Artykuł metodologiczny

Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61800

⸱

7 października 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedicine, Integrative Physiology and Pharmacology Unit, University of Turku, Turku, Finland, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, Turku, Finland, 3Centre for Reproductive Health, Hudson Institute of Medical Research, Melbourne, VIC 3168, Australia, 4Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, Melbourne, VIC 3800, Australia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wspomaganą transiluminacją mikrodysekcję segmentów kanalików nasiennych dorosłych myszy reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasienia i typy komórek w nim, a następnie barwienie immunologiczne preparatów dyni i nienaruszonych segmentów kanalików.

Streszczenie

Spermatogeneza to unikalny proces różnicowania, który ostatecznie prowadzi do powstania jednego z najbardziej charakterystycznych typów komórek w organizmie, plemników. Różnicowanie komórek rozrodczych zachodzi w kieszeniach cytoplazmatycznych somatycznych komórek Sertoliego, w których jednocześnie znajduje się od 4 do 5 pokoleń komórek rozrodczych oraz koordynują i synchronizują ich rozwój. Dlatego skład typów komórek rozrodczych w przekroju poprzecznym jest stały, a te asocjacje komórkowe są również znane jako etapy (I–XII) cyklu nabłonka nasiennego. Co ważne, stadia można również zidentyfikować na podstawie nienaruszonych kanalików nasiennych na podstawie ich zróżnicowanej charakterystyki absorpcji/rozpraszania światła ujawnionej przez transoświetlenie oraz faktu, że stadia następują po sobie wzdłuż kanalika w kolejności numerycznej. W artykule opisano metodę mikrodysekcji wspomaganą transilluminacją do izolacji segmentów kanalików nasiennych reprezentujących określone etapy cyklu nabłonka nasiennego myszy. Wzór absorpcji światła w kanalikach nasiennych jest najpierw badany pod mikroskopem preparacyjnym, a następnie segmenty kanalików reprezentujące określone etapy są wycinane i wykorzystywane do dalszych zastosowań. W tym miejscu opisujemy protokoły barwienia immunologicznego dla specyficznych dla etapu preparatów do squasha i dla nienaruszonych segmentów kanalików. Metoda ta pozwala badaczowi skupić się na zdarzeniach biologicznych zachodzących w określonych fazach spermatogenezy, zapewniając w ten sposób unikalne narzędzie do rozwojowych, toksykologicznych i cytologicznych badań spermatogenezy i leżących u jej podstaw mechanizmów molekularnych.

Wprowadzenie

Różnicowanie męskich komórek rozrodczych od plemników diploidalnych do dojrzałych plemników haploidalnych, tj. spermatogeneza, to złożony proces, który zachodzi w nabłonku kanalików nasiennych w jądrach dojrzałego płciowo osobnika1. Mitotyczni potomkowie spermatogonii A1 najpierw dzielą się pięciokrotnie, aby rozszerzyć populację zaangażowaną w różnicowanie, a następnie wchodzą w mejozę jako spermatocyty, które ostatecznie dają początek haploidalnym plemnidom. Różnicowanie okrągłych plemników w plemniki, czyli spermiogeneza, obejmuje złożone zmiany w morfologii komórki, w tym zagęszczenie jąder i budowę struktur specyficznych dla plemników, takich jak akrosom i wici. U myszy cały proces spermatogenezy trwa 35 dni2,3.

W dowolnym miejscu, nabłonek nasienny zawiera do pięciu kohort różnicujących się komórek rozrodczych plus komórki macierzyste/progenitorowe linii zarodkowej oraz somatyczne komórki Sertoliego1. Różnicujące się komórki rozrodcze tworzą koncentryczne warstwy, których skład jest przewidywalny, a komórki haploidalne na danym etapie rozwoju zawsze kojarzą się z określonymi typami spermatocytów i spermatogonii4,5. Dlatego każdy przekrój kanalika zawiera kohorty komórek rozrodczych o stałym składzie. Te specyficzne asocjacje komórkowe definiuje się jako etapy nabłonka nasiennego. Etapy same w sobie nie prezentują stanów przypominających stagnację punktów kontrolnych, ale stale rozwijają się wraz z postępem różnicowania kohort komórek rozrodczych w synchronizacji1,2,6. U myszy istnieje 12 etapów (I-XII)2, które są ułożone w sposób segmentowy wzdłuż osi podłużnej kanalika nasiennego i następują po sobie w logicznej kolejności, tworząc w ten sposób falę nabłonka nasiennego lub falę spermatologiczną7,8,9 (Rysunek 1). Zakończenie spermatogenezy trwa cztery cykle, a hierarchiczne warstwy lub kohorty różnicujących się komórek rozrodczych w obrębie dowolnego przekroju kanalików nasiennych są czasowo oddalone od siebie o jeden cykl nasienny. Długość cyklu jest zależna od gatunku i u myszy każdy cykl trwa 8,6 dnia10.

Etapy można zidentyfikować na podstawie składu komórkowego i organizacji nabłonka nasiennego na histologicznych odcinkach jąder5 (Rysunek 1 i Rysunek 2). Jednak analiza histologiczna jest pracochłonna, czasochłonna i wymaga utrwalenia i barwienia, dlatego nie można jej zastosować do żywej tkanki. Co ważne, ocenę stopnia zaawansowania można również przeprowadzić na żywej tkance pod mikroskopem preparacyjnym, wykorzystując wyraźne wzorce absorpcji/rozproszenia światła wykazywane na różnych etapach cyklu (Rysunek 2). Zdolność każdego etapu do pochłaniania i rozpraszania światła jest zależna od poziomu kondensacji chromatyny późnych post-mejotycznych spermatydów, które są gospodarzami na danym etapie, oraz od upakowania tych komórek w wiązki7,11. Różnicowanie spermatydów, tj. spermiogeneza, jest dalej podzielone na 16 etapów rozwoju, w tym 8 etapów różnicowania plemników okrągłych (kroki 1-8) i 8 etapów różnicowania plemników wydłużających (kroki 9-16) (Rysunek 1). Krok 9-11 wydłużające się spermatydy (stadium IX-XI) wykazują tylko niski poziom kondensacji chromatyny, co skutkuje małą ilością pochłaniania światła. Kondensacja chromatyny rozpoczyna się w kroku 11 spermatydy (etap XI), a w kroku 15-16 wydłużające się spermatydy (stadium IV-VIII) zawierają w pełni skondensowaną chromatynę, a zatem wykazują maksymalną absorpcję światła (Rysunek 3). Chromatyna musi zostać skondensowana, aby była szczelnie upakowana w główce nasienia. Dodatkowymi czynnikami, które przyczyniają się do wzorca absorpcji światła, są lokalizacja wydłużających się spermatyd w nabłonku (podstawa vs. wierzchołkowa) oraz wiązanie wydłużających się spermatyd (wymawiane w stadiach II-V)11 (Ryc. 3). Wiązki są widoczne jako plamki w środku kanalików i jako paski na krawędziach pod mikroskopem preparacyjnym, a im bardziej skondensowana chromatyna, tym ciemniejsza plama/pasek11.

