowana, aby była szczelnie upakowana w główce nasienia. Dodatkowymi czynnikami, które przyczyniają się do wzorca absorpcji światła, są lokalizacja wydłużających się spermatyd w nabłonku (podstawa vs. wierzchołkowa) oraz wiązanie wydłużających się spermatyd (wymawiane w stadiach II-V)¹¹ (Ryc. 3). Wiązki są widoczne jako plamki w środku kanalików i jako paski na krawędziach pod mikroskopem preparacyjnym, a im bardziej skondensowana chromatyna, tym ciemniejsza plama/pasek¹¹.

Ten artykuł opisuje użycie metody mikrodysekcji wspomaganej transillumination do izolacji segmentów kanalików nasiennych reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasiennego. Po wyizolowaniu, etapowe segmenty kanalików mogą być poddawane różnym dalszym analizom, w tym biochemicznym analizom RNA i białkom^12,13,14,15, cytometria przepływowa¹⁶, hodowla kanalików ex vivo¹⁷ i immunostaining¹⁸. W tym miejscu udostępniamy również szczegółowe protokoły dalszego przetwarzania w celu przygotowania zgniecionych monowarstw etapowych segmentów kanalików do analizy morfologicznej żywych komórek i późniejszego barwienia immunologicznego, a także barwienia immunologicznego segmentów kanalików w całości. Przepływ pracy w pigułce jest opisany w Rysunek 4.

Metoda mikrodysekcji wspomagana transillumination pozwala na dokładną identyfikację i izolację komórek rozrodczych na określonych etapach różnicowania dzięki zsynchronizowanemu składowi komórkowemu etapów. Co ważne, umożliwia również badanie zdarzeń zależnych od stadium podczas spermatogenezy na żywej tkance. Biorąc pod uwagę brak skalowalnych modeli spermatogenezy in vitro, metoda ta ma również wyjątkową zaletę, ponieważ umożliwia ukierunkowane krótkoterminowe badania rozwojowe i toksykologiczne na specyficznych dla danego stadium segmentach kanalików ex vivo^12,17. Chociaż opisujemy tutaj metodę dla myszy, tę samą procedurę można zastosować do dowolnego gatunku ssaków z podłużnym i segmentowym układem etapów nabłonka nasiennego, takich jak rat^4,7,15,19,20.

Protokół

Utrzymanie myszy laboratoryjnych i wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie w Turku.

1. Przygotowanie kanalików nasiennych do mikrodysekcji

1. Uśmierc dorosłego samca myszy (≥8 tygodni, jądro 80–120 mg w zależności od szczepu i wieku) poprzez uduszenie CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
   UWAGA: Mysz powinna być dojrzała płciowo, a najlepiej mieć co najmniej 8 tygodni. Wzorzec transiluminacji u młodocianych myszy różni się od dorosłego, ponieważ fala nabłonka nasiennego nie została jeszcze w pełni ustalona, a czas pierwszej fali spermatogenezy jest inny^21,22. Brak wydłużających się plemników u <4-tygodniowych samców myszy wyklucza ich zastosowanie do mikrodysekcji wspomaganej transilluminacją. Można stosować wszystkie szczepy myszy, które mają prawidłową spermatogenezę.
2. Spryskaj brzuszną część brzucha 70% etanolem. Otwórz jamę brzuszno-miedniczną za pomocą sterylnych nożyczek, tworząc otwór w kształcie litery V.
3. Ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową najądrza sterylnymi kleszkami, zlokalizuj jądra, wypreparuj je nożyczkami i umieść na sterylnej 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej PBS.
   UWAGA: Aby zachować sterylność, upewnij się, że wszystkie przybory laboratoryjne i narzędzia chirurgiczne są sterylne.
4. Za pomocą nożyczek z cienką końcówką odkapsuluj jądra, wycinając szczelinę w osłonce białawej, grubym włóknistym arkuszu otaczającym jądro. Następnie rozerwij osłonkę za pomocą kleszczy. Wypchnij kanaliki, naciskając kleszczami i wyrzuć tunica.
   UWAGA: Podczas wyrzucania tuniki, korzystne może być usunięcie tętnicy jądra wraz z osłonką. Unikaj uszkodzenia kanalików nasiennych.
5. Przenieś kanaliki nasienne na nową szalkę Petriego i wlej tyle sterylnego PBS, aby pokryć dno szalki Petriego. Następnie delikatnie rozsuń kanaliki, ale unikaj ich uszkodzenia.
   UWAGA: Zbyt duże naprężenia mechaniczne wpłyną na wzór transiluminacji i wpłyną na żywotność tkanki i jej architekturę komórkową. Od tego momentu kanaliki mogą być również przetwarzane w celu barwienia immunologicznego całego wierzchowca bez oceny stopnia zaawansowania (3B). Czasami wystarczy retrospektywnie określić stopień zaawansowania poprzez włączenie przeciwciał przeciwko białkom ulegającym ekspresji w różnicujących spermatogoniach, takich jak SALL4, c-KIT i DNMT3A^18,23. Gęstość spermatogonii jest stosunkowo wiarygodnym wskaźnikiem stadium (Rysunek 2).