Ten artykuł opisuje użycie metody mikrodysekcji wspomaganej transillumination do izolacji segmentów kanalików nasiennych reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasiennego. Po wyizolowaniu, etapowe segmenty kanalików mogą być poddawane różnym dalszym analizom, w tym biochemicznym analizom RNA i białkom12,13,14,15, cytometria przepływowa16, hodowla kanalików ex vivo17 i immunostaining18. W tym miejscu udostępniamy również szczegółowe protokoły dalszego przetwarzania w celu przygotowania zgniecionych monowarstw etapowych segmentów kanalików do analizy morfologicznej żywych komórek i późniejszego barwienia immunologicznego, a także barwienia immunologicznego segmentów kanalików w całości. Przepływ pracy w pigułce jest opisany w Rysunek 4.

Metoda mikrodysekcji wspomagana transillumination pozwala na dokładną identyfikację i izolację komórek rozrodczych na określonych etapach różnicowania dzięki zsynchronizowanemu składowi komórkowemu etapów. Co ważne, umożliwia również badanie zdarzeń zależnych od stadium podczas spermatogenezy na żywej tkance. Biorąc pod uwagę brak skalowalnych modeli spermatogenezy in vitro, metoda ta ma również wyjątkową zaletę, ponieważ umożliwia ukierunkowane krótkoterminowe badania rozwojowe i toksykologiczne na specyficznych dla danego stadium segmentach kanalików ex vivo12,17. Chociaż opisujemy tutaj metodę dla myszy, tę samą procedurę można zastosować do dowolnego gatunku ssaków z podłużnym i segmentowym układem etapów nabłonka nasiennego, takich jak rat4,7,15,19,20.

Protokół

Utrzymanie myszy laboratoryjnych i wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie w Turku.

1. Przygotowanie kanalików nasiennych do mikrodysekcji

  1. Uśmierc dorosłego samca myszy (≥8 tygodni, jądro 80–120 mg w zależności od szczepu i wieku) poprzez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: Mysz powinna być dojrzała płciowo, a najlepiej mieć co najmniej 8 tygodni. Wzorzec transiluminacji u młodocianych myszy różni się od dorosłego, ponieważ fala nabłonka nasiennego nie została jeszcze w pełni ustalona, a czas pierwszej fali spermatogenezy jest inny21,22. Brak wydłużających się plemników u <4-tygodniowych samców myszy wyklucza ich zastosowanie do mikrodysekcji wspomaganej transilluminacją. Można stosować wszystkie szczepy myszy, które mają prawidłową spermatogenezę.
  2. Spryskaj brzuszną część brzucha 70% etanolem. Otwórz jamę brzuszno-miedniczną za pomocą sterylnych nożyczek, tworząc otwór w kształcie litery V.
  3. Ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową najądrza sterylnymi kleszkami, zlokalizuj jądra, wypreparuj je nożyczkami i umieść na sterylnej 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej PBS.
    UWAGA: Aby zachować sterylność, upewnij się, że wszystkie przybory laboratoryjne i narzędzia chirurgiczne są sterylne.
  4. Za pomocą nożyczek z cienką końcówką odkapsuluj jądra, wycinając szczelinę w osłonce białawej, grubym włóknistym arkuszu otaczającym jądro. Następnie rozerwij osłonkę za pomocą kleszczy. Wypchnij kanaliki, naciskając kleszczami i wyrzuć tunica.
    UWAGA: Podczas wyrzucania tuniki, korzystne może być usunięcie tętnicy jądra wraz z osłonką. Unikaj uszkodzenia kanalików nasiennych.
  5. Przenieś kanaliki nasienne na nową szalkę Petriego i wlej tyle sterylnego PBS, aby pokryć dno szalki Petriego. Następnie delikatnie rozsuń kanaliki, ale unikaj ich uszkodzenia.
    UWAGA: Zbyt duże naprężenia mechaniczne wpłyną na wzór transiluminacji i wpłyną na żywotność tkanki i jej architekturę komórkową. Od tego momentu kanaliki mogą być również przetwarzane w celu barwienia immunologicznego całego wierzchowca bez oceny stopnia zaawansowania (3B). Czasami wystarczy retrospektywnie określić stopień zaawansowania poprzez włączenie przeciwciał przeciwko białkom ulegającym ekspresji w różnicujących spermatogoniach, takich jak SALL4, c-KIT i DNMT3A18,23. Gęstość spermatogonii jest stosunkowo wiarygodnym wskaźnikiem stadium (Rysunek 2).