2. Mikrodysekcja wspomagana transiluminacją

1. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym, przyklejając ją taśmą do stolika.
   UWAGA: Ważne jest, aby dobrze przykleić szalkę Petriego, aby zapobiec jej ruchowi, który mógłby spowodować mieszanie się zebranych etapów segmentów kanalików nasiennych.
2. Aby ujawnić wzorzec absorpcji światła kanalików nasiennych znajdujących się pod ostrością, upewnij się, że próbka jest oświetlona od dołu, a światło przechodzi przez próbkę, tj. jest prześwietlona.
   UWAGA: Ilość światła pochłoniętego/rozproszonego jest zależna od poziomu kondensacji chromatyny w wydłużających się spermatydach i ich wiązaniu wewnątrz kanalika nasiennego: im bardziej zagęszczone, tym więcej światła jest pochłaniane, tj. wydaje się ciemniejsze.
3. Zapoznaj się ze wzorcem absorpcji światła na różnych etapach, zgodnie z opisem w Rysunek 2, Rysunek 5A i Rysunek S1, ostrożnie przesuwając wiązki kanalików za pomocą drobnych kleszczy.
   UWAGA: Etapy zawsze następują po sobie w logicznej kolejności, tworząc falę nabłonka nasiennego. Jednak ważne jest, aby wiedzieć, że kierunek fali spermatogennej czasami odwraca się, a następnie wraca z powrotem (znane również jako modulacje^4,9), czasami komplikując procedurę. Również długość każdego etapu, pod względem liczby mm kanalików, różni się znacznie.
4. Ostrożnie podnieś interesujący nas kanalik za pomocą kleszczy z haczykowatą końcówką, a następnie odetnij segment o odpowiedniej długości za pomocą nożyczek do mikrodysekcji (patrz film uzupełniający 1). Haczyk na końcu kleszczy ułatwia podnoszenie i trzymanie rurki oraz pomaga uniknąć jej ściskania.
   UWAGA: Długość segmentów do cięcia zależy od dalszych zastosowań. W przypadku zbioru połączonych fragmentów kanalików na określonym etapie do analizy białka lub RNA^12,13 (II–V, VII–VIII i IX–XI, Rysunek 5B) długość wynosi zwykle 2–5 mm. Gdy stosuje się standardową ekstrakcję fenolowo-chloroformową, z 1 mm kanalika można uzyskać około 200 ng RNA. W przypadku barwienia segmentów kanalików etapowych w całości długość segmentów powinna wynosić >5 mm. W przypadku preparatów do squasha długość segmentów nie powinna przekraczać 1–2 mm, ponieważ komórki w środku segmentu mogą nie wyjść, jeśli są zbyt długie. Użyj skali mm pod szalką Petriego, aby uzyskać dokładny pomiar długości kanalika.