2. Mikrodysekcja wspomagana transiluminacją

  1. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym, przyklejając ją taśmą do stolika.
    UWAGA: Ważne jest, aby dobrze przykleić szalkę Petriego, aby zapobiec jej ruchowi, który mógłby spowodować mieszanie się zebranych etapów segmentów kanalików nasiennych.
  2. Aby ujawnić wzorzec absorpcji światła kanalików nasiennych znajdujących się pod ostrością, upewnij się, że próbka jest oświetlona od dołu, a światło przechodzi przez próbkę, tj. jest prześwietlona.
    UWAGA: Ilość światła pochłoniętego/rozproszonego jest zależna od poziomu kondensacji chromatyny w wydłużających się spermatydach i ich wiązaniu wewnątrz kanalika nasiennego: im bardziej zagęszczone, tym więcej światła jest pochłaniane, tj. wydaje się ciemniejsze.
  3. Zapoznaj się ze wzorcem absorpcji światła na różnych etapach, zgodnie z opisem w Rysunek 2, Rysunek 5A i Rysunek S1, ostrożnie przesuwając wiązki kanalików za pomocą drobnych kleszczy.
    UWAGA: Etapy zawsze następują po sobie w logicznej kolejności, tworząc falę nabłonka nasiennego. Jednak ważne jest, aby wiedzieć, że kierunek fali spermatogennej czasami odwraca się, a następnie wraca z powrotem (znane również jako modulacje4,9), czasami komplikując procedurę. Również długość każdego etapu, pod względem liczby mm kanalików, różni się znacznie.
  4. Ostrożnie podnieś interesujący nas kanalik za pomocą kleszczy z haczykowatą końcówką, a następnie odetnij segment o odpowiedniej długości za pomocą nożyczek do mikrodysekcji (patrz film uzupełniający 1). Haczyk na końcu kleszczy ułatwia podnoszenie i trzymanie rurki oraz pomaga uniknąć jej ściskania.
    UWAGA: Długość segmentów do cięcia zależy od dalszych zastosowań. W przypadku zbioru połączonych fragmentów kanalików na określonym etapie do analizy białka lub RNA12,13 (II–V, VII–VIII i IX–XI, Rysunek 5B) długość wynosi zwykle 2–5 mm. Gdy stosuje się standardową ekstrakcję fenolowo-chloroformową, z 1 mm kanalika można uzyskać około 200 ng RNA. W przypadku barwienia segmentów kanalików etapowych w całości długość segmentów powinna wynosić >5 mm. W przypadku preparatów do squasha długość segmentów nie powinna przekraczać 1–2 mm, ponieważ komórki w środku segmentu mogą nie wyjść, jeśli są zbyt długie. Użyj skali mm pod szalką Petriego, aby uzyskać dokładny pomiar długości kanalika.

3. Barwienie immunologiczne różnych preparatów

  1. Przygotowanie dyni: weryfikacja etapu i barwienie immunologiczne
    UWAGA: Specyficzne dla etapu fragmenty kanalików można zgnieść na szkiełku mikroskopowym ze szkłem nakrywkowym w celu przeprowadzenia analizy morfologicznej żywych komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, a następnie barwienia immunologicznego. Zaleca się, aby początkujący korzystał z tego podejścia w celu sprawdzenia etapów podczas zapoznawania się z metodą mikrodysekcji wspomaganej transillumination.
    1. Zebrać wycinek w objętości 10 μl za pomocą pipety i przenieść go na szkiełko mikroskopowe.
    2. Zgnieć kanalik, ostrożnie umieszczając szklankę nakrywkową (20 mm x 20 mm) na kanaliku. W rezultacie komórki wypłyną z kanalika i utworzą monowarstwę żywych komórek. Umieść bibułę filtracyjną na krawędzi szkła nakrywkowego, aby ułatwić rozprowadzanie komórek. Unikaj zbytniego zgniatania komórek, aby utrzymać je przy życiu.
    3. Monitoruj rozprzestrzenianie się komórek pod mikroskopem. Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym przy 40-krotnym obiektywie, aby zweryfikować rozpoznawanie etapu, badając obecne typy komórek (Rysunek 2, Rysunek S2).
    4. Gdy komórki rozprzestrzenią się, tworząc okrągłą monowarstwę z obu końców kanalika, zanurz szkiełko w pojemniku zawierającym ciekły azot, trzymając go kleszczami. Trzymaj go zanurzonego przez 10 s. Alternatywnie umieść szkiełko na płycie z suchego lodu w celu zamrożenia.
    5. Zdejmij szkło nakrywkowe, odkręcając je za pomocą skalpela.
    6. Niezwłocznie przystąp do mocowania i szybko umieść szkiełko w pojemniku z 90% etanolem na 2–5 minut.
      UWAGA: Upewnij się, że preparat do squasha nie rozmraża się przed umieszczeniem go w 90% etanolu. Można również stosować inne utrwalacze, takie jak aceton, przez 10 minut.
    7. Suszyć na powietrzu i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) (do kilku dni) lub w temperaturze -80 °C (długotrwale).
    8. W celu barwienia immunologicznego próbki należy utrwalić w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Płukać w PBS i przepuszczać 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 min.
    10. Opłucz w PBS i narysuj pierścień smarowy wokół każdej próbki dyni
      11. .
    11. Dodać 50–100 μl 10% BSA (albuminy surowicy bydlęcej) w 0,1% Tween in PBS (PBST) wewnątrz pierścienia smarowego i blokować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Usunąć roztwór BSA i inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w 10% BSA w PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    13. Myć 3x przez 5 min z PBST.
    14. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 10% BSA w PBST.
      UWAGA: Aby wybarwić akrosomy, próbki można inkubować z przeciwciałem aglutyninowym Peanut znakowanym rodaminą (PNA, 1:1000) w 10% BSA w PBST przez 1 godzinę w RT (Rysunek S3) zamiast specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
    15. Przemyć 3x po 5 min PBST, spłukać PBS i zamontować za pomocą preparatu zawierającego DAPI.
  2. Barwienie immunologiczne kanalików nasiennych w całości
    UWAGA: Poniższy protokół opisuje barwienie całego montażu dla etapowych (od kroku 2.4) segmentów kanalików. Jeśli badacz chce przeprowadzić barwienie całego montażu bez etapowania (od kroku 1.5), powinien zwrócić uwagę na uwagi w 3.2.1 i 3.2.7.
    1. Za pomocą pipety przenieś segmenty kanalików (z kroku 2.4) w lodowatym PBS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść na lodzie.
      UWAGA: W przypadku stosowania kanalików niestopniowanych od 1,5 należy rozdzielić kanaliki na szalce Petriego, kilkakrotnie pipetując w górę i z powrotem na przechyloną szalkę. Użyj pipety o pojemności 1 ml z odciętą końcówką. Ten krok ma na celu otwarcie struktury tkanki. Należy jednak unikać zbyt intensywnego pipetowania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie kanalików. Sedymentacja kanalików potrwa kilkadziesiąt sekund. Małe fragmenty kanalików, komórki śródmiąższowe i szczątki komórkowe pozostają w supernatancie.
    2. Ostrożnie usunąć supernatant (SN) za pomocą pipetowania lub aspiratora. Dodaj 10 ml lodowatego PBS i wymieszaj przez odwrócenie.
    3. Pozostawić do osadu, a następnie usunąć SN jak poprzednio.
    4. Dodać 5 ml 4% PFA i utrwalać przez 5 godzin na stole obrotowym (20–30 obr./min) w temperaturze +4 °C.
      UWAGA: Czas wiązania zależy od interesujących białek i ich lokalizacji subkomórkowej. W przypadku białek jądrowych i cytoplazmatycznych zwykle wystarcza 2-godzinne wiązanie, jednak markery błonowe, takie jak GFRα1 (receptor rodziny GDNF alfa 1; Rysunek 6A,B), korzystaj z dłuższej fiksacji, do 6 godzin.
    5. Pozostawić do osadu, usunąć SN (PFA) jak poprzednio i krótko spłukać, dodając 10 ml PBS i odwracając probówkę.
    6. Pozostawić do osadu, usunąć SN jak poprzednio i powtórzyć etap mycia PBS trzy razy przez co najmniej 10 minut każdy na stole obrotowym w temperaturze +4 °C i kontynuować barwienie lub przechowywać w temperaturze +4 °C.
      UWAGA: Jeśli warunki pracy są sterylne i czyste, próbki mogą być przechowywane i używane przez co najmniej kilka tygodni. Alternatywnie, dodać azydek sodu do końcowego stężenia 0,02% (w/v) z 2% roztworu podstawowego, aby pomóc zachować kanaliki przed przechowywaniem w temperaturze +4 °C.
    7. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś 10–20 stałych segmentów kanalików do probówki okrągłodennej o pojemności 2 ml. Pozostawić do osadu i usunąć SN.
      UWAGA: W przypadku pracy z długimi kanalikami, które nie zostały zainscenizowane, wylej kanaliki na szalkę Petriego i za pomocą nożyczek do mikrodysekcji i kleszczy wytnij segmenty o wielkości około 5–20 mm. Zbyt długie segmenty będą się plątać podczas procedury barwienia, podczas gdy zbyt krótkie segmenty łatwo się zgubią.
    8. Dodaj 1 ml 2% BSA + 10% FBS (płodowa surowica bydlęca) w 0,3% Triton X-100 w PBS (PBSX). Blokuj przez co najmniej 1 godzinę na stole obrotowym (20–30 obr./min) przy RT.
    9. Przepłukać 1 ml PBSX, usunąć SN przez pipetowanie i dodać 250 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA w PBSX (rozcieńczenie 1:100–1:2000). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze +4 °C na stole obrotowym (20–30 obr./min).
    10. Usunąć roztwór przeciwciała za pomocą pipetowania i przepłukać kanaliki 1 ml PBSX, jak powyżej. Prać trzy razy przez 1 godzinę w PBSX na stole obrotowym (20–30 obr./min) w temperaturze RT.
      UWAGA: Po tym pierwszym praniu próbkę można pozostawić na noc w temperaturze +4 °C, jeśli to konieczne.
    11. Usunąć SN i dodać 250 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA w PBSX (zwykle rozcieńczenie 1:500 przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie). Przykryć folią i inkubować na stole obrotowym (20–30 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    12. Powtórzyć czynności 3.2.10.
    13. Na koniec usuń SN i wlej kanaliki do szkiełka mikroskopowego. Delikatnie oddziel i ułóż kanaliki w paski liniowe za pomocą końcówek ładujących żel. Odcedź nadmiar bufora i dodaj podłoże montażowe oraz szkiełko nakrywkowe.
      UWAGA: Unikaj wysuszania kanalików podczas ich układania. Barwienie przeciwstawne jąder za pomocą DAPI nie jest konieczne w większości przypadków. Uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu i zniszczeniu próbki. Preparaty można przechowywać przez 1–2 tygodnie w temperaturze +4 °C przed obrazowaniem.