3. Barwienie immunologiczne różnych preparatów

1. Przygotowanie dyni: weryfikacja etapu i barwienie immunologiczne
   UWAGA: Specyficzne dla etapu fragmenty kanalików można zgnieść na szkiełku mikroskopowym ze szkłem nakrywkowym w celu przeprowadzenia analizy morfologicznej żywych komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, a następnie barwienia immunologicznego. Zaleca się, aby początkujący korzystał z tego podejścia w celu sprawdzenia etapów podczas zapoznawania się z metodą mikrodysekcji wspomaganej transillumination.
   1. Zebrać wycinek w objętości 10 μl za pomocą pipety i przenieść go na szkiełko mikroskopowe.
   2. Zgnieć kanalik, ostrożnie umieszczając szklankę nakrywkową (20 mm x 20 mm) na kanaliku. W rezultacie komórki wypłyną z kanalika i utworzą monowarstwę żywych komórek. Umieść bibułę filtracyjną na krawędzi szkła nakrywkowego, aby ułatwić rozprowadzanie komórek. Unikaj zbytniego zgniatania komórek, aby utrzymać je przy życiu.
   3. Monitoruj rozprzestrzenianie się komórek pod mikroskopem. Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym przy 40-krotnym obiektywie, aby zweryfikować rozpoznawanie etapu, badając obecne typy komórek (Rysunek 2, Rysunek S2).
   4. Gdy komórki rozprzestrzenią się, tworząc okrągłą monowarstwę z obu końców kanalika, zanurz szkiełko w pojemniku zawierającym ciekły azot, trzymając go kleszczami. Trzymaj go zanurzonego przez 10 s. Alternatywnie umieść szkiełko na płycie z suchego lodu w celu zamrożenia.
   5. Zdejmij szkło nakrywkowe, odkręcając je za pomocą skalpela.
   6. Niezwłocznie przystąp do mocowania i szybko umieść szkiełko w pojemniku z 90% etanolem na 2–5 minut.
      UWAGA: Upewnij się, że preparat do squasha nie rozmraża się przed umieszczeniem go w 90% etanolu. Można również stosować inne utrwalacze, takie jak aceton, przez 10 minut.
   7. Suszyć na powietrzu i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) (do kilku dni) lub w temperaturze -80 °C (długotrwale).
   8. W celu barwienia immunologicznego próbki należy utrwalić w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   9. Płukać w PBS i przepuszczać 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 min.
   10. Opłucz w PBS i narysuj pierścień smarowy wokół każdej próbki dyni
   .
   11. Dodać 50–100 μl 10% BSA (albuminy surowicy bydlęcej) w 0,1% Tween in PBS (PBST) wewnątrz pierścienia smarowego i blokować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   12. Usunąć roztwór BSA i inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w 10% BSA w PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   13. Myć 3x przez 5 min z PBST.
   14. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 10% BSA w PBST.
       UWAGA: Aby wybarwić akrosomy, próbki można inkubować z przeciwciałem aglutyninowym Peanut znakowanym rodaminą (PNA, 1:1000) w 10% BSA w PBST przez 1 godzinę w RT (Rysunek S3) zamiast specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
   15. Przemyć 3x po 5 min PBST, spłukać PBS i zamontować za pomocą preparatu zawierającego DAPI.
2. Barwienie immunologiczne kanalików nasiennych w całości
   UWAGA: Poniższy protokół opisuje barwienie całego montażu dla etapowych (od kroku 2.4) segmentów kanalików. Jeśli badacz chce przeprowadzić barwienie całego montażu bez etapowania (od kroku 1.5), powinien zwrócić uwagę na uwagi w 3.2.1 i 3.2.7.
   1. Za pomocą pipety przenieś segmenty kanalików (z kroku 2.4) w lodowatym PBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść na lodzie.
      UWAGA: W przypadku stosowania kanalików niestopniowanych od 1,5 należy rozdzielić kanaliki na szalce Petriego, kilkakrotnie pipetując w górę i z powrotem na przechyloną szalkę. Użyj pipety o pojemności 1 ml z odciętą końcówką. Ten krok ma na celu otwarcie struktury tkanki. Należy jednak unikać zbyt intensywnego pipetowania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie kanalików. Sedymentacja kanalików potrwa kilkadziesiąt sekund. Małe fragmenty kanalików, komórki śródmiąższowe i szczątki komórkowe pozostają w supernatancie.
   2. Ostrożnie usunąć supernatant (SN) za pomocą pipetowania lub aspiratora. Dodaj 10 ml lodowatego PBS i wymieszaj przez odwrócenie.
   3. Pozostawić do osadu, a następnie usunąć SN jak poprzednio.
   4. Dodać 5 ml 4% PFA i utrwalać przez 5 godzin na stole obrotowym (20–30 obr./min) w temperaturze +4 °C.
      UWAGA: Czas wiązania zależy od interesujących białek i ich lokalizacji subkomórkowej. W przypadku białek jądrowych i cytoplazmatycznych zwykle wystarcza 2-godzinne wiązanie, jednak markery błonowe, takie jak GFRα1 (receptor rodziny GDNF alfa 1; Rysunek 6A,B), korzystaj z dłuższej fiksacji, do 6 godzin.
   5. Pozostawić do osadu, usunąć SN (PFA) jak poprzednio i krótko spłukać, dodając 10 ml PBS i odwracając probówkę.
   6. Pozostawić do osadu, usunąć SN jak poprzednio i powtórzyć etap mycia PBS trzy razy przez co najmniej 10 minut każdy na stole obrotowym w temperaturze +4 °C i kontynuować barwienie lub przechowywać w temperaturze +4 °C.
      UWAGA: Jeśli warunki pracy są sterylne i czyste, próbki mogą być przechowywane i używane przez co najmniej kilka tygodni. Alternatywnie, dodać azydek sodu do końcowego stężenia 0,02% (w/v) z 2% roztworu podstawowego, aby pomóc zachować kanaliki przed przechowywaniem w temperaturze +4 °C.
   7. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś 10–20 stałych segmentów kanalików do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml. Pozostawić do osadu i usunąć SN.
      UWAGA: W przypadku pracy z długimi kanalikami, które nie zostały zainscenizowane, wylej kanaliki na szalkę Petriego i za pomocą nożyczek do mikrodysekcji i kleszczy wytnij segmenty o wielkości około 5–20 mm. Zbyt długie segmenty będą się plątać podczas procedury barwienia, podczas gdy zbyt krótkie segmenty łatwo się zgubią.
   8. Dodaj 1 ml 2% BSA + 10% FBS (płodowa surowica bydlęca) w 0,3% Triton X-100 w PBS (PBSX). Blokuj przez co najmniej 1 godzinę na stole obrotowym (20–30 obr./min) przy RT.
   9. Przepłukać 1 ml PBSX, usunąć SN przez pipetowanie i dodać 250 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA w PBSX (rozcieńczenie 1:100–1:2000). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze +4 °C na stole obrotowym (20–30 obr./min).
   10. Usunąć roztwór przeciwciała za pomocą pipetowania i przepłukać kanaliki 1 ml PBSX, jak powyżej. Prać trzy razy przez 1 godzinę w PBSX na stole obrotowym (20–30 obr./min) w temperaturze RT.
       UWAGA: Po tym pierwszym praniu próbkę można pozostawić na noc w temperaturze +4 °C, jeśli to konieczne.
   11. Usunąć SN i dodać 250 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA w PBSX (zwykle rozcieńczenie 1:500 przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie). Przykryć folią i inkubować na stole obrotowym (20–30 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   12. Powtórzyć czynności 3.2.10.
   13. Na koniec usuń SN i wlej kanaliki do szkiełka mikroskopowego. Delikatnie oddziel i ułóż kanaliki w paski liniowe za pomocą końcówek ładujących żel. Odcedź nadmiar bufora i dodaj podłoże montażowe oraz szkiełko nakrywkowe.
       UWAGA: Unikaj wysuszania kanalików podczas ich układania. Barwienie przeciwstawne jąder za pomocą DAPI nie jest konieczne w większości przypadków. Uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu i zniszczeniu próbki. Preparaty można przechowywać przez 1–2 tygodnie w temperaturze +4 °C przed obrazowaniem.