Wyniki

Skuteczne etapowanie i mikrodysekcja kanalików nasiennych myszy z wykorzystaniem transiluminacji zależą przede wszystkim od znalezienia odpowiednich warunków oświetlenia, właściwego mikroskopu do dysekcji oraz umiejętności rozpoznawania cech charakterystycznych dla każdego etapu. Etapy VII–VIII wydają się jednorodnie ciemne, ponieważ zawierają one dużą liczbę w pełni skondensowanych, wydłużających się spermatyd ułożonych przy powierzchni apikalnej nabłonka (Rysunek 5A i Rysunek S1). Po uwolnieniu dożrzałych plemników do światła kanalika podczas spermiacji, kanalik w etapach IX–XI wydaje się bardzo jasny z powodu braku skondensowanych wydłużających się spermatyd w nabłonku. Najłatwiejszą do zidentyfikowania cechą w transiluminowanych kanalikach jest punkt spermiacji (gwiazdka na Rysunku 5A i Rysunku S1), czyli nagłe przejście z ciemnej strefy (VII–VIII) do strefy jasnej (IX–XI). Za strefą jasną następuje strefa słabych plamek (XII–I). Plamkowy wygląd wynika z organizacji wydłużających się spermatyd ze skondensowaną chromatyną w pęczki. Pęczki te stają się bardzo wyraźne w następującej strefie silnych plamek (II–V). Ponadto pęczki spermatyd migrują w stronę jąder komórek Sertolego zlokalizowanych blisko błony podstawnej, co objawia się prążkowanym wyglądem kanalików w etapach II–V podczas transiluminacji (Rysunek 2, Rysunek 5A,B i Rysunek S1). Pęczki ulegają ostatecznie rozproszeniu w etapie VI, a kondensujące się wydłużające spermatydy przemieszczają się w stronę światła kanalika, aby zostać uwolnione z nabłonka w etapie VIII.

Dokładny etap segmentu kanalików można precyzyjnie zweryfikować za pomocą mikroskopii fazowej preparatów zgniatanych (Rycina 2 oraz Rycina S2). Konkretne etapy w preparatach zgniatanych rozpoznaje się na podstawie rozwoju akrosomu okrągłych spermatyd kroków 1–8, stanu kondensacji chromatyny w wydłużających się spermatydach oraz obecności pęczków spermatyd16 (Rycina 3 oraz Rycina S2). Ponadto w celu potwierdzenia etapu można wykorzystać obecność wcześniejszych typów komórek, takich jak spermatogonia typu B oraz spermatocyty w stadium leptoten lub zygoten, które można rozpoznać na podstawie ich cech morfologicznych). Wielkość jąder spermatocytów w stadium pachyten zwiększa się około etapu VI, co może również stanowić dodatkową pomoc w określaniu etapu.