Wyniki

Udana inscenizacja i mikrodysekcja kanalików nasiennych myszy wspomagana transilluminacją zależy przede wszystkim od znalezienia odpowiednich warunków oświetleniowych i odpowiedniego mikroskopu preparacyjnego oraz umiejętności rozpoznania specyficznych cech, które charakteryzują każdy etap. Etapy VII-VIII wydają się jednorodnie ciemne, ponieważ zawierają dużą liczbę w pełni skondensowanych, wydłużających się spermatydów, które są ustawione na wierzchołkowej powierzchni nabłonka (Rysunek 5A i Rysunek S1). Po uwolnieniu dojrzałych plemników do światła podczas spermacji, kanalik wydaje się bardzo blady w stadiach IX–XI z powodu braku skondensowanych, wydłużających się plemników w nabłonku. Najłatwiejszą do zidentyfikowania cechą na prześwietlanych kanalikach jest punkt spermii (gwiazdka w Ryc. 5A i Ryc. S1), czyli nagłe przejście ze strefy ciemnej (VII–VIII) do strefy bladej (IX–XI). Po strefie bladej następuje strefa słabego punktu (XII–I). Nierówny wygląd wynika z organizacji wydłużających się plemników ze skondensowaną chromatyną w wiązkach. Pęczki stają się bardzo widoczne w następującej strefie silnych plam (II–V). Ponadto wiązki spermatydów migrują w kierunku jąder komórek Sertoliego, które znajdują się blisko blaszki podstawnej, co po transoświetlenia jest odzwierciedlane jako prążkowany wygląd kanalika stadium II-V (Rysunek 2, Rysunek 5A, B i Rysunek S1). Pęczki ostatecznie rozpraszają się w stadium VI, a kondensujące się, wydłużające się plemniki przemieszczają się w pobliżu światła, aby zostać uwolnione z nabłonka w stadium VIII.

Dokładny etap segmentu kanalika można dokładnie zweryfikować za pomocą mikroskopii kontrastowej fazowej preparatów do squasha (Rysunek 2 i Rysunek S2). Specyficzne etapy w preparatach do squasha są rozpoznawane na podstawie akrosomalnego rozwoju okrągłych spermatyd etapu 1–8, stanu kondensacji chromatyny w wydłużających się spermatydach oraz obecności wiązek spermatydów¹⁶ (Rysunek 3 i Rysunek S2). Ponadto obecność wcześniejszych typów komórek, takich jak spermatogonia typu B i spermatocyty leptotenowe lub zygotenowe, które można rozpoznać na podstawie ich cech morfologicznych, może być wykorzystana do wsparcia rozpoznawania stadiów. Wielkość jąder spermatocytów pachytenu zwiększa się około etapu VI, co może również stanowić dodatkową pomoc w ocenie stopnia zaawansowania.

Etapowe preparaty do squasha mogą być używane do badania ekspresji i lokalizacji interesujących białek w nabłonku nasiennym za pomocą barwienia immunologicznego. Pozwala to na bardzo dokładną analizę ekspresji specyficznej dla typu komórki ze względu na dobrze zdefiniowany skład komórkowy na każdym etapie. Ekspresja specyficzna dla danego etapu może być dodatkowo wzmocniona przez współbarwienie akrosomu (np. za pomocą PNA), co umożliwia wizualizację odrębnych etapów różnicowania okrągłych spermatydów. Reprezentatywne obrazy akrosomów barwionych PNA w różnych stadiach przedstawiono na rysunku S3. Barwienie akrosomalne może być również wykorzystane do retrospektywnego zdefiniowania etapu. Inscenizacja wspomagana transiluminacją jest jednak znacznie łatwiejszą i szybszą metodą na odnalezienie pożądanego etapu niż przypadkowe wykorzystanie niezainscenizowanych fragmentów.