Przygotowania metodą rozgniecenia (squash) z określeniem stadium mogą być wykorzystywane do badania ekspresji i lokalizacji wybranych białek w nabłonku kanalików jawajników za pomocą immunostainingu. Pozwala to na bardzo dokładną analizę ekspresji specyficznej dla danego typu komórek dzięki dobrze zdefiniowanemu składowi komórkowemu w każdym stadium. Ekspresję specyficzną dla stadium można dodatkowo wzmocnić poprzez współbarwienie akrosomu (np. za pomocą PNA), co umożliwia wizualizację poszczególnych etapów różnicowania okrągłych spermatyd. Reprezentatywne obrazy akrosomów zabarwionych PNA w różnych stadiach przedstawiono na Rysunku S3. Barwienie akrosomalne może być również wykorzystywane do retrospektywnego określenia stadium. Jednakże określanie stadium z pomocą transiluminacji jest znacznie łatwiejszą i szybszą metodą znalezienia pożądanego stadium niż przypadkowe używanie nieokreślonych fragmentów.

Barwienie całego preparatu kanalików seminifernych jest zazwyczaj stosowane do badania typów komórek mających kontakt z błoną podstawną nabłonka kanalików, albo po stronie kanalikowej (spermatogonie, spermatocyty w stadium preleptonemowym i komórki Sertole; Rycina 6A,B) lub stronę śródmiąższową (perytubularne komórki mioidalne i makrofagi perytubularne; Rysunek 6C i Rycina S4A)24Metoda ta może być jednak wykorzystana również do badania komórek lub struktur znajdujących się głębiej w nabłonku, takich jak bariera krew-jądro (Espin, Rycina S4B), lub komórki linii zarodkowej po mejozie (marker akrosomu PNA, Rycina S4C). W przypadku użycia nieprzesiewanych segmentów kanalików możliwe jest retrospektywne oszacowanie danego stadium za pomocą przeciwciała przeciwko białku ekspresjonowanemu w różnicujących się spermatogoniach (A1, A2, A3, A4, In i B; zbiorczo Aróżnica) (Rycina 2). Stopniowanie opiera się następnie na gęstości syncytialnej Aróżnica które przechodzą sześć podziałów mitotycznych w sposób zależny od stadium podczas pierwszego cyklu różnicowania spermatogenicznego1w związku z czym liczba A uległa podwojeniudiff spermatogonia w syncytiach po każdym podziale1,25Jednakże staging retrospektywny jest mniej dokładny niż staging wspomagany transiluminacją, ponieważ nie istnieją swoiste markery dla poszczególnych generacji ARóżnica or ocena Aróżnica gęstość może być podatna na błędy.

Schemat etapów spermatogenezy u myszy; proces różnicowania komórkowego; rozwój komórek zarodkowych.
Rysunek 1: Mapa cyklu nabłonka kanalików nasiennych do określania etapów spermatogenezy u myszy. Pionowe kolumny przedstawiają asocjacje komórkowe w różnych etapach cyklu nabłonka kanalików nasiennych (oznaczonych cyframi rzymskimi I–XII). Najmniej dojrzałe komórki zarodkowe znajdują się na dole, natomiast najbardziej zróżnicowane na górze. Aby śledzić postęp różnicowania komórek zarodkowych, należy przesuwać się od lewej do prawej oraz od dołu do góry. Cykl nabłonka kanalików nasiennych to pełna seria etapów następujących po sobie w kolejności numerycznej. Aund, niezróżnicowane spermatogonia; A1–4, spermatogonia typu A1–A4; In, spermatogonia pośrednie; B, spermatogonia typu B; Pl, spermatocyty w stadium preleptotenowym; L, spermatocyty w stadium leptotenowym; Z, spermatocyty w stadium zygotenowym; P, spermatocyty w stadium pachytetenowym; D, spermatocyty w stadium diplotenowym; 2°, spermatocyty wtórne oraz podziały meiotyczne. Cyfry arabskie 1-16 odnoszą się do etapów dojrzewania spermatyd po mejozie (spermiogeneza). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu spermatogenezy; obrazy mikroskopowe przekrojów jądra i komórek; analiza optyczna.
Rysunek 2: Powiązania komórkowe w stadiach cyklu nabłonka kanalików nasiennych myszy. Stadia cyklu nabłonka kanalików nasiennych następują po sobie w logicznej kolejności, tworząc tym samym falę spermatogeniczną wzdłuż osi podłużnej kanalika nasiennego. Górny panel ilustruje powiązania komórek zarodkowych w różnych stadiach oraz lokalizację typów komórek w kieszonkach cytoplazmatycznych komórek Sertoliego (jasnoszare) w nabłonku kanalików nasiennych. Ilustracja kanalika nasiennego wizualizuje falę spermatogeniczną oraz specyficzne wzorce prześwietlania: strefy blade, słabe, silne i ciemne. Dla każdego wskazanego stadium przedstawiono reprezentatywne obrazy żywych komórek w kontraście fazowym z preparatów zgniatanych oraz przekroje jądra barwione kwasem okresowym i Schiffem (PAS). Dwa dolne panele pokazują segmenty kanalika nasiennego po prześwietlaniu (góra) lub barwieniu przeciwciałami (dół) przeciwko SALL4 (czerwony, marker pan-spermatogonalny) i DNMT3A (zielony, marker Adiff). Wzorce prześwietlania dla stadiów IX-XI, XII i VI są zaznaczone ramkami. Zarówno wzorzec absorpcji światła (góra), jak i gęstość różnicujących się spermatogonii dodatnich dla DNMT3A (dół) mogą być wykorzystane do określenia (przybliżonego) stadium cyklu kanalików nasiennych. Kolejne pokolenia Adiff określa się jako spermatogonia typu A1–A4, pośrednie (In) oraz typu B. Podział każdej z nich skutkuje podwojeniem gęstości komórek spermatogonalnych. Najwyższą gęstość komórek na błonie podstawnej nabłonka kanalików nasiennych obserwuje się w stadiach VI–VIII, gdy obecne są meiotyczne spermatocyty w stadium preleptoten (Pl). Paski skali: preparaty zgniatane 10 μm, pozostałe 50 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat etapów rozwoju spermatyd; formowanie akrosomu, pogrubienie flagellum, kondensacja chromatyny.
Rycina 3: Etapy spermiogenezy. Charakterystyczne cechy spermatyd na różnych etapach spermiogenezy. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat preparatyki jąder myszy; transiluminacja, przygotowanie do mikroskopii, analiza RNA/proteomiki.
Rycina 4: Schemat postępowania w niniejszym badaniu. Wzorzec transiluminacji został w pełni ustalony u dorosłej myszy (> 8 tygodni). Po uśmierceniu myszy należy niezwłocznie przystąpić do wycięcia i odoskórnienia jąder. Delikatnie rozdzielić kanaliki na szalce Petriego. Kanaliki należy utrwalić do barwień całego preparatu lub przystąpić do transiluminacji. Podczas transiluminacji można: 1) wyciąć krótkie segmenty kanalików na określonych etapach rozwoju do preparatów metodą rozgniatania (do kontroli jakości lub immunobarwienia) lub 2) wyciąć dłuższe segmenty w celu zebrania pul etapowych do analiz RNA i proteomiki, hodowli tkankowych lub barwień całego preparatu. Krótkie segmenty kanalików należy przenieść na szkiełko przedmiotowe w 10 µL PBS. Na segment należy położyć szkiełko nakrywkę, aby wypchnąć komórki i utworzyć monowarstwę żywych komórek. Następnie obserwować typy komórek pod mikroskopem, po czym utrwalić i zabarwić. WMS, barwienie całego preparatu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza struktury segmentowanej robaka, schemat z opisanymi strefami: słaby punkt, silny punkt, strefa ciemna.
Rysunek 5: Kanalik nasienny dorosłej myszy widziany w mikroskopii prześwietlającej.(A) Długi fragment kanalika nasiennego widziany w prześwietleniu, przedstawiający falę nabłonka nasiennego. Na podstawie kondensacji chromatyny w spermatydach oraz ich lokalizacji w nabłonku można zidentyfikować cztery wyraźne strefy: strefę ciemną (stadia VII–VIII), strefę jasną (stadia IX-XI), strefę słabego punktu (stadia XII–I) oraz strefę silnego punktu (stadia II–VI). Gwiazdka oznacza punkt spermiacji. Strzałki wskazują dwa krótkie segmenty w strefie słabego punktu, które mają jasny wygląd z powodu stresu mechanicznego kanalika. Pasek skali: 500 μm. Wstawki 1–5 przedstawiają większe powiększenia wybranych fragmentów kanalika. (B) Połączone segmenty kanalika nasiennego reprezentujące stadia II–V (strefa silnego punktu), VII–VIII (strefa ciemna) oraz IX–XI (strefa jasna). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia immunofluorescencyjna wykazująca ekspresję GFRa1, SALL4, DNMT3B, USF1, SOX9, F4/80, MHCII.
Rycina 6: Immunobarwienie całych preparatów z wykorzystaniem markerów spermatogonii, komórek Sertollego i makrofagów perytubularnych. (A) Barwienie całego preparatu segmentu reprezentującego stadium XI–II przeciwciałami przeciwko GFRα1 (czerwony), SALL4 (zielony) i DNMT3B (niebieski). Barwienie ujawnia trzy odrębne populacje spermatogonii: pojedyncze (As) lub sparowane (Apr) niedróżnicujące się spermatogonie macierzyste (GFRα1+/SALL4+/DNMT3B-; białe obszary punktowe), krótkie syncytialne (tutaj 4 komórki ustawione w rzędzie; Aal4) spermatogonie progenitorowe (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B-; żółte obszary punktowe) oraz różnicujące się spermatogonie (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B+). Komórki SALL4+/DNMT3B+ to spermatogonie typu A3–A4. (B) Barwienie całych kanalików nasiennych przeciwciałami przeciwko GFRα1 (czerwony), USF1 (zielony) i SOX9 (niebieski). GFRα1 barwi podzbiór spermatogonii macierzystych. USF1 jest wyrażany zarówno przez spermatogonie, jak i komórki Sertollego SOX9+. (C) Makrofagi perytubularne u dorosłych myszy są dodatnie zarówno dla F4/80 (czerwony), jak i MHCII (niebieski). DAPI barwi DNA (zielony). Jasne, duże jądra to jądra komórek mioidalnych perytubularnych. Paski skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek S1: Długi odcinek kanalika nasiennego w świetle przechodzącym, przedstawiający falę nabłonka nasiennego. Na podstawie kondensacji chromatyny w spermatydach oraz ich lokalizacji w nabłonku można wyróżnić cztery odrębne strefy: strefę słabych plamek (stadia XII–I), strefę silnych plamek (stadia II–VI), strefę ciemną (stadia VII–VIII) oraz strefę jasną (stadia IX–XI). Punkt spermiacji (gwiazdka) jest rozpoznawalny w miejscu, gdzie strefa ciemna gwałtownie przechodzi w strefę jasną. Pasek skali: 500 μm. Wstawki 1–4 to powiększenia wybranych odcinków kanalika. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek S2: Mikroskopia kontrastowa monowarstw żywych komórek na różnych etapach cyklu nabłonka kanalików nasiennych. (A) Etap I. Okrągłe spermatydy kroku 1 wciąż nie posiadają struktury akrosomalnej. Charakteryzują się małym, okrągłym jądrem (czerwone okręgi) z wyraźnym, pojedynczym chromocentrum (białe strzałki). Ciałko chromatoidalne jest widoczne w cytoplazmie jako ciemny granulat w bliskim kontakcie z błoną jądrową (niebieskie strzałki). Jądro komórki Sertolego (biały okrąg) zawiera trzy ciemne ogniska: duży jąderko z dwoma satelitarnymi chromocentrami. Komórki Sertolego rzadko są widoczne w preparatach zgniatanych, lecz sporadycznie wypływają z kanalików wraz z komórkami linii płciowej. (B) Etapy II–IV. W okrągłych spermatydach kroku 4 (czerwone okręgi) struktura akrosomalna (czerwone strzałki) pojawia się jako biały, lekko spłaszczony pęcherzyk przylegający do otoczki jądrowej. Wydłużające się spermatydy tworzą pęczki i posiadają już gruby flagellum (białe strzałki), co wskazuje na obecność pochewki mitochondrialnej w części środkowej ogonka plemnika. Jądra spermatocytów pachitenowych (PSpc) są mniej więcej dwa razy większe niż jądra okrągłych spermatyd i charakteryzują się ciemnymi obszarami chromatyny rozproszonymi w całym jądrze. (C) Etapy V–VI. W okrągłych spermatydach kroku 5–6 (czerwony okrąg) akrosom ulega dalszemu spłaszczeniu i rozprzestrzenia się nad jądrem (czerwone strzałki). Obszar otoczki jądrowej przylegający do akrosomu wydaje się ciemny ze względu na obecność akroplaksomu, białkowej płytki znajdującej się między błoną akrosomalną a błoną jądrową. Wydłużające się spermatydy uwalniają się z pęczków (białe strzałki). W nabłonku często obserwuje się spermatocyty pachitenowe (PSpc). (D) Etapy VII-VIII. Akrosom (czerwone strzałki), widoczny jako ciemna wyściółka na otoczce jądrowej z białymi cieniami, jest w pełni rozwinięty i pokrywa niemal całą stronę apikalną okrągłych spermatyd kroku 7-8 (czerwone okręgi). Etap ten charakteryzuje się obecnością dojrzałych spermatyd (białe strzałki), które mogą być liczne w wielu częściach preparatu zgniatanego. Jądro spermatocytów pachitenowych (PSpc) zwiększa swoją objętość podczas rozwoju i wydaje się większe w etapach VII–VIII niż w etapach poprzednich. Ciemne obszary chromatyny wewnątrz jądra spermatocytów pachitenowych (PSpc) wydają się rozmyte ze względu na wysoką aktywność transkrypcyjną i zdarzenia meiotyczne. (E) Etap X. Jądra spermatyd kroku 10 (białe strzałki) rozpoczęły proces wydłużania, ale chromatyna nie uległa jeszcze kondensacji. Akrosomy zaczynają tworzyć haczyk na szczycie jądra (czerwona strzałka). Jądra spermatocytów pachitenowych (PSpc) wydają się bardzo duże, ponieważ przygotowują się do podziałów meiotycznych. (F) Etap XII. Etap XII charakteryzuje się obecnością płyt metafazowych mejozy (białe przerywane okręgi). Małe, okrągłe komórki z typowym wzorem skondensowanej chromatyny to spermatocyty zygotenowe (ZSpc), w których chromosomy siostrzane ustawiają się, aby zainicjować tworzenie kompleksu synaptonemalnego. Paski skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina S3: Identyfikacja stadium cyklu nabłonka kanalików nasiennych na podstawie barwienia akrosomów i jąder. Preparaty typu squash utrwalone acetonem zabarwiono PNA sprzężonym z rodaminą oraz DAPI. Stadium I: podczas gdy w spermatydach okrągłych w kroku 1 akrosom nie występuje, w spermatydach wydłużających się można wykryć w pełni wykształcony akrosom. Stadia II–IV: rozwój akrosomu rozpoczyna się od pojawienia się ziarnistości proakrosomalnych/akrosomalnych w spermatydach okrągłych. Pęcherzyk akrosomalny na powierzchni jądra pozostaje okrągły do spermatyd w kroku 3, a następnie spłaszcza się w spermatydach w kroku 4. Stadium V: kąt rozwarcia akrosomu zwiększa się od 40 stopni do maksymalnie 95°. Stadia VI–VII: kąt rozwarcia akrosomu zwiększa się od 95 stopni do 120 stopni. Stadia VIII-IX: akrosom jest w pełni rozciągnięty w spermatydach w kroku 8 (stadium VIII), a jądra polaryzują się po stronie apikalnej komórki, nawiązując kontakt z błoną plazmatyczną (nie pokazano). Do stadium IX jądro spermatydy ulega deformacji; po raz pierwszy widoczne są powierzchnie grzbietowa i brzuszna. Stadia X-XI: spermatydy wykazują kąt grzbietowy. Stadium XII: stadium to najlepiej charakteryzuje pojawienie się podziałów meiotycznych; płytki metafazowe zaznaczono białymi strzałkami. Widoczne są również spermatydy wydłużające się z ich akrosomami. Paski skali: 10μm. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rysunek S4: Barwienie całego preparatu na markery niekonwencjonalne. (A) Alfa-aktyna mięśni gładkich (aSMA) jest ekspresowana przez perytubularne komórki mioidalne. (B) Espina lokalizuje się w szczelnych połączeniach komórek Sertolego i przyczynia się do tworzenia bariery krew-jądro. (C) PNA lokalizuje się w akrosomach spermatyd. Paski skali: 50μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Wideo uzupełniające 1: Wycięcie krótkiego segmentu kanalików jawodowych reprezentującego stadium VII-VIII. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Opisana powyżej metoda mikrodysekcji wspomagana transillumination umożliwia podejście zorientowane na etap do badania spermatogenezy. Spermatogeneza jest procesem wysoce zsynchronizowanym, a wszystkie kluczowe etapy różnicowania plemników są regulowane i wykonywane w sposób zależny od etapu, takie jak zaangażowanie w różnicowanie (na etapach VII-VIII), początek mejozy (VII-VIII), podziały mejotyczne (XII), początek wydłużania spermatyd (VIII) i spermiacja (VIII)1,26,27. Analiza zorientowana na etap stanowi potężne narzędzie do badania tych szczególnych zdarzeń, które są ograniczone do określonych etapów spermatogenezy, a zatem występują tylko na określonych etapach cyklu nabłonka nasiennego. Opanowanie metody wymaga pewnej wprawy, a kluczem do sukcesu jest użycie dobrej jakości mikroskopu preparacyjnego i odpowiednie warunki oświetleniowe. Wdrożenie tej metody jako części codziennego zestawu narzędzi może znacznie poprawić wpływ i biologiczne znaczenie badań nad męskimi funkcjami rozrodczymi, umożliwiając dokładniejszą analizę zdarzeń molekularnych podczas spermatogenezy.