Barwienie całych kanalików nasiennych jest zazwyczaj używane do badania typów komórek, które stykają się z błoną podstawną nabłonka nasiennego, albo po stronie kanalików (spermatogonia, spermatocyty preleptotenowe i komórki Sertoliego; Rysunek 6A,B) lub strona śródmiąższowa (okołokanalikowe komórki mięśniowe i makrofagi okołokanalikowate; Rysunek 6C i Rysunek S4A)²⁴. Jednak metoda ta może być również stosowana do badania komórek lub struktur znajdujących się głębiej w nabłonku, takich jak bariera krew-jądro (Espin, ryc. S4B) lub postmejotyczne komórki rozrodcze (marker akrosomów PNA, ryc. S4C). W przypadku stosowania nieetapizowanych segmentów kanalików możliwe jest retrospektywne oszacowanie danego etapu przy użyciu przeciwciała przeciwko białku, które ulega ekspresji w różnicującej spermatogonii (A1, A2, A3, A4, In i B; łącznie A_diff) (Rysunek 2). Klasyfikacja składowania opiera się następnie na gęstości syncytialnej_różnicy A, która przechodzi sześć podziałów mitotycznych w sposób zależny od etapu podczas pierwszego cyklu różnicowania plemników¹, podwajając w ten sposób liczbę spermatogonii_{A diff} w syncytii po każdym podziale^1,25. Jednak klasyfikacja retrospektywna jest mniej dokładna niż ocena stopnia zaawansowania wspomagana transoświetleniem, ponieważ nie ma specyficznych markerów dla różnych generacji_różnicy A, a ocena gęstości_różnicy A może być podatna na błędy.