Wszystkie badane przez nas szczepy myszy WT wykazują podobny wzór transiluminacji i wykazują konserwatywne asocjacje komórkowe na etapach cyklu nabłonka nasiennego. Pod warunkiem, że spermiogenne różnicowanie komórek rozrodczych nie różni się rażąco od myszy WT, to samo dotyczy wszystkich badanych przez nas modeli myszy z nokautem. Ponadto można go zastosować do innych gatunków, które wykazują podłużny segmentowy układ etapów cyklu nabłonka nasiennego7. Nie można jednak wykorzystywać gatunków o stadiach niesegmentowych (takich jak człowiek). Biorąc pod uwagę zasadniczą rolę kondensacji chromatyny w wydłużaniu spermatyd w definiowaniu wzorca transiluminacji, jasne jest, że jakakolwiek nieregulacja tego procesu nieuchronnie wpłynie na wdrożenie tej metody. U młodych myszy i młodych dorosłych (5-6 tygodni) wzorzec transiluminacji nie został jeszcze w pełni ustalony, dlatego należy stosować tylko myszy starsze niż 8 tygodni. Ważne jest również, aby pamiętać, że ściskanie i ciągnięcie kanalików nieuchronnie wpłynie na wzór transiluminacji, ponieważ zniekształca architekturę komórkową w nabłonku nasiennym.

Izolowane segmenty kanalików nasiennych mogą być również hodowane, co umożliwia obserwację ex vivo i manipulację procesami sprzężonymi ze spermatogenezą, w tym mejozą. Aby zapewnić żywotność tkanki i zapobiec degradacji RNA i białek, próbki powinny być pobierane i przetwarzane nie później niż 2 godziny po poświęceniu myszy. W przypadku hodowli kanalików nasiennych ex vivo czas od złożenia ofiary do rozpoczęcia hodowli nie powinien przekraczać 1 godziny. Integralność fragmentów kanalików może być zazwyczaj utrzymana do 72 godzin in vitro , jeśli zostaną prawidłowo pobrane.

Etap cyklu nabłonka nasiennego można zweryfikować i jeszcze dokładniej określić za pomocą mikrokopii preparatów do squasha z kontrastem fazowym16. Mikroskopia jest wykonywana na żywych komórkach, co nadaje dodatkowy wymiar analizie i umożliwia obserwację ruchów organelli lub komórek w określonych stadiach spermatogenezy 28,29,30. Mikroskopia z kontrastem fazowym zapewnia dokładną ocenę stopnia zaawansowania dla późniejszego barwienia immunologicznego, co umożliwia bardzo szczegółową analizę dynamiki ekspresji i lokalizacji białek podczas spermatogenezy, w tym zmian specyficznych dla danego etapu.

Podczas gdy komórki są uwalniane z kontekstu nabłonkowego w preparatach do squasha, barwienie immunologiczne całych odcinków kanalików umożliwia badanie komórek plemnikotwórczych w ich środowisku fizjologicznym. W związku z tym preparaty typu whole-mount mogą zapewnić lepszą wizualizację architektury kanalików nasiennych i ich kontaktów międzykomórkowych niż barwienie immunologiczne na przekrojach poprzecznych. Co ważne, wspomagana transilluminacją ocena stopnia zaawansowania segmentów kanalików przed barwieniem immunologicznym sprawia, że podejście to jest jeszcze bardziej skuteczne, ponieważ zawiera informacje na temat konkretnego etapu danego segmentu. Barwienie w całości jest szczególnie przydatnym narzędziem do badania komórek na obrzeżach kanalików nasiennych, takich jak okołokanalikowe komórki mięśniowe, makrofagi okołokanalikowe i spermatogonia, ale może również otworzyć nowe spojrzenie na badania nad mejotykami i postmejotycznymi komórkami rozrodczymi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Akademii Fińskiej [315948, 314387 dla N.K.]; Fundacja Sigrid Jusélius [do N.K., J.T.]; Fundacja Emila Aaltonena [do J.-A.M., T.L.]; Program Doktorski Medycyny Molekularnej w Turku [S.C.-M., O.O.].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA9647
szkło nakrywkowe 20x20 mmMenzel Glä ser11961988
Falcon stożkowa probówka 15 mlSarstedt62.554.502
płodowa surowica bydlęca (FBS)Smarowicz BiowestS1810
(ImmEdge)Vector LaboratoriesH-4000
Superfrost PlusThermo Scientific22-037-246
Parafinaldehyd parafolowy (PFA)Mikroskopia elektronowa Nauki15714
Szalka Petriego (100 mm)Greiner664160
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco11503387
ProLong Diamentowy uchwyt zapobiegający blaknięciuThermo FisherP36962
aglutynina orzechowa (PNA) znakowana rodaminąVectorLaboratoriesRL-1072
Triton X-100Sigma93443
Tween-20SigmaP2287
Szkiełko mikroskopowe

Bibliografia

  1. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis Physiology: Seminiferous Cycle. Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).
  2. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  3. Clermont, Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).
  4. Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. The wave of the seminiferous epithelium in the rat. American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).
  5. de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., França, L. Testis Physiology-Overview and Histology. Encyclopedia of Reproduction. , ELseiver. (2018).
  6. Leblond, C. P., Clermont, Y. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat. Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).
  7. Parvinen, M. Regulation of the seminiferous epithelium. Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).
  8. Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
  9. Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice. Reproduction. 154 (5), Cambridge, England. 569-579 (2017).
  10. Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. Histological and histopathological evaluation of the testis. , Cache River Press. Clearwater, FL. (1990).
  11. Parvinen, M., Hecht, N. B. Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities. Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).
  12. Ventelä, S., Mäkelä, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis. Stem Cells. 30 (5), Dayton, Ohio. 1008-1020 (2012).
  13. Faisal, I., et al. Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice. Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).
  14. Wright, W. W., et al. Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules. Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).
  15. Johnston, D. S., et al. Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).
  16. Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium. Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).
  17. Mäkelä, J. A., et al. Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis. Reproduction. 142 (5), Cambridge, England. 711-721 (2011).
  18. La, H. M., et al. Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline. Nature Communications. 9 (1), 04827(2018).
  19. Toppari, J., Parvinen, M. In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis. Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).
  20. Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat. The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).
  21. Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).
  22. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), Cambridge, England. 1495-1505 (2006).
  23. Chan, A. L., et al. Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes. Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).
  24. Lokka, E., et al. Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis. Nat Commun. 11 (1), 4375(2020).
  25. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium. Encyclopedia of Reproduction. , Elseiver. (2018).
  26. Griswold, M. D. Spermatogenesis: The commitment to meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
  27. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Spermatogenesis. Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).
  28. Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).
  29. Parvinen, M., Parvinen, L. M. Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products. The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).
  30. Parvinen, M., Söderström, K. O. Chromosome rotation and formation of synapsis. Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spermatogeneza myszysegmenty kanalik w specyficzne dla stadiumprotoko y immunobarwieniamikroskopia fazowo kontrastowapreparaty zgniatanebarwienie ca ych preparat wstadia kom rek zarodkowychj dra kom rek Sertolego
Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.