Rycina 1: Mapa cyklu nabłonka nasiennego do oceny stopnia zaawansowania spermatogenezy myszy. Pionowe kolumny pokazują asocjacje komórek na różnych etapach cyklu nabłonkowego nasiennika (oznaczone cyframi rzymskimi I–XII). Najbardziej niedojrzałe komórki rozrodcze znajdują się na dole, podczas gdy najbardziej zróżnicowane znajdują się na górze. Aby śledzić postęp różnicowania się komórek rozrodczych, należy poruszać się od lewej do prawej i od dołu do góry. Cykl nabłonka nasiennego to kompletna seria etapów, które następują po sobie w kolejności numerycznej. _{Niezróżnicowana} spermatogonia; A1–4, spermatogonia typu A1–A4; W, spermatogonia pośrednia; B, spermatogonia typu B; Pl, spermatocyty preleptotenowe; L, spermatocyty leptotenu; Z, spermatocyty zygotenowe; P, spermatocyty pachytenowe; D, spermatocyty diplotenowe; 2°, spermatocyty wtórne plus podziały mejotyczne. Cyfry arabskie 1-16 odnoszą się do etapów dojrzewania spermatyd po mejocie (spermiogenezy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Asocjacje komórkowe na etapach cyklu nabłonka nasiennego myszy. Etapy cyklu nabłonka nasiennego następują po sobie w logicznej kolejności, a tym samym tworzą falę spermatogenną wzdłuż osi podłużnej kanalika nasiennego. Górny panel ilustruje asocjacje komórek rozrodczych na różnych etapach oraz lokalizację typów komórek w kieszeniach cytoplazmatycznych komórek Sertoliego (jasnoszarych) w nabłonku nasiennym. Ilustracja kanalika nasiennego wizualizuje falę spermatogenną i specyficzne wzorce transoświetlenia bladego, słabego punktu, silnego punktu i ciemnych stref. Z każdego wskazanego etapu pokazane są reprezentatywne obrazy z kontrastem fazowym żywej komórki preparatów do squasha oraz przekroje poprzeczne jąder barwionych kwasem okresowym Schiffa (PAS). Dolne dwa panele pokazują segmenty kanalika nasiennego po transiluminacji (na górze) lub barwieniu przeciwciałami (na dole) przeciwko SALL4 (czerwony, marker pan-spermatogonialny) i DNMT3A (zielony, marker_różnicowy A). Wzory transiluminacji dla etapów IX-XI, XII i VI są wyróżnione obszarami ramkowymi. Zarówno wzorzec absorpcji światła (na górze), jak i gęstość spermatogonii różnicującej DNMT3A-dodatniej (na dole) można wykorzystać do określenia (przybliżonego) etapu cyklu nasiennego. Kolejne generacje_{A diff} są określane jako spermatogonia typu A1–A4, pośrednia (In) i typu B. Podział każdego z nich powoduje podwojenie gęstości komórek spermatogonialnych. Największą gęstość komórek na błonie podstawnej nabłonka nasiennego obserwuje się w stadiach VI–VIII, gdy obserwuje się mejotyczne spermatocyty preleptotenu (Pl). Podziałka skali: przygotowanie do squasha 10 μm, inne 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Etapy spermiogenezy. Charakterystyczne cechy spermatyd na różnych etapach spermiogenezy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przebieg pracy w tym badaniu. Wzorzec transiluminacji został w pełni ustalony u dorosłej (>8-tygodniowej) myszy. Poświęć mysz i niezwłocznie przystąp do sekcji jąder i dekapsulacji. Delikatnie rozsuń kanaliki na szalce Petriego. Zamocuj kanaliki do barwienia całego montażu lub przystąp do transoświetlenia. Pod wpływem oświetlenia 1) należy odciąć krótkie segmenty kanalików o określonym stadium (etapach) dla preparatów do squasha (kontrola jakości lub barwienie immunologiczne) lub 2) przeciąć dłuższe segmenty w celu zebrania puli etapów do analiz RNA i proteomicznych, hodowli tkankowych lub barwienia w całości. Przenieść krótkie segmenty kanalików na szkiełko mikroskopowe w objętości 10 μl PBS. Umieść szkiełko nakrywkowe na segmencie, aby wypchnąć komórki i utworzyć monowarstwę żywej komórki. Obserwuj typy komórek pod mikroskopem, a następnie utrwal i wybarwij. WMS, barwienie całomocne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Kanalik nasienny dorosłej myszy widziany pod mikroskopem transillumination. (A) Długi odcinek kanalika nasiennego widziany w świetle transilluminacji, ukazujący falę nabłonka nasiennego. Na podstawie zagęszczenia chromatyny w spermatydach i ich lokalizacji w nabłonku można wyróżnić cztery odrębne strefy: ciemna strefa (etapy VII–VIII), blada strefa (etapy IX–XI), strefa słabej plamki (staże XII–I) i strefa silnej plamki (staże II–VI). Gwiazdka, punkt spermienia. Strzałki wskazują dwa krótkie segmenty w strefie słabego punktu, które mają blady wygląd z powodu naprężeń mechanicznych na kanaliku. Podziałka: 500 μm. Wstawki 1–5 to większe powiększenia z wybranych segmentów kanalików. (B) Połączone segmenty kanalików nasiennych reprezentujące stadia II–V (strefa silnej plamy), VII–VIII (strefa ciemna) i IX–XI (strefa blada). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Barwienie immunologiczne w całości przy użyciu markerów spermatogonialnych, komórek Sertoliego i makrofagów okołokanalikowych. (A) Barwienie całością dla segmentu reprezentującego stadium XI-II przeciwciałami przeciwko GFRα1 (czerwony), SALL4 (zielony) i DNMT3B (niebieski). Barwienie ujawnia trzy odrębne populacje spermatogonii: pojedynczo izolowane (A_s) lub sparowane (A_pr) niezróżnicowane spermatogonie macierzyste (GFRα1⁺/SALL4⁺/DNMT3B^-; białe kropkowane obszary), krótkie syncytialne (tutaj 4 wyrównane komórki; A_al4) spermatogonia progenitorowa (GFRα1^-/SALL4⁺/DNMT3B^-; żółte kropkowane obszary) i różnicująca spermatogonia (GFRα1^-/SALL4⁺/DNMT3B⁺). Komórki SALL4 ⁺ / DNMT3B ⁺ są spermatogonią typu A3–A4. (B) Barwienie całych kanalików nasiennych przeciwciałami przeciwko GFRα1 (czerwony), USF1 (zielony) i SOX9 (niebieski). GFRα1 barwi podzbiór łodygi spermatogonii. USF1 ulega ekspresji zarówno przez spermatogonię, jak i komórki Sertoliego SOX9⁺. (C) Makrofagi okołokanalikowe u dorosłych myszy są dodatnie zarówno dla F4 / 80 (czerwony), jak i MHCII (niebieski). DAPI barwi DNA (na zielono). Jasne duże jądra to okołorurkowe jądra komórek mięśniowych. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek S1: Długi odcinek kanalika nasiennego widziany w świetle transiluminacji, ukazujący falę nabłonka nasiennego. Na podstawie zagęszczenia chromatyny w spermatydach i ich lokalizacji w nabłonku można wyróżnić cztery odrębne strefy: strefa słabej plamki (etapy XII–I), strefa silnej plamki (staże II–VI), strefa ciemna (stadia VII–VIII) i strefa blada (staże IX–XI). Punkt spermiacji (gwiazdka) można rozpoznać, gdy ciemna strefa nagle przechodzi w bladą strefę. Podziałka: 500 μm. Wstawki 1–4 to większe powiększenia z wybranych segmentów kanalików. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek S2: Mikroskopia z kontrastem fazowym monowarstw żywych komórek na różnych etapach cyklu nabłonka nasiennego. (A) Etap I. Etap 1 okrągłe spermatydy nadal nie mają struktury akrosomalnej. Charakteryzują się małym okrągłym jądrem (czerwone kółka) z charakterystycznym pojedynczym chromocentrum (białe strzałki). Ciało chromatoidu jest widoczne w cytoplazmie jako ciemna granulka w bliskim kontakcie z błoną jądrową (niebieskie strzałki). Jądro komórkowe Sertoliego (białe kółko) zawiera trzy ciemne ogniska: duże jąderko z dwoma satelitarnymi chromocentrami. Komórki Sertoliego są rzadko spotykane w preparatach do squasha, ale czasami wypływają z kanalika wraz z komórkami rozrodczymi. (b) Etap II–IV. W kroku 4 okrągłe spermatydy (czerwone kółka) struktura akrosomalna (czerwone strzałki) pojawia się jako biały, lekko spłaszczony pęcherzyk przyczepiony do otoczki jądrowej. Wydłużające się plemniki tworzą wiązki i mają już grubą wić (białe strzałki) wskazującą na obecność osłonki mitochondrialnej w środkowej części ogona plemnika. Jądra spermatocytów pachytenowych (PSpc) są mniej więcej dwa razy większe niż jądra okrągłych spermatyd i charakteryzują się ciemnymi obszarami chromatyny rozmieszczonymi w całym jądrze. c) Etap V–VI. W kroku 5–6 okrągłe spermatydy (czerwone kółko) akrosom jest dalej spłaszczony i rozprzestrzenia się po jądrze (czerwone strzałki). Obszar otoczki jądrowej skierowany w stronę akrosomu wydaje się ciemny z powodu obecności akrolaksomu, bogatej w białko płytki między błoną akrosomalną a błoną jądrową. Wydłużające się plemniki są uwalniane z wiązek (białe strzałki). W nabłonku często obserwuje się spermatocyty pachytenowe (PSpc). (D) Etap VII-VIII. Akrosom (czerwone strzałki), ciemna wyściółka na otoczce jądrowej z białymi cieniami, jest w pełni rozciągnięta i obejmuje prawie całą wierzchołkową stronę okrągłych spermatyd kroku 7-8 (czerwone kółka). Ten etap charakteryzuje się dojrzałymi spermatydami (białymi strzałkami), które mogą być obfite w wielu częściach preparatu do squasha. Jądro spermatocytów pachytenowych (PSpc) powiększa się podczas rozwoju i wydaje się większe w stadium VII–VIII niż w poprzednich stadiach. Ciemne obszary chromatyny wewnątrz jądra spermatocytów pachytenowych (PSpc) wydają się rozmyte z powodu wysokiej aktywności transkrypcyjnej i zdarzeń mejotycznych. (E) Etap X. Krok 10 jądra plemników (białe strzałki) zainicjowały wydłużenie, ale chromatyna jeszcze się nie zagęściła. Akrosomy zaczynają tworzyć haczyk na końcu jądra (czerwona strzałka). Jądra spermatocytów pachytenowych (PSpc) wydają się bardzo duże, ponieważ przygotowują się do podziałów mejotycznych. (F) Etap XII. Etap XII charakteryzuje się obecnością mejotycznych płytek metafazowych (białe przerywane kółka). Małe okrągłe komórki o typowym skondensowanym wzorze chromatyny to spermatocyty zygotenowe (ZSpc), w których siostrzane chromosomy ustawiają się, aby zainicjować tworzenie kompleksu synaptonemalnego. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek S3: Identyfikacja etapu cyklu nabłonkowego nasienia na podstawie barwienia akrosomalnego i jądrowego. Preparaty do squasha utrwalone acetonem barwiono PNA i DAPI sprzężonymi z rodaminą. Etap I: Podczas gdy w okrągłych spermatydach kroku 1 nie ma akrosomu, w pełni rozwinięty akrosom można wykryć w wydłużających się spermatydach. Etapy II–IV: Rozwój akrosomalny rozpoczyna się wraz z pojawieniem się granulek proakrosomalnych/akrosomalnych w okrągłych spermatydach. Pęcherzyk akrosomalny na powierzchni jądra wydaje się okrągły do spermatyd etapu 3, a następnie spłaszcza się w kroku 4 spermatydów. Etap V: Kąt, do którego dąży akrosom, rozciąga się od 40 stopni do maksymalnie 95°. Etapy VI–VII: Kąt nadążany przez akrosom rozciąga się od 95 stopni do 120 stopni. Etapy VIII-IX: Akrosom jest w pełni wydłużony w spermatydach kroku 8 (etap VIII), a jądra polaryzują się po wierzchołkowej stronie komórki, stykając się z błoną plazmatyczną (nie pokazano). W stadium IX jądro plemników ulega deformacji; Najpierw widoczne są powierzchnie grzbietowe i brzuszne. Etapy X-XI: Plemniki pokazują kąt grzbietowy. Etap XII: Ten etap najlepiej charakteryzuje się pojawieniem się podziałów mejotycznych; Płytki metafazowe są oznaczone białymi strzałkami. Widoczne są również wydłużające się plemniki z ich akrosomami. Podziałka skali: 10μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek S4: Barwienie całego mocowania dla niekonwencjonalnych markerów. (A) Aktyna alfa mięśni gładkich (aSMA) ulega ekspresji przez okołokanalikowe komórki mięśniowe. (B) Espin lokalizuje się w ścisłych połączeniach komórek Sertoliego i przyczynia się do bariery krew-jądro. (C) PNA lokalizuje się w akrosomach plemników. Paski skali: 50μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dodatkowe wideo 1: Przecinanie krótkiego odcinka kanalika nasiennego reprezentującego etap VII-VIII. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Opisana powyżej metoda mikrodysekcji wspomagana transillumination umożliwia podejście zorientowane na etap do badania spermatogenezy. Spermatogeneza jest procesem wysoce zsynchronizowanym, a wszystkie kluczowe etapy różnicowania plemników są regulowane i wykonywane w sposób zależny od etapu, takie jak zaangażowanie w różnicowanie (na etapach VII-VIII), początek mejozy (VII-VIII), podziały mejotyczne (XII), początek wydłużania spermatyd (VIII) i spermiacja (VIII)^1,26,27. Analiza zorientowana na etap stanowi potężne narzędzie do badania tych szczególnych zdarzeń, które są ograniczone do określonych etapów spermatogenezy, a zatem występują tylko na określonych etapach cyklu nabłonka nasiennego. Opanowanie metody wymaga pewnej wprawy, a kluczem do sukcesu jest użycie dobrej jakości mikroskopu preparacyjnego i odpowiednie warunki oświetleniowe. Wdrożenie tej metody jako części codziennego zestawu narzędzi może znacznie poprawić wpływ i biologiczne znaczenie badań nad męskimi funkcjami rozrodczymi, umożliwiając dokładniejszą analizę zdarzeń molekularnych podczas spermatogenezy.

Wszystkie badane przez nas szczepy myszy WT wykazują podobny wzór transiluminacji i wykazują konserwatywne asocjacje komórkowe na etapach cyklu nabłonka nasiennego. Pod warunkiem, że spermiogenne różnicowanie komórek rozrodczych nie różni się rażąco od myszy WT, to samo dotyczy wszystkich badanych przez nas modeli myszy z nokautem. Ponadto można go zastosować do innych gatunków, które wykazują podłużny segmentowy układ etapów cyklu nabłonka nasiennego⁷. Nie można jednak wykorzystywać gatunków o stadiach niesegmentowych (takich jak człowiek). Biorąc pod uwagę zasadniczą rolę kondensacji chromatyny w wydłużaniu spermatyd w definiowaniu wzorca transiluminacji, jasne jest, że jakakolwiek nieregulacja tego procesu nieuchronnie wpłynie na wdrożenie tej metody. U młodych myszy i młodych dorosłych (5-6 tygodni) wzorzec transiluminacji nie został jeszcze w pełni ustalony, dlatego należy stosować tylko myszy starsze niż 8 tygodni. Ważne jest również, aby pamiętać, że ściskanie i ciągnięcie kanalików nieuchronnie wpłynie na wzór transiluminacji, ponieważ zniekształca architekturę komórkową w nabłonku nasiennym.

Izolowane segmenty kanalików nasiennych mogą być również hodowane, co umożliwia obserwację ex vivo i manipulację procesami sprzężonymi ze spermatogenezą, w tym mejozą. Aby zapewnić żywotność tkanki i zapobiec degradacji RNA i białek, próbki powinny być pobierane i przetwarzane nie później niż 2 godziny po poświęceniu myszy. W przypadku hodowli kanalików nasiennych ex vivo czas od złożenia ofiary do rozpoczęcia hodowli nie powinien przekraczać 1 godziny. Integralność fragmentów kanalików może być zazwyczaj utrzymana do 72 godzin in vitro , jeśli zostaną prawidłowo pobrane.

Etap cyklu nabłonka nasiennego można zweryfikować i jeszcze dokładniej określić za pomocą mikrokopii preparatów do squasha z kontrastem fazowym¹⁶. Mikroskopia jest wykonywana na żywych komórkach, co nadaje dodatkowy wymiar analizie i umożliwia obserwację ruchów organelli lub komórek w określonych stadiach spermatogenezy 28,29,30. Mikroskopia z kontrastem fazowym zapewnia dokładną ocenę stopnia zaawansowania dla późniejszego barwienia immunologicznego, co umożliwia bardzo szczegółową analizę dynamiki ekspresji i lokalizacji białek podczas spermatogenezy, w tym zmian specyficznych dla danego etapu.

Podczas gdy komórki są uwalniane z kontekstu nabłonkowego w preparatach do squasha, barwienie immunologiczne całych odcinków kanalików umożliwia badanie komórek plemnikotwórczych w ich środowisku fizjologicznym. W związku z tym preparaty typu whole-mount mogą zapewnić lepszą wizualizację architektury kanalików nasiennych i ich kontaktów międzykomórkowych niż barwienie immunologiczne na przekrojach poprzecznych. Co ważne, wspomagana transilluminacją ocena stopnia zaawansowania segmentów kanalików przed barwieniem immunologicznym sprawia, że podejście to jest jeszcze bardziej skuteczne, ponieważ zawiera informacje na temat konkretnego etapu danego segmentu. Barwienie w całości jest szczególnie przydatnym narzędziem do badania komórek na obrzeżach kanalików nasiennych, takich jak okołokanalikowe komórki mięśniowe, makrofagi okołokanalikowe i spermatogonia, ale może również otworzyć nowe spojrzenie na badania nad mejotykami i postmejotycznymi komórkami rozrodczymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A9647
szkło nakrywkowe 20x20 mm	Menzel Glä ser	11961988
Falcon stożkowa probówka 15 ml	Sarstedt	62.554.502
płodowa surowica bydlęca (FBS)	Smarowicz Biowest	S1810
(ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000
Superfrost Plus	Thermo Scientific	22-037-246
Parafinaldehyd parafolowy (PFA)	Mikroskopia elektronowa Nauki	15714
Szalka Petriego (100 mm)	Greiner	664160
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco	11503387
ProLong Diamentowy uchwyt zapobiegający blaknięciu	Thermo Fisher	P36962
aglutynina orzechowa (PNA) znakowana rodaminąVector	Laboratories	RL-1072
Triton X-100	Sigma	93443
Tween-20	Sigma	P2287